Em formação

Processo de inibição de proteína


Costumo encontrar substâncias que ativam proteínas, como ApoA-I, mas não encontro substâncias que a inibam.

Então, em um desenho experimental, eu poderia considerar a ausência de uma droga que atue diretamente no aumento de uma proteína poderia ser considerada um processo inibitório?


Não, a ausência de uma substância estimulante não é apropriada para ser considerada como inibição.

Para ver por quê, considere uma situação em que existem duas dessas substâncias, a substância A e a substância B, que podem estimular a proteína P (existem muitas dessas relações). Se você adicionar apenas a substância B, a proteína P será estimulada. Uma vez que o P está sendo estimulado neste caso, não seria razoável descrever a proteína sendo inibida pela falta da substância A.


Elucidando a base molecular para a regulação da neurotransmissão inibitória por artemisininas

O medicamento antimalárico de linha de frente artemisinina e seus derivados também foram implicados na modulação de múltiplas vias celulares de mamíferos, incluindo a recente identificação de direcionamento ao receptor de ácido γ-aminobutírico tipo A (GABAUMAR) sinalização no pâncreas. Seu mecanismo de ação molecular, entretanto, permanece indefinido. Aqui, apresentamos estruturas cristalinas de gefirina, o organizador central em pós-sinapses inibitórias, em complexo com artesunato e artemeter com resolução de 1,5-Å. Estas artemisininas têm como alvo o epítopo de ligação ao receptor de neurotransmissor inibitório universal da gefirina, inibindo assim as interações críticas entre os receptores de gefirina e glicina (GlyRs), bem como GABAUMARs. Registros eletrofisiológicos revelam uma inibição significativa da neurotransmissão mediada por gefirina pelas artemisininas. Além disso, as análises de agrupamento em neurônios primários demonstram uma inibição rápida e uma regulação dependente do tempo de gefirina e GABAUMAParâmetros do cluster R. Nossos dados não apenas fornecem um modelo abrangente para a modulação da neurotransmissão inibitória mediada pela artemisinina, mas também estabelecem as artemisininas como compostos potenciais para interferir farmacologicamente neste processo.

Palavras-chave: Receptores GABA (A), drogas antimaláricas artemisininas, gefirina, receptores de glicina, pós-sinapses inibitórias, distúrbios do neurodesenvolvimento de proteínas, estruturas de transmissão sináptica de proteínas.


6 Antibióticos usados ​​em inibidores da síntese de proteínas

Os pontos a seguir destacam os seis antibióticos usados ​​nos inibidores da síntese de proteínas. Os antibióticos são: 1. Cloranfenicol 2. Puromicina 3. Estreptomicina 4. Actinomicina 5. Tetraciclinas e 6. Cicloheximida.

Antibiótico # 1. Cloranfenicol (cloromicetina):

Ele inibe a síntese de proteínas interferindo na transferência de aminoácidos pelo s-RNA para os ribossomos (apenas 70 S).

Antibiótico # 2. Puromicina:

Este antibiótico inibe a síntese de proteínas de forma específica e reversível. Previne o alongamento da cadeia polipeptídica porque tem um grupo amino livre que forma uma ligação peptídica com o grupo carboxílico terminal da cadeia polipeptídica em crescimento.

Antibiótico # 3. Estreptomicina:

Este antibiótico não inibe a síntese protéica per se (como tal), mas parece alterar os ribossomos de modo que o mecanismo de tradução é perturbado, produzindo pró-títeína inativa. Este antibiótico foi descoberto por S.A. Waksman, Prêmio Nobel de 1952 na categoria Fisiologia ou Medicina.

Antibiótico # 4. Actinomicina:

Este antibiótico inibe a síntese de proteínas ao inibir a síntese de m-RNA dirigida por DNA, i.e., a inibição ocorre ao nível da transcrição.

Antibiótico # 5. Tetraciclinas:

Estes inibem a síntese de proteínas em bactérias bloqueando o local & # 8216A & # 8217 no ribossomo, de modo que a ligação de aminoacil-tRNAs é inibida.

Antibiótico # 6. Cicloheximida:

Inibe a síntese de proteínas ao bloquear a peptidil transferase de ribossomos eucarióticos (apenas 80 S). Além dessas, algumas toxinas, como a toxina da difteria e a ricina, são potentes inibidores da síntese de proteínas. A toxina da difteria inativa o fator de alongamento eucariótico eEF2 enquanto a ricina (da mamona) inativa a subunidade 60 S dos ribossomos eucarióticos.

(Venkatraman, Ramakrishnan, Thomas A. Steitz e Ada E Yonath compartilharam o Prêmio Nobel de Química de 2009 por seu trabalho pioneiro e colaborativo na estrutura e função dos ribossomos, que são cruciais para a vida e também um grande alvo para novos antibióticos.

Usando a cristalografia de raios-X, esses cientistas mapearam a posição de cada uma das centenas de milhares de átomos que compõem o ribossomo e geraram modelos tridimensionais que mostram como diferentes antibióticos se ligam aos ribossomos. Seu trabalho ajudará imensamente a produzir antibióticos que não são resistentes a bactérias, pois se tornaram resistentes a muitos dos medicamentos atualmente disponíveis no mercado.)


Localização e função

BIRPs envolvidos na inibição da morte celular: IAPs

O tecido e a localização subcelular de IAPs de mamíferos variam (ver Tabela 1) e podem ser importantes na determinação da contribuição relativa de diferentes IAPs para a regulação da morte celular em diferentes tipos de células e em resposta a diferentes estímulos apoptóticos.

O XIAP parece ser amplamente expresso [5,6]. Tem uma localização citoplasmática e foi relatado que inibe a morte celular em resposta a uma variedade de estímulos apoptóticos, incluindo irradiação ultravioleta, fator de necrose tumoral (TNF), ligante Fas e uma série de drogas tóxicas (revisado por LaCasse et al. [43]). O XIAP interage muito eficientemente e inibe as caspases 3, 7 e 9 ativas [44,45,46]. A interação de XIAP por meio de seu domínio dedo RING com receptores de proteína morfogenética óssea (BMP) tipo I também foi relatada, o que presumivelmente permitiria que algum XIAP se localizasse na membrana plasmática [47]. Foi proposto um papel para XIAP na regulação da via de sinalização do receptor de BMP ligando o receptor à molécula de sinalização a jusante TAB1.

As proteínas cIAP-1 e cIAP-2 foram inicialmente identificadas em um complexo com o receptor 2 do TNF, uma associação indireta resultante da interação direta com os fatores associados ao receptor do TNF (TRAFs) 1 e 2 envolvendo os domínios BIR e TRAF das respectivas proteínas [3]. A expressão de cIAP-1 e cIAP-2 é aumentada após a ativação do fator de transcrição NF-κB pelo receptor de TNF, e esses IAPs podem ter um papel na proteção de células da apoptose induzida por TNF, reduzindo a quantidade de ativação de caspase 8 [ 48]. Exatamente como eles fazem isso não está claro, porque a caspase 8 não pode ser inibida diretamente por cIAP-1 ou -2 ou por qualquer outro IAP conhecido [49]. Talvez eles atuem inibindo caspases a jusante, como a caspase 3, evitando o loop de feedback envolvido na ativação adicional da caspase 8 a montante. As proteínas cIAP-1 e cIAP-2 mostraram inibir diretamente a atividade das caspases 3 e 7 [49 ] Embora cIAP-1 e cIAP-2 possam ser encontrados dentro do complexo TNF-R e estejam presumivelmente localizados em parte na membrana celular, não está claro qual proporção de cIAP-1 ou cIAP-2 celular total isso representa, e quando transitoriamente transfectado em células, cIAP-1 tem uma localização perinuclear [50].

