Em formação

Por que as subunidades ribossômicas 60S e 40S fazem um ribossomo 80S (não 100S)?


Por que as subunidades 60S e 40S fazem um ribossomo 80S (não 100S) e, da mesma forma, 50S e 30S fazem 70S? 60 + 40 não é igual a 80, nem 50 + 30 é igual a 70, então por que as subunidades dos ribossomos 80S e 70S têm nomes tão esquisitos? Não consegui encontrar nenhuma outra explicação matemática.


Isso não é uma adição matemática simples!

Se essas unidades fossem massa, por exemplo, você pode (e deve) adicioná-los: uma peça de Lego de 60g combinada com uma peça de Lego de 40g formará, naturalmente, um combo de 100g.

No entanto, esses números são unidades Svedberg, o que é ...

uma unidade não métrica para a taxa de sedimentação [...] O coeficiente de Svedberg é um não linear função. A massa, densidade e forma de uma partícula determinarão seu valor S. (ênfase minha)

Curiosamente, a maioria dos meus alunos achava que S significa Sedimentação. No entanto, é uma homenagem a Theodor Svedberg, vencedor do Prêmio Nobel de Química em 1926.

Assim, em uma explicação simplificada demais, o ribossomo procariótico tem duas subunidades. Os grandes sedimentos da subunidade aos 50s, os sedimentos das pequenas subunidades aos 30s, mas os dois juntos (isto é, todo o ribossomo) sedimentos aos 70s, não aos 80s.

Da mesma forma que um ribossomo eucariótico tem uma grande subunidade que sedimenta aos 60s, uma pequena que sedimenta aos 40s, mas toda a estrutura sedimenta aos 80s, não aos 100s.

Além disso, os rRNAs que constituem as subunidades também têm suas próprias taxas de sedimentação (em unidades svedberg):

Para uma explicação detalhada com toda a matemática de que você precisa, as outras respostas aqui e aqui explicam-na lindamente.


Quando uma mistura complexa de partículas sofre ultracentrifugação, elas se separam com base em sua forma e massa devido à força aplicada pela centrífuga e à força de atrito contrária ao solvente. Você pode ler mais sobre este procedimento aqui. S significa Svedberg, que é uma medida da taxa de sedimentação de uma partícula. Isso é dado pela fórmula $ s = frac {v} {a} $ onde $ s $ é o coeficiente de sedimentação e $ v $ é a velocidade que uma partícula se move quando uma aceleração, $ a $, é aplicada.

Um svedberg é definido como exatamente 10−13 s. Essencialmente, o coeficiente de sedimentação serve para normalizar a taxa de sedimentação de uma partícula pela aceleração aplicada a ela. O valor resultante não depende mais da aceleração, mas depende apenas das propriedades da partícula e do meio em que está suspensa. Os coeficientes de sedimentação citados na literatura geralmente pertencem à sedimentação em água a 20 ° C.

Uma partícula 1S, por exemplo, se moveria em 10-13 m / s quando uma aceleração de 1 g é aplicada (ignorando a difusão).

O que é importante perceber é que a taxa de sedimentação de uma partícula depende não apenas de sua massa, mas também de sua forma (entre outras coisas), uma vez que sua área de seção transversal determina a força de atrito efetiva que ela experimenta.

Quando isso foi feito com E. coli extratos, picos foram observados em 32S, 51S, 70S e 100S, dependendo do Mg2+ concentração. Os pesquisadores concluíram que os picos 32S e 51S eram componentes do pico 70S e que o pico 100S era um dímero de duas partículas 70S. Eles também determinaram que a massa da partícula 50S era cerca do dobro da massa da partícula 30S que, juntos, somavam a massa da partícula 70S.


As outras duas respostas fornecem detalhes interessantes, então quero dar uma resposta um pouco mais matemática aqui.

