Em formação

Problemas de Laemmli-SDS-PAGE


Eu fiz Laemmli-SDS-PAGE para meu precipitado de sulfato de amônio, mas eu tinha uma banda muito fraca e uma parte muito estranha no final do gel. Por favor me ajude a resolver esse problema. Obrigado


Seu gel parece ótimo para mim. Simplesmente indica que o precipitado de sulfato de amônio contém grandes quantidades desta pequena proteína na parte inferior (seja ela qual for). As bandas superiores parecem boas, a quantidade carregada é apropriada: elas não estão sobrecarregadas como a inferior, mas também não são muito fracas. O fato de sua primeira e última pistas parecerem um pouco manchadas é devido à grande quantidade da pequena proteína (as pistas parecem borradas quando tão sobrecarregadas). A faixa inferior é definitivamente alguma proteína, e não um artefato de coloração; Eu já vi essa forma antes com proteínas purificadas sobrecarregadas em SDS-PAGE.

Uma coisa que você pode fazer, supondo que ainda tenha amostras suficientes, é aplicar um gel complementar com 100 vezes menos material. Dilua por um fator de 1/100 em tampão de desnaturação Laemmli 1X e carregue um novo gel com o mesmo volume deste. Você não verá mais as bandas superiores, mas terá uma banda inferior muito mais limpa, à qual esperançosamente será capaz de atribuir um peso molecular aparente (ou mesmo cortar para identificação de especificação de massa; use luvas e use ferramentas limpas se você faça isso, caso contrário, eles irão detectar principalmente a queratina de sua pele).

Supondo que o objetivo desse gel fosse verificar o resultado da precipitação de sulfato de amônio usada como uma etapa de purificação, bem, obviamente não funcionou bem para separar todas essas bandas, e pode ser necessário repetir e tentar diferentes concentrações. Mas se a faixa inferior é aquela que você está tentando purificar, então você teve sucesso (as faixas superiores representam menos de 10% de contaminação, eu diria pela estimativa do globo ocular). Se você está interessado em uma das melhores bandas, então claramente não funcionou.

Uma dessas pistas é o sobrenadante? Nesse caso, você também tem grandes quantidades da pequena proteína lá (está em todas as pistas). Um enriquecimento tão alto parece suspeito: poderia ser lisozima purificada que você adicionou durante o procedimento de purificação para ajudar a quebrar a parede celular bacteriana? (assumindo que você está tentando purificar uma proteína superexpressada em E. coli).


Estabelecimento da proteína 43 de ligação ao DNA de TAR quimicamente oligomerizável que simula a patologia da esclerose lateral amiotrófica em células de mamíferos

Uma das marcas patológicas da esclerose lateral amiotrófica (ALS) é a agregação citosólica mal localizada da TAR DNA-Binding Protein-43 (TDP-43). Não apenas o TDP-43 por si só é um gene causador da ELA, mas também a localização incorreta e a agregação de TDP-43 parecem ser uma alteração patológica comum na ELA esporádica e familiar. O mecanismo como o TDP-43 nuclear se transforma em agregados citosólicos permanece indefinido, mas estudos recentes usando optogenética propuseram que a separação aberrante de fase líquido-líquido (LLPS) do TDP-43 se liga ao processo de agregação, levando à distribuição citosólica. Embora LLPS desempenhe um papel importante na formação de agregados, ainda existem vários problemas técnicos na técnica optogenética a serem resolvidos para o progresso do estudo in vivo. Aqui relatamos um sistema TDP-43 quimicamente oligomerizável. A oligomerização de TDP-43 foi alcançada por um pequeno composto AP20187, e o TDP-43 oligomerizado passou por formação de agregado, seguido por localização errônea citosólica e indução de toxicidade celular. O TDP-43 mal localizado co-agregado com wt-TDP-43, Fused-in-sarcoma (FUS), TIA1 e sequestosome 1 (SQSTM1) / p62, mimetizando a patologia de ALS. O TDP-43 quimicamente oligomerizável também revelou os papéis do domínio N-terminal, motivo de reconhecimento de RNA, sinal de exportação nuclear e domínio de baixa complexidade na formação de agregados e localização incorreta de TDP-43. As propriedades de agregação de TDP-43 foram aumentadas por uma mutação causadora de ALS familiar. Em conclusão, o sistema TDP-43 quimicamente oligomerizável pode ser útil para estudar os mecanismos subjacentes à transição de fase de agregação de gotícula e má localização citosólica de TDP-43 em ALS e um estudo mais aprofundado in vivo.


