Em formação

Como escrever uma matriz estequiométrica para uma parte da via da Pentose Fosfato


talvez isso seja mais bioengenharia do que biologia, mas não encontrei tal grupo.

Então, tirei a seguinte foto:

E fui solicitado a fazer o seguinte para a rede dentro da área vermelha.
1) Escreva a matriz estequiométrica para a rede
2) Desenhe um mapa do caminho para a rede
3) Desenhe mapas de conectividade de metabólitos primários
4) Escreva as equações de balanço de massa para metabólitos primários

Eu sei que para o primeiro as colunas são as reações que ocorrem e as linhas são os "produtos químicos". As marcações nas colunas devem ser iguais aos números que estão escritos em cada reação? (como "3.1.1.31") Quase todas as reações podem ir em ambas as direções, há algo que diga qual produto químico deve ser negativo e qual deve obter positivo? Minha tentativa na matriz foi:

Quanto ao mapa do caminho, não é basicamente a foto dada?
E, finalmente, o que seria um "metabólito primário" neste caso?

Todas as ajudas e dicas muito bem apreciadas!


Esta não é uma pergunta de lição de casa muito bem escrita. Vou tentar dar algumas dicas com base em como o interpreto.

1) A matriz estequiométrica. Você tem exatamente a ideia certa. Eu escreveria as reações como nomes de enzimas ou nomes de genes em vez dos números EC (por exemplo, G6PD ou G6P desidrogenase em vez de 1.1.1.49). Para as reações reversíveis, não há razão a priori para escrevê-las em uma direção ou outra, mas a convenção seria tornar o consumo de glicose uma direção positiva. Eu não incluiria "glicólise" como uma reação separada. Eu também consideraria incluir cofatores e subprodutos nas moléculas afetadas pela reação (por exemplo, CO2, NADP +, NADPH, (talvez ADP, ATP, NAD +, NADH também se esses surgirem)).

2) Sim, é basicamente o que você já tem. Não é um diagrama particularmente bom, então você pode desenhá-lo de uma forma mais clara.

3) Não tenho ideia do que isso significa, mas talvez o próximo ponto ajude.

4) Metabólito primário não é um termo super bem definido, mas acho que, neste contexto, eu diria que da maneira como eles pretendem a questão, eles estão procurando por uma "reação de via total" que descreve as entradas e saídas do caminho.

Algo assim:

$$ X_1 G6P + X_2 NADP + implica X_3 GAP + X_4 FBP + X_5 CO_2 + X_6 NADPH $$ (G6P = Glicose-6-fosfato, GAP = Gliceraldeído-3-fosfato, FBP = Frutose-bis-fosfato)

Vou deixar para você descobrir o que são os Xs ou se deixei alguma coisa de fora (já que, afinal, é uma tarefa de casa).


Compreendendo as Causas e Implicações da Variação Metabólica Endotelial na Doença Cardiovascular por meio da Modelagem Metabólica em Escala de Genoma

O perfil bioquímico de alto rendimento levou à necessidade de técnicas avançadas de interpretação de dados, capazes de integrar a análise de genes, proteínas e perfis metabólicos para lançar luz sobre as relações entre genótipos e fenótipos. Aqui, consideramos o estado atual de conhecimento do metabolismo das células endoteliais (CE) e suas conexões com as doenças cardiovasculares (DCV) e exploramos o uso de modelos metabólicos em escala de genoma (GEMs) para integrar dados metabólicos e genômicos. Os GEMs combinam a expressão gênica e os dados metabólicos agindo como estruturas para sua análise e, em última análise, permitem uma compreensão mecanicista de como a variação genética afeta o metabolismo. Demonstramos como GEMs podem ser usados ​​para investigar variação genética relacionada a DCV, mecanismos de resistência a drogas e novas vias metabólicas em CEs. A aplicação de GEMs na medicina personalizada também é destaque. Particularmente, nos concentramos no potencial dos GEMs para identificar biomarcadores metabólicos de disfunção endotelial e para descobrir métodos de estratificação de tratamentos para DCVs com base em marcadores genéticos individuais. Avanços recentes na metodologia de biologia de sistemas e como essas metodologias podem ser aplicadas para entender o metabolismo da CE na saúde e na doença são, portanto, destacados.


Fundo

O frango de corte moderno (carne) é o produto de mais de 60 anos de seleção artificial para características comercialmente desejáveis, resultando em eficiência alimentar melhorada e rendimento de músculo do peito. Atualmente, os frangos atingem o peso de mercado ¾ no tempo que levava na década de 1950, mas pesam quase o dobro das raças dos anos 1950, com o músculo do peito representando um componente maior da massa total da ave [1]. Vários estudos compararam linhas modernas com linhas não selecionadas em termos de taxa de crescimento e eficiência alimentar [2, 3]. Em um estudo comparando o crescimento de uma linha de frangos de corte moderna (Ross 708) com uma linha legada de aves comerciais de uso geral não selecionadas desde 1950 (UIUC) ao longo das primeiras 5 semanas após a eclosão, o músculo do peito foi encontrado para compreender 18 e 9 % da massa corporal total, respectivamente [4]. Mudanças adicionais no padrão de crescimento se manifestam na alometria do fígado. Em ambas as linhas, a massa relativa do fígado atingiu um máximo semelhante de aproximadamente 3,8% da massa corporal e então começou a declinar. No entanto, esse pico ocorreu uma semana antes no frango moderno. Essa descoberta forneceu parte da base para este estudo, incluindo a seleção do fígado e as primeiras 3 semanas após a eclosão, pois foi hipotetizado que o início mais precoce desse pico surgiu devido à seleção para crescimento rápido e ao importante papel do fígado no metabolismo de nutrientes.

Os pintinhos passam por mudanças fisiológicas drásticas como consequência da eclosão. O embrião em desenvolvimento depende inteiramente dos nutrientes da gema [5,6,7]. Durante o desenvolvimento embrionário tardio, muito do lipídio da gema é absorvido e armazenado no fígado, predominantemente como ésteres de colesterol [8]. No dia 18 de incubação, 3 dias antes da eclosão, os lipídios constituem 10% da massa do fígado devido à absorção e armazenamento dos nutrientes da gema [9]. Este lipídio armazenado, junto com o resto da gema, fornece ao pintinho nutrientes após a eclosão, mas no dia 5 após a eclosão 90% do lipídio da gema foi absorvido [10]. Os pintinhos recebem uma dieta rica em carboidratos no nascimento porque o jejum durante este período retarda o potencial de crescimento muscular inicial dos pintinhos [11]. Essas mudanças iniciais na fonte de nutrientes, juntamente com o crescimento rápido, significam que a manutenção da homeorese metabólica é um grande desafio que o fígado enfrenta nas primeiras semanas após o nascimento.

As análises de transcriptoma de alto rendimento fornecem instantâneos de RNAs transcritos a qualquer momento e são úteis para identificar genes regulados diferencialmente entre condições ou pontos de tempo. Combinar a transcriptômica com a metabolômica não direcionada é um meio poderoso para inferir hipóteses sobre as interações entre o transcriptoma e o metaboloma. Por exemplo, a integração desses dois métodos de alto rendimento identificou vias metabólicas e de sinalização que respondem ao estresse térmico no fígado de frangos de corte modernos [12]. Estudos anteriores descreveram o transcriptoma hepático do frango moderno [13,14,15,16]. Um estudo comparou o transcriptoma hepático em seis pontos de tempo durante a transição do embrião para o nascimento, de embriões de 16 dias a pintinhos de 9 dias [17]. Eles identificaram muitas vias metabólicas consistentes com a transição da fonte de nutrientes que os pintinhos sofrem na primeira semana após a eclosão, especialmente algumas que afetam o metabolismo lipídico. Outro estudo recente examinou alterações no transcriptoma hepático resultantes de jejum e realimentação pós-nascimento imediatos, identificando genes regulados pelo fator de transcrição lipogênico THRSPA e alternando entre os estados lipolítico e lipogênico [18].

Não houve estudos integrados de alto rendimento do fígado de frangos de corte modernos em condições normais nas primeiras 3 semanas críticas após a eclosão. Portanto, as mudanças moleculares que estão ocorrendo durante este período de tempo - os impulsionadores metabólicos do rápido crescimento muscular e da eficiência alimentar - são mal compreendidas. Explorá-los de forma orientada por dados pode elucidar novos conhecimentos sobre as funções do fígado durante o crescimento pós-nascimento do pintinho e também como o próprio fígado está se desenvolvendo. Neste trabalho, integrando o transcriptoma hepático e o metaboloma, comparamos as principais vias metabólicas do fígado em dois momentos: Dia 4 (D4) e Dia 20 (D20) pós-eclosão. Eles foram selecionados para capturar a reprogramação metabólica necessária para apoiar a transição da dependência da gema armazenada para a ração consumida por via oral que fundamenta a taxa de crescimento e o fenótipo dos frangos de corte modernos.


Resultados e discussão

Comparamos nosso algoritmo FIA com o amplamente utilizado software MFA 13CFLUX [17], que se baseia na abordagem de cumômero, e com o software Open-FLUX [15] mais recente, que é baseado na abordagem EMU [14]. A fim de comparar os métodos, conduzimos estimativas de fluxo para várias vias metabólicas bem estudadas. Nosso primeiro exemplo é baseado no tutorial que Wiechert et al. fornecer com seu software 13CFLUX: o Embden-Meyerhof e Fosfato Pentose vias metabólicas de Escherichia coli[17]. Este exemplo compara o tempo de execução e a robustez de ambos os algoritmos em resposta ao ruído de entrada. Nosso segundo exemplo compara os resultados e o desempenho de FIA ​​tanto para um método ad hoc quanto para o algoritmo OpenFLUX para a análise da produção de lisina por C. glutamicum, conforme descrito por Becker et al. [18] e Quek et al. [15].

Comparação FIA vs. 13CFLUX: Vias de Embden-Meyerhof e Pentose Fosfato

Nesta seção, examinamos uma rede que representa o Embden-Meyerhof e Fosfato Pentose caminhos de E. coli, que se baseia no tutorial fornecido por Wiechert et al. como parte de seu pacote de software 13CFLUX. Uma vez que nossa implementação FIA suporta nativamente arquivos de entrada 13CFLUX (ou seja, arquivos "FTBL"), os mesmos arquivos de entrada podem ser usados ​​para ambos os algoritmos. (Observe, no entanto, que a FIA não requer a definição de fluxos livres nem valores iniciais e, portanto, estes são simplesmente ignorados quando importados). A Figura 1 mostra a rede simples usada junto com a nomenclatura usada em publicações anteriores. Além da estrutura de rede, os modelos são fornecidos com medições de fluxo e isotópicas, conforme mostrado na Tabela 1.