Em primeiro lugar, o S de que você está falando são as unidades de Svedberg (de coeficiente de sedimentação, em homenagem ao químico sueco Theodor Svedberg), usadas para caracterizar o comportamento de uma partícula no processo de sedimentação, especialmente a centrifugação. Um svedberg corresponde a exatamente 10-13 segundos (veja outras respostas para mais detalhes).

Agora, vamos começar com as equações. O coeficiente de sedimentação é escrito na equação como:

$ s = frac {v_t} {a} $

onde $ v_t $ é a velocidade terminal. A velocidade terminal de uma partícula em um determinado meio é constante porque a força da gravitação (ou centrifugação) é cancelada pela força viscosa do meio. Nesse caso, a velocidade terminal é calculada como a razão da força centrífuga para a resistência viscosa (da lei de Stoke) e sua equação torna-se:

$ v_t = frac {mr omega ^ 2} {6 pi eta r_0} $

Além disso, aceleração centrífuga:

$ a = r omega ^ 2 $

Colocando o valor de $ v_t $ e $ a $ na primeira equação:

$ s = frac {v_t} {r omega ^ 2} = frac {m} {6 pi eta r_0} $

Como você pode ver, embora o coeficiente de sedimentação seja a razão entre a velocidade terminal e a aceleração centrífuga, ele não depende de nenhum deles! Agora, todas as outras coisas são constantes e a massa seria adicionada linearmente. Então, por que o valor de $ s $ diminui? É por causa da adição não linear de $ r_0 $ (raio). Veja o diagrama abaixo:

É claramente visível agora que as subunidades não apenas se misturam (como duas gotículas de óleo se juntando para formar uma gota maior), a subunidade pequena se encaixa na subunidade grande (a forma real varia, mas aproximadamente a forma é assim ) Isso torna o valor médio de $ r_0 $ do ribossomo maior do que a soma do valor médio de $ r_0 $ das subunidades, ou seja, $ r_0 (pequeno) + r_0 (grande)

Referências:

  • Coeficiente de sedimentação - Wikipedia

  • Diferença entre ribossomo 70S e 80S


Ribossomo eucariótico

Os ribossomos são uma grande e complexa máquina molecular que catalisa a síntese de proteínas, conhecida como tradução. O ribossomo seleciona RNAs de transferência aminoacilados (tRNAs) com base na sequência de um RNA mensageiro que codifica uma proteína (mRNA) e liga covalentemente os aminoácidos em uma cadeia polipeptídica. Ribossomos de todos os organismos compartilham um centro catalítico altamente conservado. No entanto, os ribossomos de eucariotos (animais, plantas, fungos e um grande número de organismos unicelulares, todos com núcleo) são muito maiores do que os ribossomos procarióticos (bacterianos e arqueanos) e sujeitos a vias de regulação e biogênese mais complexas. [1] [2] Ribossomos eucarióticos também são conhecidos como ANOS 80 ribossomos, referindo-se a seus coeficientes de sedimentação em unidades de Svedberg, porque eles sedimentam mais rápido do que os ribossomos procarióticos (70S). Os ribossomos eucarióticos têm duas subunidades desiguais, designadas subunidade pequena (40S) e subunidade grande (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. Ambas as subunidades contêm dezenas de proteínas ribossômicas organizadas em um arcabouço composto de RNA ribossômico (rRNA). A subunidade pequena monitora a complementaridade entre o anticódon tRNA e o mRNA, enquanto a subunidade grande catalisa a formação de ligações peptídicas.


Diferença entre ribossomos 80S e 70S

A próxima discussão irá atualizá-lo sobre as diferenças entre os Ribossomos 80S e 70S.