O IAP ML-IAP de mamífero recentemente descrito é detectável em tecido embrionário, tecidos adultos selecionados e várias linhas de células de câncer, particularmente em linhas de células de melanoma (ver Tabela 1) [14,15,16]. Um estudo relatou expressão predominantemente no núcleo, mas também em estruturas filamentosas no citoplasma, enquanto apenas a expressão citoplasmática foi relatada em outro estudo. Embora ML-IAP tenha apenas um domínio BIR, é relatado que ele interage com e inibe tanto a caspase 9 iniciadora quanto as caspases 3 e 7 efetoras, ele inibe a morte celular induzida por receptores de morte, por superexpressão das proteínas da via de morte celular FADD, Bax , RIP, RIP3 e DR3 ou em resposta a vários medicamentos tóxicos.

O primeiro NAIP gene foi identificado como um gene candidato defeituoso na atrofia muscular espinhal [5,20]. Agora está claro que a deleção de um gene vizinho que codifica a proteína do neurônio motor de sobrevivência (SMN) é a causa da doença [51], mas é possível que a perda de NAIP funcional possa contribuir para a gravidade da doença. NAIP é relatado para inibir a morte celular em resposta à retirada do soro, menadiona e TNF, mas porque o NAIP O cDNA utilizado nestes experimentos não corresponde a nenhum dos NAIP genes e podem representar sequências derivadas de uma série de diferentes NAIP genes, as atividades exatas das proteínas NAIP não são claras.

A evidência mais forte para a regulação da morte celular do desenvolvimento por IAPs vem de estudos em Drosophila, onde a perda de DIAP1 resulta em extensa morte precoce de células embrionárias e um aumento correspondente na atividade da caspase [52]. Um estudo equivalente em mamíferos ainda é necessário para estabelecer o papel dessas proteínas na morte de células de desenvolvimento de mamíferos (ver seção Fronteiras). Um padrão de expressão perinuclear pontilhado foi descrito para DIAP2 quando superexpresso em células de inseto [53].

BIRPs envolvidos na regulação da divisão celular

Embora originalmente descrita como uma proteína que poderia inibir a morte celular [21], Survivin atua principalmente na regulação da divisão celular, um papel conservado na levedura e C. elegans BIRPs, cujos domínios BIR se assemelham ao de Survivin [23,24,54,55,56,57,58,59]. A survivina é expressa apenas durante a mitose (ver Tabela 1). A localização subcelular mostrou que a Survivina é uma proteína cromossômica passageira: ou seja, está inicialmente associada aos centrômeros, mas na transição metafase-anáfase deixa os centrômeros e permanece na zona média do fuso [56,57,58,60]. Ele pode ser encontrado no meio do corpo na telófase, após o que é ubiquitinado e degradado. Consistente com sua localização subcelular, a eliminação de Survivin por recombinação homóloga resulta em embriões de camundongo que são incapazes de sobreviver além do dia 5 devido à falha da citocinese [56].

o C. elegans as proteínas BIR-1 e BIR-2 também estão envolvidas na regulação da citocinese [23,57]. BIR-1, como Survivin, é expresso apenas durante a divisão celular e é uma proteína passageira do cromossomo. O fenótipo de embriões deficientes em BIR-1 é idêntico ao dos embriões deficientes para a quinase AIR-2 semelhante a Aurora, e BIR-1 é necessário para a localização de AIR-2. Como Survivin e o C. elegans BIRPs, proteínas de levedura ScBIR1P e Spbir1P têm um papel na regulação da divisão celular [24], e como as leveduras não têm caspases, um papel na regulação da morte celular pode ser excluído.

Mammalian Bruce / Apollon tem um padrão pontilhado de expressão celular e colocaliza com a proteína marcadora de Golgi TGN38. Expressão em dendritos e axônios de neurônios primários também foi detectada [22]. Embora Bruce tenha um domínio BIR em seu terminal amino, ele também tem atividade de conjugação de ubiquitina como resultado de um domínio de enzima de conjugação de ubiquitina (UBC) no terminal carboxila da proteína. O domínio BIR de Bruce é mais semelhante aos domínios BIR de Survivin e outros BIRPs que estão envolvidos na regulação da divisão celular, embora a função de Bruce seja desconhecida.

Mecanismo de inibição da caspase

As caspases são produzidas como zimógenos inativos que são processados ​​em uma forma ativa após estímulos de morte celular. Acredita-se que a caspase ativa seja um complexo heterotetramérico gerado a partir de dois monômeros de zimogênio. As vias de morte celular envolvem a ativação sequencial das caspases iniciadoras e efetoras (ver Figura 2). A ativação de caspases iniciadoras, como caspases 9 e 8, é facilitada por proteínas adaptadoras, como Apaf-1 ou FADD, e quando ativadas, as caspases 8 e 9 podem processar e ativar caspases efetoras a jusante, como caspases 3 e 7. IAPs podem inibir alguns ativos caspases, enquanto a proteína de mamífero DIABLO antagoniza a função IAP [61,62,63] (ver Figuras 2,3).

O papel dos IAPs na regulação da morte celular. A apoptose induzida por TNF ou ligante Fas via receptores de morte (DR) envolve o recrutamento mediado por proteína adaptadora e ativação de caspases iniciadoras, como caspase 8 (C8), e a ativação subsequente de caspases a jusante, como caspase 3 (C3) e 7 (não mostrado). Na morte celular induzida por vias de estresse, como irradiação ou drogas, o citocromo c (Cyt c) e o DIABLO são liberados da mitocôndria. O citocromo c se liga ao terminal carboxila da proteína adaptadora Apaf-1, permitindo que ela se desdobre, interaja com a caspase 9 inativa (Pro-C9) e promova sua oligomerização e autoprocessamento para dar a caspase 9 ativa C9 e, então, pode ativar as caspases a jusante. Membros pró-sobrevivência da família Bcl-2 inibem a morte celular por meio de vias de estresse e podem prevenir a liberação de citocromo ce DIABLO da mitocôndria. As caspases a jusante clivam substratos celulares (como a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e o inibidor da DNase ativada por caspase (ICAD), resultando em muitas mudanças morfológicas e culminando na morte celular. Os IAPs previnem a morte celular ao interagir e inibir as caspases ativas, enquanto o antagonista do IAP, DIABLO, pode prevenir essas interações.

Mecanismo de inibição da caspase por IAPs e sua prevenção pelo antagonista IAP DIABLO / Smac. (uma) O terminal amino da subunidade p10 da caspase 9, revelado após autoprocessamento, interage fortemente dentro de uma ranhura do domínio BIR3 de XIAP. (b) A região ligante a montante do domínio BIR2 de XIAP interage fortemente com o sítio catalítico da caspase 3 (e a caspase 7 C indica o resíduo de cisteína catalítica), resultando na inibição eficaz da caspase. Foi proposta uma interação menos significativa do terminal amino da pequena subunidade da caspase 3 dentro de um sulco do domínio BIR2. (c) O terminal amino de DIABLO (vermelho) é semelhante ao da caspase 9 e compete pelo mesmo local de interação no domínio BIR3. (d) Acredita-se que um sulco semelhante dentro do domínio BIR2 de XIAP medeia a interação com DIABLO e fornece um mecanismo para DIABLO remover a caspase 3 de XIAP.

O domínio BIR3 de XIAP interage com e inibe a caspase 9 processada ativa [46,63,64]. O terminal amino de DIABLO e o da subunidade p10 da caspase 9 ativa - que é revelado apenas após autoprocessamento - são semelhantes e competem exatamente pelo mesmo local dentro de um sulco do domínio BIR3 de XIAP [64,65,66,67, 68,69] (Figura 3). As interações de DIABLO e caspase 9 com XIAP são, portanto, mutuamente exclusivas. Os terminais amino do Drosófila as proteínas Grim, Reaper e Hid são semelhantes ao terminal amino de DIABLO dentro dos primeiros quatro aminoácidos, e esta região é responsável pela interação com IAPs [67,68,69].