1. Introdução

A eletroforese de afinidade é uma técnica de separação baseada no fenômeno em que as mobilidades de moléculas carregadas em um campo elétrico de corrente contínua variam conforme interagem ou não com outras moléculas pelas quais possuem afinidades. A eletroforese de afinidade tornou-se uma técnica importante, principalmente nos setores biológico e médico, onde é utilizada para separar e analisar macromoléculas biológicas. A primeira técnica de eletroforese de afinidade, eletroforese cruzada, foi desenvolvida por Nakamura et al. [1,2]. A eletroforese cruzada tem sido usada na detecção de complexos enzima-substrato [3,4,5,6] e em análises da cinética de reações antígeno-anticorpo [7,8]. O princípio associado a este método tem sido aplicado nas técnicas de imunoeletroforese de foguete e imunoeletroforese cruzada [9].

Foi desenvolvida uma grande variedade de técnicas de eletroforese de afinidade que fornecem bons resultados qualitativos ou têm boas capacidades de separação. Uma dessas técnicas pioneiras é a de afinoforese [10], que utiliza um afinóforo, um polímero hidrofílico carregado que se liga a moléculas com uma afinidade adequada. Na afinoforese, apenas as moléculas que se ligam especificamente ao afinóforo podem ser induzidas a migrar pela aplicação de um campo elétrico. O desenvolvimento de sondas de afinidade (ou ligantes de afinidade), que são moléculas que possuem afinidades por moléculas específicas, agora ocupam um papel importante no crescimento da tecnologia de eletroforese de afinidade. Além disso, técnicas de eletroforese de afinidade baseadas no retardo da migração de moléculas que se ligam fortemente a sondas de afinidade imobilizadas em uma matriz suportada também foram desenvolvidas e contribuíram para análises das principais modificações pós-tradução de proteínas [11,12,13, 14]. Vários tipos de aparelhos para eletroforese de afinidade foram desenvolvidos para uso em técnicas como eletroforese capilar [15,16,17] e eletroforese de microchip [18,19,20]. A eletroforese de afinidade capilar, em particular, tem sido amplamente utilizada como uma técnica para vários modos no campo das ciências da vida [21]. Além disso, a eletroforese de afinidade também é usada em uma nova técnica de eletroforese em que uma membrana de poli (fluoreto de vinilideno) (PVDF) é usada como uma nova matriz molecular suportada [22,23,24]. Têm sido feitas tentativas para aplicar esta técnica em separações por afinidade de grandes glicoproteínas [25].

Este artigo descreve os avanços em técnicas analíticas envolvendo eletroforese de afinidade que surgiram durante os últimos cinco anos. Além disso, apresenta uma técnica para a análise de proteínas fosforiladas que é baseada na sonda de afinidade de fosfato, Phos-tag [11,26,27,28,29,30,31,32,33], que desenvolvemos, e descreve as contribuições feitas à fosfoproteômica por técnicas baseadas em Phos-tag.


1. Introdução

Desde a sua descoberta em 1996 como um parceiro de ligação de RAS, a proteína 1 de ligação de proteína Ras-GTPase (GAP) (G3BP1) foi ligada a uma variedade de processos biológicos, funções moleculares e compartimentos celulares (Parker et al., 1996 ) Inicialmente sugerido para desempenhar um papel fundamental na via de sinalização Ras através da ligação direta ao Ras, evidências mais recentes contradizem essa função potencial (Annibaldi et al., 2011 Xu et al., 2013). Mesmo que essa função inicial seja debatida, com base em seu papel no desenvolvimento, metabolismo do RNA, degradação e resposta ao estresse, a G3BP1 parece ser uma proteína idiota fundamental para a homeostase celular.

Ao longo dos anos, o G3BP1 demonstrou ser essencial para a sobrevivência celular, seja como um elemento-chave para combater infecções virais (Lloyd, 2016 White et al., 2007 White & Lloyd, 2011) ou no câncer, onde foi demonstrado que ajuda a tumores e células cancerosas na superação de quimioterápicos e condições hostis (Dou et al., 2016 Wang, Fu, et al., 2018 Zhang et al., 2015, 2019). No entanto, até o momento, as funções moleculares exatas de G3BP1 em um contexto fisiológico ainda não foram totalmente descobertas. Na Vivo evidências indicam claramente que G3BP1 é especialmente importante para o desenvolvimento do cérebro e atividades neuronais basais (Martin et al., 2013, 2016). A maior parte do que se sabe sobre G3BP1 está focado em sua ligação com grânulos de RNA especializados, denominados grânulos de estresse, mas principalmente em um contexto não neuronal.