Diferença # Ribossomos 80S:

1. Eles ocorrem apenas em células eucarióticas.

2. Eles ocorrem dentro do citoplasma de eucariotos livremente ou anexados ao ER.

3. Os ribossomos são maiores em tamanho, com comprimento de (300—340 A) e largura (200—240 A).

4. O coeficiente de sedimentação é 80.

5. Eles são comparativamente mais pesados, 4,0—4,5 milhões de Daltons.

6. As duas subunidades são 40S e 60S.

7. Os rRNAs dos ribossomos BOS são 28S + 5.8S + 5S na subunidade maior e 18S na subunidade menor.

8. Os ribossomos possuem menos rRNA em comparação com a proteína (40: 60).

9. Os ribossomos 80S são sintetizados dentro do nucléolo.

10. Ele contém cerca de 73 moléculas de proteína, 40 na subunidade maior e 33 na subunidade menor.

11. A síntese de proteínas não é inibida por antibióticos comuns como o cloranfenicol.

Diferença # Ribossomos 70S:

1. Os ribossomos 70S são encontrados tanto em procariotos quanto em eucariotos.

2. Os ribossomos são encontrados livremente dentro do citoplasma de procariotos e matriz de plastídeos e mitocôndrias de eucariotos.

3. Eles são comparativamente menores, com um comprimento de (200—290 A) e um diâmetro de (170— 210 A).

4. O coeficiente de sedimentação é 70.

5. Os ribossomos 70S são comparativamente mais leves, 2,7-3,0 milhões de daltons.

6. As duas subunidades são 30S e 50S.

7. Os rRNAs dos ribossomos 70S são 23S + 5S (subunidade maior) e 16S (subunidade menor).

8. Os ribossomos contêm mais rRNA do que proteína (60:40).

9. Os ribossomos 70S são sintetizados no citoplasma de procariotos e na matriz de organelas celulares semiautônomas.

10. Possui cerca de 55 moléculas de proteína, 34 na subunidade maior e 21 na subunidade menor.


O que são ribossomos eucarióticos

Os ribossomos eucarióticos são os grandes ribossomos que ocorrem apenas nas células eucarióticas, como animais, plantas, fungos e outros organismos eucarióticos unicelulares. Sua subunidade grande é 60S e a subunidade pequena é 40S.

Ribossomos eucarióticos (R. norvegicus)

Subunidade Grande (60 S)

Subunidade pequena (40S)

& # 8211 28S rRNA (4718 nucleotídeos)

& # 8211 18S rRNA (1874 nucleotídeos)

Figura 2: Função Ribossomo

A maioria dos ribossomos eucarióticos são ligados à membrana, mas alguns estão livres no citoplasma. A principal função de um ribossomo é servir como um local para a síntese de proteínas, facilitando a ligação de aminoácidos em uma ordem especificada pelo mRNA. Este processo é conhecido como tradução. Além disso, os ribossomos também são chamados de aparelhos translacionais.


Q: Baleia é praga Descreva em detalhes o ciclo de vida do palhogênio que causa a requeima na Polônia

R: Existem diferentes tipos de doenças de plantas observadas na Terra. Cada um deles é causado por bactérias.

A: TRADUÇÃO DE INFORMAÇÕES BÁSICAS (FORMAÇÃO DE PROTEÍNAS) É o processo no qual a proteína se forma.

Q: Em gatos, a cor preta do pelo é causada por um alelo ligado ao X que o outro alelo neste locus causa oran.

R: A questão está relacionada à inativação do cromossomo X em fêmeas mamíferas. Um dos cromossomos X.

P: Identifique os componentes do sistema digestivo humano na ilustração a seguir.

R: Os humanos têm um sistema digestivo complicado que consiste no canal alimentar e vários tipos de d.

Q: Estriações, células cilíndricas e múltiplos núcleos são observados em ________. uma. músculo esquelético apenas.

R: O músculo é um dos tipos de tecido mole no qual as células contêm filamentos de proteínas de actina e.

P: O que acontece com os açúcares que as plantas produzem?

R: O açúcar é gerado nas folhas das plantas pela fotossíntese e é transportado pelo oligossacarídeo.

P: Quais seriam as consequências se os pássaros e insetos não tivessem estruturas que podem se dispersar ou refazer.

