Em formação

O que é um protocolo simples para a coloração de células em suspensão?


Sou um estudante de engenharia que estuda como os campos elétricos afetam as células, especificamente os fenômenos de eletroporação em células vivas.

Eu sei que a eletroporação é amplamente usada para introduzir genes nas células, mas realizar um experimento completo de transfecção não é tão viável no laboratório em que estou trabalhando.

Minha pergunta é:

Se eu quiser demonstrar o princípio da eletroporação, ou seja, que as células se abrem e absorvem substâncias do meio ambiente, usando algum tipo de corante que posso visualizar posteriormente, qual poderia ser um bom modelo para esse tipo de experimento? Especificamente - que corante, que células podem ser usadas para isso?


Você obterá muitos falsos positivos usando o método a seguir, e uma transfecção real de uma proteína fluorescente é sempre o caminho a percorrer, porque assim você provará que a transfecção foi realmente bem-sucedida.

Dito isso, você pode tentar usar DAPI, seguido por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. DAPI é uma coloração muito brilhante para DNA e não pode passar por uma membrana celular intacta. Se a membrana celular for rompida, e. g. por necrose, o DAPI entrará na célula. Nunca vi ninguém tentando provar a eletroporação dessa forma, mas vale a pena tentar. Pode ser que o tempo seja muito curto para DAPI entrar na célula, então você precisa ajustar sua configuração.

Eu tentaria o seguinte: Prepare uma solução de célula com DAPI (algo como 5 µM de concentração deve servir). Divida a solução em duas cubetas de eletroporação, faça a eletroporação com uma cubeta e deixe a segunda intacta como controle. Após a eletroporação, analise as amostras MOMENTARIAMENTE (significa: dentro de alguns minutos) usando um citômetro de fluxo (se possível).

Quanto às células, você poderia usar qualquer coisa. Sugiro células eucarióticas porque são mais fáceis de visualizar do que bactérias. No entanto, você precisaria de uma capela de fluxo laminar para o manuseio asséptico de células. Em teoria, você também poderia usar bactérias, que são mais fáceis de manusear, mas não tenho experiência com imunofluorescência em bactérias.


Protocolo de coloração de células para microscopia

Microscopia refere-se à prática que envolve o uso de um microscópio para fins de observação de estruturas em pequena escala que não podem ser vistas a olho nu e, muitas vezes, a coloração das células é necessária, pois as estruturas são difíceis de discernir devido ao contraste insuficiente.

A coloração de células é uma técnica utilizada com o objetivo principal de aumentar o contraste por meio da alteração da cor de algumas partes da estrutura observada, permitindo uma visão mais clara. Há uma variedade de manchas que podem ser usadas em microscopia.

Em primeiro lugar, a coloração pode ser in vivo ou in vitro. A diferença entre elas é que, enquanto a coloração in vivo se refere à coloração de uma matéria biológica enquanto ela ainda está viva, a coloração in vitro se refere a uma técnica de coloração em que a matéria biológica não é viva.

A seguir estão as manchas comuns que explicam técnicas, preparações e procedimentos para cada um:

Coloração com hematoxilina e eosina

Essas são duas manchas usadas no exame de fatias finas de tecido biológico. O contraste é criado pelas manchas onde a hematoxilina torna os núcleos azuis, enquanto a eosina torna o citoplasma, bem como outras partes, rosa ou vermelho.

1- Meça 10 gramas de cristais de hematoxilina 500 ml de água (70-80 graus centígrados) e misture para diluir completamente

2- Em um frasco separado, meça 20 gramas de alume e misture com 500 ml de água quente da torneira (70-80 graus)

3- Misture as duas misturas (1 e 2)

Enquanto o alúmen é o mordente, o timol impede o crescimento de fungos.

5- A mistura é então mantida em um frasco translúcido, longe da luz direta do sol, por uma semana. Este é coberto com uma toalha de papel que permite a circulação do ar (maturação precoce). A solução é então colocada em um frasco escuro e bem fechada após uma semana, e armazenada em um local escuro por 3 semanas. (Maturação tardia)

1- Meça 10 gramas de cristais de eosina e adicione à mistura em 1000ml de água quente da torneira (70-80 graus). Isso deve ser misturado para diluir e armazenado em um frasco escuro. Isso pode ser usado diretamente.