O principal ponto de contato entre as caspases 3 e 7 e XIAP envolve a região de ligação imediatamente a montante do domínio BIR2 de XIAP [31,32,33,70] (Figura 3). O ligante forma um contato direto com o sítio catalítico das caspases, bloqueando assim sua atividade. Uma interação adicional do terminal amino do fragmento p10 processado da caspase 3 dentro do sulco do domínio BIR2 foi proposta [33] e, embora dispensável para a interação e inibição da caspase por XIAP, acredita-se que o antagonista IAP DIABLO / Smac compita para o mesmo sulco, presumivelmente tirando a caspase 3 e desalojando-a do IAP.

DIABLO é uma proteína dimérica com dois terminais amino que podem interagir potencialmente com os domínios BIR [65]. Embora DIABLO seja capaz de interagir com domínios BIR2 e BIR3 individuais, embora com maior afinidade para o BIR3, o tipo de interação favorecido com XIAP de comprimento completo não é conhecido. Por exemplo, é possível que um dímero DIABLO interaja simultaneamente através de seus dois terminais amino com os domínios BIR2 e BIR3 em uma única molécula XIAP, ou que os dois terminais amino interajam com domínios BIR em diferentes moléculas XIAP com três domínios BIR possíveis diferentes combinações (dois domínios BIR2, um domínio BIR2 mais BIR3 ou dois domínios BIR3). Estabelecer isso estruturalmente pode ser difícil, dado que a geração de XIAP de corpo inteiro bem dobrados iludiu os cristalógrafos até agora.


5. Extensões Futuras: Redefinição da Transcrição, Processos de Tradução e Representação do Complexo Hierárquico

O problema do diagrama de processo atual é que os processos de transcrição e tradução não estão bem definidos. Enquanto o diagrama é definido como um diagrama de transição de estado, os processos de transcrição e tradução usam setas como ativação transcricional e ativação translacional que não é consistente com outra parte do diagrama. No lançamento futuro do CellDesigner (esperado na versão 2.5), a notação do diagrama de processo é estendida e redefinida para aprimorar a capacidade de representação para os processos de transcrição e tradução.

5.1 Processos de transcrição e tradução

Para uma descrição simples da transcrição, os genes são representados como caixas retangulares simples e fatores de transcrição e outros fatores regulatórios se ligam à caixa. Uma seta tracejada que representa o processo de transcrição é usada para indicar que o RNA é transcrito a partir da sequência e o RNA traduzido em proteína (Fig. 9). Os processos de transcrição e tradução são representados por setas especiais que devem representar processos complexos por trás deles.


Fig. 9. Um exemplo simples de um processo de transcrição orientado por CREB clique para ampliar a imagem
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A Fig. 10 representa mais detalhes desse processo. & # 12288Como um diagrama de transição de estado, a transcrição deve ser descrita como a transição de nucleotídeos em RNA, e a tradução deve ser a transição de aminoácido em proteína. A Fig.10 representa explicitamente esses processos. No entanto, em muitos casos, tais processos não precisam ser explicitamente representados, de modo que definiremos símbolos dedicados para simplificar o trabalho do usuário, como pode ser visto na Fig. 9. Símbolos específicos para transcrição e tradução serão definidos na época de CellDesigner Versão 2,5.


Fig. 10. Processo de transcrição conduzido por CREB com maquinaria de transcrição representada clique para ampliar a imagem
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5. 2 Representações da Estrutura do Promotor

Uma nova extensão permite ao usuário definir a estrutura da região promotora, exon e histonas. Regiões promotoras específicas, exon e histona são representados na parte superior da caixa (Fig. 11). Quando essas informações de estrutura são definidas, as linhas de ambos os lados e da parte inferior da caixa não são mostradas ou escurecidas para destacar as estruturas representadas na linha superior.


Fig.11. Nova notação para transcrição e tradução

A Fig. 12 (a) indica um conjunto de novos símbolos para transcrição e a Fig. 12 (b) mostra como eles podem ser usados.


Fig. 12 (a). Símbolos relacionados à transcrição e tradução


Fig.12 (b). Um exemplo de uso de símbolos relacionados à transcrição

Com o uso de notação detalhada para a região do promotor, a transição de estado detalhada para a transcrição pode ser descrita. A Fig. 13 mostra um exemplo de transição de estado de ligações de fatores de transcrição e um processo de transcrição.


Fig. 13. Um processo de transcrição no diagrama de processo

5,3 RNA

O RNA é representado em uma caixa inclinada. Quando a estrutura do exon é representada, os exons são representados na linha superior (Fig. 14).


Fig. 14. Representação da estrutura do exon do RNA clique para ampliar a imagem

O splicing alternativo pode ser representado como a transição do RNA do estado original para o RNA múltiplo com diferentes padrões de splicing (Fig. 15).


Fig.15. Exemplo de emenda alternativa

5.4 Representação do Complexo Hierárquico

A notação atual descreve o complexo como uma associação simples de vários símbolos de proteínas. No entanto, isso não é conveniente quando o próprio complexo tem um nome distinto. Por exemplo, NF- & kappaB é um heterodímero de p65 e p50. A notação atual só pode representar NF- & kappaB como uma proteína elementar ou como um complexo de p65 e p50 sem nomeá-los como NF- & kappaB. O compromisso prático é nomear cada subunidade como NF- & kappaB (p65) e NF- & kappaB (p50), mas longe de ser satisfatória. Muitos receptores são complexos de subunidades, cada um com seu próprio nome, de modo que essa nomenclatura complexa é um grande problema é uma descrição adequada e conveniente. Para resolver este problema, a representação hierárquica complexa será introduzida que permite aos usuários nomear subunidades e complexos. A Fig. 16 mostra exemplos de tal descrição complexa.


Fig. 16. Exemplos de descrição do complexo hierárquico
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Arquivos suplementares

Degradação de proteínas por meio de PROTACs baseados em inibidores covalentes

G. Xue, J. Chen, L. Liu, D. Zhou, Y. Zuo, T. Fu e Z. Pan, Chem. Comum., 2020, 56, 1521 DOI: 10.1039 / C9CC08238G

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Abordagens de biologia química levam à descoberta de uma nova enzima reguladora de lipidação de proteínas

Um membro recém-descoberto da família de proteínas acilproteína tioesterase (APT) de proteínas S-acilação e quoteraser leva à elucidação de um papel para a lipidação de proteínas na regulação redox mitocondrial.

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A lipidação dinâmica de proteínas por meio da modificação de resíduos de cisteína com tioésteres de ácidos graxos fornece um mecanismo para ajustar as propriedades de todo o proteoma, como hidrofobicidade e interações de membrana. Análogo à sinalização de fosforilação à base de quinase e fosfatase, a proteína "S-acilação" (também referida como "S-palmitoilação", uma vez que o palmitato é a modificação lipídica pós-tradução (PTM) mais abundante usada nesta via) é modulada por " enzimas escritor "(acil transferase) e" apagador "(desacilase). Embora milhares de proteínas humanas estejam sujeitas a modificação por S-acilação PTMs, existem apenas 6 "apagadores" anotados para esta marca, denominados acil-proteínas tioesterases (APTs). Uma questão chave que meu laboratório tem tentado investigar nos últimos anos é como esse PTM é regulado, com a hipótese de que a regulação espacial e temporal são aspectos críticos dessa via de sinalização.