R: A dispersão ou refração da luz é um fenômeno que ajuda os animais a funcionar adequadamente e.

P: O que é Scabp Descreva no ciclo de vida debail Venturia inaequalis.

R: Venturia inaequalis é um fungo ascomiceto pertencente ao filo Ascomycota, classe Dotideomiceto.

P: O primeiro tipo de osso a se formar durante o reparo da fratura é o osso ________. uma. compacto b. lamelar c. sp.

R: O osso é o tecido conjuntivo formado por quatro tipos de células que são células de revestimento ósseo, osteocl.


Qual é a aparência dos ribossomos?

Clique para ler os detalhes completos aqui. Conseqüentemente, qual é a forma real do ribossomo?

Ribossomos parecem achatados e esféricos em forma quando visto em um microscópio eletrônico, com um diâmetro variando entre 15 a 25 nm. Essas estruturas são compostas por duas subunidades principais de ribonucleoproteínas.

Da mesma forma, como os ribossomos se parecem em uma célula? Ribossomos são os construtores de proteínas ou os sintetizadores de proteínas do célula. Retículo endoplasmático com ribossomos é chamado de ER bruto. Isto visual acidentado sob um microscópio. O anexo ribossomos fazer proteínas que serão usadas dentro do célula e proteínas feitas para exportação fora do célula.

Também saber, qual é a estrutura de um ribossomo?

Ribossomos consistem em dois componentes principais: o pequeno ribossomal subunidades, que lêem o mRNA, e as subunidades grandes, que unem aminoácidos para formar uma cadeia polipeptídica. Cada subunidade consiste em um ou mais ribossomal Moléculas de RNA (rRNA) e uma variedade de ribossomal proteínas (proteína r ou proteína r).

Onde os ribossomos são encontrados?

Ribossomos estão encontrado 'livre' no citoplasma ou ligado ao retículo endoplasmático (ER) para formar ER rugoso. Em uma célula de mamífero, pode haver até 10 milhões ribossomos. Diversos ribossomos pode ser anexado à mesma fita de mRNA, esta estrutura é chamada de polissoma.


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Estrutura e características

Estruturalmente, parece um pequeno pão de hambúrguer com duas subunidades: uma grande (o pão de cima) e uma pequena (o pão de baixo).

Tamanho e forma

Eles são notáveis ​​por sua uniformidade de tamanho e forma. Os ribossomos encontrados nas células superiores de plantas e animais são achatados ou esferóides, com um diâmetro de 150 a 200 A 0. O tamanho exato dos ribossomos varia, dependendo do tipo de célula e se a célula está em repouso ou participando da divisão celular. Tanto as formas livres quanto as ligadas não são fechadas por membrana.

Partes e sua composição: do que são feitos os ribossomos

São organelas compostas em grande parte por RNA especializado, conhecido como RNA ribossomal (rRNA) e dezenas de proteínas distintas e, portanto, também conhecidas como ribonucleoproteínas. Cerca de 37 a 62% do ribossomo é composto por RNA, e o restante são proteínas.

Quando vistos ao microscópio eletrônico, as proteínas ribossômicas e os rRNAs são organizados em duas partes ribossômicas distintas de tamanhos diferentes, geralmente conhecidas como subunidades grandes e pequenas do ribossomo. Ambas as subunidades se combinam para formar uma organela completa. As duas subunidades são classificadas com base em sua constante de sedimentação, medida na unidade de Svedberg (S). Ele oferece uma medida da taxa de sedimentação de uma partícula, com base em seu tamanho, forma e densidade.

