Em formação

RNAs decorrentes de regiões intergênicas


Que tipo de molécula de RNA é codificada em regiões intergênicas? Acho que deve ser um RNA não codificador, mas não tenho certeza de qual tipo.


O termo intergênico está mais ou menos obsoleto agora. Na verdade, é irônico dizer que um gene, que pode dar origem a uma proteína funcional ou a um RNA, é expresso a partir de uma região intergênica. No entanto, o uso continua para lncRNAs e miRNAs (outro tipo principal de ncRNA em metazoários1 - os piRNAs têm classificações diferentes). Os lncRNAs são vagamente classificados como sobreposição de sentido (expressa na mesma direção de um gene conhecido, mas não completamente sobreposta), antisense (expressa a partir da fita antisense de um gene conhecido) ou intergênica; da mesma forma, os miRNAs são classificados como intrônicos ou intergênicos.

Não é necessário que o RNA intergênico tenha que ser estritamente não codificador, ele também pode ser codificador; uma nova proteína.

Em todos esses casos, o termo intergênico significa - não se sobrepondo a um conhecido gene. Uma melhor nomenclatura é necessária à medida que o campo da genômica faz mais progresso.

Veja este artigo.

1 A maioria dos metazoários.


Região intergênica

Um região intergênica (IGR) é um trecho de sequências de DNA localizadas entre genes. [1] As regiões intergênicas são um subconjunto de DNA não codificador. Ocasionalmente, algum DNA intergênico atua para controlar genes próximos, mas a maior parte dele não tem função conhecida atualmente. É uma das sequências de DNA às vezes referida como DNA-lixo, embora seja apenas um fenômeno rotulado como tal e nos estudos científicos atuais, o termo é menos usado. O RNA recentemente transcrito de fragmentos de DNA em regiões intergênicas era conhecido como "matéria escura" ou "transcritos de matéria escura". [2]


Artigo MINI REVIEW

  • Departamento de Microbiologia e Imunologia, Geisel School of Medicine em Dartmouth, Hanover, NH, Estados Unidos

Em organismos eucarióticos, fragmentos derivados de RNA de transferência (tRNA) têm diversas funções biológicas. Considerando as sequências conservadas de tRNAs, não é surpreendente que fragmentos de tRNA endógenos em bactérias também desempenhem papéis regulatórios importantes. Estudos recentes mostraram que os micróbios secretam vesículas extracelulares (EVs) contendo fragmentos de tRNA e que os EVs entregam fragmentos de tRNA a hospedeiros eucarióticos onde regulam a expressão gênica. Aqui, revisamos a literatura que descreve a biogênese do fragmento de tRNA microbiano e como os fragmentos secretados em EVs microbianos suprimem a resposta imune do hospedeiro, facilitando assim a infecção crônica. Além disso, discutimos lacunas de conhecimento e desafios de pesquisa para compreender os papéis patogênicos dos fragmentos de tRNA microbianos na regulação da resposta do hospedeiro à infecção.


O RNA intergênico deriva principalmente de transcritos nascentes de genes conhecidos

Fundo Os genomas eucarióticos sofrem transcrição generalizada, levando à produção de muitos tipos de RNAs estáveis ​​e instáveis. A transcrição não se restringe a regiões com características genéticas anotadas, mas inclui quase qualquer contexto genômico. Atualmente, a fonte e a função da maioria dos RNAs provenientes de regiões intergênicas do genoma humano permanecem obscuras.

Resultados Nossa hipótese é que muitos RNA intergênicos podem ser atribuídos à presença de genes ainda não anotados ou à transcrição "difusa" de genes conhecidos que se estende além dos limites anotados. Para elucidar as contribuições dessas duas fontes, reunimos um conjunto de dados de & gt2,5 bilhões de leituras de RNA-seq publicamente disponíveis em 5 linhas de células humanas e múltiplos compartimentos celulares para anotar unidades de transcrição no genoma humano. Cerca de 80% dos transcritos de regiões intergênicas não anotadas podem ser atribuídos à transcrição difusa de genes existentes; os transcritos restantes se originam principalmente de loci de RNA não codificantes longos putativos que raramente são processados. Nós validamos a atividade transcricional desses RNA intergênicos usando medições independentes, incluindo locais de início da transcrição, assinaturas de cromatina e ocupações genômicas de RNA polimerase II em vários estados de fosforilação. Também analisamos a localização nuclear e as sensibilidades dos transcritos intergênicos às nucleases para ilustrar que eles tendem a ser rapidamente degradados "na cromatina" por XRN2 ou "fora da cromatina" pelo exossomo.

Conclusões Nós fornecemos um atlas com curadoria de RNAs intergênicos que distingue entre processamento alternativo de genes bem anotados de unidades de transcrição independentes com base na análise combinada de assinaturas de cromatina, localização de RNA nuclear e vias de degradação.