1- Uma seção reidratada é corada em uma solução de hematoxilina por 20 a 40 minutos

2- A seção é então lavada em água da torneira por cerca de 3 minutos até que fique azul,

3- A seção é diferenciada em 70 por cento de etanol que contém 1 por cento de HCL por cerca de 5 segundos para remover o excesso de corante e permitir que o nuclear surja,

Em seguida, é lavado em água da torneira,

5- Corar com eosina por 10 minutos,

6- Em seguida, lave por cerca de 1 a 5 minutos em água da torneira,

7- Desidratação, limpar e montar em um rack

Haematoxylin-Eosin Stain Kaposi's Sarcoma lesion - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Coloração de Papanicolaou

Isso também é conhecido como coloração de Papanicolaou ou esfregaço de Papanicolaou. É usado com o propósito de examinar amostras de células obtidas de fluidos corporais.

A técnica envolve a combinação de produtos químicos que incluem:

o Verde claro SF amarelado,

A solução diferenciadora ACCUMATE está pronta para uso. Um substituto da água da torneira de Scott é preparado através da mistura de uma parte do concentrado de substituto da água da torneira de Scott com 9 partes de água desionizada. Isso é seguido pela filtragem dos reagentes do sistema de coloração de papanicolaou antes do uso.

1- Fixe as lâminas em fixador acético por 15 minutos,

2- Álcool absoluto por dois minutos,

3- 70 por cento de álcool por 2 minutos,

4- em 50 por cento por 2 minutos

5- Água da torneira por 2 minutos,

6- profundamente em hematoxilina por 4 minutos,

7- Enxágüe rapidamente em água da torneira,

8- Diferencie-se em álcool ácido por cerca de 5 segundos,

10- Desidratar usando álcool absoluto duas vezes,

11- Mancha em laranja G por dez segundos,

12- Enxágüe em álcool absoluto duas vezes

13- Mancha em E.A 50 por dois minutos,

14- Mancha em álcool absoluto duas vezes,

15- Transparente em xileno três vezes,

16- Monte o slide em xileno três vezes,

a) Presença de corpo de psammoma na ausência de células atípicas no esfregaço cervicovaginal (coloração de Papanicolaou, 200 ×) b) Cistoadenofibroma ovariano seroso com corpos de psamoma parietal (Hematoxilina e Eosina, 100 ×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Ácido e fucsina básica Mancha

A fucsina ácida é um corante ácido magenta vermelho amplamente utilizado para a coloração de plasma, enquanto a fucsina básica é um corante magenta básico amplamente utilizado para corar o núcleo.

A técnica também é conhecida como coloração ácido-resistente. As bactérias ácido resistentes têm uma substância cerosa (ácido micólico) em sua parede celular que as torna impermeáveis ​​a procedimentos de coloração.

O termo ácido resistente é usado porque eles resistem à descoloração com álcool ácido. Carbol fucsina, a mancha primária contém fenol, que ajuda a solubilizar a parede celular, enquanto o calor é usado para aumentar a penetração da mancha.

Ao usar álcool para descolorir, as células ficarão descoloridas, exceto as ácido-resistentes. O azul de metileno é usado como contraste para qualquer célula que foi descolorada. No final do procedimento, as células álcool-ácido resistentes permanecem vermelhas / rosa, enquanto as células não-ácido-resistentes mantêm a cor azul.

Preparação de carbol fucsina pela mistura de duas soluções:

Solução 1- 0,2 gramas de fucsina básica e 10 ml de etanol a 95 por cento,

Solução 2- 5 gramas de fenol e 90 ml de água destilada,

1- Esfregue as larvas da polpa juntas de modo a permitir que a polpa se espalhe sobre a lâmina e deixe secar

2- Consertar o calor queimando sobre um queimador várias vezes,

3- Inundar usando 0,2 por cento de carbol fucsina por cerca de 30 segundos,

4- Lave a mancha e, em seguida, seque ao ar / secar suavemente antes do exame

Uma fotomicrografia de Mycobacterium smegmatis (rosa) e Micrococcus luteus (azul) ampliação de 1000x. Mycobacterium smegmatis é ácido-resistente, retendo o corante carbol-fucsina, aparentando ser rosa. Micrococcus luteus não é ácido-resistente, perde o carbol-fucsina durante a descoloração e é contra-corado com azul de metileno.

Imagem de: http://inst.bact.wisc.edu

Mancha de Wright

Este é um tipo Romanowsky de corante metacromático que é preparado pela mistura de corante azul de metileno especialmente tratado com eosina.

A porção ácida da mancha se une aos componentes básicos das células, como a hemoglobina, e, portanto, são denominados eosinofílicos e são corados em rosa ou vermelho.

Os componentes ácidos da célula, como os ácidos nucléicos, por outro lado, pegam o corante básico e se tingem de azul ou roxo.