Tipos

Com base na constante de sedimentação de suas subunidades, os ribossomos são amplamente classificados em dois tipos:

  1. Ribossomos procarióticos (bacterianos): Tem uma constante de sedimentação de 70S (igual ao peso molecular de 2,7 × 106 Daltons) com a subunidade pequena de 30S e a subunidade grande de 50S. E. coli, por exemplo, com uma pequena subunidade 30S tem uma subunidade 16S RNA que consiste em 1540 nucleotídeos ligados a 21 proteínas, enquanto a grande subunidade 50S é composta por uma subunidade 5S RNA com 120 nucleotídeos, uma subunidade 23S RNA com 2900 nucleotídeos e 31 proteínas.
  2. Ribossomos Eucarióticos: Têm ribossomos 80S (igual ao peso molecular de 4 × 106 Daltons) localizados em seu citosol, cada um consistindo em uma pequena subunidade 40S e uma grande subunidade 60S. Humanos, por exemplo, com uma pequena subunidade 40S tem um RNA 18S com 1900 nucleotídeos e 33 proteínas, enquanto a grande subunidade 60S é composta por um RNA 5S com 120 nucleotídeos, RNA 28S com 4700 nucleotídeos, RNA 5.8S com 160 nucleotídeos e 46 proteínas.

Ribossomos de células eucarióticas: história, estrutura e funções

Fábricas de ribonucleoproteínas (RNP), partículas de Palade, fábricas de proteínas, partículas de Claude e # 8217s. Como os ribossomos são encontrados na mitocôndria e no cloroplasto, eles são chamados de organelas dentro das organelas.

Os ribossomos são organelas de ribonucleoproteína granular sem membrana, submicroscópicas, menores, densas, encontradas em todas as células vivas.

A. Claude (1941), primeiro observou ribossomos e os chamou de microssomas que eram na verdade fragmentos de RER.

Robinson e Brown (1953) descobriram os ribossomos pela primeira vez, em células vegetais (raízes de Vicia).

Palade (1955) isolou ribossomos de células animais e detectou RNA neles.

R.B. Roberts (1958) cunhou o termo ribossomo.

Distribuição e número:

Os ribossomos estão presentes em células procarióticas e eucarióticas, mas ausentes em hemácias maduras e espermatozoides. Em células procarióticas, eles são encontrados livremente espalhados no citoplasma, mas em células eucarióticas eles ocorrem livres na matriz citoplasmática e também aderidos à superfície externa do retículo endoplasmático rugoso e envelope nuclear. Os ribossomos também são encontrados na matriz das mitocôndrias e no estroma dos plastídeos nas células eucarióticas. Esses ribossomos são chamados de ribossomos organeller para distingui-los dos ribossomos citoplasmáticos.

Os ribossomos ocorrem isoladamente (monossomos) ou agrupados (polissomos). No momento da síntese de proteínas, 6-8 ribossomos unem-se temporariamente a um mRNA para formar um agrupamento denominado poli-ribossomo ou polissomo ou ergossoma. O número de ribossomos em uma célula depende da síntese protéica ativa. Em células eucarióticas até 10 milhões presentes. As células de uma planta podem conter até 5.00.000 ribossomos, 10.000 e # 8211 30.000 ribossomos, formando 25% da massa total da célula bacteriana.

Com base no coeficiente de sedimentação, medido em unidades Svedberg ou unidades S, dois tipos de ribossomos foram reconhecidos & # 8211 ribossomos 70 S e ribossomos 80 S. No entanto, ribossomos com diferentes valores de sedimentação encontrados em diferentes filos, por ex. 77S em mitocôndrias fúngicas e 55S em mitocôndrias de mamíferos.

Esses tipos de ribossomos são encontrados em células procarióticas, como bactérias e cianobactérias, mitocôndrias e cloroplastos de células eucarióticas. Seu coeficiente de sedimentação é 70 S e peso molecular 2,7 x 10 6 Daltons. Cada ribossomo 70S é composto de duas subunidades, a subunidade 30 S menor permanece ligada com a subunidade SOS maior, como uma tampa.

Eles são maiores em tamanho do que os ribossomos 70S. Seu coeficiente de sedimentação é 80 S e peso molecular 40 x 10 6 Daltons. Como os ribossomos 70 S, ele também é composto de duas subunidades & # 8211 60 S e 40 S com 40 S colocados sobre a subunidade 60 S.