A presente revisão irá descrever as características genéticas e estruturais de G3BP1, bem como destacar importantes interatores. Também discutiremos como G3BP1 demonstrou estar implicado em uma série de mecanismos moleculares importantes e como eles podem estar associados a doenças neurodegenerativas. Exploraremos ainda as diferenças importantes entre G3BP1 e seus parálogos G3BP2a e G3BP2b, e como eles podem ser importantes no SNC.


Introdução

A atual pandemia de COVID-19, causada pelo SARS-CoV-2, já custou mais de 2,7 milhões de vidas e representa um desafio excepcional para nossa sociedade, economia e ciência. Por causa da alta morbidade e mortalidade em grupos de risco e possíveis sequelas de múltiplos órgãos a longo prazo, estratégias para alcançar imunidade de rebanho natural suficiente não são aceitáveis. Estamos, portanto, testemunhando esforços sem precedentes para desenvolver vacinas a serem administradas à maioria da humanidade. Embora felizmente aconteça que algumas vacinas SARS-CoV-2 aprovadas podem estimular respostas imunes protegendo da doença COVID-19 sem efeitos colaterais imediatos evidentes e fundamentalmente contribuir para a contenção futura da pandemia (ver, por exemplo, [1-4]), numerosas e Diversas vacinas candidatas estão sendo desenvolvidas para atender à necessidade de proteção rápida de humanos de todas as idades e condições e / ou prevenir a transmissão do vírus. A avaliação prudente e transparente de antígenos, adjuvantes e veículos de aplicação é crítica para prevenir riscos médicos e inspirar confiança pública nas vacinas.

De particular preocupação para a segurança da vacina são os veículos de entrega potencialmente precários, incluindo vírus replicantes recentemente desenvolvidos, bem como respostas imunológicas prejudiciais a antígenos inadequados, conhecidos como realce dependente de anticorpos (ADE). Uma preocupação especial no caso de vírus respiratórios como o SARS-CoV-2 é a doença respiratória intensificada associada à vacina (VAERD) [5–7], que aconteceu anteriormente após a vacinação com antígenos virais conformacionalmente incorretos do vírus sincicial respiratório (RSV). Especialmente, VAERD foi associado a altos níveis de anticorpos não neutralizantes. Uma combinação de deposição de imunocomplexos, ativação do complemento e resposta imune tendenciosa para Th2 levou ao aumento dos sintomas respiratórios [8-10].

O SARS-CoV-2 pandêmico é um betacoronavírus [11–13] intimamente relacionado ao vírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS) (agora denominado SARS-CoV-1) que surgiu em 2003 [14,15]. Pesquisas anteriores sobre SARS-CoV-1 foram altamente instrutivas e forneceram projetos valiosos para o desenvolvimento de vacinas COVID-19. Em particular, Buchholz e colegas mostraram que a proteína pico da superfície viral (S) é a única proteína do vírus que estimula os anticorpos neutralizantes do vírus (VNAs) [16], que são cruciais para a maioria das abordagens de vacinas. Consequentemente, S é o principal alvo das vacinas COVID-19 atuais e vacinas candidatas [17] e os VNAs são entretanto estabelecidos como o principal correlato de proteção após a infecção ou vacinação contra COVID-19 em humanos e modelos animais [18-22] .

A proteína S transmembrana de classe I é o principal determinante do tropismo e da transmissão do coronavírus. A proteína precursora S é processada por proteases celulares no terminal N maduro S1 e nas subunidades S2 ligadas à membrana [23-25]. S1 contém o domínio de ligação ao receptor (RBD) responsável pela ligação do vírus ao principal receptor celular, a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) [26,27]. A ligação do RBD ao receptor resulta em rearranjos estruturais profundos necessários para a fusão da membrana pela subunidade S2 e liberação do genoma do RNA viral no citoplasma. As diferenças moleculares para SARS-CoV-1 S incluem uma maior afinidade de ligação do RBD à molécula ACE2 [26-28] e a presença de um local de clivagem multibásico, provavelmente promovendo a maturação proteolítica e o transporte da proteína [11,23,24 ] Esses fatores provavelmente contribuem para uma gama extensa de hospedeiros e órgãos e para a alta contagiosidade do SARS-CoV-2 [29-31].