O pH deve ser controlado usando um tampão de 6,4 a 6,7 ​​para evitar manchas ruins.

o Meça 1,0 grama de pó de tinta de Wright e 400 ml de metanol (álcool metílico),

o Adicione algumas contas de vidro para ajudar na dissolução e adicione o etanol à mancha,

o Misture bem em intervalos até que o pó esteja completamente dissolvido (faça isso aquecendo em banho-maria a 37 C para ajudar na dissolução),

o Rotule as garrafas e marque-as como inflamáveis ​​e tóxicas,

o Firmemente em cima e guarde em temperatura ambiente no escuro

1- Prepare um preenchimento da amostra e deixe secar em uma lâmina,

2- Prepare três recipientes, e preencha um com uma etapa de coloração de Wright e os outros dois com água destilada,

3- Mantenha a mancha bem coberta quando não estiver em uso para evitar a evaporação (sempre substitua a mancha quando ela se tornar insuficiente)

4- Sempre substitua a água destilada assim que a espuma iridescente começar a se formar na superfície, ou quando começar a ficar azul,

5- Mergulhe a lâmina na mancha por 15 a 20 segundos,

6- Mergulhe a lâmina em água destilada no segundo recipiente por 15-45 segundos,

7- Mergulhe a lâmina no recipiente 3 por 25 segundos usando mergulhos rápidos,

8- Limpe o verso do slide,

9- Seque a lâmina na posição vertical, sobre a superfície absorvente e evite borrar o esfregaço,

10- Aplique óleo para examinar microscopicamente,

Essas etapas devem ser repetidas duas vezes para esfregaços de medula óssea.

1- Prepare a amostra e deixe secar ao ar,

2- Coloque o slide em um rack,

3- Aplique a mancha de um passo de Wright usando frascos conta-gotas,

4- Espere cerca de 15-30 segundos e adicione volumes semelhantes de água destilada,

5- Despeje a mistura de mancha e água da lâmina,

6- Mergulhe a lâmina em água destilada por cerca de 25 segundos usando mergulhos rápidos,

7- Limpe a parte de trás do slide,

8- Seque a lâmina na posição vertical do lado absorvente e evite borrar o esfregaço,

Essas etapas devem ser repetidas duas vezes para amostras de medula óssea.

Imagem de: http://www.vetmed.vt.edu

Coloração de Gram

Esta é uma das técnicas de coloração mais comuns.

É amplamente utilizado para diferenciar espécies de bactérias como gram positivas ou gram negativas. Isso é obtido por meio das propriedades químicas das paredes das células bacterianas, onde diferentes cores são exibidas após a coloração.

Essa técnica é baseada no fato de que a parede celular do Gram positivo tem uma forte atração pelo cristal violeta após a adição de iodo, em comparação com a parede celular do Gram negativo.

O iodo é o mordente e forma um complexo com o violeta cristal, que é facilmente removido da parede celular gram-negativa com álcool etílico.

Coloração celular em Microscopia é útil e necessário para destacar aqueles elementos estruturais de sua amostra / espécime a serem devidamente observados. Existem outros que o MicroscopeMaster pode cobrir no futuro, então marque esta página e visite novamente para ver mais informações sobre coloração.

Saiba mais sobre cultura celular, divisão celular, diferenciação celular, bem como tipos e técnicas de cultura de tecidos. E dê uma olhada nas razões para considerar a compra de um Kit de coloração de microscópio.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Técnica patológica. Filadélfia e Londres. W.B. Sunders Company. Copyright, 1938, por W.B. Sunders Company. Reimpresso em junho de 1942 e setembro de 1944. Pgs. 70 e 9

Johnson PL, Klein MN: Aplicação da coloração de Papanicolaou em seções de parafina. Stain Technol 31: 223, 1956

Delisle, G. e L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, American Society for Microbiology, Washington, DC.

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Células de suspensão de subcultura

Os seguintes protocolos descrevem procedimentos gerais para a subcultura de células de mamíferos em cultura em suspensão. Observe que o procedimento para passagem de células de insetos difere daquele para células de mamíferos em várias etapas cruciais. Para obter mais informações, consulte Notas sobre a subcultura de células de insetos.

Para a passagem de sua própria linha celular, recomendamos que você siga de perto as instruções fornecidas com cada produto que estiver usando em seus experimentos. As consequências de se desviar das condições de cultura necessárias para um determinado tipo de célula podem variar desde a expressão de fenótipos aberrantes até uma falha completa da cultura de células.