Para estudar a regulação de APTs em células vivas, meu grupo desenvolveu um conjunto de ferramentas químicas, incluindo sondas de ativação para APTs (https://www.nature.com/articles/nchembio.2262 e https: //pubs.acs .org / doi / abs / 10.1021 / acs.biochem.7b00835) e sondas APT raciométricas (https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2017/sc/c7sc02805a). Ficamos fascinados com a lipidação mitocondrial, porque muitas proteínas mitocondriais podem ser modificadas por PTMs baseadas em S-acilação, conforme descoberto por uma série de métodos proteômicos imparciais. Isso foi intrigante para nós, no entanto, porque nenhum dos APTs conhecidos foram anotados como funcionais nas mitocôndrias. Portanto, fizemos uma pergunta simples: há regulação mediada por enzimas da acilação de proteínas na mitocôndria e, em caso afirmativo, quem são os atores nesse processo regulatório?

Para começar a responder a essa pergunta, sintetizamos uma sonda APT direcionada para a mitocôndria, que nos permitiu testar experimentalmente se há alguma enzima ativa naquele compartimento. De fato, usando esta sonda, descobrimos que existem APTs nas mitocôndrias e, para nossa surpresa, descobrimos que APT1, o membro fundador desta classe de proteínas regulatórias, está parcialmente localizada nas mitocôndrias (https://www.nature.com/ artigos / s41467-017-02655-1). APT1 foi anotado como uma proteína citosólica há mais de 20 anos, então nossa abordagem de biologia química para atribuir funções celulares forneceu novos insights críticos sobre o papel potencial dos APTs na sinalização mitocondrial. Uma próxima etapa crítica, no entanto, foi anotar um papel funcional para APTs nas mitocôndrias.

Nossa hipótese era simples: usaríamos um inibidor de APT pan-ativo e procuraríamos os efeitos celulares ligados à função mitocondrial, que nos levariam às funções e alvos do APT1, já que este era o único APT mitocondrial conhecido. Acontece que essa hipótese estava completamente errada, mas nos levou por um caminho intrigante (e incrivelmente desafiador). Nós primeiro descobrimos que a regulação redox mitocondrial foi perturbada por inibidores APT e validamos que era um efeito derivado da mitocôndria, desenvolvendo, validando e usando um novo inibidor APT mitocondrial direcionado. Naquele ponto, pensamos que só restaria mostrar que APT1 era o responsável pelo fenótipo, ponto em que tentaríamos alegar que se tratava de um efeito mitocondrial mediado por APT1. No entanto, APT1 não foi o alvo, pois qualquer perturbação desta enzima não apresentou efeito em nossos ensaios.

Portanto, sabíamos que havia uma enzima nova e desconhecida que precisávamos descobrir. Dada a crescente complexidade do projeto, pedi aos membros da equipe que adotassem abordagens diferentes para identificar nossa nova enzima. Um grupo fez a triagem com enzimas superexpressas e nossas sondas de atividade para identificar novas proteínas com atividade APT. Um segundo grupo fez o perfil de proteína com base na atividade (ABPP) para identificar os alvos de nosso novo inibidor. Para nossa alegria, ambas as abordagens convergiram para o mesmo alvo: ABHD10. Essa enzima não tinha função endógena conhecida, mas era de fato a enzima que estávamos procurando, pois recapitulou o fenótipo antioxidante mitocondrial observado anteriormente. Por meio de uma série de estudos bioquímicos e celulares, descobrimos que o ABHD10 é de fato um APT, e até resolvemos uma estrutura cristalina de alta resolução da proteína, revelando modos potenciais de regulação. Finalmente, anotamos PRDX5 como o primeiro alvo de ABHD10 e elaboramos um mecanismo pelo qual ABHD10 controla a capacidade antioxidante de PRDX5 por modificação direta do local ativo.

Coletivamente, este projeto me ensinou algumas coisas. Primeiro, podemos adicionar outra enzima, ABHD10, à lista de APTs, elevando o número de APTs mitocondriais para dois. Em segundo lugar, descobrimos um novo modo de regulação redox por lipidação, o que eu certamente não esperava. Terceiro, este trabalho mostra que abordagens de biologia química, envolvendo o desenvolvimento de sondas simples e inibidores brutos, podem realmente levar à descoberta biológica. Por fim, aprendi que a anotação de enzimas é muito difícil e o valor do trabalho em equipe para lidar com esse tipo de ciência interdisciplinar. Este projeto exigiu três investigadores principais para ser concluído (dois alunos de graduação e um pós-doutorado), bem como outros colaboradores no meu grupo e em outros grupos. De uma perspectiva gerencial, a ciência baseada em equipe nunca é fácil. Mas eu realmente acredito que este projeto não teria funcionado se não fosse pela abordagem colaborativa que adotamos.

Eu realmente parabenizo Yang, Tian e Rahul por trabalharem juntos para fazer esse trabalho acontecer. Saara-Anne, uma estudante de MD / PhD em meu grupo, forneceu assistência crítica e ajuda com experimentos in vivo. O professor Masaki Fukata e sua equipe nos ajudaram com nossa triagem, e minha colega, a professora Phoebe Rice, nos ajudou com a estrutura (meu grupo nunca havia feito biologia estrutural de proteínas).


Resumo

Aumentar o colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) é uma estratégia promissora na luta para prevenir doenças cardiovasculares, e os inibidores da proteína de transferência de éster de colesterol (CETP) foram desenvolvidos para conseguir isso. Os primeiros resultados são encorajadores e, de fato, em coelhos, a inibição da CETP reduz a aterosclerose. Como os dados humanos relativos à redução da carga de ateroma requerem mais tempo, os mecanismos bioquímicos subjacentes à suposta ateroproteção de inibidores da CETP estão atualmente dissecados e várias vias surgiram. Primeiro, a inibição da CETP aumenta o HDL-C e reduz os níveis de colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) consistentes com a atividade de transferência de lipídios da CETP e seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT). Isso coincide com aumentos supostos benéficos no tamanho do HDL e do LDL. No entanto, muitos aspectos relacionados ao impacto da inibição da CETP na via do RCT permanecem indefinidos, em particular se a primeira etapa referente ao efluxo de colesterol dos tecidos periféricos para o HDL é influenciada. Além disso, a relevância do receptor necrófago BI e, consequentemente, o papel central do HDL no RCT humano ainda não está claro. Em segundo lugar, foi demonstrado que a inibição da CETP aumenta recentemente as enzimas antioxidantes associadas ao HDL, por sua vez associado à diminuição da oxidação do LDL. A ateroproteção no homem é atualmente esperada com base na melhora desses parâmetros bioquímicos conhecidos por influenciar a aterosclerose, mas a confirmação final sobre o impacto da inibição da CETP no resultado cardiovascular terá que vir de estudos avaliando desfechos clínicos.

O mecanismo subjacente ao suposto efeito ateroprotetor da inibição da CETP aponta não apenas para efeitos benéficos por meio do aumento dos níveis de HDL-C. Além disso, o LDL-C e o LDL pequeno e denso podem diminuir, o que é consistente com o papel dos CETPs no transporte reverso do colesterol. Além disso, a inibição da CETP pode melhorar o potencial antioxidante do HDL.

A inibição da proteína de transferência de éster de colesterol (CETP) é uma promessa como uma nova abordagem para prevenir a doença arterial coronariana (DAC) devido ao seu profundo efeito nos níveis de colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C). O escopo desta revisão é discutir o impacto da inibição da CETP além desse efeito primário.