Como mostram os dados acumulados, os pacientes com COVID-19 desenvolvem prontamente altos níveis de anticorpos direcionados contra a proteína S inteira, a maioria dos quais, entretanto, não neutraliza a infectividade do vírus. Em contraste, a quantidade esmagadora de anticorpos de ligação a RBD exibe atividade neutralizante [22,32-35]. É importante ressaltar que epítopos de anticorpos não neutralizantes das proteínas SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2 S aumentam a infecção pelo vírus em vitro [36,37] e foi sugerido que o anti-S IgG de pacientes com COVID-19 gravemente enfermos pode promover respostas hiperinflamatórias [38]. Portanto, é aconselhável focar no imunógeno RBD para induzir anticorpos neutralizantes potentes e evitar anticorpos S não neutralizantes desnecessários ou potencialmente prejudiciais.

Vírus de RNA de fita negativa recombinante incluindo rabdovírus como o patógeno animal VSV [39] ou o vírus zoonótico da raiva [40] são plataformas atraentes para vacinas experimentais contra doenças virais emergentes e negligenciadas, bem como para terapias imunológicas oncolíticas (para revisões recentes, ver [41 , 42]). Os rabdovírus são vírus de RNA em forma de bala, citoplasmáticos e não integrados, que codificam uma única glicoproteína (G) responsável pela ligação do receptor e infecção das células. Como ilustrado antes, os vetores de comprimento total de VSV ou deficientes no gene G (VSVΔG) que expressam S funcional de SARS-CoV-1 induziram uma resposta imune protetora em modelos animais [43,44]. Como a patogenicidade residual do VSV de comprimento total recombinante é amplamente atribuída à glicoproteína G [45], uma estratégia para atenuar as vacinas de VSV é a substituição do gene G por aqueles de proteínas de envelope heterólogas, como exemplificado na vacina Ebola recentemente aprovada VSV-Zebov (Ervebo) [46]. Não surpreendentemente, VSV deficiente em G expressando proteínas SARS-CoV-2 S totalmente funcionais foram rapidamente preparados e propostos como candidatos à vacina COVID-19 [47-51]. É importante ressaltar que, em contraste com o SARS-CoV-1, a autêntica proteína de pico SARS-CoV-2 pode mediar prontamente a disseminação e amplificação de S VSVs substitutos em cultura de células, organóides e animais [43,44,52]. Além disso, VSVΔG-SARS-CoV-2 S rapidamente desenvolveu mutações no gene S para se adaptar às condições de cultura de células e produzir vírus de alto título, bem como mutações de escape de anticorpos [47,53,54]. Como a atenuação do VSV evidentemente depende das glicoproteínas usadas para a construção de vírus substitutos e seu tropismo [55], testes pré-clínicos extensos são necessários - como foi feito no caso do VSV-Zebov (para revisão, consulte) [46] - para inspirar confiança em qualquer vacina de vírus substituto de VSV ou VSVΔG replicante.

Aqui, propomos uma alternativa segura e altamente eficaz para ambos os vírus competentes de replicação e expressão do antígeno SARS-CoV-2 S de comprimento total para minimizar as respostas imunes potencialmente prejudiciais. Usando design guiado por estrutura, desenvolvemos um construto RBD transmembrana quimérico, denominado "minispike", para apresentação de antígeno estruturalmente correta e aprimorada. Na construção de minispike, o domínio RBD é fundido a uma âncora de haste transmembrana C-terminal da proteína G do rabdovírus da raiva (RABV), para permitir a expressão eficaz como um imunógeno ligado à membrana celular. Além disso, a expressão do minipike de vetores de replicação de VSV ou RABV deficientes em propagação (G-deficiente) ou RABV resulta na secreção de VLPs não infecciosas decoradas com o antígeno de minipike. Notavelmente, a imunização com uma dose única de um replicon VSV complementado por G que codifica uma única cópia do gene RBD minispike (VSVΔG-minispike-eGFP) foi encontrada para proteger camundongos K18-hACE2 transgênicos da doença. Como a construção de minispike é compatível com RABV, VSV e provavelmente outros rabdovírus, todos passíveis de troca de envelope, o sistema de minispike de rabdovírus oferece opções atraentes para uma diversidade de regimes de iniciação / reforço, incluindo imunização oral com vírus RABV G complementados.


Notas de rodapé

Esta pesquisa foi apoiada por um National Institutes of Health Grant GM58442 (M.D.D.), por um National Institutes of Health Predoctoral Training Grant T32-GM08700 (A.J.D.), e por um National Institutes of Health Predoctoral Training Grant T32 GM008347 (J.D.O.). Este trabalho foi realizado em parte usando instrumentação do Centro de Espectrometria de Massa e Proteômica da University of Minnesota, do Minnesota Supercomputer Institute e das instalações do Masonic Cancer Center. Agradecemos ao Dr. Lorraine Anderson, Todd Markowski e Bruce Witthuhn, do Centro de Espectrometria de Massa da Universidade de Minnesota, por sua assistência e orientação técnica.