Variantes de RNA de codificação não proteica longa intergênica e suscetibilidade a doenças

Na verdade, a ocorrência de doenças complexas (por exemplo, câncer) está relacionada a vários fatores, incluindo genéticos, ambientais e estilo de vida. Entre eles, os fatores genéticos são de particular interesse, assim como os GWASs e os estudos de sequenciamento de última geração ampliaram muito a compreensão das variantes genéticas que conferem risco de doenças. Numerosas variantes genéticas em regiões de lincRNA foram determinadas como associadas à suscetibilidade de doenças heterogêneas, especialmente vários tipos de câncer. Aqui, revisamos alguns lincRNAs que abrangem variantes associadas a doenças ou características (Tabelas 1, 2).

Tabela 1. Visão geral das variantes associadas ao traço no locus chr8q24.

Mesa 2. Visões gerais de outros lincRNAs abrangendo variantes associadas a características.

Variantes longas de RNA codificador de não proteína intergênica no locus chr8q24

Estudos de associação de todo o genoma apontaram para o locus genômico chr8q24 como um hotspot para variantes associadas ao câncer devido à grande densidade, mais força e alta frequência de alelos dessas variantes (Yeager et al., 2007 Tuupanen et al., 2009) . Mesmo que o cromossomo 8q24 tenha sido considerado uma região & # x201Cgene desert & # x201D devido à ausência de genes funcionalmente anotados, com a única exceção notável do frequentemente amplificado MEU C (um proto-oncogene envolvido na tumorigênese) (Chung et al., 2011). Surpreendentemente, estudos em grande escala revelaram que vários lincRNAs são transcritos do locus chr8q24, como CCAT1 (Kim et al., 2014), CCAT2 (Ling et al., 2013), PVT1 (Hanson et al., 2007), PCAT1 (Guo et al., 2016), e PRNCR1 (Li et al., 2013) todos esses englobam várias variantes associadas ao câncer. Por exemplo, lincRNA CCAT2 (Transcrição 2 associada ao câncer de cólon, também denominado LINC00873), uma transcrição abrangendo SNV rs6983267, está associada a um risco aumentado de câncer de próstata, mama, cólon e colorretal (Yeager et al., 2007 Tuupanen et al., 2009 Ling et al., 2013). CCAT2 é superexpresso em vários tipos de câncer e pode contribuir para o crescimento do tumor, metástases e instabilidade cromossômica, aumentando a expressão de MYC (Ling et al., 2013). LincRNA PRNCR1 foi relatado como estando envolvido na carcinogênese da próstata e pode desempenhar um papel oncogene através da modulando o receptor de andrógeno (Chung et al., 2011), PRNCR1 variantes, especialmente rs1456315, estão associadas à suscetibilidade aos cânceres de próstata e colorretal (Li et al., 2013 Teerlink et al., 2016). Por meio de uma análise integrativa do transcriptoma lncRNA e dados GWAS, Guo et al. (2016) identificaram uma transcrição associada ao câncer de próstata PCAT1 e 10 loci de risco no chr8q24.21, incluindo PCAT1 variantes rs10086908 e rs7463708, que estão significativamente associadas à suscetibilidade ao câncer de próstata. Quanto a PVT1 (também denominado LINC00079), uma análise GWAS identificou que suas variantes rs13255292 e rs4733601 estão associadas à suscetibilidade de linfoma difuso de grandes células B (Cerhan et al., 2014). Outros SNVs independentes (por exemplo, rs2720709 e rs2648875), que são mapeados em PVT1, contribui especialmente para o desenvolvimento de doença renal em estágio terminal (ESRD) em pacientes com diabetes tipo 2 (Hanson et al., 2007). Uma meta-análise recente resumiu a relação entre duas variantes comuns (rs10505477 e rs7837328) na região intrônica de CASC8 (LINC00860) no locus 8q24 com o risco de câncer (Cui et al., 2018), incluindo câncer colorretal, gástrico e de pulmão (Ma et al., 2015 Hu et al., 2016). Outro loci intrônico rs378854 está relacionado à adiposidade em indivíduos de ascendência africana (Ng et al., 2017).

Variantes de nucleotídeo único em locus de RNA H19 codificador de longa não proteína intergênica