A função fisiológica da CETP na circulação, ou seja, a transferência de lipídios neutros (colesteril ésteres [CEs] e triglicerídeos [TGs]) entre as lipoproteínas e as causas e efeitos da variação natural na atividade da CETP, tem sido objeto de muitas revisões sobre a inibição da CETP e da CETP. 1–6 Portanto, optamos por resumir a compreensão atual da remodelação de lipoproteínas por CETP (Figura, 1 e 2). É importante ressaltar que em dislipidemias caracterizadas por concentrações aumentadas de partículas ricas em TG (principalmente lipoproteína de densidade muito baixa [VLDL] e remanescentes de VLDL), a transferência de CE de HDL muda de LDL para VLDL, particularmente VLDL1 grande (Figura 2). 7,8 Isso é considerado aterogênico porque as VLDLs enriquecidas com CE tornam-se substratos para a lipase hepática (LH), resultando na geração de pequenas LDL densas deletérias. 9 Recentemente, o aumento da atividade da CETP foi de fato associado ao aumento do risco de DAC em indivíduos com TGs elevados. 10 Levando isso em consideração, pode-se hipotetizar que, em indivíduos hipertrigliceridêmicos, a inibição da CETP pode ser antiaterogênica por reduzir a formação de pequena densidade densa de LDL.

Representação esquemática simplificada dos efeitos da inibição de CETP na via de RCT e proteção contra inflamação e oxidação. Os flashes numerados indicam áreas de impacto de inibição da CETP, as quais são detalhadas nos respectivos painéis. Flashes com setas para cima ou para baixo indicam regulação ascendente e regulação descendente, respectivamente. Setas pretas indicam transferência de colesterol livre (FC), CE, ou setas abertas TG indicam conversão de partícula de lipoproteína. 1, RCT. ABCA1 transporta FC e PLs através da membrana celular para apoA-I pobre em lipídios. LCAT esterifica FC em CEs, que são internalizados no núcleo de HDL em maturação. CETP transfers CEs from HDL to apoB lipoproteins ((V)LDL) in exchange for TG. CETP inhibition results in accumulation of CE-rich HDL and decreases LDL-CE. Normally, CE-rich LDL is taken up by the liver via the LDL receptor, and TG in TG-rich HDL is hydrolyzed by HL, resulting in regeneration of lipid poor apoA-I. 2, Under hypertriglyceridemic conditions, CETP preferentially transfers CE from HDL to TG-rich particles (TRL). This results in CE-rich VLDLs, which are a substrate for HL resulting in the formation of small dense LDL (sdLDL 3,5 ). 3, Efflux of cholesterol from macrophages. ABCA1 shuttles FC and PL to lipid-poor apoA-I particles. 30 SR-BI (or human homologue CLA-1) 50,51 can transfer FC to various-sized HDL particles 34 ABCG1 and ABCG4 may specifically transfer cholesterol to larger HDL particles (HDL2). 35 CETP inhibition increases the HDL2 fraction and may also increase lipid-poor apoA-I. 42 The total impact of CETP inhibition on cholesterol efflux is unclear. 4, Uptake of HDL-CE and LDL by the liver. LDL is taken up by the liver by the LDL receptor (LDL-R). CETP inhibition decreases LDL-C, 11 but expression of the LDL-R may be upregulated by CETP inhibition. 74,75 Specific-uptake CE from HDL by the liver is accommodated by SR-BI in mice and perhaps by CLA-1 in humans. ApoE-containing HDL is increased after CETP inhibition. 25,78 This may be taken up by the liver by CLA-1, the LDL-R, or other receptors. 5, Antioxidative action of HDL. HDL protects LDL from oxidation into oxLDL. Several enzymes present on HDL have been shown to account for this such as apoA-I, PON1, PAF-AH, and LCAT. CETP inhibition increases these proteins, except for the latter. 102,103,106,107,110,111 ApoA-II, which is also increased by CETP inhibition, has been shown to displace PON1 from HDL. 117 The ultimate effect of CETP inhibition on oxidation of LDL is not known.

Recent data on CETP inhibition in rabbits and humans show that pharmacological inhibition of CETP has similar effects on the lipid profile as naturally occurring CETP deficiency. 11 Notably, next to the marked increases in HDL-C and HDL size, the CETP inhibitor torcetrapib induced a significant increase in LDL size, caused by both an increase in large LDL particles and a decrease in small LDL particles, suggesting a less atherogenic lipid profile. 12 Recently, similar effects were reported for JTT-705. 13 In this review, we focus on how changes in lipoprotein concentrations and lipoprotein neutral lipid content after CETP inhibition may influence cholesterol exchange processes between the periphery, the circulation, and the liver, thereby covering the reverse cholesterol transport (RCT) pathway. We furthermore discuss the effects of CETP inhibition on fecal sterol excretion. Finally, we briefly touch on the effects of CETP inhibition on the anti-inflammatory and antioxidative properties of HDL.

CETP Inhibition and RCT

RCT is generally invoked to provide the rationale for the antiatherogenic properties of HDL. It concerns the removal of excess cholesterol from peripheral tissues for elimination by the liver and secretion into bile (Figure). 14 Many of its players have been identified, and their particular functions are confirmed by in vitro and animal studies. 15 The Figure, 1, illustrates the most direct route for removal of cholesterol in humans the ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) shuttles cholesterol from peripheral cells to lipid-poor apolipoprotein A-I (apoA-I). Next, lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) esterifies free cholesterol, and the resulting CEs induce maturation of HDL particles. These HDLs can deliver cholesterol to the liver via the scavenger receptor BI (SR-BI) as shown in mice. 16 In humans and rabbits, the presence of CETP in the circulation creates a major diversion from this route. In exchange for TGs, CETP facilitates transfer of CE from HDL to apoB-containing particles, which can also be taken up via the LDL receptor. Ultimately, excess liver cholesterol can be excreted as neutral sterols and bile acids into bile for removal via the feces. Although this model is widely accepted, it is of note that there exists very little experimental evidence that HDL is indeed central to this dynamic process in humans. Nevertheless, RCT provides an excellent tool to discuss the effects of CETP inhibition on HDL metabolism, and we review the role of CETP in each step of this pathway.

Cholesterol Efflux From Peripheral Tissues to HDL

One of the atheroprotective properties of HDL is its ability to act as an acceptor of cholesterol from peripheral cells, or specifically macrophage foam cells in the arterial wall. This initial step in RCT depends mainly on the presence of cholesterol transporters in the cell membrane and the presence and avidity of extracellular acceptor particles, mostly thought to be HDL. 17 CETP has been suggested to affect this process by changing the cholesterol efflux capacity of donor cells and by modulating the uptake capacity as well as availability of initial acceptor particles (Figure, 3).

Cholesterol Donor Capacity of Cells

A role for CETP in the cellular cholesterol donor capacity was proposed after it was shown that CETP is expressed by monocyte-derived macrophages present in fatty streaks and atherosclerotic plaques of human origin. 18,19 Zhang et al also reported that blood-borne macrophages of a CETP-deficient subject were less efficient in cholesterol efflux compared with a control subject, and that COS-7 cells transiently overexpressing CETP showed an increased efflux capacity to medium, whereas influx capacity was unaltered. 19 In contrast to this potentially antiatherogenic role for CETP in macrophages, suppression of CETP synthesis in a liver cell line (HepG2) enhanced cholesterol efflux to HDL, whereas this was unaltered in an adipose tissue cell line (SW872). 20,21 Considering the crucial role of macrophage foam cells in atherogenesis, further research into the exact function of CETP produced by these cells is warranted.