Passando Culturas de Suspensão
A subcultura de células em suspensão é um pouco menos complicada do que a passagem de células aderentes. Como as células já estão suspensas no meio de crescimento, não há necessidade de tratá-las enzimaticamente para destacá-las da superfície do recipiente de cultura, e todo o processo é mais rápido e menos traumático para as células. A substituição do meio de crescimento não é realizada em culturas em suspensão, em vez disso, as células são mantidas alimentando-as a cada 2 a 3 dias até que atinjam a confluência. Isso pode ser feito diluindo diretamente as células no frasco de cultura e continuando a expandi-las, ou retirando uma parte das células do frasco de cultura e diluindo as células restantes até uma densidade de semeadura apropriada para a linha celular. Normalmente, o período de latência após a passagem é mais curto do que o observado com culturas aderentes.


Desagregação de Tecido

Mincing Tissues

Após a dissecção dos tecidos sólidos de um organismo, antes da introdução das enzimas digestivas, os tecidos devem ser enxaguados para limpar qualquer sangue ou outro material indesejado. Os tecidos devem ser picados e dispersos com tesoura, bisturi ou lâmina para aumentar a área de superfície total. Isso aumenta o contato entre as enzimas e a superfície dos tecidos, levando a uma digestão mais eficiente e completa, ao mesmo tempo que encurta o tempo necessário para a digestão.

Enzimas

Os tecidos mantêm as células unidas, apoiadas por matriz extracelular e junções célula-célula formadas por um conjunto diversificado de proteínas e outras moléculas biológicas que requerem enzimas específicas para uma digestão adequada e remoção da suspensão celular. As enzimas digestivas que desempenham um papel essencial na desagregação dos tecidos sólidos estão resumidas na Tabela 1. A primeira categoria de enzimas a considerar são aquelas enzimas que quebram a matriz extracelular. Dispase é uma protease neutra comumente usada isolada de bactérias, com alto nível de especificidade enzimática para colágeno IV e fibronectina 21, 22. Dispase é útil no desprendimento de colônias de células e na dissociação de pedaços de tecido em pequenos grupos de células, pois funciona para clivar ligações entre células e a matriz extracelular sem afetar as junções célula-célula 23. No entanto, deve-se ter cuidado ao digerir tecidos com dispase, pois ela é capaz de clivar moléculas de superfície ou antígenos relevantes específicos, como aqueles ligados à análise de células T 24, 25. Portanto, omitir dispase do tampão de digestão pode ser útil se uma perda de epítopos for observada. Também eficaz na desagregação da matriz extracelular é a colagenase. A colagenase é capaz de quebrar as ligações peptídicas presentes no colágeno, o que ajuda a digerir a matriz extracelular, liberando as células em suspensão. É importante observar que as enzimas colagenase purificadas são mais eficazes do que a colagenase tradicional derivada naturalmente de bactérias, pois há menor variabilidade na composição da enzima purificada, aumentando a estabilidade das células ao longo da digestão tecidual 26. A última enzima a ser considerada na digestão da matriz extracelular em tecidos sólidos é a hialuronidase. O hialuronano, um proteoglicano estrutural da matriz extracelular, é degradado pela família de enzimas hialuronidase, que são produzidas em organismos bacterianos e vertebrados. Essas enzimas hialuronidases clivam a ligação β1,4-glicosídica presente na porção glicosaminoglicana do hialuronano 27, contribuindo para a digestão da matriz extracelular.

- Destrói a matriz extracelular

-Freia ligações entre as células e a matriz extracelular

- Destrói a matriz extracelular

- Rompe as ligações peptídicas presentes no colágeno

- Destrói a matriz extracelular

-Freia ligações glicosídicas em hialuronano

- Evita a agregação de células

-Freia as junções célula-célula

- Não altera a expressão do antígeno como a tripsina faria

O próximo grupo de enzimas a ser considerado na preparação de uma suspensão de célula única inclui as enzimas que quebram as junções célula-célula. A tripsina é uma protease natural sintetizada no sistema digestivo de organismos vertebrados. Embora seja útil na degradação de certas proteínas presentes nas junções célula-célula, a tripsina também tem um efeito muito severo nas proteínas da membrana celular 1. Além disso, a tripsina mostrou levar à agregação de células induzida por DNA livre, o que indica que a lise celular está ocorrendo dentro da suspensão 28. Portanto, a tripsina é tradicionalmente evitada na preparação de uma única suspensão de células de tecidos sólidos para experimentos de citometria de fluxo. A papaína é uma protease alternativa derivada da planta do mamão. A papaína é conhecida por degradar as proteínas que constituem as junções herméticas entre as células 29. No entanto, como a tripsina, a papaína mostrou levar à agregação de células induzida por DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática 28.