E.Coli EMP e vias metabólicas PPP. o Embden-Meyerhof e Fosfato Pentose vias metabólicas de Escherichia coli.

Primeiro, examinamos a saída dos dois algoritmos para o arquivo de entrada "silencioso" tradicional. Para executar a análise, 13CFLUX requer que o usuário defina um conjunto de "fluxos livres" junto com seus valores iniciais associados [7]. Observe que uma má escolha de fluxos livres ou seus valores associados pode resultar em desempenho algorítmico pobre (tanto em tempo de computação quanto em precisão). Na verdade, sob várias suposições iniciais, o algoritmo não convergiu de todo. Quanto à FIA, nenhum dos itens acima é necessário. Uma vez que a rede juntamente com as medidas fornecidas estão bem definidas, no caso sem ruído os dois algoritmos retornaram valores semelhantes para fluxos unidirecionais, como pode ser visto na Tabela 2. Alguns ligeiros desacordos foram observados para os fluxos bidirecionais, que são mais pobres identificado.

Em seguida, comparamos as sensibilidades dos algoritmos ao ruído. Em uma série de 10 experimentos, o ruído gaussiano branco foi adicionado a todos os valores de isotopômeros medidos, e as saídas e tempos de computação para ambos os algoritmos foram registrados. Como pode ser visto na Figura 2, os fluxos unidirecionais permanecem bastante constantes e dificilmente sofrem com o erro experimental adicionado (para ambos os algoritmos). No entanto, os fluxos bidirecionais são afetados pelo ruído adicionado. 13CFLUX sofre de uma dispersão de variância maior dos valores estimados do que FIA ​​(portanto, é mais sensível ao ruído de medição adicionado). Observe que a diferença surge não apenas pelo modelo matemático utilizado, mas também pelas propriedades de estabilidade do método de otimização escolhido.

Valores de fluxos medidos. Fluxos bidirecionais calculados usando FIA e 13CFLUX para conjunto de medição com ruído.

Em seguida, examinamos o desempenho computacional dos dois métodos. A Tabela 3 mostra o tempo de execução do algoritmo para convergência (em segundos). O tempo médio de execução para 13CFLUX foi de 133 segundos, enquanto para FIA este tempo foi de 7 segundos. A proporção do tempo de execução (13CFLUX / FIA) para experimentos individuais variou entre × 9 a × 75.

Comparação FIA vs. OpenFLUX: Produção de Lisina por C. glutamicum

Nesta seção, examinamos a análise do metabolismo central de duas cepas superprodutoras de lisina de Corynebacterium glutamicum: ATCC 13032 (lysC fbr) e seu PEFTUmutante fbp. Ambos expressam isoformas resistentes a feedback da enzima aspartoquinase lysC, enquanto o último é adicionalmente projetado para superexpressar a enzima glicolítica frutose-1,6-bisfosfatase. O exemplo é baseado nas medições fornecidas por Becker et al. [18], que implementou um programa ad-hoc para estimar os valores de vários fluxos metabólicos. Em seu artigo mais recente apresentando o pacote de software OpenFLUX [15], Quek et al. optou por comparar seus resultados aos de Becker et al. Portanto, expandiremos sua comparação usando nossa implementação FIA. O arquivo de entrada para FIA foi construído usando as medidas e a estrutura do caminho fornecidas em [18] e [15]. Conforme descrito em [15], as frações de isotopômeros de massa publicadas foram modificadas para interferência de massa de isótopos de estrutura não-carbono usando a fórmula molecular dos fragmentos de aminoácidos. A FIA suporta a geração automática da matriz de correção de isótopos de ocorrência natural quando as fórmulas moleculares medidas são fornecidas. Isso ajusta o vetor de fluxômeros medido que aparece na função objetivo durante o processo de otimização. Se necessário, é possível não usar esse recurso, mas fornecer diretamente ao algoritmo os valores de medição corrigidos.

Ao comparar os tempos de execução de FIA ​​com OpenFLUX, as diferentes abordagens algorítmicas dos dois devem ser mantidas em mente. Enquanto o OpenFLUX requer que o usuário forneça conjuntos de fluxos livres, o FIA não requer fluxos livres nem valores iniciais. O Open-FLUX avalia rapidamente dezenas de ciclos de otimização diferentes com valores iniciais aleatórios e busca o melhor resultado de ajuste entre eles, enquanto o FIA usa apenas uma única (mais longa) execução. Assim, a probabilidade de convergência do OpenFLUX depende do número de tentativas e valores aleatórios gerados durante sua operação, enquanto os resultados do FIA não dependem de nenhum valor aleatório. Além disso, em sua análise, os algoritmos baseados em EMU avaliam apenas os fluxos necessários para a comparação das medições e, portanto, seu tempo de execução depende da estrutura da rede metabólica e da quantidade e localização das medições fornecidas. A FIA, por outro lado, pode fornecer todo o conjunto de fluxos metabólicos a qualquer momento, sem necessidade de computação adicional (que depende principalmente da estrutura da rede).

Fluxos medidos como constantes

Primeiro, rodamos exatamente a mesma simulação que Quek et al. realizada em seu artigo. Eles fornecem valores muito precisos (erro médio da ordem de 0,15 mol%) para as medições do rótulo e usam os fluxos medidos dados como se fossem medições silenciosas (portanto, como constantes). Começamos comparando o tempo de simulação para este caso simples. De acordo com [15] e validado por nós usando nosso computador, o OpenFLUX exigiu 50 iterações de cerca de 16 segundos cada para encontrar um ponto mínimo decente, portanto, cerca de 800 segundos no total. Enquanto isso, a análise FIA ​​levou 60 segundos para análise inicial e criação de matrizes, e 300 segundos adicionais para convergência, portanto 360 segundos como um todo. Em relação aos resultados da simulação, como se pode observar na Tabela 4 e na Tabela 5, os fluxos são muito próximos aos calculados anteriormente, sendo que os fluxos estimados que o FIA retornou tiveram o menor valor residual em relação aos demais métodos.

Fluxos medidos como medições

Também podemos executar a mesma otimização, mas ponderar as medições de fluxo fornecidas por suas variações. Ao executar essa otimização usando OpenFLUX (novamente usando 50 iterações), a quantidade de tempo aumentou muito e terminou em cerca de 48 minutos. Já para a FIA, o tempo de execução foi o mesmo de antes, ou seja, cerca de 6 minutos. Comparando os resultados dos algoritmos, o OpenFLUX sofreu de graves problemas de convergência. A maioria de suas iterações terminou sem convergir em absoluto, enquanto aquelas que convergiram produziram resultados inúteis, longe das medições. A FIA, por outro lado, conseguiu convergir para todos os cenários. Para a via de produção de lisina do tipo selvagem, os resultados foram muito próximos aos anteriores (uma vez que os fluxos e as medições foram bastante precisos). Para o exemplo do mutante, que era menos preciso, uma redução do valor residual foi alcançada por pequenas mudanças nos fluxos medidos. fluxos e valores residuais podem ser examinados na Tabela 4 e Tabela 5.

Usando medições de MS não normalizadas

Agora mostramos que o FIA pode facilmente usar medições incompletas ou não normalizadas examinando seu desempenho no exemplo acima. As medições de MS fornecidas foram normalizadas para o n +1 átomos de carbono da estrutura principal dos metabólitos medidos. Em vez de usar os dados normalizados fornecidos, multiplicamos cada conjunto de medições de metabólitos por um número constante aleatório. Ao fazer isso, simulamos o caso em que apenas os primeiros 3 (2 para GLY) picos de MS foram medidos e não haviam sido normalizados. Os valores de medição não normalizados originais e fornecidos podem ser encontrados na Tabela 4. Observe que os valores foram corrigidos pelas fórmulas moleculares dos fragmentos medidos (novamente, pode ser executado automaticamente por FIA). Na ausência de dados normalizados, a FIA forneceu fluxos estimados muito próximos aos casos anteriores, com valores residuais muito baixos, como pode ser visto na Tabela 5. O tempo de execução do algoritmo não foi afetado pela mudança.


Aplicação de uma estratégia de controle de oxigênio dissolvido para aumentar a expressão de Streptococcus suis glutamato desidrogenase em Escherichia coli

O acúmulo de acetato em Escherichia coli inibe o crescimento celular e a síntese proteica desejada, e a densidade celular e a expressão proteica são aumentadas pela redução da excreção de acetato. O oxigênio dissolvido (OD) é um parâmetro importante para a síntese de acetato, e o acúmulo de acetato é inversamente correlacionado ao nível de OD.Neste estudo, o efeito dos níveis de DO na expressão da glutamato desidrogenase (GDH) foi investigado e, em seguida, diferentes estratégias de controle de DO foram testadas para efeitos na expressão de GDH. A estratégia de controle de DO IV (50% 0–9 h, 30% 9–18 h) forneceu a maior densidade celular (15,43 g / L) e concentração de GDH (3,42 g / L), valores 1,59 e 1,99 vezes maiores do que aqueles alcançado em 10% DO. O acúmulo de acetato foi de 2,24 g / L com a estratégia de controle de OD IV, uma diminuição de 40,74% em relação ao obtido para o crescimento a 10% de OD. Além disso, sob a estratégia de controle de OD IV, houve menor expressão de PoxB, uma enzima chave para a síntese de acetato, tanto no nível transcricional quanto translacional. Ao mesmo tempo, níveis mais elevados de transcrição e expressão de proteína foram observados para um gene shunt de glioxilato (ásA), um gene de absorção de acetato (acs), genes da gluconeogênese e das vias anapleróticas (pckUMA, ppsUMA, ppc, e sfcA), e um gene do ciclo TCA (gltUMA). O fluxo de acetato com a estratégia IV de DO foi de 8,4%, uma diminuição de 62,33% em comparação com o fluxo a 10% de DO. Esta diminuição representa tanto um fluxo mais baixo para a síntese de acetato quanto um fluxo aumentado de acetato reutilizado.