Dados S1. Resumo das informações do peptídeo do programa Scaffold usado para a identificação das sete proteínas marcadas usando o composto 6a.

Nome do arquivo Descrição
CBDD_1037_sm_SI.pdf297,7 KB Item de informação de apoio

Observação: O editor não é responsável pelo conteúdo ou funcionalidade de qualquer informação de suporte fornecida pelos autores. Quaisquer dúvidas (que não sejam de conteúdo ausente) devem ser direcionadas ao autor correspondente do artigo.


Informações de Apoio

S1 Fig

As células H4 foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 125 & # x003bcM ou 250 & # x003bcM IDN5706 por 16 h, e os níveis de mRNA de EDEM1 foram analisados ​​por RT-PCR semiquantitativo e comparados com os níveis de mRNA de GAPDH usados ​​como controle.

S2 Fig

As células H4 foram deixadas sem tratamento (faixa 1 e 3) ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 por 16 h (faixa 2) ou 2,5 & # x003bcg / ml de tunicamicina por 12 h (faixa 4), seguido por Western blotting com um anticorpo para EDEM1. O tratamento com tunicamicina revelou EDEM1 imaturo não glicosilado (iEDEM1). mEDEM1, EDEM1 maduro.

S3 Fig

As células H4 foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 por 16 h, e a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio de MTT. As barras representam a média & # x000b1 SD de quatro experimentos independentes. NS, não significativo.

S4 Fig

Células normais de rim de rato (NRK) expressando de forma estável GFP-LC3 foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 por 16 h e analisadas por microscopia de fluorescência. As barras representam a média & # x000b1 SD do sinal fluorescente de GFP-LC3 em dez conjuntos de imagens. ***, P & # x0003c 0,001.

S5 Fig

As células H4 foram deixadas sem tratamento (pistas 1 e # x020135) ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 (pistas 6 e # x0201310) por 16 h, seguido por cicloheximida-chase com 150 & # x003bcg / ml de cicloheximida e 40 & # x003bcg / ml cloranfênico (CHX-chase) por 1 & # x020134 h na presença de 250 & # x003bcM IDN5706. Os extratos celulares foram submetidos à análise de Western blot com um anticorpo para LC3. LC3-I, LC3 não lipidado LC3-II, LC3 lipidado. Western blotting com anticorpo para & # x003b2-actina foi usado como controle de carga. A posição dos marcadores de massa molecular é indicada à esquerda.

S6 Fig

As células H4 de neuroglioma humano expressando de forma estável mRFP-EGFP-LC3 foram deixadas sem tratamento ou tratadas com EBSS por 2 h, Cloroquina 0,1 mM (CQ) por 2 h, ou 250 & # x003bcM IDN5706 por 8 h, e analisadas por microscopia de fluorescência. As barras representam a média & # x000b1 SD do sinal fluorescente somente mRFP-LC3 (mRFP + EGFP -) de dez conjuntos de imagens. NS, não significativo ***, P & # x0003c 0,001.

S7 Fig

As células H4 foram deixadas sem tratamento (faixa 1) ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 durante os períodos de tempo indicados (faixa 2 e # x020136). Os extratos celulares foram submetidos a análise de Western blot usando o anticorpo anti-cauda para a região citosólica C-terminal de APP. mAPP, APP maduro iAPP, APP imaturo. Western blotting com anticorpo para & # x003b2-actina foi usado como controle de carga. A posição dos marcadores de massa molecular é indicada à esquerda.

S8 Fig

As células H4 expressando de forma estável uma versão amiloidogênica de APP marcada para GFP e expressando de forma estável tanto shRNA de luciferase (shLuc de controle) ou shRNA de Atg5 (shAtg5), foram tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 por 8 h (A e C) ou deixadas sem tratamento ( B). As células foram fixadas e marcadas com um anticorpo monoclonal de camundongo para Calnexin, seguido por IgG de burro anti-camundongo conjugado com Alexa-594 (canal vermelho A-C). As células coradas foram analisadas por microscopia de fluorescência. As barras representam a média & # x000b1 SD de dez conjuntos de imagens de APP-GFP indicando a sobreposição entre APP e Calnexina (A) ou sinal fluorescente de GFP (B e C). ***, P & # x0003c 0,001 NS, não significativo.