o H19 (também denominado LINC00008) está localizado no cromossomo 11p15.5, um gene onco-fetal com impressão paternal, que é tipicamente regulado negativamente em tecidos adultos, mas pode ser superexpresso em vários tipos de câncer sólido. LincRNA H19 a expressão está intimamente relacionada ao crescimento do tumor, metástase, recorrência e prognóstico clínico (Ge et al., 2018). H19 as variantes estão envolvidas na suscetibilidade a várias doenças. Um estudo de meta-análise indicou que o alelo variante T de rs2107425 está correlacionado com uma diminuição do risco de desenvolver cânceres (por exemplo, câncer de mama, ovário, pulmão e bexiga) (Chu et al., 2016 Wu et al., 2017), enquanto a variante rs2839698 está associada a um risco aumentado de cânceres digestivos (câncer colorretal e gástrico) através da regulando H19 expressão digna de nota, não há associação significativa observada entre a variante rs217727 e a suscetibilidade a câncer (Chu et al., 2016). No entanto, em outros relatórios, H19 rs217727 foi associado ao risco de carcinoma hepatocelular (HCC) (Ge et al., 2018), carcinoma de células escamosas oral (OSCC) e câncer de bexiga na população chinesa (Guo Q. Y. et al., 2017). Para doença arterial coronariana (DAC), a variante T de rs217727 está associada a um risco aumentado, enquanto rs2067051 Uma variante está ligada a um risco reduzido (Gao et al., 2015). H19 O rs217727, mas não a variante rs2107425, está associado à suscetibilidade de mulheres com pré-eclâmpsia (PE) (Harati-Sadegh et al., 2018). Além disso, a transmissão fetal materna H19 variantes (por exemplo, rs217727, rs2071094 e rs10732516), junto com paternas IGF2 variantes, são independentemente correlacionadas com os níveis de metilação do DNA da placenta (Marjonen et al., 2018) e peso ao nascer dos recém-nascidos (Petry et al., 2011).

Variante de nucleotídeo único em MALAT1 e MIAT Regiões

LincRNA MALAT1 (transcrito 1 de adenocarcinoma de pulmão associado à metástase, também denominado LINC00047) tem a variante rs619586 A & # x003E G, que está significativamente associada à suscetibilidade da hipertensão arterial pulmonar (HAP), e os portadores com genótipos da variante G têm um risco reduzido de HAP (Zhuo et al., 2017). Um estudo recente sugeriu que os genótipos rs619586 AG / GG podem reduzir os riscos de doença cardíaca aterosclerótica coronariana e doença cardíaca congênita (CHD) regulando MALAT1 expressão (Li et al., 2018b). Outro relatório mostrou que MALAT1 é superexpresso em cânceres colorretais e que o mapeamento SNV rs1194338 para sua região promotora está significativamente associado a uma diminuição do risco de câncer colorretal (Li et al., 2017). Além disso, os estudos de associação de controle de caso & # x2013 em grande escala identificaram uma nova transcrição associada ao infarto do miocárdio, MIAT (também denominado LINC00066), que engloba rs2331291, e outras variantes conferem a suscetibilidade ao infarto do miocárdio (Ishii et al., 2006). Como um componente da matriz nuclear, MIAT é expresso principalmente em neurônios, Rao et al. (2015) relataram que o SNV rs1894720 está correlacionado com a susceptibilidade à esquizofrenia paranóide e o MIAT pode contribuir para a patogênese da esquizofrenia.

Outras variantes de RNA de codificação não proteica longa intergênica em cânceres humanos

Além das moléculas de lincRNA acima, estudos recentes identificaram muitas outras variantes associadas ao câncer nas regiões de lincRNA. Por exemplo, o RNA codificador de não proteína indutor de diferenciação de tecido (TINCR), também denominado LINC00036, é essencial para a diferenciação do tecido somático e progressão do tumor (Kretz et al., 2013). Foi demonstrado que duas variantes de TINCR (rs2288947 e rs8105637) estão significativamente correlacionados com a suscetibilidade e metástases de linfonodos de câncer colorretal (Zheng et al., 2017) o lincRNA TINCR Os genótipos do alelo rs2288947 G e do alelo rs8113645 A podem reduzir o risco de câncer gástrico. HULC, um lncRNA regulado positivamente de HCC, também denominado LINC00078, e suas variantes (rs7763881 e rs1041279) estão ligadas à suscetibilidade de HCC (Wang et al., 2018a). No carcinoma da tireoide, vários candidatos à suscetibilidade ao carcinoma papilar da tireoide, como PTCSC2, contém uma variante de risco rs965513 e PTCSC3 engloba rs944289 dois níveis de expressão de lincRNA são fortemente regulados para baixo em tecidos de carcinoma da tireóide (Jendrzejewski et al., 2012 He et al., 2015). Além disso, as análises de GWAS identificaram cinco SNVs de tag, incluindo rs944289 localizado em PTCSC3, estão associados a acidente vascular cerebral isquêmico de grandes vasos (Lee et al., 2016). Xue et al. (2013) relataram que um marcador de expressão gênica de câncer de próstata, PCGEM1 (LINC00071), contendo dois SNVs de risco (alelos rs6434568 C e rs16834898 A) que estão associados a um risco reduzido de câncer de próstata. Outro mapeamento do alelo associado ao risco de câncer de próstata rs75823044 para o promotor de LINC00676 é quase exclusivamente encontrado em populações de ancestrais africanos (Conti et al., 2017). Em uma análise GWAS, cinco variantes comuns, incluindo rs3803662 no exon de CASC16 (LINC00918) foram identificados como contribuindo para a suscetibilidade aos cânceres de pulmão e de mama (Orr et al., 2011). Além disso, o SNV de risco de câncer colorretal rs11776042 está localizado no promotor de LNC00964, em que o lincRNA é significativamente diminuído em tecidos de câncer colorretal (Chu et al., 2015). Para supressor de tumor lncRNA GAS5, uma variante de inserção / exclusão de rs145204276 está associada à suscetibilidade de HCC (Tao et al., 2015) e câncer colorretal e gástrico (Li et al., 2018a).