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Métodos

Compostos químicos e reações

Criamos uma lista de compostos químicos com 2, 3 ou 4 átomos de carbono, gerando todas as combinações lineares possíveis dos 20 'blocos de construção' mostrados na Tabela Suplementar 2. Cada um dos blocos de construção era composto de um único átomo de carbono com oxigênio associado, grupos hidroxila, hidrogênio, fosfato e / ou amino. Os blocos de construção foram conectados em cadeias lineares por ligações simples ou duplas. Esse procedimento gerou 1.966 moléculas lineares, das quais 1.477 são eletrostaticamente carregadas em solução, ou seja, contendo pelo menos um grupo carboxila ou fosfato. Essas 1.477 moléculas são nossos metabólitos internos. Em seguida, para cada par possível de moléculas desta lista, verificamos sistematicamente se as reações da Tabela 1 (ver Tabela Suplementar 3 também para detalhes) poderiam transformar uma molécula em outra, permitindo todos os acoplamentos possíveis com os metabólitos externos. Dessa forma, foi gerada uma rede de 7.940 reações.

Energias livres de compostos e reações

Para aqueles metabólitos internos que são espécies bioquímicas conhecidas, energias livres padrão de formação ΔfG foram retirados da literatura 24. Para outros metabólitos internos, para os quais esses dados não existem, empregamos uma variante do método de contribuição de grupo 25,26,27,28 que explica o fato de que as moléculas existem em solução como uma mistura de equilíbrio de diferentes espécies iônicas. Para cada uma dessas moléculas g1g2gn, composto de blocos de construção <geu>, calculamos ΔfG usando

Onde E0 é uma constante, E1(gj) é a contribuição do grupo gj e E2(gj,gk) é uma pequena correção devido às interações grupo-grupo vizinho. Os valores de E0, o vetor E1 e matriz E2 são determinados realizando um ajuste de mínimos quadrados a um conjunto de treinamento de moléculas com ΔfGs que correspondem mais de perto às moléculas CHOPN lineares de nossa rede (consulte Métodos Suplementares para obter detalhes).

Cálculo de fluxo

Usamos o método mencionado na ref. 7 para calcular o fluxo transportado por uma via linear. Este método assume que o fluxo através da reação eu é dado por 7,30

Onde kd é a constante de taxa de difusão controlada, [Eeu] é a concentração da enzima, [Seu−1] e [Seu] representam as concentrações de substrato e produto e qeu é a constante termodinâmica. Esta expressão assume que a enzima atua como um catalisador perfeito e é usada para derivar uma expressão para o fluxo da via e as concentrações de metabólitos (consulte os Métodos Suplementares para obter detalhes). Em seguida, usamos o método de Powell 42 para encontrar o conjunto de concentrações de enzima que maximizam o fluxo sujeito às restrições de que (i) todas as concentrações intermediárias em estado estacionário estão dentro da faixa prescrita e (ii) a concentração total de enzima é fixa. Também repetimos nossa análise usando a cinética reversível de Michaelis-Menten, consulte Métodos Suplementares para detalhes de cálculo.

Amostragem do espaço de parâmetro

Selecionamos aleatoriamente 10.000 pontos do espaço de parâmetro correspondente às concentrações de 11 metabólitos externos e as concentrações de G3P e piruvato. Cada parâmetro foi amostrado logaritmicamente ao longo de uma faixa cobrindo várias ordens de magnitude acima e abaixo de suas concentrações fisiológicas típicas (ver Tabela Suplementar 4 para detalhes). Para cada um desses pontos, calculamos o fluxo otimizado Jeu de cada caminho candidato, conforme detalhado acima, e calculou o CF do caminho eu como CFeu=Jeu/ max <Jk>, dividindo seu fluxo pelo fluxo mais alto obtido em todas as vias em um determinado ponto no espaço de parâmetros.

Robustez de nossos resultados para pequenas mudanças de energia livre

Usando o método de contribuição de grupo, o erro típico em nosso cálculo da energia livre da formação ΔfG para uma dada molécula é alguns kJ mol −1 (veja Métodos Suplementares para detalhes). Para verificar a robustez dos nossos resultados a tais erros, toda a nossa análise foi repetida usando ΔfG valores calculados usando diferentes conjuntos de moléculas de treinamento, consistindo em 80% das moléculas do conjunto de treinamento original, escolhidas aleatoriamente. Os resultados qualitativos usando tais redes foram idênticos aos obtidos com o conjunto completo de compostos de treinamento. Por exemplo, as 25 principais vias glicolíticas obtidas a partir do conjunto reduzido continham 23 das 25 vias da análise original.


Como escrever uma matriz estequiométrica para uma parte da via da Pentose Fosfato - Biologia

Milho Milho, arroz, sorgo, cana-de-açúcar Arroz Arroz

Saha et al. (2011) de Oliveira Dal’Molin et al. (2010b) Poolman et al. (2013) Lakshmanan et al. (2013)

Minimize o fl uxo total Minimize a absorção da taxa de biomassa (fóton para fotossíntese / fotorrespiração e sacarose para o metabolismo heterotrófico) Minimize o ajuste metabólico (MOMA) 25 combinações de cinco funções objetivas, incluindo a minimização do fl uxo geral, maximização da biomassa, minimização do consumo de glicose, maximização de Produção de ATP e maximização da produção de NADPH Minimize o fl uxo total Maximize o crescimento (otimização linear) Minimize o fl uxo geral (otimização quadrática) Minimize a absorção de carbono (otimização linear) Minimize o fl uxo geral (otimização quadrática) Equilíbrio de fluxo: minimize as capturas de substrato e luz Variabilidade de fluxo: minimizar e maximizar cada reação enquanto a função objetivo é fixada A produção real de biomassa com base nas medições da literatura Maximize o fl uxo da reação de biomassa Igual ao AraGEM Minimize o fl uxo total Equilíbrio de fluxo: maximize a produção de biomassa Variabilidade de fluxo: minimize e maximize cada reação enquanto a função objetivo é fi

Portanto, uma descrição realista dos múltiplos comportamentos das células provavelmente exigirá funções objetivas múltiplas e mais complexas (Collakova et al., 2012). Outro obstáculo é o conhecimento insuficiente atual sobre as restrições que afetam todas as espécies e todas as condições ambientais (Allen et al., 2009). Uma gama de funções de objetivo diferentes pode ser usada no FBA, incluindo maximizar o rendimento de ATP por fluxo unitário, minimizar o uso de energia, minimizar a absorção de substrato (no efluxo de biomassa fixa), minimizar as etapas de reação ou fluxo total e maximizar o rendimento de biomassa por fluxo total. No entanto, nenhuma dessas funções objetivo são consistentemente bem-sucedidas na previsão das taxas de crescimento (Chen e Shachar-Hill, 2012). Na modelagem FBA de planta, a restrição mais popular é o requisito de sintetizar biomassa em proporções apropriadas e a uma determinada taxa. A função objetivo é geralmente baseada na minimização dos fl uxos de reação totais na rede ou na maximização da eficiência de conversão de carbono (Tabela 3). Um problema que surge aqui é que a síntese de biomassa líquida consome uma pequena proporção do orçamento total de energia. Portanto, quando o FBA é restringido apenas pela síntese de biomassa, os fl uxos através das vias de transformação de energia são muito negligenciados (Sweetlove et al., 2013). Portanto, devido à grande demanda energética devido aos custos de transporte e manutenção das células, a restrição de biomassa por si só não é suficiente para prever fluxos realistas no metabolismo heterotrófico central das células vegetais (Cheung et al., 2013). Assim, quando Cheung et al. (2013) estudaram o efeito de diferentes restrições e funções objetivo sobre a precisão da previsão de fluxo por um modelo FBA de células heterotróficas de Arabidopsis em cultura, eles descobriram que contabilizam os custos de energia (transporte

e custos de manutenção) no sistema de rede sejam mais importantes do que a escolha da função objetivo. A este respeito, eles desenvolveram um método para contabilizar os custos de ATP e redutor da manutenção das células com base na razão de fl uxo medida entre as etapas oxidativas da via da pentose fosfato oxidativa (OPPP) e da glicólise. Outro problema é que, embora o FBA seja restrito apenas pela síntese de biomassa, o fl uxo por meio do OPPP está ausente na grande maioria dos modelos FBA de plantas. Considerando que esses modelos são responsáveis ​​pela síntese de biomassa em quantidades suficientes, isso ilustra que o algoritmo de otimização escolhe outras enzimas desidrogenases para satisfazer a demanda NADPH do metabolismo (Sweetlove et al., 2013). Cheung et al. (2013) mostram que a presença de ciclos de transidrogenase termodinamicamente implausíveis nos modelos também pode levar à ausência de um fluxo de OPPP previsto. Limitar esses ciclos a zero leva imediatamente a fluxos OPPP diferentes de zero. Ainda assim, há estudos que mostram que o FBA, em sua forma padrão atual, tem sido muito eficaz na previsão de fluxos metabólicos em plantas. Por exemplo, foi demonstrado que o FBA pode prever a evolução líquida de CO2 em uma variedade de tecidos vegetais e em resposta ao ambiente (Sweetlove et al., 2013). Mais interessante, ao aplicar um conjunto de restrições apropriadas, a estrutura FBA foi usada para estabelecer um modelo mais representativo do metabolismo da folha, resolvendo as duas fases dos ciclos fotossintéticos diurnos e noturnos como um único problema de otimização (um modelo de equilíbrio de fluxo dielétrico). Aplicar apenas mudanças mínimas às restrições deste modelo permitiu capturar com precisão o CAM ao longo de um ciclo diário (Cheung et al., 2014). Outros estudos também mostraram que o FBA tem a capacidade de estabelecer uma condição específica