S9 Fig

As células H4 que expressam de forma estável um shRNA de luciferase de controle (shLuc) ou um shRNA específico de EDEM1 (shEDEM1) foram deixadas sem tratamento (pistas 1 e 3) ou tratadas com 250 & # x003bcM IDN5706 por 8 h (pistas 2 e 4). Os extratos celulares foram submetidos à análise de Western blot com anticorpos específicos para LC3 e EDEM1. LC3-I, LC3 não lipidado LC3-II, LC3 lipidado mEDEM1, EDEM1 maduro. O asterisco indica uma banda detectada apenas em células H4. Western blotting com anticorpo para & # x003b2-actina foi usado como controle de carga. A posição dos marcadores de massa molecular é indicada à esquerda.


Introdução

Proteínas ancoradas na cauda (TA) são proteínas de membrana do tipo II que abrigam um único domínio transmembranar (TMD) perto de seus terminais C e, portanto, são equipadas com um domínio luminal curto característico. Os membros desta classe de proteínas transmembrana são encontrados no retículo endoplasmático (RE) e suas endomembranas relacionadas, a membrana mitocondrial externa, peroxissomos e em plantas também na membrana externa de plastídios (Borgese et al., 2003). Os métodos pelos quais as proteínas TA são corretamente direcionadas para o RE e a membrana mitocondrial externa, os principais locais de integração da membrana, têm atraído atenção significativa, uma vez que ficou claro que a importação pós-tradução dessas proteínas deve ocorrer por novas rotas (High e Abell, 2004 Steel et al., 2002 Yabal et al., 2003). Mecanismos que permitiriam a inserção de proteínas TA nas membranas alvo permanecem indefinidos e a questão se a inserção da membrana requer componentes de membrana proteica, como a partícula de reconhecimento de sinal (SRP) é atualmente disputada (Abell et al., 2004 Brambillasca et al. , 2005 Steel et al., 2002).

Os sinais de direcionamento das proteínas TA estão geralmente localizados dentro de seus terminais C e incluem o TMD. A partir de vários estudos que abordam o direcionamento diferencial de proteínas TA para mitocôndrias e ER, surgiu um conceito que explica a especificidade de direcionamento por meio de características físico-químicas gerais, em vez de características específicas de sequência do sinal de direcionamento. Isso inclui o comprimento e a hidrofobicidade do TMD e as cargas líquidas de seus resíduos de flanco. Um sinal de direcionamento mitocondrial, por exemplo, exibe um TMD bastante curto com apenas hidrofobicidade moderada e regiões de flanco que são carregadas positivamente (Beilharz et al., 2003 Borgese et al., 2003 Hwang et al., 2004 Rapaport, 2003). A inserção de uma âncora de cauda na membrana ER é pensada para ocorrer por padrão, ou seja, na ausência de um sinal de direcionamento mitocondrial (ou plastídeo) (Borgese et al., 2003), embora SRP possa apoiar a orientação de pelo menos algumas proteínas TA ( Abell et al., 2004). Uma série de proteínas TA são inicialmente direcionadas para o ER e subsequentemente classificadas para seu destino final dentro do sistema de endomembrana, como o Golgi ou o envelope nuclear, por meio de motivos adicionais que estão localizados em seu domínio citosólico (Beilharz et al., 2003). As proteínas TA destinadas à membrana peroxissômica também foram relatadas para usar um sistema bipartido de sinais de direcionamento, um sinal de direcionamento de ER para trazer a proteína para o ER e um sinal peroxissômico, que entrega a proteína do ER para o peroxissomo (Elgersma et al. , 1997 Mullen et al., 1999 Mullen e Trelease, 2000 Nito et al., 2001). Neste caso, no entanto, a própria âncora de cauda, ​​em vez do domínio citosólico, contém as informações de direcionamento específicas do peroxissoma.

Embora PEX3 (Hoepfner et al., 2005) e provavelmente algumas outras proteínas de membrana peroxissomal (PMPs) também tenham como primeiro alvo o ER (Geuze et al., 2003 Titorenko e Rachubinski, 1998), a maioria dos PMPs são provavelmente inseridos em peroxissomos diretamente do citosol (Lazarow e Fujiki, 1985). Este último processo é facilitado pela PEX19, uma proteína predominantemente citosólica que também é encontrada na membrana peroxissômica (Götte et al., 1998 Matsuzono et al., 1999). PEX19 interage com virtualmente todos os PMPs (Fransen et al., 2001 Sacksteder et al., 2000 Snyder et al., 2000) por meio de um motivo comum que está presente pelo menos uma vez (Halbach et al., 2005 Rottensteiner et al., 2004) . Essa interação, por um lado, evita que o PMP se agregue antes da inserção da membrana e, por outro lado, serve para guiar o PMP para a membrana peroxissômica (Jones et al., 2004 Shibata et al., 2004). Os locais de ligação de PEX19 são suficientes para o direcionamento peroxissomal, desde que um ou mais TMDs estejam adicionalmente presentes para ancorar o fragmento dentro da membrana (Rottensteiner et al., 2004). Um modo distinto de interação PEX19 se aplica a PEX3 (Fransen et al., 2005 Jones et al., 2004 Mayerhofer et al., 2002), consistente com a função proposta de PEX3 como o fator de docking para PEX19 na membrana peroxissômica (Jones et al., 2004 Muntau et al., 2003). Assim, o conhecimento atual sugere a presença de pelo menos duas vias de importação distintas para PMPs: uma dependente do PEX19 e outra que envolve o ER (Heiland e Erdmann, 2005).