Os ribossomos são as organelas menores e mais abundantes de uma célula. Cada ribossomo é poroso, hidratado e composto de duas subunidades desiguais, uma maior em forma de cúpula e a menor oblata & # 8211 elipsóide. A subunidade grande possui uma protuberância, uma crista e um pedúnculo. A subunidade menor possui uma plataforma, fenda, cabeça e base. Tem cerca de metade do tamanho da subunidade maior. A subunidade menor se encaixa sobre a maior em uma das extremidades como uma tampa (Fig. 3.38).

As duas subunidades geralmente permanecem separadas e se unem apenas no momento da síntese de proteínas. Para a união de duas subunidades requer 0,001 M de subunidades de Mg 2+ dissociadas abaixo dela. Quando a concentração de Mg 2+ está acima de 0,0001M, dimmers não funcionais são formados. Cada ribossomo tem quatro locais para funções específicas na síntese de proteínas.

(i) sítio de ligação de mRNA em subunidade menor

(ii) sítio A ou sítio aminoacil-tRNA,

(iii) sítio P ou sítio peptidil-tRNA e

(iv) local E ou local de saída para o qual o t-RNA não carregado vem antes de deixar o ribossomo (Fig. 3.39).

& # 8220Quimicamente ribossômico, & # 8221 subunidade consiste em RNA ribossômico altamente dobrado (rRNA) e muitas proteínas anexadas. A proporção de rRNA para proteína em ribossomos procarióticos e eucarióticos é 60:40 e 50:50 em peso, respectivamente. As proteínas ribossomais podem ter função básica, estrutural ou enzimática. A subunidade maior do ribossomo contém uma importante enzima & # 8211 peptidil transferase, que provoca a formação da ligação peptídica. Dentro do ribossomo, o rRNA permanece totalmente coberto por proteínas. Os ribossomos são, portanto, partículas de ribonucleoproteína (RNP).

(uma) Como fábricas de proteínas:

Os ribossomos são o local da síntese de proteínas e também fornecem as enzimas necessárias para as mesmas. Portanto, elas são chamadas de & # 8220Fábricas de proteínas & # 8221.

(b) Ribossomos livres e anexados:

Síntese de ribossomos livres proteínas estruturais e enzimáticas para uso dentro da célula. Os ribossomos anexados sintetizam proteínas para transporte (ou seja, proteínas de transporte).

(c) Enzimas e fatores:

Os ribossomos fornecem enzimas (por exemplo, peptidil transferase) e fatores para condensação de aminoácidos para formar polipeptídeo.

Ribossomo contém rRNAs para fornecer pontos de fixação para mRNA e tRNAs (RNA de transferência).

Ribossomos tem túnel para mRNA para que possa ser traduzido corretamente.

Um polipeptídeo recém-sintetizado é fornecido proteção de enzimas citoplasmáticas, encerrando-o no sulco da subunidade maior do ribossomo até que atinja a estrutura secundária.


Materiais e métodos

Nomenclatura

Usamos a nomenclatura universal para proteínas r, mas a nomenclatura clássica de leveduras também é mostrada nas figuras (Ban et al, 2014).

Cepas e condições de crescimento

As cepas estão listadas na Tabela S1. Em cada cepa, a proteína r indicada ou fator de montagem de ribossomo foi expresso apenas a partir de um gene transcrito do Gal1 / 10 promotor. Nós nos referimos a essas cepas como Pgarota-xx, onde xx é o nome da proteína expressa a partir do GAROTA promotor. Muitas proteínas r na levedura são codificadas por dois genes parálogos. Com exceção da proteína r uL4, analisamos apenas a repressão de um dos dois parálogos, mas como a anulação da síntese de proteínas diferentes de uma determinada subunidade gerou o mesmo padrão de acumulação da subunidade ribossômica, é improvável que a proteína r específica alelo usado tem qualquer efeito importante nos resultados. Para a repressão da síntese de uL4, todos os experimentos, exceto na Fig 6D-E e G, foram realizados com JWY8402 expressando o gene que codifica uL4A (RPL4A) do promotor de galactose. Na Fig 6D – E e G, o gene que codifica o alelo uL4B (RPL4B) estava sob controle de galactose (cepa YLL2083).