Biologia de Sistemas e Metabolismo

modelo metabólico que é preditivo sob diferentes condições ambientais (Williams et al., 2010 Cheung et al., 2013 Poolman et al., 2013). A extensão em que o FBA pode prever com sucesso os fluxos das redes no metabolismo da planta é surpreendente, pois este método não faz referência à cinética ou regulação enzimática. Isso implica que a regulação enzimática (ou seja, a regulação alostérica e as modi fi cações pós-tradução) atua de maneira a manter o estado metabólico estável, em vez de ser o principal impulsionador da distribuição do fl uxo pela rede. Em vez disso, parece que as demandas de produção são os principais impulsionadores da distribuição do fl uxo no metabolismo central (Sweetlove et al., 2014). No entanto, esforços contínuos têm sido empreendidos para melhorar os aspectos técnicos e práticos da planta FBA. Até agora, os modelos FBA de plantas foram baseados principalmente em dados calculados em diferentes tipos de células (Sweetlove e Ratcliffe, 2011). Dado que muitas funções metabólicas de plantas são baseadas em interações entre diferentes compartimentos subcelulares, células, tecidos e órgãos, a reconstrução de modelos FBA em nível de tipo de célula, tecido específico ou mesmo órgão específico é um pré-requisito para seu uso em processos metabólicos engenharia (Grafahrend-Belau et al., 2013). Uma mudança clara nesta área ocorreu com um número crescente de tecido específico (de Oliveira Dal'Molin et al., 2010b Hay e Schwender, 2011a, 2011b Lakshmanan et al., 2013) e órgão específico (Mintz-Oron et al., 2012) modelos FBA ou um modelo em escala de planta inteira (Grafahrend-Belau et al., 2013). Uma questão chave que pode surgir no uso de modelos baseados em restrições é a existência de soluções ótimas alternativas nas quais a mesma função objetivo pode ser alcançada por meio de diferentes distribuições de fluxo. A análise da variabilidade do fluxo (FVA) é uma estratégia eficiente para calcular a variabilidade do fluxo que pode existir para atingir os objetivos ideais e subótimos (Tomar e De, 2013) e tem sido usada para explorar as capacidades metabólicas do metabolismo do óleo em um modelo de desenvolvimento de B. napus embriões (Hay e Schwender, 2011a). O FVA também foi aplicado para entender como o oxigênio influencia as distribuições de fluxo interno em um modelo de arroz, representando dois tipos de tecido: sementes em germinação e folhas fotorrespirantes (Lakshmanan et al., 2013). Cheung et al. (2014) também aplicou FVA para determinar o intervalo viável de todos os fl uxos, a fim de comparar as previsões de uma estrutura de modelagem diel com os fl uxos previstos em um modelo de luz constante. Modelos metabólicos em escala de genoma Na última década, a modelagem metabólica em escala de genoma forneceu insights únicos sobre o metabolismo de microrganismos procarióticos (Toya e Shimizu, 2013 Xu et al., 2013a). Modelos em escala de genoma de procariotos podem ser analisados ​​com uma ampla gama de ferramentas e algoritmos baseados em otimização para design racional em estudos de engenharia metabólica. Três das ferramentas mais populares são OptKnock, OptORF e OptFlux, que são usadas para simular a regulação simultânea para cima ou para baixo (ou nocaute) de vários genes (Lee et al., 2011 Tomar e De, 2013). Ainda assim, em plantas, a aplicação de modelagem metabólica em escala de genoma é bastante nova, e foi somente em 2009 que o primeiro modelo em escala de genoma para cultura em suspensão de células de Arabidopsis (Poolman et al., 2009) se tornou disponível. Desde então, a modelagem metabólica em escala genômica tem sido aplicada ao estudo do metabolismo central de várias plantas C4 (de Oliveira Dal’Molin

et al., 2010b Saha et al., 2011), Arabidopsis (de Oliveira Dal’Molin et al., 2010a Mintz-Oron et al., 2012) e arroz (Poolman et al., 2013). Em geral, esses modelos metabólicos em escala de genoma vegetal provaram ser funcionais, robustos e precisos na previsão de mudanças qualitativas em aspectos selecionados do metabolismo central do carbono (Collakova et al., 2012 de Oliveira Dal’Molin e Nielsen, 2013). No entanto, no contexto da engenharia metabólica, existem algumas preocupações quando se trata de comparar a aplicação de modelos metabólicos à escala do genoma a plantas e microrganismos, pois, ao contrário dos microrganismos, as plantas geralmente não são cultivadas sob um regime ambiental altamente controlado. De um modo geral, estender os resultados da análise de fl uxo de rede de microorganismos para estudos de engenharia metabólica de plantas exigirá algum cuidado (Stitt et al., 2010). Nesse sentido, Shachar-Hill (2013) forneceu um estudo ilustrativo usando o caso da produção de lisina, que é um alvo da engenharia metabólica comum a plantas e micróbios. Métodos de modelagem matemática têm sido usados ​​com sucesso para melhorar a produção de lisina em sistemas de fermentação bacteriana de Corynebacterium glutamicum. Essas ferramentas ajudaram a identificar possíveis gargalos metabólicos e mudanças significativas, levando a um aumento significativo na produção de lisina. No entanto, quando a mesma abordagem foi aplicada ao endosperma de milho, a conclusão geral foi que tais limitações podem não existir (Shachar-Hill, 2013). Outra preocupação é que, embora os modelos metabólicos à escala do genoma possam ter sido validados para aspectos selecionados do metabolismo central, eles geralmente não se estendem ao metabolismo secundário (Collakova et al., 2012). Uma exceção a isso pode ser encontrada em um modelo de Arabidopsis, que inclui alguns aspectos do metabolismo secundário (Mintz-Oron et al., 2012). Outros desafios enfrentados pelos modelos metabólicos da genomescala das plantas incluem a incerteza sobre a localização subcelular das reações e a anotação incompleta dos genomas das plantas (Sweetlove e Fernie, 2013). Abordagens foram sugeridas para lidar com esses desafios, como a aplicação de software de previsão de localização subcelular para compartimentar reações metabólicas e genômica comparativa para anotar conteúdo genômico não descoberto (Seaver et al., 2012 Lakshmanan et al., 2013). A integração de modelagem em escala de genoma e conjuntos de dados de transcriptômica ou proteômica é outra abordagem que pode ser usada para ampliar a compreensão do comportamento metabólico complexo das plantas (Töpfer et al., 2012, 2013). Uma abordagem integrativa foi usada para prever a resposta metabólica de Arabidopsis às mudanças nas condições, e descobriu-se que a inclusão dos dados transcriptômicos melhorou as previsões, embora os níveis de transcrição não se relacionem diretamente com os fl uxos (Töpfer et al., 2013). Uma análise mais aprofundada mostrou que esta abordagem pode preencher a lacuna entre os métodos centrados no fl uxo e nos metabólitos (Töpfer et al., 2014). Em geral, o fato de que os modelos à escala do genoma da planta dependem da análise baseada em restrições os torna particularmente adequados para definir os limites externos do comportamento de um sistema, em vez de fazer previsões precisas. Uma progressão ideal seria construir um modelo cinético à escala do genoma de uma rede metabólica, embora se possa esperar que a determinação dos parâmetros cinéticos seja difícil, talvez até ao ponto em que se torne muito complexo para cálculo. Uma primeira tentativa de construir um modelo cinético parametrizado em escala de genoma do metabolismo da levedura

foi descrito por Smallbone et al. (2010). No entanto, esta abordagem ainda requer amplo desenvolvimento antes que possa ser aplicada a sistemas eucarióticos superiores. Dada a aceleração no sequenciamento de diversos genomas de plantas e o crescente interesse em modelos metabólicos em escala de genoma como uma ferramenta para examinar redes metabólicas de plantas, há todos os motivos para esperar que, com mais melhorias nos dados disponíveis e, consequentemente, mais refinamento dos modelos, seus a aplicação dará uma contribuição importante para a engenharia metabólica da planta. MFA Apesar do fato de que as técnicas de MFA em estado estacionário abordaram questões importantes, incluindo o papel da Rubisco no desenvolvimento de sementes e na regulação do metabolismo das sementes oleaginosas (Kruger et al., 2012), sua aplicação a organismos superiores (como plantas e sistemas de mamíferos ) enfrenta desafios, como formulações de mídia complexas, compartimentação subcelular e dinâmica de marcação lenta (Allen et al., 2009).A principal aplicação de MFA até agora tem sido em células ou tecidos isolados, onde normalmente 50 a 100 reações são monitoradas (Allen et al., 2009). Dificuldades técnicas em estender a análise para redes de plantas têm incentivado o desenvolvimento de técnicas alternativas (Sweetlove e Ratcliffe, 2011), como as combinações MFA / EMA (Schwender et al., 2004) e MFA / FVA, que foram aplicadas ao estudo desenvolvimento de embriões de B. napus (Hay e Schwender, 2011a, 2011b). Além disso, para evitar o longo período de tempo que o MFA requer para atingir o estado estacionário isotópico, foi desenvolvida a técnica de MFA isotopicamente não estacionário (INST-MFA). O INST-MFA analisa os padrões de marcação de metabólitos obtidos durante o período de marcação transiente antes do estado estacionário isotópico. Esta técnica foi aplicada com sucesso em estudos de células humanas (Murphy et al., 2013) e também foi usada para estudar a fotossíntese (Young et al., 2011 Szecowka et al., 2013). O MFA em estado estacionário é inaplicável a tecidos fotoautotróficos porque a marcação com 13CO2 leva à marcação uniforme de todos os metabólitos no estado estacionário (Roscher et al., 2000). Portanto, embora o MFA em estado estacionário seja uma técnica bem estabelecida para estudar tecidos vegetais heterotróficos e mixotróficos, não pode ser usado para estudar a fotossíntese. Além disso, alcançar um estado estacionário isotópico nas folhas é, em qualquer caso, improvável devido às complicações introduzidas pelo ciclo de escuridão e a lenta rotação de pools de metabólitos (Sweetlove et al., 2013). Para resolver esse problema, Young et al. (2011) aplicaram a técnica INST-MFA à cianobactéria Synechocystis. Eles obtiveram um mapa de fluxo abrangente para todas as reações do ciclo de Calvin-Benson e algumas reações colaterais, incluindo aquelas catalisadas por Glc-6-fosfato desidrogenase, enzima málica e a via fotorrespiratória. Nesta análise, os tamanhos do pool metabólico foram ajustados como parâmetros livres, enquanto na aplicação de uma abordagem semelhante, balanceamento de fluxo cinético, para Arabidopsis, o modelo foi restringido com tamanhos de pool medidos obtidos por espectrometria de massa, bem como fracionamento não aquoso para fornecer informações sobre tamanhos de reservatórios subcelulares. Neste estudo, Szecowka et al. (2013) deduziram um conjunto de fl uxos intracelulares em rosetas de Arabidopsis iluminadas intactas. Eles analisaram a redistribuição dinâmica do rótulo de 13CO2