Outras variantes associadas a doenças em regiões de RNA codificador de não proteína intergênica longa

Exceto pela suscetibilidade ao câncer, algumas variantes do lincRNA estão associadas ao risco de outras doenças heterogêneas. As análises de GWAS e locus de características quantitativas de expressão (eQTL) identificaram um fator de risco para respostas inflamatórias patológicas da hanseníase, SNV rs1875147, que é uma variante de eQTL para lincRNA LOC105378318 localizado no cromossomo 10p21.2 (Fava et al., 2017). Rautanen et al. encontraram uma variante rs140817150 no íntron de LOC107986770, que pode estar correlacionado com a susceptibilidade à bacteremia em crianças africanas (Kenyan Bacteraemia Study Group et al., 2016). Uma análise sistemática destaca alguns loci variantes em regiões lncRNA ligadas a distúrbios cardiometabólicos, um deles, lincRNA LOC157273 abrigando rs4841132, está ligado à regulação do colesterol lipídico sérico (Ghanbari et al., 2018). Shyn et al. & # X2019s (2011) A análise GWAS identificou um transtorno depressivo maior (MDD) variante associado ao risco rs12526133, que reside no exon de LINC01108, em que lincRNA é superexpresso em pacientes com TDM. Além disso, o gene impresso expresso pela mãe, MEG3 (também denominado LINC00023), contendo as variantes rs941576 (Wallace et al., 2010) e rs34552516 (Westra et al., 2018), que se constatou estar associado à suscetibilidade do diabetes tipo 1. Nikpay et al. & # X2019s (2015) metanálises GWAS abrangentes relataram uma associação de suscetibilidade a CAD com vários SNVs, como rs1870634, que está localizado a jusante de LINC00841, e seu genótipo GG está fortemente relacionado ao risco de DAC e tem maior frequência em pacientes com DAC.


RNAs não codificantes intergênicos longos no carcinoma hepatocelular - um foco em Linc00176

Proveniência: Este é um editorial convidado comissionado pelo Editor de Seção Meiyi Song (Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia, Instituto de Doenças Digestivas, Hospital Tongji, Escola de Medicina da Universidade de Tongji, Xangai, China).

Recebido: 06 de fevereiro de 2018 Aceito: 13 de fevereiro de 2018 Publicação: 19 de março de 2018.

O câncer de fígado é um tipo comum de câncer que ocupa o segundo lugar em mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo (1). O carcinoma hepatocelular (CHC) é o tipo predominante de câncer de fígado e geralmente surge na fase de cirrose. Os fatores de risco associados à incidência de CHC incluem hepatite viral (vírus da hepatite B e C), a síndrome metabólica incluindo doenças hepáticas gordurosas não alcoólicas, hepatite autoimune e ingestão de aflatoxina-B (2,3). O inibidor da multiquinase, sorafenibe, é a única terapia médica de 1ª linha amplamente disponível, com seu medicamento irmão regorafenibe aprovado para uso de 2ª linha em pacientes selecionados (4,5). Essas drogas têm um impacto limitado na expectativa de vida. Mudanças transcriptômicas que acompanham o desenvolvimento e progressão do câncer têm sido amplamente exploradas em pacientes com CHC, com subgrupos criados com base no perfil de transcrição e estado mutacional (6-9). Até o momento, esses estudos não informaram adequadamente a seleção de medicamentos candidatos para ensaios clínicos, a grande maioria dos quais não mostraram nenhum benefício de sobrevivência. Embora o desenho do estudo e as toxicidades tenham contribuído para as falhas (8), nossa falta de compreensão global da biologia do tumor provavelmente também desempenhou um papel. Recentemente, em vez de aderir ao dogma do transcriptoma central da proteína DNA-mRNA, os pesquisadores começaram a apreciar os muitos outros transcritos desse fluxo de trabalho que são específicos e funcionais do câncer, como fontes alternativas para a identificação de novos alvos terapêuticos candidatos. Técnicas de sequenciamento de alto rendimento em combinação com software de previsão computacional avançado e ferramentas epigenéticas identificaram novos transcritos de RNA e são até mesmo capazes de prever funções específicas. Essas novas transcrições identificadas incluem "RNAs não codificantes longos (lncRNAs)", um termo que gerou mais de 13.500 resultados em uma pesquisa PubMed no final de 2017 - três quartos dos quais foram publicados na última década. Isso inclui um artigo recente de Tran e colegas, publicado em Oncogene, em que o lncRNA Linc00176 foi interrogado em conjuntos de dados disponíveis publicamente. Foi relatado como uma transcrição regulada positivamente em HCC que é digna de ser perseguida como um alvo direcionado por biomarcador para a terapia do câncer (10).