Plasmídeos carregando fusões C-terminais de genes para GFP e uS5 ou uL23 expressos a partir dos promotores da proteína r nativa foram descritos anteriormente (Hurt et al, 1999 Milkereit et al, 2003). Para permitir a indução da síntese de uL23-GFP durante a repressão da síntese de uS17 / S11, um fragmento de DNA que abriga o gene para o fator de transcrição sensível a β-estradiol artificial Z3EV (McIsaac et al, 2013), natMX6 e um fragmento de ADE2 foi integrado ao cromossômico ADE2 gene de Pgal-uS17 (Y325) selecionando para resistência à nourseotricina (Hentges et al, 2005). Em seguida, um gene para uL23 / L25 marcado com GFP foi colocado sob o controle do promotor PNM3 responsivo a Z3EV e integrado no gene URA3 usando ácido 5-fluororótico para seleção.

Culturas em estado estacionário crescendo com agitação a 30 ° em YEP-galactose ou meio completo sintético de galactose (Sgal) sem uracila foram deslocadas para meio YPD pré-aquecido ou meio completo sintético de glicose (SD) sem uracila (Sherman et al, 1979). Alíquotas para análise de ribossomos ou componentes ribossômicos foram retiradas imediatamente antes (tempo 0) e nos horários indicados após o turno. As culturas foram diluídas com meio pré-aquecido sempre que necessário para manter a DO600 abaixo de 0,8. A densidade celular foi medida em uma cubeta de 10 mm usando um espectrofotômetro Hitachi U1100 (Hitachi High-Technologies Corporation). OD600 = 1 corresponde a 1,5–2 × 10 7 células (unidades formadoras de colônias) por mililitro.

Análise ocidental

As células foram centrifugadas a 5K por 10 min, lavadas e suspensas em tampão A (Tris-HCl 20 mM, KCl 150 mM, Na-EDTA 5 mM, Triton X-100 0,1% e glicerol 10%), ditiotreitol (1 mM) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (20 μl / ml). As células foram então lisadas por vórtex durante 15 min a 4 ° C com contas de vidro. Números iguais de unidades A280 de três culturas independentes para cada ponto de tempo foram aplicados a géis de poliacrilamida a 15%. Amostras de todos os pontos de tempo foram fracionadas no mesmo gel. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF por 1,5 h a 130 V usando o aparelho celular Trans-Blot (Bio-Rad). As membranas foram então incubadas em uma solução de bloqueio (20 mM Tris, pH 7,5 e 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 5% leite em pó [LabScientific, Inc.]) antes de incubar com anti-soros primários (1: 10.000-1: 4.000 diluições). Os anti-soros policlonais de coelho para as proteínas ribossomais de levedura foram preparados para nosso laboratório pela Covance usando peptídeos sintéticos com a sequência de 20-22 aminoácidos N-terminais de uS4, uL4, uL5 e uL18 como antígenos. A membrana foi eliminada do excesso de anti-soros com tampão de lavagem (Tris-Cl 25 mM [pH 7,4], KCl 2,5 mM e NaCl 200 mM) antes de ser incubada com anticorpo secundário de conjugado IgG (H + L) -AP de cabra anti-coelho (Bio-Rad). As bandas foram detectadas expondo a membrana ao substrato Amersham ECF (GE Healthcare) seguido de digitalização em um Storm 860 Imager System (Molecular Dynamics). As bandas foram quantificadas com ImageJ, calculada a média para um determinado ponto de tempo e normalizada para a média de três amostras de 0-h. Os valores normalizados foram plotados, juntamente com os respectivos erros padrão da média. Finalmente, os valores de uS4, uL5 e uL18 foram normalizados para o valor de uL4 na mesma faixa, calculados para cada ponto de tempo e plotados juntamente com os erros padrão da média. Os anti-soros foram titulados contra A 280 unidades carregadas e usadas em excesso das proteínas r nas amostras para determinação das proteínas r nas amostras experimentais (Fig S6).