Cholesterol Acceptor Capacity of HDL Particles

By changing the neutral lipid composition and size of HDL, CETP may affect the avidity of these particles for cholesterol. In CETP-deficient individuals 2,22,23 and after CETP inhibition, 12,24–27 average HDL size increases, and the cholesterol content of mainly large HDL 2 particles is increased. 12,28 Indeed, it was reported that plasma from homozygotes for CETP null defects had a reduced acceptor capacity for cholesterol from lipid-laden macrophages. 28,29 These investigators concluded that the large CE-rich HDL particles in CETP deficiency are defective as cholesterol acceptors. These effects can be understood today when considering that ABCA1 only mediates cholesterol and phospholipid (PL) efflux to lipid-free or lipid-poor apoA-I. 30,31 In CETP deficiency, apoA-I synthesis is furthermore unchanged, 32 and recycling of HDL is thought to be compromised. 33 Thus, acceptor capacity in the form of lipid-poor apoA-I may be attenuated. However, other molecules that transport lipids across the cell membrane of macrophages, such as SR-BI, ABCG1, and ABCG4, were recently shown to also stimulate cholesterol efflux, but instead to larger HDL particles (HDL2). 31,34–37 This suggests that these transporters may accommodate cellular cholesterol efflux to the larger HDL particles as observed in CETP deficiency and after CETP inhibition. Indeed, with the present knowledge of ABCA1 and SR-BI transporters, Miwa et al recently readdressed cholesterol efflux in CETP deficiency using both serum and HDL from 3 homozygotes and 3 heterozygotes for a CETP null mutation (the CETP Int14 mutation). 38 Their results suggest that the ABCA1 pathway functions normally and is preferred under reduced CETP activity as seen in heterozygotes, whereas the SR-BI pathway is activated in complete absence of CETP.

These data furthermore suggest that CE-rich HDL particles are still efficient cholesterol acceptors. In vitro studies on cholesterol efflux have shown that the most important property of acceptor particles is PL content. 39 Also in plasma of hypertriglyceridemic subjects, it was observed that HDL-PL and not low HDL-C levels determined efflux from Fu5AH cells. 40 In this respect, it is interesting that increases in total HDL-PL have been observed after CETP inhibition in both humans and rabbits, but how this relates to efflux acceptor capacity has not been addressed to date. 25,26,41,42

Availability of Cholesterol Acceptor Particles

It was postulated that the driving force of cellular cholesterol efflux is not the concentration of the initial acceptors (lipid-poor apoA-I or HDL) but the presence of secondary acceptors (LDL and VLDL) and proteins and enzymes, such as LCAT, CETP, and lipases (phospholipid transfer protein, HL, lipoprotein lipase), which redistribute cholesterol to secondary acceptors and recycle initial acceptors. 39 This suggests that CETP enhances cellular cholesterol efflux rates, but evidence that relates CETP activity to efflux rates is spurious. In one in vitro study, it was indeed demonstrated that cholesterol efflux from red blood cells was highly correlated with LCAT and CETP activities in postprandial plasma as well as the concentration of secondary acceptors, such as chylomicrons, VLDL, and LDL, but not with the initial acceptor HDL. 43 However, in other in vitro studies, no association between CETP activity in plasma and cholesterol efflux from Fu5AH cells was observed. 44,45 A cholesterol efflux–enhancing role for CETP was also observed in human CETP transgenic mice but not in rabbits. Serum of human transgenic (htg) apoA-I/CETP mice showed an increased relative efflux efficiency per HDL particle compared with htg apoA-I mice, as assayed by measuring efflux from both cholesterol-loaded Fu5AH cells and fibroblasts. 46,47 After CETP inhibition, HDL from JTT-705–treated rabbits was equally efficient in accepting cholesterol from acetylated LDL-loaded J774 macrophages compared with HDL from control rabbits. 41 This is most likely related to the observed increase in apoA-I synthesis in rabbits after CETP inhibition. 42 Interestingly, it has been shown that in patients with low HDL-C, torcetrapib decreased the fractional catabolic rate of apoA-I, whereas the synthetic rate was unaltered. 26 This illustrates that the extrapolation of data from animals to man, even if these animals possess endogenous CETP, is challenging.

Together, it is difficult to establish the role of CETP in the important initial step in the RCT pathway, which in vivo occurs within the confinement of the arterial wall. Here, we depend on artificial systems in which only 1 factor that contributes to cholesterol efflux can be assessed at once. For example, SR-BI–mediated efflux is usually addressed in the rat hepatoma cell line Fu5AH, whereas for ABCA1 expression, fibroblasts or cAMP-stimulated macrophages are generally used. 15 There is accumulating evidence that both cholesterol efflux pathways work complementarily, and respond diversely to, for example, the PL content of acceptor particles or metabolic changes. 36,48,49 Moreover, because the relative contributions of ABCA1, SR-BI (and human homologue CLA-1), 50,51 ABCG1, and ABCG4 in macrophage efflux are not firmly established in human physiology, 17 we wish to refrain from predicting to what extent CETP inhibition will affect the initial step in the RCT pathway.

Uptake and Storage of Cholesterol in Adipose Tissue

Adipose tissue is an important storage and sensing organ for cholesterol homeostasis, and the metabolic consequences of adiposity play a role in the progression of atherosclerosis. 52,53 Moreover, both adipocytes and adipose tissue-derived macrophages secrete inflammatory proteins that may contribute to the development of a systemic inflammatory state. 54 Therefore, it is of interest to underline that in addition to the liver, adipose tissue is the second major site of CETP production. 55 Maybe the adipocyte may quickly regulate plasma CETP levels in response to physiological changes. 56 Indeed, CETP gene expression in adipose tissue is significantly upregulated by dietary cholesterol as observed in hamster and human adipose tissue. 21,55 There are indications that CETP plays a role in the selective uptake of HDL CE in adipose tissue, which could accommodate removal of cholesterol from the circulation. 57,58 Vassiliou and McPherson showed in vitro that extracellular CETP (mimicking CETP in the circulation) accounts for 14% of CE-selective uptake in adipose tissue independent of the presence of apoB receptors and SR-BI. These authors propose that this so-called lateral cholesterol transport and storage may be antiatherogenic, and that CETP inhibitors may influence this process. This was addressed recently in liver cells, as is discussed below. 59

CETP may also play a role in intracellular cholesterol homeostasis Izem and Morton showed that suppression of CETP synthesis in the adipose tissue cell line SW872 causes CE accumulation. 21 CETP activity is moreover positively correlated with BMI and waist-to-hip ratio, but it is unclear whether this is cause or consequence. 60,61 Interestingly, a significant weight gain was observed in rabbits receiving JTT-705 in combination with a severe hypercholesterolemic diet for 3 months compared with controls on the same diet. 62 However, this was not observed in a previous study on a milder hypercholesterolemic diet. 63

Given this information, it could be inferred that inhibition of CETP gives rise to a reduction in lipid uptake in adipose tissue, but whether this will have an impact on cholesterol homeostasis, systemic inflammatory status, and atherosclerosis is unclear. Therefore, it would be of interest to study the effect of CETP inhibition on adipose tissue, inflammatory markers, and body weight changes.

Uptake of Cholesterol by the Liver

In mice, which lack CETP, ∼70% of circulating CE is taken up directly from HDL by the liver, 64 which is mediated by SR-BI. 65 Similar data have been obtained in the hamster, a low-CETP animal. 66 As soon as higher CETP levels come into play, the delivery route of CEs to the liver changes dramatically. In rabbits, 70% of CEs are transferred from HDL to apoB-containing particles and subsequently taken up in the liver by the LDL receptor and related receptors and only 30% via apoA-I–containing particles. 67 In humans, a recent kinetic analysis by Schwartz et al indicates that irreversible CE output from lipoproteins to the liver comes from apoB-containing particles and not from HDL. 68 This would suggest that HDL-mediated cholesterol uptake in the liver does not play an important role in humans. This could mean that CETP inhibition will affect the normal uptake of CEs in the human liver via the LDL pathway. Therefore, we discuss the effects of CETP on both HDL and LDL receptor–mediated pathways as illustrated in the Figure, 4.