O termo lncRNA define uma categoria de transcritos de RNA com mais de 200 nucleotídeos de comprimento que não codificam para proteínas. Essas características diferenciam lncRNAs de transcritos curtos como miRNAs, tRNAs ou snoRNAs, bem como de mRNAs. LncRNA e mRNA compartilham semelhanças na regulação de sua transcrição e processamento pós-transcricional, mas lncRNAs são mais curtos em comprimento e têm menos exons e estruturas primárias conservadas em comparação com transcritos de codificação de proteínas (11). A integração do transcriptoma de RNA humano com análise bioinformática avançada indicou que mais de 60% dos transcritos no chamado “MiTranscriptoma” de transcritos de RNA poliadenilados longos humanos são lncRNAs (12). Localizado dentro das regiões intergênicas e expresso em níveis mais baixos do que os RNAs codificadores de proteínas, o agrupamento não supervisionado dos transcritos diferencialmente expressos identificou a existência de assinaturas específicas de tecido distintas de lncRNAs. Além disso, lncRNAs são expressos diferencialmente entre o câncer e o tecido normal dentro do mesmo órgão (12). No fígado, o sequenciamento de RNA de 60 HCC primário em pacientes chineses, combinado com o tecido da trombose tumoral da veia porta (PVTT) e fígado não tumoral adjacente, identificou um pool desregulado de lncRNAs nos tumores primários e metastáticos (13). Notavelmente, mais de 75% dos lncRNAs sequenciados identificados no HCC não foram previamente anotados no MiTranscriptoma (12) ou no transcriptoma GENCODE (14). Nesta coorte de pacientes chineses com CHC, a metilação do DNA e a variação do número de cópias (CNV) foram associadas ao pool desregulado de lncRNAs e os transcritos de lncRNA pareceram ter papéis regulatórios nas funções celulares, como a resposta imune e a adesão celular. A especificidade de tecido e câncer de lncRNAs, juntamente com papéis regulatórios importantes, implica importância na fisiopatologia do câncer e destaca seu potencial como novos alvos específicos do câncer.

O complexo transcrição / exportação (TREX) de exportação de mRNA é um regulador mestre da biogênese de mRNA, estando envolvido em diferentes etapas de transcrição, processamento e exportação de mRNA. O complexo TREX de mamífero inclui THOC1 (hHpr1), THOC2, THOC7, THOC5 (FMIP), THOC6, THOC3 (hTEX1), Uap56, DDX39c e Aly (15). O grupo de pesquisa de Hannover liderado por Teruko Tamura mostrou anteriormente que camundongos nulos THOC5 reduziram drasticamente o número de células progenitoras mielóides e do sistema hematopoiético, sem qualquer efeito no rim, coração e fígado adultos (16). O grupo levantou a hipótese de que o THOC5 era essencial para a manutenção das células-tronco / células progenitoras, mas não para as células terminalmente diferenciadas como os hepatócitos. O mesmo grupo demonstrou níveis elevados de THOC5 em tecidos e linhas celulares de CHC, juntamente com uma indução de apoptose e desregulação do ciclo celular. em vitro, após derrubar THOC5 (17). Hipotetizando que os genes-alvo THOC5 eram importantes na sobrevivência das células cancerígenas do fígado, a equipe de Tamura passou a estudar um gene-alvo em particular - a saber, o lncRNA 00176 (Linc00176).

Linc00176 (NR_027686.1) está localizado no cromossomo 20 e seu transcrito HCC é relatado como tendo 4 exons e 5.264 nucleotídeos de comprimento. Na linha de células HepG2 HCC um spliced ​​alternativamente Linc00176 transcrito, sem o exon 1, 1.601 nucleotídeos do exon 2, bem como 962 nucleotídeos do exon 4, foi identificado (18). Além dessas informações, pouco se sabia sobre o papel do Linc00176 em HCC. Tran et al. (10) agora exploraram os dados de pacientes com CHC disponíveis no The Cancer Genome Atlas (TCGA) e no consórcio ENCODE (18). Linc00176 os transcritos em splicing alternativo estavam presentes nas linhas de células HepG2, Hep3B, Huh7, HLE e HLF HCC, com as células HepG2 exibindo os níveis de expressão mais elevados. Linc00176 a expressão não era evidente em nenhum tecido humano normal (incluindo fígado, pâncreas, pulmão, pele, cérebro, tecido adiposo, músculo, coração e medula óssea) ou outras doenças malignas (leucemia, melanoma, câncer de mama, neuroblastoma, rabdomiossarcoma e câncer cervical humano linhas de células) (10). Em dados de HCC primários humanos em TCGA, níveis altos versus baixos de Linc00176 a expressão foi significativamente associada com o grau de tumor pouco diferenciado e menor sobrevida do paciente.