O mamífero PEX26 pertence à classe das proteínas peroxissomais TA. Apesar da falta de similaridade de sequência, PEX26 pode representar o ortólogo funcional de Pex15p em que ambas as proteínas recrutam PEX6 para a membrana peroxissômica (Birschmann et al., 2003 Matsumoto et al., 2003a). Pacientes portadores de alelos de perda de função de PEX26 sofrem dos sintomas típicos atribuídos ao espectro de Zellweger. Em um nível molecular, a ausência de PEX26 causa um defeito de importação de proteínas da matriz peroxissômica do tipo II (Matsumoto et al., 2003b) e, em grande medida, também do tipo I (Weller et al., 2005).

Aqui, estudamos o direcionamento da proteína TA de mamífero PEX26 e analisamos se isso ocorre por meio da via dependente de PEX19. Nós mostramos que o domínio luminal de PEX26 continha um local de ligação de PEX19 típico que era capaz de direcionamento peroxissômico. Com base nessas observações, reexaminamos o direcionamento da levedura Pex15p e encontramos uma composição funcional semelhante de seu sinal de direcionamento. Discutimos nossos resultados em termos de classificação de proteína TA peroxissômica que é ativada por meio de um sítio de ligação de PEX19 C-terminal anexado e que não requer necessariamente um trânsito provisório através do ER.


Problema tipo I de colágeno bovino de Western blot - (30 / dez / 2010)

Estamos caracterizando o colágeno tipo I na maioria das vezes. Espero que aqui estejam alguns especialistas em colágeno.

OK, agora vou te contar meu problema:

Tenho uma dispersão de colágeno a 1% (em ácido acético 0,5M) e faço um L mmli SDS-PAGE com géis pré-moldados de SERVA.
Eu tomo géis neutros pH 7,4 e uso o tampão L mmli com 2-mercaptoetanol. Fervo as sondas por 5 minutos a 95 C. Depois disso, centrifugo e inicio o meu Gel. Até aqui funciona, mas não estou realmente satisfeito com meus resultados, muitas vezes obtenho uma grande banda de trímero a 300 kDa e as bandas alfa 1 e 2 em cerca de 120 kDa são muito fracas.


Então eu Blot meu Gel para Nitrocelulose e faço um corante controle com Ponceau S. Aqui eu vejo minhas bandas esperadas e muita mancha. Talvez outras proteínas do meu extrato bruto, (o colágeno não está 100% limpo, existem algumas proteínas desconhecidas nele)

Até aqui funcionou, poderia ser otimizado aber eu tenho pelo menos a proteína do meu interesse, mas aí o imunotransferência começa.

Aqui, usei um anticorpo policlonal de coelho anti-colágeno bovino I da AbD Serotec como primeiro e um IgG AP de galinha anti-coelho marcado como anticorpo secundário. E eu tenho fundo enorme, que não vem do segundo ab. (Eu testei sem primeiro)

Sei que um policlonal primário não é fácil de usar, também ofereci um anticorpo monoclonal colágeno I, mas achei que ficaria melhor com um bovino. Especialmente para uma validação posterior, seria bom se funcionasse com este.

Tentei várias coisas para otimizar, mas nada funciona,
Usei para Bloqueio 5% de leite em pó, 1 h em temperatura ambiente e sol de Bloqueio paralelo. da franqueza
Eu tornei minhas soluções de anticorpos normais em TBS-0,1% Tween 20 e 0,1% BSA e tentei versus Low cross buffer de Candor, mas não ajudou.

Detecto com NBT / BCIP.
Meu colágeno de controle da Sigma funciona bem, mas minha extração de colágeno está totalmente rosa. Portanto, presumo que o primeiro anticorpo se liga ao desconhecido e a outras proteínas de vaca.

