Em formação

Cálculo da concentração do Fator VIII para Elisa


Eu tenho o seguinte problema. Estou tentando obter o cálculo da concentração para uma planilha do Excel que calculará os valores de uma placa Elisa.

A base é uma curva padrão com os seguintes valores:

Padrão: Fator PreDil 1: 40 Fator PreDil 2: 55 ---> Prediluição total = 2200 Concentração: 2123 µg / ml

Diluição 1:20 1:40 1:80

Padrão 1 1,3910 0,6360 0,2850

Std 2 1,4020 0,6360 0,3140

Std 3 1,3500 0,6250 0,2880

Std 4 1,4470 0,6810 0,2900

Os valores de amostra são os seguintes:

Prediluição: 15

Diluição 1:20 1:40 1:80

Amostra 0,4060 0,1940 0,0760

De acordo com o programa utilizado anteriormente, a concentração passará a ser de 4.786 µg / ml. Como faço para calcular isso da melhor maneira? Infelizmente, não consigo obter a resposta certa.

Para adicionar mais contexto à questão. Eu trabalho em um projeto para mover um programa antigo que calculava as concentrações para uma nova planilha do Excel. Infelizmente, não faço essas análises sozinho, pois trabalho em outra parte do laboratório.

No entanto, a questão é baseada em como obter o valor da concentração da amostra não diluída. O padrão usado tem uma concentração não diluída de 2123 µg / ml. É pré-diluído em duas etapas, primeiro 1/40 e depois 1/50 dando uma diluição total de 1/2200.

O padrão é então analisado para três doses diferentes 1/20, 1/40 e 1/80. Duas vezes no início da corrida e duas vezes no final.

A amostra é pré-diluída 1/15 para então ser analisada para as mesmas três doses que o padrão.

O que fiz agora é usar o modelo de linha paralela para tentar calcular a concentração. Infelizmente, não obtenho a mesma resposta do programa de cálculo anterior (que é 4.786) e pude descobrir que o problema é que obtenho uma ligeira mudança na potência relativa. Infelizmente, não consigo descobrir onde está o problema.

Esperançosamente, isso esclarece um pouco.


Minha resposta: 4,79 µg / ml

(Todos os valores abaixo são µg / ml)

Dados de calibração

Determine a média dos quatro valores de absorbância em cada diluição.

A curva de calibração é então um gráfico de concentração (eixo x) em relação à absorbância média. Observe que a concentração real no ensaio é (2123/2200) / diluição onde a diluição é 20, 40 ou 80. Se você traçar um gráfico, verá que os dados se ajustam bem a uma linha reta.

Use as funções SLOPE e INTERCEPT do Excel para derivar os parâmetros da linha de tendência. (Obtenho INCLINAÇÃO = 30,59; INTERCEPÇÃO = -0,8225)

A equação para converter um valor de absorbância observada em uma concentração é:

concentração = (absorbância - INTERCEPÇÃO) / INCLINAÇÃO

Dados de amostra

Para as medições de amostra, o único que é válido é para a diluição 20x porque as outras absorbâncias estão fora da faixa dos dados de calibração (ver nota abaixo).

Usando 0,406 como o valor de absorbância na equação acima dá um valor de 0,01596 para a concentração no poço de ensaio. Esta amostra foi diluída 20 vezes para o ensaio, e a fonte para essa diluição foi derivada de uma 'pré-diluição' 15 vezes, de modo que a concentração original da amostra é 300x o valor do ensaio que é 4,788 µg / ml.

Observação

Não sei a natureza da discrepância entre seus cálculos e o valor alvo, mas se você tentar incorporar as diluições de 40x e 80x para a amostra, obterá valores mais altos para a concentração da amostra. Presumivelmente, o ensaio se torna não linear em baixas concentrações.


Expressão estável de alto nível de fator VIII em células de ovário de hamster chinês em sistema baseado em fator 1 alfa de alongamento melhorado

O fator VIII recombinante (FVIII), usado para a terapia da hemofilia A, é um dos mais desafiadores entre as proteínas terapêuticas produzidas em sistemas de expressão heterólogos. A variante de deleção de FVIII, em que todo o domínio B é substituído por um pequeno peptídeo ligante, foi aprovada para uso médico. A eficácia e segurança desta variante de deleção de FVIII são semelhantes às preparações de FVIII de comprimento total, enquanto o nível de produção em células CHO é substancialmente mais alto.

Os níveis típicos de produtividade para linhas de células CHO que produzem a variante de deleção FVIII-BDD SQ, descrita em outro lugar, são 0,5–2 IU / ml, correspondendo à concentração de FVIII de cerca de 0,2 μg / ml. Usando vetores padrão com base no promotor de citomegalovírus (CMV) e no cDNA da di-hidrofolato redutase, obtivemos anteriormente a linha celular secretando 0,5 IU / ml de FVIII-BDD, que corresponde aproximadamente aos dados publicados anteriormente.