Estudando Linc00176 região promotora putativa (500 nucleotídeos a montante do local de iniciação), Tran et al. integraram hepatócitos humanos e células HepG2 DNase-Seq, RNA-Seq, ChIP seq e análise de limite de dados de expressão gênica (CAGE) (18) e aplicaram o software PROMO (ALGGEN, programa de previsão de sítios de ligação do fator de transcrição). A equipe se concentrou em uma série de fatores de transcrição regulatórios candidatos (Myc, MAZ e AP-4). Foi relatado que Myc regula preferencialmente a maquinaria de transcrição de lncRNAs (19) e Tran et al. expandiram esta observação em vitro mostrando que Myc / AP-4 double knock down sinergicamente esgotou Linc00176 expressão (10). Funcionalmente, esgotamento de Linc00176 de Huh7 e HepG2 aboliram sua proliferação e as converteram em células TUNEL-positivas após 2 dias em comparação com as células de controle. Ao contrário da apoptose induzida pela depleção de THOC5 (17), Linc00176 supostamente exerce seu papel por meio de necroptose via linhagem mista semelhante à quinase (MLKL) (10). A análise da via de engenhosidade da bioinformática (IPA) realizada nos genes diferencialmente expressos em células HepG2 após o knock down de Linc00176 apoiou esta descoberta, classificando o câncer e a necrose como as principais vias desreguladas.

Tendo identificado reguladores a montante de Linc00176, bem como o impacto de seu knockdown, Tran et al. considerou os três principais mecanismos pelos quais os lncRNAs exercem suas funções regulatórias (20). Alguns lncRNAs atuam como estruturas físicas formando complexos macromoleculares flexíveis com matriz nuclear, proteínas reguladoras da cromatina e proteínas de metilação do DNA para controlar o estado da cromatina. Outros lncRNAs recrutam a maquinaria reguladora da cromatina para loci específicos de DNA, seja por meio de sua afinidade para algumas proteínas regulatórias, seja por meio da localização 3D guiada por proximidade para certos loci gênicos. Alternativamente, muitos lncRNAs moldam a estrutura nuclear de uma forma que encoraja / desencoraja a expressão gênica. Tran et al. passou a demonstrar que Linc00176 liga-se a dois antitumorais, miRNAs regulados por Myc, a saber, miRNA-9 e miRNA-185 (10). O esgotamento das concentrações desses miRNAs diminuiu seus efeitos antiproliferativos nas células tumorais. Além disso, a depleção desses dois miRNAs usando inibidores específicos resgatou o efeito de proliferação proibida de Linc00176 derrubar em linhas de células tumorais.

Este trabalho do grupo de Tamuras (10) explora conjuntos de dados disponíveis publicamente, combinados com estudos laboratoriais confirmatórios e exploratórios, de uma forma que traz lncRNAs para o centro do campo de HCC. Essas transcrições não são apenas altamente específicas para o CHC, sugerindo papéis potenciais no diagnóstico específico do CHC, mas também aumentam o potencial de intervenção para prevenir ou tratar o câncer. Linc00176 junta-se a outros lncRNAs, como RP11-166D19.1 (13) relatado anteriormente, como um candidato a biomarcador de diagnóstico. Além disso, este estudo sugere que a segmentação de Linc00176 não apenas inibiria seletivamente a proliferação de células tumorais, mas também favoreceria o desenvolvimento de um nicho antitumoral, aumentando a disponibilidade de miRNAs limitadores de tumor como miRNA-9 e miRNA-185. O desenvolvimento de ensaios de biomarcadores de diagnóstico e monitoramento, medindo Linc00176 e seus alvos nos tecidos, juntamente com os meios para direcionar seus efeitos funcionais, podem ser dignos de consideração para pacientes com CHC. Pode haver outros lncRNAs, ou combinações, que têm relevância para diferentes pacientes, possivelmente com cânceres que surgem em diferentes origens etiológicas. Este é um estudo marcante não apenas porque destaca a importância potencial de Linc00176, mas porque lidera o caminho no HCC, demonstrando o valor translacional da interrogação sistemática e integração de dados publicamente disponíveis (figura 1).


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Métodos

Databases

Five sets of RNA-seq data were downloaded from the NCBI Sequence Read Archive (SRA) database (Additional file 1). These datasets include two single-read samples and three paired-end samples that were 36 to 100 bp long sequenced on Illumina platforms (

100 million reads for the total). o Bos taurus UMD3.1 reference genome FASTA file and the Gene Transfer Format (GTF) file were downloaded from the ensembl website (http://asia.ensembl.org). The UniRef90 (UniProt Reference Clusters) database was downloaded from the UniProt website (http://www.ebi.ac.uk/uniprot/database/download.html).

Alignment of RNA-seq reads and assembly of transcripts

The quality control of downloaded RNA sequences was performed by the FastQC software (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc, version 0.11.2). Adaptors were filtered using the Trimmomatic program (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic, version 0.33). RNA-seq reads from bovine mammary glands were aligned to the Bos Taurus UMD3.1 reference genome with the TopHat2 (version 2.0.12) [17]. Mapped reads were assembled with the Cufflinks (version 2.2.1) [18]. All assembled transcripts were then merged using the cuffcompare (version 2.2.1) [19].