fornecido às folhas, a partir das quais um pequeno conjunto de fluxos foi calculado. Esta abordagem permitiu-lhes determinar mudanças cinéticas nos padrões de isótopos de 40 metabólitos do metabolismo primário do carbono e compará-los com quatro assinaturas de fl uxo classicamente determinadas da fotossíntese (Szecowka et al., 2013). Modelagem Cinética Onde houver dados confiáveis ​​o suficiente, um modelo cinético pode ser abrangente e preditivo (Schallau e Junker, 2010 Wang et al., 2014). Um exemplo é o modelo cinético de biossíntese de monolignol em Populus trichocarpa (Wang et al., 2014), que foi construído realizando um estudo abrangente para obter os parâmetros cinéticos de reação e inibição de todas as enzimas relevantes com base em proteínas recombinantes funcionais. No entanto, poucos desses modelos abrangentes foram apresentados no metabolismo vegetal por causa da dificuldade em obter as informações necessárias (Wang et al., 2014). A modelagem cinética-estrutural pode fornecer uma maneira potencial de contornar essa deficiência. Este método representa uma ponte de transição entre a abordagem estequiométrica e os vários modelos cinéticos dinâmicos. Embora não defina o comportamento dinâmico real, ele descreve a estabilidade e robustez de um estado metabólico específico e esclarece as interações e parâmetros relacionados que regem as propriedades dinâmicas do sistema. Informações matemáticas detalhadas, bem como o fluxo de trabalho proposto para modelagem, foram fornecidas por Steuer et al. (2006). Um modelo cinético estrutural consistindo de 18 metabólitos e 20 reações foi estabelecido para analisar o ciclo de Calvin-Benson. O modelo extraiu com sucesso as propriedades dinâmicas do sistema sem depender de qualquer suposição particular sobre a forma funcional das equações da taxa cinética (Steuer et al., 2006). A mesma abordagem foi aplicada ao ciclo do TCA em plantas (Steuer et al., 2007) para detectar e quantificar o comportamento dinâmico. Uma segunda abordagem para resolver o problema foi montar o modelo cinético de uma forma "de cima para baixo", chegando a ajustar o modelo às concentrações e fl uxos de metabólitos observados. Essa abordagem foi usada para modelar a rede de benzenoides na flor de petúnia (Petunia hybrida), levando à identificação bem-sucedida das principais etapas de controle do fl uxo (Colón et al., 2010). Uma abordagem de modelagem cinética "de baixo para cima" foi descrita na modelagem do fl uxo do floema na cana-de-açúcar (Saccharum of fi cinarum) na forma de uma estrutura de reação de difusão-advecção. Este modelo pioneiro provavelmente pode ser adaptado a outras espécies de plantas e talvez até mesmo ser estendido para estudar o fl uxo do xilema. Foi sugerido que a mesma estrutura poderia formar a base para a criação de um modelo cinético integrado da função fisiológica da planta inteira (Rohwer, 2012).

NOVAS INFORMAÇÕES SOBRE METABOLISMO E SISTEMAS DE ENGENHARIA DE PLANTAS Um dos objetivos mais importantes da engenharia metabólica é a otimização das vias metabólicas para a produção de metabólitos industrialmente importantes. Um grande desafio é selecionar com precisão os caminhos alvo e, em seguida, ajustar e otimizar

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o nível de expressão de cada enzima para as vias selecionadas (Xu et al., 2013b). Modelos de metabolismo vegetal começaram a enfrentar esse desafio, fornecendo uma base mais rigorosa para a futura engenharia genética. Um exemplo é a identificação de alguns pontos-chave regulatórios dentro da via do metabolismo do monoterpeno na hortelã-pimenta, usando uma abordagem dinâmica de MFA. Os resultados derivados do modelo deste estudo foram verificados experimentalmente e demonstraram o potencial para guiar a manipulação do metabolismo para aumentar o acúmulo de monoterpeno (Rios-Estepa et al., 2008). Outro exemplo é fornecido em um estudo sobre a semente de Arabidopsis, onde o modelo FBA foi usado para projetar estratégias de engenharia metabólica para superprodução de vitamina E (Mintz-Oron et al., 2012). Um terceiro exemplo é um modelo cinético de biossíntese de monolignol em P. trichocarpa, que revelou mecanismos envolvidos na regulação da biossíntese de lignina (Wang et al., 2014). Este trabalho fornece uma plataforma para a futura engenharia da produção de lignina, bem como melhorias em outras áreas relacionadas, como a resistência a estresses bióticos e abióticos e a produção de novos biomateriais (Wang et al., 2014). Os compostos sintetizados dentro da célula vegetal podem ser classificados como metabólitos primários ou metabólitos secundários (Bu’Lock, 1965 Luckner, 1972 Richter, 1978). A manipulação de redes metabólicas secundárias normalmente é menos complexa do que a do metabolismo primário, permitindo que sejam prontamente divididas em entidades mais gerenciáveis ​​e, portanto, oferecendo oportunidades mais favoráveis ​​para a engenharia de vias (Sweetlove et al., 2010). Além disso, apesar da notável diversidade do metabolismo secundário, eles ainda podem ser organizados em grupos de compostos estruturalmente relacionados. Isso facilita a categorização das vias e até mesmo sua ordem para tornar sua modelagem mais tratável. O agrupamento de metabólitos de origem biossintética semelhante forma a base lógica da organização de modelos de fl uxos, bem como de modelos cinéticos (Morgan e Shanks, 2002 Fernie e Morgan, 2013). No entanto, a engenharia de metabólitos secundários em plantas é menos desenvolvida do que em outros organismos, talvez por causa das conexões de rede altamente complicadas que ligam os metabolismos primário e secundário. Por exemplo, alguns fatores de transcrição associados à produção de um determinado grupo de metabólitos secundários coativam a expressão de genes que codificam enzimas metabólicas ligadas a vias primárias que fornecem precursores para esses metabólitos secundários (Aharoni e Galili, 2011). Essas ligações têm sido responsáveis ​​por frustrar uma série de tentativas de engenharia do metabolismo secundário da planta, produzindo resultados imprevistos ou alterações triviais no sistema (Colón et al., 2010 Stitt et al., 2010). Portanto, estudar a rede do metabolismo central pode promover a engenharia do metabolismo primário e secundário. Fotossíntese Numerosos experimentos foram conduzidos para aumentar a produtividade da cultura por manipulação genética do transporte de elétrons fotossintéticos, regeneração RuBP, atividade Rubisco e o fl uxo associado à fotorrespiração (Peterhansel et al., 2008 Raines, 2011). Esses resultados reafirmam a importância dos modelos matemáticos para um melhor entendimento das reações fotossintéticas.

(Arnold e Nikoloski, 2014). Um modelo funcional de fotossíntese deve incluir não apenas as etapas metabólicas individuais, mas também os principais mecanismos reguladores que afetam essas etapas. Esses modelos abrangentes idealmente preveriam a resposta da rede metabólica fotossintética a perturbações ambientais ou genéticas e teriam implicações para o redirecionamento do carbono para produtos naturais de alto valor e, em última análise, a melhoria do rendimento da colheita (Szecowka et al., 2013 Zhu et al., 2013 ) Embora muitos aspectos das redes fotossintéticas tenham sido submetidos a estudos de modelagem, o ciclo de Calvin-Benson tornou-se um alvo privilegiado, pois é a principal via nas plantas, produzindo amido e sacarose a partir de CO2 (Arnold e Nikoloski, 2014). No entanto, um aspecto negligenciado da rede de fotossíntese C3 é o controle do fl uxo do ciclo de Calvin-Benson para as vias de saída do amido, sacarose, isoprenóides, chiquimato e nucleotídeos. Por causa disso, é difícil prever de maneira abrangente como o fluxo relativo a essas vias muda durante o desenvolvimento ou em resposta a mudanças ambientais (Raines, 2011). No entanto, os modelos existentes potencialmente fornecem um bom ponto de partida para estender e melhorar os modelos de fotossíntese futuros. A este respeito, Arnold e Nikoloski (2011) compararam 15 modelos de ciclo de Calvin-Benson montados nos últimos 30 anos e forneceram uma classificação detalhada com base nos limites do modelo, o nível de organização celular, a complexidade da cinética e a processos regulatórios que foram incluídos. Eles classificaram os modelos em vários critérios, incluindo sensibilidade, estabilidade, robustez e a soma residual dos quadrados nos estados estacionários resultantes. Seu objetivo era identificar candidatos a modelo que fornecessem previsões quantitativamente precisas para uso em engenharia metabólica. Com base em sua análise, eles categorizaram os modelos existentes em dois grupos: os adequados para a fi xação de carbono e os adequados para a engenharia metabólica. Os modelos mais adequados parecem ser os propostos por Farquhar et al. (1980) e Poolman et al. (2000), respectivamente. A vantagem do modelo proposto por Farquhar et al. (1980) é que ele liga Rubisco com medições in vivo da taxa fotossintética e, portanto, é capaz de prever taxas líquidas de fixação fotossintética de CO2 em resposta a condições ambientais variáveis. Por causa dessas vantagens, o modelo foi estudado e amplamente validado ao longo de muitos anos, e derivados do modelo foram estabelecidos, os quais são usados ​​atualmente em estudos de modelagem ecológica em grande escala (Sweetlove et al., 2013). O modelo de Farquhar e seus derivados consistem exclusivamente em equações algébricas que só podem capturar o comportamento em estado estacionário por meio de suposições restritivas (Arnold e Nikoloski, 2013). No entanto, a fotossíntese raramente está em estado estacionário no ambiente natural devido às condições flutuantes do ambiente. Portanto, um modelo altamente mecanístico e bem validado é necessário para estudar a fotossíntese em uma abordagem mais prática. Nesse sentido, um modelo cinético (e-fotossíntese), que inclui cada processo discreto desde a captura de luz até a síntese de carboidratos, foi recentemente descrito para a fotossíntese C3. O modelo de e-fotossíntese imita com eficácia muitas cinéticas típicas de recursos fotossintéticos e fornece uma plataforma viável para orientar a engenharia de eficiência fotossintética aprimorada (Zhu et al., 2013).