O último tipo de enzima a ser considerado na preparação de uma suspensão de célula única é a desoxirribonuclease (DNase), que atua clivando as ligações fosfodiéster da estrutura do DNA. Os dois principais tipos de DNase são DNase-I e DNase-II, que possuem funções enzimáticas ligeiramente diferentes. A DNase-II não é adequada para a preparação de uma suspensão de célula única, pois desempenha um papel nas vias de degradação do DNA mediadas por engulfment envolvidas na apoptose 30, 31. A DNase-I é apropriada para a digestão de tecidos e preparação de uma suspensão de célula única, pois evita a agregação de células ao degradar o DNA livre liberado por lise de células mortas durante a digestão enzimática, sem iniciar as vias apoptóticas. Cloreto de cálcio (CaCl2) atua como um ativador enzimático da DNase-I e, portanto, é introduzido no coquetel de digestão durante a digestão enzimática. Os íons cálcio (Ca 2+) se ligam fortemente à enzima DNase-I para estabilizar sua conformação ativa e permitir a degradação adequada do DNA livre 32.

Para evitar os possíveis problemas causados ​​pela adição das enzimas acima a um coquetel de digestão de tecidos, coquetéis de digestão disponíveis comercialmente foram desenvolvidos e otimizados. Accutase é uma mistura de protease e colagenase disponível comercialmente que imita a ação da tripsina e colagenase, mas o faz em uma concentração muito mais baixa do que a necessária ao usar as enzimas padrão. Accutase contém uma mistura de enzimas com atividade proteolítica, colagenolítica e DNase e produz um maior rendimento celular total e melhor preservação geral do antígeno quando comparado com o uso de um coquetel de enzimas semelhantes para a digestão de tecidos 33, 34. TrypLE é outro coquetel de enzimas disponível comercialmente contendo enzimas recombinantes purificadas que mimetizam a atividade da tripsina sem alterar a expressão dos antígenos da superfície celular 35. Este produto evita os problemas que surgem com o uso de tripsina na digestão de tecidos e permite uma melhor sobrevivência celular e uma preparação de suspensão de célula única mais eficiente.

Dissociação Enzimática e Mecânica

A dissociação enzimática é realizada pela introdução de um coquetel de digestão em tecidos sólidos picados e incubando a temperaturas específicas, com base no coquetel de enzimas que está sendo usado. As enzimas podem ser específicas da temperatura e, portanto, funcionam com velocidade e eficiência máximas em uma determinada temperatura, geralmente 37 ° C. Dependendo das enzimas específicas, a dissociação enzimática também pode ser realizada a 4 ° C ou em gelo. Essas temperaturas mais baixas provavelmente diminuirão a taxa de reação das enzimas e estenderão o período de incubação, mas podem ajudar a minimizar a morte celular. A força da enzima e a concentração da enzima são os dois fatores mais importantes a serem considerados ao escolher um coquetel de digestão para a preparação de uma suspensão de célula única para citometria de fluxo. Enzimas com alta força ou alta concentração podem comprometer marcadores de superfície celular presentes nas células, o que pode afetar a disponibilidade desses marcadores e a viabilidade das células em experimentos futuros. Portanto, células levemente aderentes, como linfócitos, devem ser isoladas usando um curto período de digestão com uma enzima suave ou leve para evitar esses problemas 36. A determinação da força e concentração ideais das enzimas usadas na dissociação enzimática é empírica e crítica para o isolamento adequado das células e a digestão bem-sucedida dos tecidos.

A dissociação mecânica desempenha um papel na preparação de uma suspensão de células únicas de tecidos sólidos ao longo da dissociação enzimática. Para auxiliar na dissociação mecânica dos tecidos, pela qual as células são liberadas da matriz extracelular em suspensão, a digestão enzimática pode ser realizada em um agitador orbital. Após a dissociação enzimática, a suspensão deve ser filtrada para excluir quaisquer pedaços de tecido não digeridos ou agregados da suspensão de célula única recém-preparada.


16: Mancha Simples

Para corar a amostra bacteriana para microscopia, deve-se primeiro preparar o esfregaço na lâmina. Isso envolve basicamente três etapas - transferir uma suspensão líquida da bactéria na lâmina, secar o esfregaço e aquecer ligeiramente para fixar firmemente o esfregaço na lâmina. Feito isso, o procedimento de coloração começa.

NÃO deixe suas suspensões de esfregaço muito espessas. O corante não penetrará bem e haverá muitas células bacterianas para ver as formas e arranjos individuais. É preciso ter cuidado com esfregaços espessos ao retirar a amostra de um meio de ágar.