Identification of putative LincRNAs

There is no generally accepted or standard methodology that allows for easy discovery of lincRNAs. Thus, in order to identify true intergenic lincRNAs and avoid false-positive ones, stringent conditions were applied in this study to filter the mapped reads with the following criteria: (1) Only unknown intergenic transcripts (UITs) were used to identify putative lincRNAs (2) If UITs had only one exon or the length of UITs was less than 200 bp, they were discarded [20] (3) The UITs with low expression levels (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped, FPKM <1) and the minimal read coverage threshold of these transcript below three were discarded (4) The UITs closest to the coding gene less than 1 kb were discarded (5) To predict coding potentials of the remaining UITs which are not annotated in the bovine genome, four programs including the CNCI, the CPC, the CPAT and the hmmscan were used concurrently. The CPC (version 0.9-r2), a SVM based algorithm (http://cpc.cbi.pku.edu.cn/), uses UniRef90 to identify protein-coding UITs or noncoding UITs. We selected the coding potential score > 0 as the coding UITs and the coding potential score < 0 as the noncoding UITs. The CPAT (version 1.2.2) uses a logistic regression model to assess the coding or noncoding transcripts in our UITs. We downloaded 10,000 bovine known protein sequences from the ensembl website and 10,000 bovine noncoding RNAs from the NONCODE database (version 4) (http://www.noncode.org/index.php). These sequences were used for training by CPAT. The software calculated the hexamer tables and a bovine specific logistic regression model was built. Because the coding probability score from the CPAT was different in different species, the cut-off value of 0.348 was chosen for reliability and sensitivity according a previous similar study of cows [11]. The UITs with scores <0.348 were retained as putative noncoding RNAs . The CNCI (version 2) program profiles the adjoining nucleotide triplets (ANT) to differentiate coding and noncoding sequences. The CNCI software was downloaded from the web (https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI) and used with the default setting. Finally, all 886 UITs were translated into six possible open reading (ORF) frames. Six possible ORF frames contain three frames for the sense strand and three frames for antisense strand. The six ORF frames were compared against the Gene3D, Pfam, TIGRFAM and Superfamily databases using the hmmscan algorithm. If one or more motifs were found in any of six possible ORF frames, the UIT was considered as a coding UIT and was discarded. Only noncoding UITs identified by all four software programs were considered as our putative lincRNAs.

Localization of lincRNAs in quantitative trait loci

The positions of the 184 putative lincRNAs were compared with positions of know quantitative trait loci (QTL) on the Bos taurus UMD3.1 reference genome according to the AnimalQTLdb. The AnimalQTLdb is a public QTL database on animal species including cattle, chicken, horse, pig, rainbow trout and sheep (http://www.animalgenome.org/QTLdb/) [21].

Prediction of lincRNA–RNA interactions and pathway analyses

In order to predict the targets of lincRNAs in mammary glands and thus understand potential functions of lincRNAs, the LncTar tool with the first type of file format for predicting the lincRNA–RNA interactions was used. The first type of file format contains two files. One file was lincRNA sequence file and the other file was mRNA sequence file. During the analysis, only lincRNAs with the lowest normalized free energy < −0.14 were selected as possible lincRNA target genes. Predicted gene targets were used for further analyses of gene ontology (GO) functional annotations and KEGG pathway analysis using the R package clusterProfiler [22].

Validation by RT-PCR

The PCR primers for six randomly selected lincRNAs were designed by the Primer Premier 5 (PREMIER Biosoft international, Palo Alto, CA, USA). Primer sequences are in Additional file 2. Expected lengths of PCR products were from 206 to 336 bp. Total RNA was extracted from bovine mammary epithelial cells (MAC-T) by Trizol according to the manufacturer’s instructions (Invitrogen, Carlsbad, CA). The first strand of cDNA was synthesized using the PrimeScript™ RT reagent kit (Takara, Dalian, China) according to the manufacturer’s instructions. PCR was performed using the 2 × EasyTaq PCR SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, China). The following PCR cycling condition was used: 94 °C 5 min, followed by 35 cycles of 94 °C for 30s, annealing for 30s (annealing temperatures for the lincRNAs are in Additional file 2), 72 °C for 30s and a final extension step was 72 °C for 10 min. Five ul of each PCR product was analyzed by 1% agarose gel.


Susan Gottesman, Ph.D.

Dr. Gottesman has pioneered studies on post-transcriptional mechanisms of regulation in bacterial systems, with a focus on the role of energy-dependent proteolysis in regulation and the role of small non-coding RNAs in regulating translation and mRNA stability. One focus of her work has been on how these regulatory inputs affect the bacteria’s response to stress.

1) microbial genetics, 2) bacterial regulatory RNAs, 3) ATP-dependent proteolysis

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Small Regulatory RNAs and Energy-Dependent Proteolysis: Novel Modes for the Regulation of Gene Expression

Our laboratory has been interested in novel mechanisms for gene regulation and how these mechanisms contribute to global control circuits in Escherichia coli (E. coli) For many years, the focus of the laboratory was energy-dependent proteolysis. In the past decade, much of the lab has shifted to studying small regulatory RNAs, although we continue to investigate the mechanisms for regulating energy-dependent proteolysis. We first encountered small RNAs when studying the regulation of synthesis of a substrate for the energy-dependent proteases, and we continue to see significant overlap between mRNAs regulated by small RNAs and the products of these mRNAs that are regulated by proteolysis.