Devido à sua natureza de estado estacionário, o modelo de Farquhar e seus derivados são incapazes de capturar mudanças dinâmicas que ocorrem na relação entre fotossíntese e fotorrespiração em intensidades de luz e concentrações de CO2 e O2 variáveis. Evidências experimentais recentes indicam que a fotorrespiração também está envolvida na assimilação de nitrato, produção de energia da fotossíntese, troca de equivalentes redox entre compartimentos, metabolismo de um carbono (C1) e transdução de sinal redox (Arnold e Nikoloski, 2013). A modelagem quantitativa precisa da fotorrespiração é, portanto, de grande importância para entender como o ajuste fino dos níveis de intermediários e fl uxos mantém a assimilação ideal de CO2 em resposta a condições em constante mudança (Fernie et al., 2013). Deixando de lado os derivados do modelo de Farquhar, mesmo as abordagens de modelagem cinética da fotorrespiração negligenciaram seu papel complexo e, em grande parte, acoplaram uma versão muito simplificada ao metabolismo fotossintético. No entanto, o modelo de e-fotossíntese (Zhu et al., 2013) incluiu fotorrespiração em mais detalhes. Uma abordagem promissora para modelar a fotorrespiração poderia ser montar uma rede metabólica completa de forma que a conexão do metabolismo do nitrogênio também seja levada em consideração. Por exemplo, por meio da perturbação de reações específicas do nitrogênio em tal modelo, a interação da fotorrespiração e da fotossíntese, bem como os efeitos em todo o sistema, poderiam ser testados. Uma extensão de tal abordagem poderia ser realizada adicionando as descobertas recentes sobre eventos regulatórios e de sinalização de fotorrespiração em modelos em escala de genoma (Arnold e Nikoloski, 2013). Embora o equilíbrio entre a fotossíntese e a respiração seja um fator determinante da economia de carbono, outra falha no modelo Farquhar e seus derivados é que eles prevêem a respiração com base em sua correlação com outros processos, não como um fenômeno metabólico independente (Sweetlove et al. , 2013). Para atingir o objetivo de um modelo de respiração mecanicista aplicável, vários desafios devem ser enfrentados. Parece que o termo “respiração” deve ser definido de forma a captar as redes metabólicas independentes da luz, que levam à produção líquida de CO2. A esse respeito, Sweetlove et al. (2013) sugerem substituir o termo mal definido "respiração" por "evolução líquida de CO2", que é definido como a soma de todas as etapas de produção de CO2 menos a soma de todas as etapas de consumo de CO2, excluindo fotossíntese e fotorrespiração. Concentrar-se na evolução líquida de CO2 resulta na identificação de dois desafios precisos para o processo de modelagem. Primeiro, deve-se identificar todos os processos metabólicos que contribuem para a produção líquida de CO2 e isso é geralmente considerado extremamente difícil. Em segundo lugar, qualquer modelo preditivo deve permitir diferenças entre os tipos de tecido e o impacto de uma mudança nas condições nos processos que contribuem para a evolução líquida de CO2. Ao enfrentar esses desafios, a quantificação dos processos bioquímicos que levam à evolução líquida de CO2 por MFA mostra que a contribuição de diferentes processos para o balanço de CO2 é altamente variável. Também mostra que a variabilidade na evolução do CO2 entre as espécies e os tecidos pode ser maior do que entre as condições de crescimento. Essa descoberta refletiria indiretamente a necessidade de uma rede metabólica central robusta em face de condições ambientais subótimas. Além do MFA, foi avaliado o potencial do FBA como ferramenta para prever a evolução líquida de CO2. Embora existam relativamente poucos estudos FBA

para os quais dados de fluxo metabólico experimentalmente restritos estão disponíveis como um ponto de comparação / validação, a conclusão é que o FBA tem o potencial de prever a origem metabólica do CO2 evoluído em diferentes tecidos / espécies e sob diferentes condições (Sweetlove et al., 2013) . No entanto, a maioria desses modelos assume que o organismo cresce em luz constante, o que é diferente da situação natural em que a interação entre o metabolismo claro e escuro é uma característica importante do metabolismo dos organismos fotossintéticos. Para estabelecer um modelo mais representativo do metabolismo foliar, Cheung et al. (2014) construíram um modelo de equilíbrio de diel fl uxo que contabilizou os fl uxos metabólicos nas fases claro e escuro do metabolismo da folha, simulando-os simultaneamente em um único problema de otimização. O modelo diário foi obtido pela aplicação de uma estrutura específica de restrições a um modelo existente em escala de genoma do metabolismo de Arabidopsis (Cheung et al., 2013). O modelo capturou com sucesso muitas características conhecidas do metabolismo da folha C3, incluindo o papel da síntese e acúmulo de citrato à noite (através do ciclo do ácido tricarboxílico mitocondrial) e sua exportação do vacúolo durante o dia como um precursor para o fornecimento de esqueletos de carbono para aminoácidos síntese. Geralmente, este modelo descobriu algumas características importantes de interações entre o metabolismo claro e escuro e previu com sucesso os fl uxos metabólicos na luz na fotossíntese C3. As plantas C4 possuem uma anatomia foliar característica, que sobrecarrega a fotossíntese concentrando CO2 nas proximidades de Rubisco e reduzindo significativamente a reação de oxigenação (Wang et al., 2012). A compreensão do sistema da anatomia distinta e da fisiologia única é um pré-requisito para a modelagem eficaz do metabolismo C4. A fim de alcançar uma compreensão de nível de sistema da regulação espacial da fotossíntese em plantas C4, um modelo metabólico em escala de genoma (C4GEM) foi desenvolvido e aplicado para investigar a distribuição do fluxo entre dois tecidos interagindo de bainha de feixe e mesofilo durante a fotossíntese C4. O modelo é uma extensão de um modelo de Arabidopsis (AraGEM) (de Oliveira Dal'Molin et al., 2010a), que representa três diferentes subtipos C4 NADP-ME (enzima dependente de NADP), NAD-ME (enzima málica dependente de NAD) e PEPCK (fosfoenolpiruvato carboxicinase) (de Oliveira Dal'Molin et al., 2010b). Em uma extensão deste estudo, Wang et al.(2012) simularam a influência de cada subtipo na síntese de biomassa e fixação de CO2 e concluíram que o subtipo PEPCK é superior aos subtipos NADP-ME e NAD-ME sob fornecimento suficiente de água e nitrogênio. Além disso, o modelo C4GEM destacou diferenças nos fl uxos relativos através do fotossistema I e fotossistema II (PSII) nos diferentes tipos de células e em cada um dos três subtipos C4. O modelo também previu que os subtipos NAD-ME e PEPCK têm atividade PSII substancial nos tecidos da bainha do feixe, enquanto as espécies NADPME têm pouco PSII e mais transporte cíclico de elétrons (CET) em suas células da bainha do feixe. Embora as plantas C4 exijam mais ATP do que as plantas C3 para assimilar o CO2, não foi elucidado como o ATP extra é produzido. Curiosamente, as simulações mostraram que o CET ocorrendo na bainha do feixe é um meio eficiente para fornecer o ATP extra necessário no subtipo NADPH-ME. O modelo comparou o requisito mínimo de fótons para CET na bainha do feixe de mesofilo. Os resultados mostraram que

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O CET na bainha do feixe é energeticamente mais eficiente, pois requer menos fótons para produzir o ATP extra do que o CET ativo no mesofilo (de Oliveira Dal’Molin et al., 2010b). Uma compreensão em nível de sistema de como a fotossíntese C4 opera e difere das plantas C3 também é um pré-requisito para entender como as enzimas de transporte de carbono são ajustadas por redes de controle (Wang et al., 2012 Weissmann e Brutnell, 2012). O estudo de Wang et al. (2012) compararam uma rede metabólica C3 (AraGEM, para Arabidopsis) com uma rede metabólica C4 (C4GEM, para milho). Para este fim, eles primeiro fizeram algumas melhorias em ambos os modelos e os compararam usando a análise da teoria dos grafos (que permite a comparação de parâmetros topológicos importantes). Eles descobriram que a rede C3 tem uma topologia mais densa do que a C4. Isso provavelmente é um reflexo da diferença anatômica entre a estrutura das folhas C4 e C3, já que a primeira inclui as células do mesofilo e da bainha do feixe, enquanto a última consiste em tipos de células únicas. A simulação de nocautes enzimáticos (deleção de reação única) mostrou que mais de 86% (onde a função objetivo é biomassa máxima) e mais de 96% (onde a função objetivo é a fixação de CO2) das reações não têm influência quando deletados em C4 e C3 redes. Isso demonstra a robustez dessas redes. Além disso, uma comparação da redundância da rede metabólica primária entre C4 e C3 mostrou que, independentemente do tipo de função objetivo, a planta C4 é mais robusta a mutações gênicas ou mudanças ambientais (Wang et al., 2012). CAM representa uma separação temporal de eventos metabólicos em que o CO2 é inicialmente fixado à noite na forma de ácidos carboxílicos (principalmente ácido málico) e depois descarboxilado durante o dia para fornecer CO2 para a fotossíntese convencional (Cheung et al., 2014). O CAM maximiza a eficiência do uso da água e mantém a alta produtividade da biomassa concentrando o CO2 em torno da Rubisco, favorecendo a atividade da carboxilase. CAM também representa uma estrutura anatômica mais simples, pois seu metabolismo fotossintético ocorre em uma única célula do mesofilo, em vez de nas duas células separadas, como na fotossíntese C4. A modelagem pode fornecer uma abordagem chave para a compreensão sistêmica abrangente dos eventos regulatórios enzimáticos e temporais que controlam a carboxilaçãodecarboxilação de ácidos carboxílicos e os fl uxos metabólicos concomitantes por meio da glicólise-gliconeogênese (Borland et al., 2014). Relativamente pouco esforço foi feito para estudar o CAM em um nível de sistema. Para resolver isso, Cheung et al. (2014) usaram uma abordagem técnica inovadora, fazendo algumas mudanças nas restrições do modelo original de diel C3, a fim de capturar o ciclo clássico de CAM de uma folha madura e prever o fl uxo metabólico ao longo de um ciclo de dia. Enquanto o modelo previu com sucesso fluxos metabólicos consistentes com o conhecido ciclo CAM, ele também mostrou que, apesar do potencial para supressão da fotorrespiração através da concentração de CO2, é improvável que haja benefícios energéticos significativos na fotossíntese CAM sobre C3. O modelo previu que a economia energética da maquinaria enzimática, que foi alcançada pela supressão da fotorrespiração, é provavelmente compensada pelo maior fluxo de demanda do ciclo CAM. Além da Rubisco, que é a enzima carboxilante que opera no ciclo de Calvin-Benson, a natureza emprega várias outras vias de fixação do carbono. Esta diversidade de soluções naturais