RECOMENDAÇÃO: Você pode achar útil desenhar um círculo (lápis de cera é melhor) no lado oposto do slide, onde você espalhará o esfregaço. Isso o ajudará mais tarde a localizar o esfregaço, às vezes um problema ao mover a lâmina para frente e para trás à procura de bactérias. O lápis de cera é melhor do que um marcador porque não sai facilmente do vidro.


Procedimento

    Obtenha uma suspensão uniforme de células: Siga o protocolo de neutralização de typsinization / tripsina para o tipo de célula específico. Coloque a suspensão de células em um tubo cônico de centrífuga de tamanho adequado. Para que uma contagem precisa de células seja obtida, uma suspensão uniforme contendo células individuais é necessária. Pipete a suspensão de células para cima e para baixo no tubo 5-7 vezes usando uma pipeta com um pequeno orifício (pipeta de 5 ml ou 10 ml). Para células descongeladas da criopreservação (em 1ml de meio de criopreservação), pipete para cima e para baixo 7-10 vezes usando uma pipeta de 1ml.

Para uma determinação precisa, o número total de células que recobrem 1 mm 2 deve estar entre 15 e 50. Se o número de células por 1 mm 2 exceder 50, dilua a amostra e conte novamente. Se o número de células por 1 mm 2 for inferior a 15, use uma amostra menos diluída. Se amostras menos diluídas não estiverem disponíveis, conte as células em ambos os lados do hemocitômetro (áreas de 8 x 1 mm 2).

Mantenha uma contagem separada de células viáveis ​​e não viáveis. Se mais de 25% das células forem inviáveis, a cultura não está sendo mantida na quantidade adequada de meio. Reincubar a cultura e ajustar o volume da mídia de acordo com a confluência das células e a aparência da mídia. Incluir células na parte superior e esquerda tocando a linha média. As células que tocam a linha média na parte inferior e direita não são contadas.

eu. Trypan Blue é a "mancha vital" excluída das células vivas.
ii. As células vivas aparecem incolores e brilhantes (refratárias) sob o contraste de fase.
iii. As células mortas ficam coradas de azul e não são refratárias.

  • % De viabilidade celular = [células viáveis ​​totais (não coradas) / células totais (viáveis ​​+ mortas)] X 100.
  • Células viáveis ​​/ ml = contagem média de células viáveis ​​por quadrado x Fator de diluição x 10 4 /
  • Contagem média de células viáveis ​​por quadrado = Número total de células viáveis ​​em 4 quadrados / 4.
  • Fator de diluição = Volume total (Volume da amostra + Volume do líquido diluente) / Volume da amostra.
  • Células viáveis ​​totais / Amostra = Células viáveis ​​/ ml x O volume original de fluido do qual a amostra de células foi removida.
  • Volume de mídia necessária = (número de células necessárias / número total de células viáveis) x 1000.

Conclusões

O protocolo de isolamento de HTF apresentado aqui é um método simples e rápido para obter um grande número de células (1,3 × 10 6 fibroblastos positivos para vimentina) a partir de uma única biópsia de trabeculectomia de 2–3 mm × 1 mm em aprox. 25 dias. Nosso protocolo pode permitir a fácil configuração de bancos de células em condições de laboratório e para novos testes de drogas oftalmológicas in vitro. Também foi demonstrado que 5% de FGF-EMEM é uma escolha melhor do que 10% de DMEM para propagação rápida de HTFs antes da preparação dos experimentos. No entanto, no caso de estudos que objetivam avaliar o efeito de um agente testado na taxa de proliferação ou capacidade de produção de colágeno tipo I, 5% de FGF-EMEM deve ser usado apenas para isolamento de HTFs, e então 10% de DMEM deve ser aplicado para configuração experimental, uma vez que 5% de FGF-EMEM afeta significativamente as divisões celulares e a capacidade de formação de ECM dos fibroblastos.


Protocolos de preparação de amostras

A microscopia confocal estava se tornando mais do que apenas uma novidade no início dos anos 1980, devido ao aumento nas aplicações da fluorescência de campo amplo para investigar a arquitetura e função celular. Como as técnicas de imunofluorescência, bem como a coloração de estruturas subcelulares usando fluoróforos sintéticos, tornaram-se amplamente praticadas no final da década de 1970, os microscopistas ficaram cada vez mais frustrados com sua incapacidade de distinguir ou registrar detalhes finos em instrumentos de campo amplo devido à interferência pela emissão de fluorescência que ocorre acima e abaixo o plano focal. Hoje, a microscopia confocal, quando acoplada à aplicação de novos fluoróforos sintéticos avançados, proteínas fluorescentes e reagentes de imunofluorescência, é um dos métodos mais sofisticados disponíveis para sondar a estrutura subcelular. Os protocolos descritos nesta seção abordam as técnicas de preparação de espécimes usando fluoróforos sintéticos acoplados à imunofluorescência que são necessários para investigar células aderentes fixas e criosseções de tecido usando microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal.