Esqueci de dizer que ainda não experimentei uma Native Page. Aqui eu tenho um problema de borrão, mas este é outro assunto. Talvez o anticorpo funcione melhor lá, mas o AbD Serotec não tem informações sobre isso.

Posso experimentar PVDF ou incubar a 4 C, mas não tenho esperança de que algo mude.

Talvez outra pessoa tenha mais experiência nisso?

você está vendo o fundo geral ou apenas nas pistas?

se for um pano de fundo geral, pode ser necessário alterar o agente de bloqueio. com um anticorpo secundário de galinha, eu usaria 2-5% de soro de galinha normal (ncs) para bloquear a membrana. Eu também adicionaria 1-2% ncs às soluções de anticorpos em vez de 0,1% bsa (eu teria usado 1-2% bsa).

se o fundo estiver apenas nas faixas, o anticorpo primário também está captando fragmentos e isômeros do colágeno. o anticorpo também pode não ser tão específico quanto você deseja. você pode ter que tentar um anticorpo diferente.

Tenho apenas antecedentes nas pistas com colágeno bovino, a sonda de controle com colágeno de frango tipo II é negativa.

Acho que o primeiro anticorpo faz meu background, portanto, ofereço um primeiro anticorpo monoclonal e outro segundo anticorpo.

A dica com soro de frango é boa, talvez eu tente.

Oi,
Eu gostaria de ter o protocolo para SDS-PAGE de colágeno. Colágeno obtido pela dissolução do tendão com ácido acético. Não tenho certeza se o ácido acético impedirá a quantificação da proteína pelo ensaio BCA e por SDS-PAGE. Eu preciso dialisar o colágeno em qualquer outro solvente antes de executar o BCA Assay e SDS-PAGE? Obrigado


Mini kit de diálise, corte de 1 kDa

Os tubos descartáveis ​​do Mini Kit de Diálise oferecem uma solução simples para os problemas de manuseio da diálise de pequeno volume. Cada tubo de diálise no kit tem uma tampa que incorpora um pequeno disco de membrana de diálise

Selecione o modelo

Por favor, mude o país em seu perfil para mudar para outra loja de país.

Por que o volume da minha amostra aumentará após a diálise?

Quando você dialisa uma amostra, há uma tendência física para o volume aumentar, pois o buffer fora da membrana entra no tubo até que a pressão hidrostática interna seja igual à pressão externa. Este ganho de volume se aproxima de zero à medida que o tubo é preenchido com a amostra. Para pequenas amostras, o ganho de volume pode ser bastante significativo, em termos de porcentagem. Esta diluição é aceitável? Caso contrário, use um dos kits de limpeza, que precipita as proteínas, permitindo que elas sejam ressuspensas em qualquer volume que o usuário escolher.

Would dialyze overnight at room temperature cause degradation of my sample?

Would dialyze overnight at room temperature cause degradation of my sample?

It's always a possibility, but considering that most users will be rehydrating their IPG strips with sample overnight at room temperature anyway, this additional step shouldn't result in any additional degradation. Furthermore, the dialysis usually occurs against a strongly denaturing mixture (e.g., 8 M urea) which would denature proteases as well.

Still, if this is a concern, dialysis can be performed at 4 °C.

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

For 2-D electrophoresis, you are generally better off using the 8 kDa cut-off. The larger the cut-off, the faster and more complete the dialysis will be. There will be some loss of polypeptides below 8 kDa, but these smaller polypeptides don't show up in standard SDS-PAGE anyway.* Therefore, there will be no effect on the 2-D spot pattern if the 8 kDa cut-off is used rather than the 1 kDa cut-off.

*NOTE: Standard Laemmli SDS-PAGE (which uses Tris-Cl buffer in the gels and Tris-glycine running buffer) cannot resolve polypeptides of MW 14 kD and lower. These small proteins migrate at the dye front. To resolve such small polypeptides, a Tris-Tricine system is commonly employed [Schagger, H. and Von Jagow, G. (1987). Analytical Biochem. 166, 368].

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Yes, small ionic contaminants can be removed using the Mini Dialysis Kit. This product is designed for the dialysis of small sample volumes with minimal handling and sample loss, offering a simple solution to the handling problems of low-volume dialysis and reducing the pronounced streaking on 2-D gels caused by low-molecular-weight contaminants.

How long should I dialyze my sample?

How long should I dialyze my sample?

Because there is so much diversity among samples, it is difficult to give a definitive recommendation. However, overnight dialysis should be recommended to begin with.


Assista o vídeo: The principle of SDS PAGE-a full and clear explanation of the technique and how does it work (Janeiro 2022).