oferece a chance de utilizar uma combinação de modelagem junto com a biologia sintética, para montar caminhos de fixação de CO2 totalmente inovadores que podem ser mais e fi cientes do que o ciclo C3. Com o objetivo de projetar vias metabólicas sintéticas para melhorar a fixação, o crescimento e a produção de carbono, Bar-Even et al. (2010) considerou toda a gama de 5000 enzimas metabólicas conhecidas por ocorrer na natureza como componentes e usou um FBA para descobrir sistemicamente todas as possibilidades que podem ser concebidas com essas enzimas como blocos de construção. Isso levou a várias vias de fixação de carbono sintético promissoras, que então eles compararam com as vias naturais usando critérios físico-químicos. A comparação sugeriu que algumas das vias sintéticas propostas poderiam ter uma vantagem quantitativa significativa sobre as naturais. Além do ciclo de Calvin-Benson, que suporta a maior parte da fi xação global de carbono, existem atualmente cinco vias de fi xação de carbono que ocorrem naturalmente: o ciclo redutor de TCA, o ciclo 3-hidroxipropionato / malil-CoA, a via redutiva de acetilCoA, o 3- ciclo hidroxipropionato / 4-hidroxibutirato e o ciclo dicarboxilato / 4-hidroxibutirato. Boyle e Morgan (2011) compararam a termodinâmica e a eficiência dessas seis vias usando FBA. Com base nas comparações da demanda de energia ou da necessidade de fótons para a conversão do fotoassimilato em biomassa, foi demonstrado que o ciclo redutor do TCA é a forma mais eficiente de gerar biomassa a partir da energia solar. No entanto, o ciclo redutor de TCA é apenas trivialmente mais eficiente do que o ciclo de Calvin-Benson. No geral, este estudo enfatiza o papel do ciclo de Calvin-Benson, que evoluiu para operar no atual ambiente oxidativo da Terra (Boyle e Morgan, 2011). Ciclo do TCA Em microrganismos, a análise da via in silico sugeriu um potencial significativo para a otimização do ciclo do TCA (Kjeldsen e Nielsen, 2009), portanto, esforços foram iniciados para projetá-lo (Becker et al., 2009). A engenharia do ciclo do TCA nas plantas também pode ser útil por causa dos metabólitos de alto valor derivados dos esqueletos de carbono fornecidos por esta via, incluindo aminoácidos, ácidos graxos, flavonóides, pigmentos, alcalóides e isoprenóides. Nas fábricas, existem obstáculos significativos no avanço da engenharia do ciclo do TCA, talvez por causa da complexidade geral do sistema. No entanto, quase todos os genes que codificam as enzimas envolvidas no ciclo do TCA foram clonados de diferentes espécies de plantas e muitas das proteínas codificadas foram bioquimicamente caracterizadas. Esforços também foram intensificados para entender a organização modular do ciclo do TCA (Carrari et al., 2003). Essas conquistas forneceram a base para os esforços para modificar geneticamente o ciclo do TCA e para aumentar o conteúdo de ácido orgânico nas plantas (Morgan et al., 2013). Experimentos genéticos e metabólicos mostraram que o ciclo convencional de TCA não é a única via pela qual o fl uxo de TCA passa (Sweetlove et al., 2010), levantando inúmeras questões ainda sem resposta sobre o equilíbrio entre os modos de fl uxo cíclico e não cíclico. As respostas a essas perguntas podem ajudar a projetar com eficiência o ciclo de TCA da planta. Para este fim, os experimentos de modelagem foram de grande benefício em mostrar que, quando a demanda por ATP é baixa, o fluxo cíclico

o modo não é necessariamente mantido (Sweetlove et al., 2010). Da mesma forma, um modelo em grande escala do metabolismo celular em embriões em desenvolvimento da semente em desenvolvimento de B. napus demonstrou que a atividade do TCA cíclico é reduzida à medida que a produção fotossintética de NADPH e ATP aumenta (Hay e Schwender, 2011a, 2011b), enquanto um FBA- O modelo baseado no metabolismo heterotrófico de Arabidopsis demonstrou que o fluxo de TCA cíclico só é necessário quando há uma alta demanda por ATP (Poolman et al., 2009). No endosperma da cevada, o FBA foi usado para mostrar que a mudança gradual do TCA cíclico (no tecido aeróbio) para o não cíclico (no tecido hipóxico) ocorre durante o processo de maturação do grão, provavelmente porque a succinato desidrogenase (que conecta o ciclo do TCA com a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial) está associada a apenas um fluxo menor (GrafahrendBelau et al., 2009a). De acordo com este relatório, os mapas de fluxo in silico de células de arroz em suspensão derivada de sementes cultivadas sob condições anóxicas mostraram uma operação de ciclo de TCA truncada entre fumarato e oxaloacetato, enquanto um ciclo de TCA totalmente operacional foi caracterizado em condições aeróbicas. Esta diferença foi principalmente devido à regeneração limitada de cofatores redox, uma vez que a respiração mitocondrial foi prejudicada sob anoxia. Curiosamente, a FBA revelou o possível papel da derivação do ácido g-aminobutírico na conversão de a-cetoglutarato em succinato em vez de a-cetoglutarato desidrogenase e succinato-CoA ligase em condições anaeróbias. Além disso, em contraste com as condições anaeróbias, uma quantidade significativa de piruvato foi convertida em acetil-CoA em condições aeróbias, permitindo assim sua entrada no ciclo do TCA para produção de energia (Lakshmanan et al., 2013). O modelo metabólico em escala de genoma de uma célula de folha de arroz em desenvolvimento previu que as respostas das três enzimas vizinhas succinato desidrogenase, fumarato e malato desidrogenase são diferentes sob diferentes intensidades de luz. Este estudo apontou que o ciclo do TCA tem a capacidade de reconfigurar suas reações para atender a diferentes requisitos em diferentes condições ou estágios de desenvolvimento (Poolman et al., 2013). Essa visão do ciclo de TCA é apoiada por evidências experimentais de outros estudos (Studart-Guimarães et al., 2007 Rocha et al., 2010). Metabolismo da sacarose O acúmulo de sacarose nos tecidos de armazenamento é acompanhado por clivagem e síntese recorrentes, durante as quais o ATP é desperdiçado (Schäfer et al., 2004). Pode-se esperar que a inibição genética desse ciclo fútil aumente a produtividade da cultura. Identificar os genes candidatos para a regulação transgênica exigiria uma abordagem laboriosa gene por gene (Rohwer, 2012), ao passo que a modelagem poderia abreviar radicalmente esse processo. Aplicando uma combinação de EMA e modelagem cinética, 14 modos elementares foram detectados durante o acúmulo de sacarose na cana-de-açúcar, cinco dos quais estavam associados a um ciclo fútil. O modelo também previu que a atenuação da invertase neutra e a superexpressão de um importador de sacarose vacuolar e transportadores de glicose e frutose da membrana plasmática forneceriam um meio eficiente de reduzir a ciclagem fútil (Rohwer e Botha, 2001). Essas previsões foram parcialmente validadas em uma análise de culturas de células em suspensão nas quais a atividade da invertase neutra foi regulada negativamente pela interferência de RNA, uma vez que essas células foram

mais capaz de acumular sacarose em comparação com o tipo selvagem (Rohwer, 2012). O MFA do grão de milho mostrou de forma semelhante que dependendo da localização subcelular do gliceradeído 3-fosfato e da identidade das enzimas envolvidas, a ciclagem fútil pode desperdiçar entre 18 e 47% do pool de ATP (Alonso et al., 2011). No entanto, Kruger et al. (2007) argumentam que é improvável que este valor seja tão alto quanto relatado e que medições confiáveis ​​de 13C MFA do fl uxo de hexose fosfato para glicose (ciclo de sacarose), só serão possíveis se o padrão de marcação for conhecido tanto para o citossólico quanto para o vacuolar pools de glicose. Síntese do óleo de semente Durante a deposição de armazenamento de sementes, a biossíntese de diferentes compostos de armazenamento precisam de diferentes proporções de cofatores de energia (ATP e NADPH), bem como diferentes proporções de precursores metabólicos (Hay e Schwender, 2011b). Como um modelo preditivo do metabolismo do óleo é útil na manipulação da composição da semente, muitos esforços têm sido realizados a esse respeito. Uma característica importante que influencia o rendimento do óleo de semente é a eficiência média de conversão de carbono (CCE), uma medida da eficiência de conversão de substratos em produto de armazenamento (Alonso et al., 2011). CCE é uma definição direta de eficiência metabólica e destaca a proporção de recursos dedicados ao acúmulo de biomassa estrutural, de armazenamento e reprodutiva (Chen e Shachar-Hill, 2012). As estimativas de CCE foram obtidas para o embrião de girassol (Helianthus annuus) (50%) (Alonso et al., 2007), o endosperma de milho (76 a 92%) (Alonso et al., 2011) e embrião (56 a 71% ) (Alonso et al., 2010) e a semente de B. napus (> 80%) (Alonso et al., 2007). O estudo da base metabólica subjacente a essas diferenças pode promover insights sobre como a engenharia genética pode ser usada para aumentar o teor de óleo e melhorar sua composição. Vários modelos foram estabelecidos para a descrição da produção de óleo, incluindo em B. napus (Schwender et al., 2004 Schwender, 2008 Hay e Schwender, 2011a, 2011b), milho (Alonso et al., 2010, 2011) e girassol ( Alonso et al., 2007). A modelagem do metabolismo de armazenamento no embrião em desenvolvimento de B. napus destacou a participação potencial de várias vias, incluindo a formação do precursor de lipídios piruvato e o papel potencial da carboxilação de PEP na assimilação de nitrogênio ou na síntese de lipídios. Nenhum aumento da captação ou uso alterado de aminoácidos, como possível precursor de lipídios, foi previsto usando MFA ou FVA (Hay e Schwender, 2011a, 2011b). Os mesmos estudos também caracterizaram o desvio das reações glicolíticas da Rubisco para a síntese de lipídios. Esta via de “bypass Rubisco” pode explicar o aumento observado no CCE. No entanto, devido à necessidade de energia do bypass, esta contribuição só é prevista como benéfica se a intensidade da luz estiver acima de um certo limite (Hay e Schwender, 2011a). Em um estudo elegante, um modelo FBA para B. napus cultivado (Hay e Schwender, 2011a, 2011b) foi combinado com medições de alta resolução de embriões em desenvolvimento in planta, a fim de obter uma visão aprofundada da variação espacial em fl uxos metabólicos em diferentes tecidos de semente oleaginosa. Ao contrário da previsão do modelo FBA, este estudo previu que o desvio de Rubisco ocorre apenas no cotilédone externo, hipocótilo e radícula, mas não no

Biologia de Sistemas e Metabolismo

cotilédone interno. Isso provavelmente ocorre devido ao formato da semente, pois à medida que a semente fica maior, a penetração da luz nos tecidos internos fica menor (Hay e Schwender, 2011a Borisjuk et al., 2013). O MFA do embrião de milho em desenvolvimento e do endosperma também revelou que o fl uxo através do OPPP é maior no embrião do que no endosperma. No entanto, mesmo a quantidade de carbono que entra no embrião não pode atender totalmente a demanda de NADPH para a síntese de ácidos graxos e pode limitar a produção de óleo, enquanto o NADPH não é um fator limitante para a síntese de lipídios no endosperma. Os estudos de MFA também revelaram o papel principal da atividade da enzima málica dependente de NADP plastídica no fornecimento de redutor e carbono para a síntese de ácidos graxos no desenvolvimento de embriões de milho (Alonso et al., 2010, 2011).