This is exemplified in the regulation of RpoS, a stress sigma factor of E. coli. RpoS is rapidly degraded during exponential growth by the ClpXP protease but not when the cell is starved, stressed, or enters stationary phase. This degradation requires the response regulator protein RssB. RssB, an adaptor protein for RpoS degradation, affects degradation only of RpoS, and not of other ClpXP substrates, na Vivo e em vitro. The primary question has been how environmental signals regulate RpoS degradation. Using a genetic screen, we identified multiple small anti-adaptor proteins that are made in response to specific stress signals and interfere with the ability of RssB to deliver RpoS to the protease. In collaboration with Dr. Sue Wickner, na Vivo e em vitro studies are providing insight into how many anti-adaptors there are, how the anti-adaptors work, and how RssB functions.

In addition to this complex regulation of RpoS degradation, the translation of RpoS is positively regulated by multiple small RNAs. One of these, DsrA, is synthesized preferentially at low temperatures and is necessary for the low-temperature expression of RpoS. DsrA modulates RpoS synthesis by positively affecting translation of this protein by pairing with parts of the RpoS untranslated leader. A second small RNA regulator of RpoS, RprA, was also identified. RprA acts by a mechanism similar to that of DsrA in stimulating RpoS synthesis, but is regulated not by low temperature but by a two-component regulatory system responsive to cell surface status. We identified a third small RNA regulator of RpoS, ArcZ, that also positively regulates RpoS but is controlled by regulators that sense aerobic vs. anaerobic growth. Each of these small RNAs also negatively regulate other mRNAs, providing complex combinatorial regulation. The small RNAs link RpoS regulation to multiple environmental and metabolic inputs.

In collaboration with Gisela Storz (National Institutue of Child Health and Human Development) and others, we carried out a number of genome-wide searches for other small regulatory RNAs. Initially, highly conserved stretches within intergenic regions were found to be reliable hallmarks of small RNAs. In another genome-wide collaborative study, we defined small RNAs that bind the RNA chaperone Hfq, used by fully 1/3 of the small RNAs in the cell. This led to identification of yet other, less conserved small RNAs. This work combined with studies by others have defined more than 80 small RNAs in E. coli, and studies of these demonstrate that small RNAs are important and previously underappreciated components of many regulatory circuits.

A large number of the small RNAs that bind Hfq have now been studied. Small RNAs that bind Hfq act by pairing to target mRNAs to change mRNA stability and translation. In addition to defining targets, we need to define their upstream regulators so we can understand when they act. One of these, RyhB, is synthesized only when iron is limiting (it is repressed by the Fur repressor). RyhB redirects cellular metabolism to respond to the iron limitation by down-regulating synthesis of non-essential proteins that use Fe. A number of small RNAs were found to regulate major cell surface proteins, including proteins implicated in attachment of bacteria to surfaces. Another, controlled by a two-component system important for virulence, regulates modification of LPS. These small RNA effects on the cell surface may modulate interactions with hosts, affecting the immune response and/or pathogenesis. The lab has now developed rapid and flexible methods to scan all Hfq-binding small RNAs for their ability to regulate genes of interest.

While the bacterial small RNAs parallel microRNAs in their ability to affect the stability and translation of target mRNAs, the pathway for their function is rather different. We are studying how Hfq, a member of the Sm/Lsm family of proteins, acts to bring RNAs together, and what other functions are necessary for small RNA function.

Collaborators on this research include Gisela Storz, Sue Wickner, and Xinhua Ji, at NIH and Sarah Woodson, Johns Hopkins University


Long non-coding RNAs and their functions in plants

Plant lncRNAs participate in regulation of transcription, splicing, and nuclear structure.

In flowering, multiple lncRNAs act in silencing of FLC via diverse mechanisms.

Plant lncRNAs function in RNA-directed DNA methylation and epigenetic functions.

The RNA-processing machinery probably plays a key role in the regulation of lncRNAs.

Eukaryotic genomes encode thousands of long noncoding RNAs (lncRNAs), which play important roles in essential biological processes. Although lncRNAs function in the nuclear and cytoplasmic compartments, most of them occur in the nucleus, often in association with chromatin. Indeed, many lncRNAs have emerged as key regulators of gene expression and genome stability. Emerging evidence also suggests that lncRNAs may contribute to the organization of nuclear domains. This review briefly summarizes the major types of eukaryotic lncRNAs and provides examples of their mechanisms of action, with focus on plant lncRNAs, mainly in Arabidopsis thaliana, and describes current advances in our understanding of the mechanisms of lncRNA action and the roles of lncRNAs in RNA-dependent DNA methylation and in the regulation of flowering time.


Assista o vídeo: 6. Doenças genéticas (Janeiro 2022).