SR-BI/CLA-1

CLA-1, the human homologue of SR-BI, is expressed mainly in adrenal tissues, liver, and reproductive organs and was shown to have receptor affinity for all lipoproteins, including native HDL, LDL, and VLDL, but also modified oxidized LDL (oxLDL) and acetylated LDL. 69,70 However, the data on the relationship between HDL remodeling by CETP and cholesterol uptake by SR-BI are contradicting. Kinoshita et al observed that in SR-BI–overexpressing Chinese hamster ovary cells, the uptake of CE per HDL particle is increased from CE-rich HDL of CETP-deficient individuals compared with normal HDL. 71 This suggests that SR-BI may efficiently take up cholesterol from CE-enriched HDL after loss of CETP function. In contrast, CETP enhances CE uptake in the liver of mice overexpressing human LCAT or apoA-I, 72,73 leading to less atherosclerosis in htg LCAT/CETP mice. 72 Moreover, the enhanced liver uptake was directly from HDL and not attributable to transfer to apoB-containing particles. 73 Because the role of CLA-1 in humans is not established, the implications of CETP inhibition for this cholesterol uptake route in the liver cannot be properly discussed.

LDL Receptor

As already indicated, the main route for delivery of CE to the liver in humans is thought to be mediated by apoB-containing lipoproteins. Remarkably, increased apoB catabolism has been observed in homozygous CETP deficient subjects compared with unaffected controls. 74 This is consistent with upregulation of the LDL receptor in rabbits injected with antisense CETP oligonucleotides 75 and downregulation of the LDL receptor in mice that overexpress human CETP. 76 It has been suggested that upregulation of the LDL receptor in homozygous CETP deficiency is a compensatory mechanism to counteract reduced affinity for the LDL receptor of the observed polydisperse apoB-containing particles. 77 Depending on the CETP inhibitor, marked 12,25 or modest 24,27 reductions in LDL-C have been shown in humans. A similar effect was also observed when CETP inhibitors were used in combination with statins. 12,26,27 Whether this is also attributable to an upregulation of the LDL receptor remains to be determined. Alternatively, the reduced LDL-C levels after CETP inhibition can also be explained by the decreased CETP-mediated transfer of CE from HDL to LDL. In this case, CEs are not removed from the circulation via LDL, and the influx into the liver may in fact be reduced. In this respect, it is interesting to note that after CETP inhibitor treatment, LDL size increases, particularly by a decrease in small LDL, which may suggest that the remaining LDL particles are less atherogenic. 12,13

As an alternative pathway, the uptake of CE by the liver could also be mediated via apoE-containing HDL because CETP inhibition is associated with increased apoE levels. 25,27,78 It has been shown that apoE-containing HDL particles can be taken up by the members of the LDL receptor family 79–81 but also by SR-BI. 82,83 Furthermore, Yamashita et al showed that apoE-rich HDL from CETP-deficient individuals had a higher affinity for LDL receptors on fibroblasts than LDL itself. 84 Although Clark et al did not confirm that the increase of apoE levels can be accounted for by an apoE-enrichment of HDL, it can be hypothesized that CETP inhibitors may lead to enhanced removal of CE via apoE-containing HDL particles. 25,78

Receptor-Independent Selective Uptake of HDL-CE

In 1987, Granot et al reported that addition of CETP to liver cells (HepG2) in vitro enhanced selective uptake of HDL-CE. 85 Later, this was attributed to the indirect effect of CETP-mediated transfer of HDL-CE to other lipoproteins before uptake because this presumed that selective uptake of HDL-CE could be blocked by antibodies against the LDL receptor and other apoB and apoE receptors. 86 In contrast, Gauthier et al recently observed that exogenous CETP enhanced the uptake of HDL-CE in mouse hepatocytes of both LDL receptor-null mice and SR-BI−/− mice in vitro. 59 Torcetrapib partially inhibited this selective uptake mediated by endogenous CETP in these experiments. In vivo, in adenoviral CETP-expressing mice, high doses of intravenously injected torcetrapib attenuated CETP-mediated decrease in total cholesterol only partially. The authors suggest that the remaining decrease in total cholesterol was attributable to hepatic cholesterol clearance by cell-associated CETP, and that this antiatherogenic function of CETP may not be inhibited by torcetrapib. Nevertheless, the overall importance in humans needs to be established because kinetic analysis by Schwartz suggests that selective uptake of HDL-CE in man plays a minor role in total hepatic uptake of CE. 68

In summary, CETP inhibition is likely to influence the hepatic uptake of CE from the circulation via apoE-rich HDL, maybe in combination with upregulation of the LDL receptor.

Secretion of Cholesterol by the Liver Into the Intestine

The ultimate step in the removal of cholesterol from the body is the excretion of neutral sterols and bile acids in the feces, which can be upregulated in humans by the infusion of apoA-I or reconstituted HDL (rHDL). 87,88 These studies support the idea that HDL is central to the removal of (peripheral) cholesterol in humans, and it was hypothesized that increasing HDL-C and apoA-I levels by CETP inhibition may also increase fecal cholesterol excretion. However, Brousseau et al did not observe a difference in fecal sterol excretion, even after torcetrapib induced a 100% to 125% increase in HDL-C in patients with low HDL-C at baseline. 26 Similarly, in rabbits, attenuation of CETP activity by red pepper was shown to slightly increase TG excretion but did not affect cholesterol excretion. 89 In htg CETP mice, it has also been observed that liver cholesterol levels and cholesterol synthesis are strongly affected by infusion of rHDL, but this had no effect on fecal excretion. 90 A lack of change in fecal cholesterol secretion was also observed in ABCA1 knockout mice that have almost no HDL-C in the circulation. 91 Together, these data suggest that the earlier steps in the RCT pathway (ie, the enrichment of HDL with CE), and, consequently, the increase of HDL-C, have little to do with the removal of cholesterol from the human body as a final step in RCT. On the other hand, it could be that fecal sterol excretion does not accurately reflect changes in hepatic cholesterol influx after CETP inhibition. This hypothesis is supported by the observation that rats metabolize CE taken up via HDL CE more efficiently into bile acids than CE from LDL. 92,93 Finally, it may be that torcetrapib did not induce fecal sterol excretion to the same extent as a large intravenous dose of apoA-I, but there may have been a reduction in fecal sterol excretion, which was too small to detect. Although there is no evidence that CETP inhibition stimulates fecal cholesterol excretion, overexpression of human CETP in mice has been shown to enhance fecal cholesterol excretion. 94 This effect could be related to the increased CE content of the liver of these mice, but these investigators also observed a small increase in the expression of ABCG5. Because this transporter is known to affect hepatic sterol excretion, this suggests that CETP can affect cholesterol output in this model, albeit not along the classical route of RCT. 94

In summary, these CETP inhibition data support the view that HDL may not represent the major vehicle to deliver CE to the liver for subsequent elimination in bile in humans. There is no consensus regarding the significance of this final excretion step with respect to maintaining whole body flux in RCT, neither whether this final step in RCT is actually connected to and reflects what is assumed the most important step for the atherosclerosis process (ie, cholesterol efflux from macrophages). 95,96 This leaves the question whether CETP inhibition may affect atherogenesis by altering RCT as yet unanswered.