Metabolismo e meio ambiente O nível de metabólitos é dramaticamente influenciado pelas adversidades ambientais. No entanto, a conexão entre as condições ambientais e o metabolismo é escondida pelas complexas redes que os ligam. Compreender essa conexão torna-se mais importante quando tentamos reconhecer o papel do metabolismo na aclimatação ao estresse abiótico. Modelagem metabólica tem sido aplicada a esta questão, buscando respostas para questões como até que ponto o funcionamento da (s) via (s) metabólica (s) pode (m) estar associado (s) às mudanças ambientais e se a conectividade da rede é conservada ou muda entre as diferentes condições de crescimento. Uma das primeiras tentativas de modelagem estequiométrica do metabolismo vegetal foi realizada para analisar o padrão de armazenamento do endosperma de semente de cevada em desenvolvimento em resposta à depleção de oxigênio (Grafahrend-Belau et al., 2009a). Desde então, várias investigações de modelagem de interações planta-ambiente estudaram o impacto do estresse (aumento da temperatura e estresse hiperosmótico) (Williams et al., 2010 Cheung et al., 2013), disponibilidade de carbono e nitrogênio (Sulpice et al., 2013 ), condições de luz e temperatura (Töpfer et al., 2013) e fornecimento de nitrogênio (nitrato ou amônio) (Masakapalli et al., 2013) no metabolismo heterotrófico em Arabidopsis. A crescente disponibilidade de dados de alto rendimento para plantas agrícolas está levando a novas aplicações de modelagem em estudos da interação entre as plantas agrícolas e seu ambiente. Por exemplo, para elucidar os perfis de fluxo metabólico durante estresses abióticos (estresses de inundação e seca), uma rede metabólica / regulatória de células de arroz foi reconstruída para dois tecidos de arroz diferentes, sementes em germinação e folhas fotorrespirantes (Lakshmanan et al., 2013). Em outro estudo, um modelo metabólico em escala de genoma de uma célula de folha de arroz em desenvolvimento foi usado em uma gama de valores de fl uxo de fótons (Poolman et al., 2013). A criação de novas variedades de culturas com melhor desempenho sob estresse abiótico está se tornando cada vez mais importante. Portanto, espera-se que a modelagem metabólica desempenhe um papel fundamental neste campo em um futuro próximo.

OBSERVAÇÕES FINAIS A modelagem computacional da planta está evoluindo rapidamente e logo chegará ao ponto em que pode começar a causar impacto na planta

prática de engenharia metabólica. No entanto, ainda há uma necessidade de superar sérias dificuldades antes que modelos metabólicos de plantas possam ser rotineiramente incorporados como parte da biologia de sistemas de cultivo e há uma necessidade particular de modelos multiescala (Baldazzi et al., 2012). Por definição, um modelo multiescala integra explicitamente os mecanismos que ocorrem em várias escalas e / ou funções espaciais ou temporais (Baldazzi et al., 2012 Walpole et al., 2013). O estabelecimento de tal modelo às vezes requer uma gama de diversos dados de mecanismos bioquímicos ou mecanísticos a fenômenos biomecânicos, o que leva a um modelo multiescala híbrido (Baldazzi et al., 2012). Um excelente exemplo desse modelo híbrido multiescala foi desenvolvido para o coração (Noble, 2011) em que as equações de reação-difusão (como uma descrição para a contração eletromecânica do coração) são acopladas a um conjunto de equações diferenciais ordinárias (como uma descrição do transporte de íons na membrana celular). Exemplos em biologia vegetal incluem modelos que correlacionam processos de nível molecular com desenvolvimento / morfogênese vegetal em Arabidopsis (Vernoux et al., 2011 Grieneisen et al., 2012). No entanto, o papel fisiológico abrangente da rede metabólica só pode ser totalmente compreendido de uma perspectiva de corpo inteiro, onde células individuais, o tecido circundante e todo o organismo interagem continuamente em um nível metabólico (Krauss et al., 2012 Grafahrend-Belau et al., 2013). Diversas abordagens para combinar modelos metabólicos, cobrindo diferentes níveis de organização biológica em humanos foram descritas (Krauss et al., 2012), enquanto no momento desta revisão, o único modelo metabólico multiescala em plantas foi apresentado por Grafahrend-Belau et al. . (2013). Durante este estudo, o modelo FBA de vários órgãos foi combinado com um modelo de planta funcional multiescala de planta inteira dinâmica. O FBA dinâmico foi realizado particionando uma fase de crescimento da planta selecionada em vários intervalos de tempo e calculando um FBA estático no início de cada intervalo de tempo. Para incluir processos dinâmicos, fluxos de troca que foram previstos pelo modelo de planta funcional e também são dependentes do tempo foram usados ​​para restringir o FBA estático dentro de cada intervalo de tempo. O estabelecimento de um modelo de planta multiescala requer a modelagem simultânea de muitos tipos de células diferentes em vários tecidos / órgãos conectados.Considerando a grande escala de um modelo multiorgânico ou de organismo inteiro, a modelagem estequiométrica, em particular FBA, é a abordagem mais adequada. Com o objetivo de alcançar um modelo metabólico multiescala, primeiro os modelos específicos do subsistema validado devem ser construídos separadamente e, em seguida, as partes separadas podem ser acopladas para construir o modelo multiescala. Isso apresenta vários desafios técnicos e matemáticos. A primeira é que precisamos formular novas restrições e / ou funções objetivo, tanto no nível dos subsistemas quanto no nível do modelo integrado, para descrever o comportamento da planta da forma mais realista possível. A segunda é a falta de informações específicas do tecido sobre a captação e a secreção de metabólitos, que são necessárias para a ACE (Shlomi et al., 2008). É óbvio que o acoplamento de submodelos redesenha os limites do sistema. A questão que surge durante os modelos de subsistema de acoplamento é até que ponto as interdependências dos fl uxos nos subsistemas variam com as da rede metabólica acoplada. Análises matemáticas especiais, como a análise de acoplamento de fluxo, foram desenvolvidas para lidar com essa questão (Marashi e Bockmayr, 2011 Marashi et al., 2012).

A engenharia metabólica da planta será capaz de atender às necessidades humanas apenas quando começar a fazer mudanças significativas em escala industrial. Para conseguir isso, a modelagem multiescala é um pré-requisito para obter uma melhor compreensão do metabolismo em um nível de sistema. No entanto, antes disso, a modelagem metabólica da planta precisa ser suportada por plataformas de bioinformática mais avançadas e caixas de ferramentas computacionais. Também é necessário obter uma melhor compreensão dos circuitos reguladores que governam o metabolismo celular. Além disso, a resolução celular melhorada e a sensibilidade aumentada da metabolômica também são necessárias.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES Todos os autores contribuíram para a redação do artigo.

AGRADECIMENTOS Agradecemos a R. George Ratcliffe por sua valiosa contribuição intelectual e feedback ao longo do desenvolvimento deste artigo.

Recebido em 25 de julho de 2014, revisado em 22 de setembro de 2014, aceito em 2 de outubro de 2014, publicado em 24 de outubro de 2014.

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Biologia de Sistemas e Metabolismo

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Modelagem Metabólica de Plantas: Obtendo Novos Insights sobre Metabolismo e Engenharia Metabólica Kambiz Baghalian, Mohammad-Reza Hajirezaei e Falk Schreiber Plant Cell originalmente publicado on-line em 24 de outubro de 2014 DOI 10.1105 / tpc.114.130328 Essas informações são atuais em 24 de outubro de 2014 Permissões


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Reconhecimentos

A equipe de Reproducible Research Results (R3), em particular, C. Trefois e Y. Jarosz, do Luxembourg Centre for Systems Biomedicine, é reconhecida por sua ajuda na configuração da máquina virtual e do servidor Jenkins. Este estudo foi financiado pelo Centro Nacional de Excelência em Pesquisa (NCER) sobre a doença de Parkinson, o Departamento de Energia dos EUA, Escritórios de Pesquisa em Computação Científica Avançada e Pesquisa Biológica e Ambiental como parte do programa de Descoberta Científica Através de Computação Avançada, concessão no . DE-SC0010429. Este projeto também recebeu financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação HORIZON 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção no. 668738 e o programa ATTRACT (FNR / A12 / 01) e OPEN (FNR / O16 / 11402054) do Fundo Nacional de Investigação do Luxemburgo (FNR). N.E.L. foi apoiado pelo NIGMS (R35 GM119850) e pela Novo Nordisk Foundation (NNF10CC1016517). M.A.P.O. foi apoiado pela subvenção AFR / 6669348 do Fundo Nacional de Investigação do Luxemburgo (FNR). A.R. foi apoiado pelo Prêmio Lilly Innovation Fellows. F.J.P. foi apoiado pelo Ministro da Economia e Competitividade da Espanha (BIO2016-77998-R) e o Programa ELKARTEK do Governo Basco (KK-2016/00026). I A. foi apoiado por uma bolsa pré-doutorado do Governo Basco (PRE_2016_2_0044). B.Ø.P. foi apoiado pela Fundação Novo Nordisk por meio do Centro de Biossustentabilidade da Universidade Técnica da Dinamarca (NNF10CC1016517).


7 Resumo e Outlook

A profunda importância da tiamina para a saúde de todos os organismos e as deficiências dos métodos anteriores de análise de tiamina, juntos, alimentaram um interesse contínuo no aprimoramento das metodologias de monitoramento da tiamina em uma variedade de matrizes. Inúmeras abordagens colorimétricas, fluorescentes, eletroquímicas e biológicas foram desenvolvidas, cada uma com seus próprios benefícios e advertências inerentes (Tabela 1). Embora as abordagens colorimétricas já tenham sido amplamente utilizadas, devido ao princípio de detecção inerentemente simples, elas caíram em desuso em vez de métodos fluorométricos mais sensíveis, devido aos seus altos limites de detecção (μm) e risco de interferências, especialmente quando biológicas as amostras são consideradas. Como resultado, as metodologias mais comumente empregadas basearam-se na detecção de fluorescência após a separação cromatográfica. Essas metodologias estabelecidas oferecem o benefício de quantificação sensível de tiamina em misturas de multicomponentes e especiação de fosfatos de tiamina. Os avanços nas separações de HPLC e as melhorias nas capacidades de detecção oferecem a capacidade de atingir níveis de detecção de pM impressionantes, adequados para ambientes de laboratório bem equipados.


Assista o vídeo: VIA DAS PENTOSES-FOSFATO (Janeiro 2022).