Dois dias após a indução do tamoxifeno, as células epiteliais na fossa interpapilar expressam cores aleatórias, indicando que múltiplos clones proliferaram independentemente. Porém, após 84 dias, cada fossa interpapilar foi ocupada por células de uma única cor, indicando que são derivadas de células-tronco monoclonais. (Nature Cell Biology 15, 511-518, 2013)

Os dados da imagem são cortesia de:
Hiroo Ueno (Ph.D.)
Departamento de Patologia de Células-Tronco, Kansai Medical University

Apresentada na Figura 1, está uma imagem confocal de varredura a laser revelando a extensa rede filamentosa de actina presente no tecido muscular liso de uma criossecção fina (8 micrômetros) do diafragma de rato. A criosseção do tecido foi marcada com um coquetel contendo Alexa Fluor 488 conjugado com faloidina (coloração com actina) e Texas Red-X conjugado com aglutinina de gérmen de trigo (lectinas direcionadas). Além disso, os núcleos da amostra foram contrastados com Hoechst 33342. As imagens foram registradas em escala de cinza com um Olympus FluoView FV1000 acoplado a um microscópio invertido IX81 usando íon de argônio (linha de 488 nanômetros), diodo violeta (405 nanômetros) e hélio verde. lasers de néon (543 nanômetros). Durante o estágio de processamento, canais de imagem individuais foram pseudocolorados com valores RGB correspondentes a cada um dos perfis espectrais de emissão de fluoróforo.

Protocolos de coloração

Células aderentes de coloração tripla com MitoTracker, Phalloidina (ou Phallacidina) e Corantes Nucleares

A vitalidade e as propriedades físicas das células aderentes cultivadas em lamelas em placas de Petri podem ser determinadas usando uma combinação de manchas fluorescentes. Este protocolo detalha um procedimento generalizado para a coloração de uma variedade de tipos de células.

Coloração de células aderentes com anticorpos primários de filamento intermediário e fluoróforos sintéticos

Fibroblastos e linhas de células epiteliais derivadas de humanos e animais de laboratório produzem espécimes fluorescentes de cores vivas destacando proteínas específicas na rede de filamentos intermediários quando corados.

Coloração de células e criosecções de tecido com anticorpos primários de tubulina, falotoxinas e fluoróforos sintéticos

Linhas celulares e seções de tecido de mamíferos derivadas de humanos e animais de laboratório, incluindo intestino, rim, testículos, músculos, fígado e pulmões, produzem espécimes fluorescentes de cores vivas.

Coloração de células aderentes com anticorpos primários de citoqueratina e fluoróforos sintéticos

Linhas de células epiteliais derivadas de humanos e animais de laboratório produzem espécimes fluorescentes de cores vivas detalhando a rede de filamentos intermediários de citoqueratina quando corados com anticorpos de queratina.

Criosecções de tecido com coloração tripla com aglutinina de germe de trigo, faloidina e corantes nucleares

A maioria das seções de tecido comuns derivadas de animais de laboratório, incluindo intestino, rim, testículos, músculos, fígado e pulmões, produzem espécimes fluorescentes de cores vivas, detalhando uma ampla variedade de características anatômicas quando coradas.

Imunofluorescência com criosecções de tecido cerebral

Entre os alvos de anticorpos frequentemente marcados em seções de tecido cerebral estão a proteína glial fibrilar ácida (GFAP), neurofilamentos neuronais e axonais, classe III beta-tubulina, proteínas associadas a microtúbulos, proteínas de barreira hematoencefálica e antígenos associados a doenças específicas.

Imunofluorescência com criosseções flutuantes do tecido cerebral

A imunofluorescência indireta é uma técnica que permite a visualização de alvos específicos usando uma combinação de anticorpos primários e secundários. Este protocolo detalha um procedimento para a coloração de criosseções flutuantes de cérebro congelado com mais de 30 micrômetros de espessura.

Autores Contribuintes

Nathan S. Claxton, Gregory K. Ottenberg, John D. Griffin, Scott G. Olenych, e Michael W. Davidson - Laboratório Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Flórida, 32310.


Protocolo de citometria de fluxo: coloração com marcador de superfície celular

Observação: Este método é adequado para a coloração da superfície celular em citometria de fluxo.