As fendas de um gel de poliacrilamida SDS 15% foram carregadas com números crescentes de A 280 unidades de lisado de células inteiras de BY4741 cultivadas em meio YEP-galactose. Após a eletroforese e o blotting, a membrana foi sondada com um coquetel de anti-soros contra uS4, uL4, uL5 ou uL18. A intensidade das bandas foi determinada usando ImageJ, e as intensidades das bandas relativas são representadas graficamente contra o número de A 280 unidades carregadas em cada slot.

Análise de gradiente de sacarose

Em muitos relatórios usando gradientes de sacarose para fracionamento de ribossomo, a cicloheximida foi adicionada à cultura em crescimento antes da colheita. No entanto, incubações curtas com a droga aumentam artificialmente a fração de ribossomos em polissomos e o nível de "meio-meros" (polissomos com um número de ribossomos 80S mais um 40S inicial esperando por um 60S para se juntar ao complexo) (Helser et al, 1981). . Presumivelmente, isso reflete o bloqueio da droga do escoamento do ribossomo dos mRNAs, embora não afete o início da tradução. A mudança no equilíbrio da iniciação e do escoamento também afeta o acúmulo de meio-metades, o que explica por que vemos menos metades do que aqueles relatados por outros após a inibição da montagem 60S. Como os efeitos da cicloheximida no padrão de gradiente de sacarose podem ser considerados um artefato, não adicionamos cicloheximida à cultura, mas a incluímos no tampão de lise para preservar os polissomos após a lise. As células foram resfriadas rapidamente sobre gelo, giradas e lavadas com água gelada. O sedimento foi então ressuspenso em tampão de gradiente resfriado em gelo (acetato Tris 50 mM, pH 7, NH 50 mM4Cl, MgCl 12 mM2e 1 mM DTT) contendo 50 μg de cicloheximida por ml. A mistura foi transferida para um tubo (NC9437081 Sarstedt) contendo 2,5 g de contas de vidro (G9268 ou G8772 Sigma-Aldrich) e agitada em vórtice cinco vezes a uma velocidade máxima por intervalos de 30 s a 4 ° C. O lisado celular resultante foi centrifugado duas vezes a 13.000 g durante 15 min a 4 ° C, e o sedimento foi descartado após cada rotação. Unidades iguais A 260 do sobrenadante após a segunda rotação foram carregadas em gradientes de sacarose de 10–50% em tampão de gradiente. Os gradientes foram girados a 40.000 rpm por 4 h a 4 ° C usando um rotor SW40Ti Beckman. As frações (500 μl) foram coletadas usando um coletor de fração ISCO Foxy Jr, bombeando a 1 ml / min. Os gradientes que foram comparados foram carregados com o mesmo número de unidades A 260 de lisado, e a sensibilidade do colorímetro de fluxo foi definida como a mesma para os gradientes a serem comparados. As quantidades relativas de material A 260 nos diferentes picos foram determinadas usando ImageJ.

Análise de RNA

Extração de RNA total

As células foram colhidas por centrifugação e armazenadas a -80 ° C. As células foram então ressuspensas em água gelada e o RNA foi extraído usando o método fenol-clorofórmio conforme descrito (Lindahl et al, 1992). Alternativamente, o RNA foi preparado usando um kit RiboPure (LifeTechnologies AM1926) seguindo as instruções do fabricante.


Assista o vídeo: Why 50S + 30S = 70S for Ribosomes? (Janeiro 2022).