CETP Inhibition and Anti-Inflammatory and Antioxidative Properties of HDL

It has been long recognized that apart from its role in RCT, HDL possesses properties that may reduce atherosclerosis by attenuating inflammation of the vascular wall and by preventing oxidation of LDL. 97 For details, we refer to a recent review by Barter. 98 It was recently shown that rHDL can effectively block neutrophil infiltration in the carotid artery of the rabbit, 99 an early event of inflammation of the vessel wall. 100 Other investigators reported that apoA-I can inhibit T-cell activation of macrophages, which, in turn, will reduce the production of inflammatory cytokines and chemokines. 101 In addition, through prevention of LDL oxidation, a key event in atherogenesis, HDL has also been shown to inhibit the formation of foam cells. 102,103 Most of this effect is currently attributed to enzymes that are associated with HDL (Figure, 5), but also, physicochemical properties of HDL subfractions have been implicated. 104–106 First, apoA-I was shown to prevent LDL oxidation. 102,103 Second, paraoxonase 1 (PON1), exclusively present on HDL, protects LDL from oxidation but also enhances cholesterol efflux from macrophages and, as such, may play a dual role in the protection against atherosclerosis. 107–109 Other HDL-associated enzymes that may reduce propagation of oxidation of LDL are platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH or lpPLA2) 110 and LCAT. 106,111

Because of the strong impact of CETP inhibition on HDL, it is plausible that CETP inhibition modifies the anti-inflammatory and antioxidative properties of HDL. Currently, there are no data on the effects of CETP inhibitors on changes in the anti-inflammatory properties of HDL. Antioxidative properties can be indirectly addressed by measuring resistance of LDL to oxidation or antibody levels against oxLDL, which, however, does not give information on the underlying mechanism. In 78 postmenopausal women, CETP activity and oxidation of LDL were weakly correlated. 61 In vitro, LDL incubated in plasma containing a CETP inhibiting antibody was more resistant to oxidation, indicating that CETP inhibition might reduce oxidative modification of lipoproteins. 112 In contrast, it was also shown that CETP may be antiatherogenic because it prevented cholesterol loading of oxLDL. 113 Studies in mice have also provided equivocal data. Introduction of the human CETP gene in mice did not affect oxLDL antibodies in the circulation. 114 However, in ovariectomized mice, a lack of CETP resulted in higher oxLDL antibody levels, suggesting that CETP is protective under these physiological conditions.

Data on antioxidative enzymes in CETP deficiency or after CETP inhibition are scarce. Elevation of PON1 activity was observed in 1, but not in a second homozygous CETP-deficient individual. 115 Moreover, when adjusted for HDL-C or apoA-I levels, lower specific PON1 activity was observed in CETP-deficient individuals compared with controls. This could be connected to the observation that human apoA-II can displace PON1 from HDL particles taken the increased LpAI:AII fraction in CETP deficiency. 28,116,117 Zhang et al recently showed that PON1 and PAF-AH increased significantly after treating rabbits with JTT-705, 78 but it should be noted that this was not observed by Huang et al in a previous report. 62

Recently, Bisoendial et al have assessed PON1 activity and autoantibodies against oxLDL after CETP inhibition with JTT-705 in patients with very low HDL-C. 13 The data indicate that CETP inhibition improves the antioxidative status of these individuals, but the sample size is small, and further studies are warranted.

Impact of CETP Inhibition on Atherogenesis and Concluding Remarks

The purpose of CETP inhibition therapy is to protect against CAD by reducing atherosclerosis or stabilizing vulnerable plaques. Awaiting the first human data, studies with rabbits have provided a basis for optimism. Already in 1998, Sugano et al observed markedly reduced atherosclerosis in Japanese white (JW) rabbits on a high-cholesterol diet (0.3%) using an antisense strategy that inhibits CETP expression. 75 Furthermore, 3 different vaccines that induce antibodies against CETP have been shown to reduce atherosclerosis in New Zealand white (NZW) rabbits on a cholesterol-rich diet. 118–120 Pharmacological inhibition with JTT-705 prevented atherosclerosis progression in JW rabbits on a 0.2% cholesterol diet. 63 However, no significant effects were observed in a different study in JW rabbits that received a similar dose of JTT-705, but were on a 0.25% cholesterol diet. 62 This may be explained by more severe diet-induced hypercholesterolemia in the latter rabbits, but the treatment period was also shorter. More recently, pharmacological inhibition of CETP with torcetrapib also prevented atherosclerosis in NZW rabbits on a 0.2% cholesterol/10% coconut oil diet. 121

It is a major challenge to determine what mechanisms are primarily responsible for the atheroprotective effect of CETP inhibition. Of course the marked increase in HDL-C levels is put forward but which functions of HDL are responsible for atheroprotection? Moreover, as illustrated in this review, CETP does not only affect HDL metabolism but also LDL metabolism. To protect the arterial wall against atherosclerosis, the following processes are thought important: (1) preventing inflammation, and internalization/modification of LDL to attenuate foam cell formation (2) stimulating cholesterol efflux from lipid-laden macrophages and (3) enhancing LDL uptake by the liver, thereby limiting LDL modification and plasma residence time of this atherogenic lipoprotein. The current literature provides evidence that CETP inhibition may affect each of these processes. At the same time, this review shows that many aspects regarding the functions of CETP in human metabolism and the importance of human RCT are still elusive. The first issue that remains to be resolved is the role of CETP in adipose tissue. Second, with respect to the classical concept of RCT, there is concern that CETP inhibition reduces the flux of cholesterol through RCT both by decreased recycling of HDL acceptor particles and by diminished hepatic cholesterol uptake via the LDL receptor. The unchanged fecal cholesterol excretion after CETP inhibition may be considered an indication of this however, it can also indicate that HDL is not central to liver cholesterol uptake in man. Importantly, this does not rule out that HDL serves as an initial acceptor of cholesterol from lipid-laden macrophages in the intima. There remains a strong need to determine what parameter can give us in vivo information on this crucial first step of RCT, rather than waiting for changes in arterial wall morphology or atheroma burden. Furthermore, it is not clear what the relative contribution of RCT to human atheroprotection is, especially when compared with the anti-inflammatory and antioxidation properties of HDL. Finally, this review has addressed the complex biology of CETP in RCT, but it remains to be seen whether this is relevant when it comes to atheroprotection.

Despite all the uncertainties, the impact of CETP inhibition on raising HDL-C and decreasing both LDL-C and small dense LDL illustrates its potential to reduce atherosclerosis in man. Moreover, CETP inhibition may protect against atherosclerosis by improving the anti-inflammatory and antioxidant actions of HDL, as demonstrated previously in rabbits and now for the first time in man. These data suggest that CETP inhibition goes beyond raising HDL-C levels alone.

This work was supported by the Netherlands Heart Foundation grant 2003B191.


Inhibition of constitutive protein secretion from lactating mouse mammary epithelial cells by FIL (feedback inhibitor of lactation), a secreted milk protein

M.E. Rennison, M. Kerr, C.V. Addey, S.E. Handel, M.D. Turner, C.J. Wilde, R.D. Burgoyne Inhibition of constitutive protein secretion from lactating mouse mammary epithelial cells by FIL (feedback inhibitor of lactation), a secreted milk protein. J Cell Sci 1 October 1993 106 (2): 641–648. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.106.2.641

The effect of a protein feedback inhibitor of lactation (FIL) on casein synthesis and secretion was examined using isolated acini from lactating mouse mammary gland. As previously found, FIL partially inhibited protein synthesis but produced an additional inhibition of constitutive casein secretion. The inhibition of synthesis and secretion showed similar dose-dependency and the inhibition was fully reversible. Constitutive secretion of pre-formed protein was inhibited by FIL in a pulse-chase protocol, indicating that the inhibitor regulated protein secretion by reducing protein movement through the secretory pathway independently of any initial inhibition of synthesis. Regulated exocytosis was not inhibited since casein release due to elevation of cytosolic Ca2+ concentration by the ionophore ionomycin was unaffected. Brefeldin A, which is known to block ER-to-Golgi transport, also inhibited both protein synthesis and secretion in mammary cells. The action of FIL on synthesis and secretion and previously described actions on casein degradation would be consistent with a block at an early stage in the secretory pathway. In support of this idea FIL treatment was found to result in vesiculation and swelling of the endoplasmic reticulum. These data provide evidence for a novel control of a constitutive secretory pathway by a physiological extracellular regulatory protein.


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