Os marcadores de superfície celular são expressos na superfície celular e podem ser usados ​​para definir subtipos celulares, bem como funcionar quando são marcados com anticorpos marcados com fluorescência e analisados ​​por citometria de fluxo. As those surface proteins are accessible to the antibodies, they can be easily stained without permeabilization steps which are critical to intracellular staining.

  • PBS: Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.15 g Na2HPO4 and 0.2 g KH2PO4 in 800 mL distilled water. Adjust the pH to 7.4 with HCl and final volume to 1 liter with additional distilled H2O.
  • Cell staining buffer: Add 0.5% BSA and 0.05% Sodium Azide (NaN3) to PBS.
  • Fc receptor binding reagents
  • Conjugated primary antibodies
  • Conjugated secondary antibodies, if needed

Sample preparation:

1. Harvest the desired tissues and cells, prepare a single cell suspension and adjust the suspension to a concentration of 1 x 10 6 cells/mL in cell straining buffer.

Blocking Fc-receptors (optional):

2. Blocking Fc receptors is useful to reduce non-specific immunofluorescent staining. Add 1 μg of Fc receptors binding reagents per 1 x 10 6 cells and incubate for 10 minutes at room temperature.

  • For mouse cells, purified anti-mouse CD16/CD32 antibody specific for Fcγ R III/II (cat. no. CABT-45660RM) can be used to block the Fc receptors.
  • For human cells, purified human Fc receptor binding inhibitor solution can be used to eliminate non-specific staining.
  • In the absence of an effective/available blocking antibody for Fc receptors, an alternative approach is to block cells with excess irrelevant purified IgG from the same species and same isotype as the antibodies used for immunofluorescent staining.

Observação: Do not wash excess blocking reagents from this reaction.

3. Add appropriately primary antibody with previously determined optimum concentration and vortex. Incubate on ice for 15 to 30 minutes.

Observação: If using primary antibodies directly conjugated with fluorochrome, the incubation should be carried out in the dark, and then skip to Step 7.

4. Wash cells with cell staining buffer to remove any unbound antibodies. Centrifuge at 300-400 x g for 5 minutes at 4°C and discard supernatant.

6. Add an appropriate fluorescent-conjugated secondary antibody with recommended concentration. Incubate on ice for 15-20 min in the dark.

7. Repeat Step 4 three times.

8. Resuspend cell in 200-500 uL cell staining buffer for final flow cytometric analysis.


Immunofluorescence protocol (IF protocol)

Immunofluorescence is one of the widely used techniques in modern biology and medicine, and it is developed by Coons et al. (1950), and it is a combination of immunofluorescence technique and morphological technology to develop immune fluorescent cells (or tissue). The development of fluorescence immunoassay technology is very fast in recent years, especially in the field of medical, biological and environmental studies, it is widely used in the determination of endocrine hormones, growth factors, proteins, nucleic acids, neurotransmitters, receptors, in vivo drug and infectious sources, and so on, these subjects have been developed. According to the detection of different samples can be divided into three major categories.
There are two different immunofluorescence assay which include indirect immunofluorescence assay and direct immunofluorescence assay.For indirect immunofluorescence assay, the protocol mainly include tissue or cell preparation, tissue or cell fixation, serum blocking, primary antibody incubation, marked second antibody incubation, staining, result judgment and imaging. For direct immunofluorescence assay, there are only marked primary antibody been incubated without second antibody and other steps are same.
For direct immunofluorescence assay, specific fluorescent antibody was prepared by the combination of specific antibodies and fluorescein. It is the most simple and fast method for the examination of cell or tissue antigen. This method is highly specific and is commonly used in renal biopsy and pathogen examination. Its disadvantage is that a fluorescent antibody can only examine one kind of antigen, which is less sensitive. For indirect immunofluorescence assay, specific antibodies against the corresponding antigen, fluorescein labeled anti - antibody (anti - specific IgG fluorescent antibody) and the primary antibody
Although the basic steps and principles of immune fluorescence are the same, but because of the specific conditions are not the same, the detailed operation steps of each laboratory will not be exactly the same. For example, the use of the solution, the fixed liquid and antibody dilution liquid will be slightly different. Here to give a more common method, the detailed use of the operation can be based on the steps to adjust and change, and ultimately determine the most appropriate method for youself.

Indirect Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each
11. Incubate samplels with fluorochrome-conjugated secondary antibody at appropriate dilution in PBS for 1 hour at 37°C in dark(optimal condition should be confirmed in different l aboratory)
12. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
13. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
14. Mount samples with a drop of mounting medium

Direct Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with fluorochrome- conjugated primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
11. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
12. Mount samples with a drop of mounting medium


Assista o vídeo: El subcultivo de células en monocapa. Video 2 (Janeiro 2022).