Resultados

Um sistema de expressão baseado em sequências genômicas CHO incluindo o promotor CHO-EEF1A e fragmento de repetição terminal do vírus Epstein-Barr nos permitiu atingir um aumento de 80 vezes no nível de produção em comparação com o sistema de expressão convencional baseado no promotor CMV.

Imediatamente após a seleção primária, as células produtoras de FVIII secretaram 5–10 IU / ml de FVIII-BDD, e após a amplificação conduzida por metotrexato em múltiplos estágios, uma linha clonal estável 11A4H foi selecionada, secretando 39 IU / ml de FVIII-BDD no simples condições de cultivo em lote, que superam consideravelmente os indicadores conhecidos para produtores industriais desta proteína. Em contraste com outras linhas produtoras de FVIII-BDD, 11A4H acumula baixa proporção de FVIII secretado na membrana. Sua produtividade pode ser aumentada aproximadamente duas vezes adicionando butirato de sódio e hidroxianisol butilado ao meio de cultura.

Foi utilizado um processo de purificação de cinco estágios para o fator VIII. Permitiu o isolamento do FVIII-BDD intacto, conforme foi confirmado por espectrometria de massa. O FVIII-BDD purificado tem uma atividade específica de 11.000 UI / mg, semelhante às drogas FVIII recombinantes conhecidas.

Conclusões

O FVIII-BDD recombinante foi produzido em células CHO sem adição de quaisquer materiais derivados de animais, purificado e caracterizado. As novas construções genéticas para a expressão de proteínas heterólogas combinadas com o método de cultivo otimizado permitiram obter o nível de secreção de FVIII recombinante biologicamente ativo aumentado em quase dez vezes em comparação com os análogos publicados anteriormente.


Como fazer uma curva de calibração e calcular as concentrações de amostra usando o Excel e o tutorial de vídeo # 8211

Tutorial em vídeo da curva de calibração do ExcelTrabalhando em laboratório, há várias maneiras diferentes de calcular a quantidade de um analito presente em uma amostra, comparando-os com os padrões. Você pode usar um único padrão externo, uma curva de calibração, padrão interno ou usar adição de padrão. Aprender a usar esses diferentes métodos de cálculo é essencial para trabalhar no laboratório e é uma parte essencial de qualquer programa de treinamento laboratorial.

Este é um tutorial em vídeo para fazer uma planilha Excel para criar uma curva de calibração usando seis padrões e usá-la para calcular automaticamente as concentrações de amostra desconhecidas.

A planilha também inclui um calculador de fator de diluições, usando o qual a concentração de analito nas amostras não diluídas também pode ser calculada automaticamente.

Também mostramos como proteger a planilha Excel para que as fórmulas não sejam alteradas por engano e também você pode validar posteriormente a planilha Excel para uso em um ambiente regulamentado.

Para obter os melhores resultados, veja o vídeo em HD, no modo de tela inteira e use fones de ouvido para melhor clareza de som.

No tutorial em vídeo, você aprenderá como & # 8211

  1. Insira os dados para uma curva de calibração no Excel
  2. Faça uma curva de calibração com linha de tendência de regressão linear
  3. Mostra a equação de regressão linear da linha no gráfico
  4. Exibir o valor r 2 da linha de regressão no gráfico
  5. Calcule a inclinação e intercepte a linha de regressão usando fórmulas
  6. Calcule a concentração de amostras desconhecidas usando a equação y = mx + c
  7. Calcular o fator de diluição para as amostras que são diluídas antes da análise
  8. Calcular as concentrações da amostra não diluída
  9. Protegendo a planilha do excel para que você possa validá-la no futuro
  10. Formatar a folha de excel para que possa ser impressa corretamente em uma folha de papel

Para que você pode usar esta folha?

Você pode usar esta folha para calcular a concentração da amostra a partir de uma curva de calibração padrão para qualquer técnica como HPLC, GC, UV, AAS ou qualquer outra técnica onde a regressão linear é usada. Você também pode usá-lo na validação do método para avaliar a linearidade da resposta e estabelecer a faixa do método.

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Reivindicações

1. Método para aumentar a proteína Fator VIII (FVIII) em um sujeito humano, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito humano de uma ou mais doses de 5 × 1012 a 5 × 1013 vg / kg de um vetor de vírus associado a adenovírus (AAV) que codifica uma proteína FVIII, em que a administração do vetor AAV resulta em um aumento clinicamente relevante no nível de atividade FVIII circulante.

2. Método para aumentar a proteína Fator VIII (FVIII) em um sujeito humano, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito humano de uma ou mais doses de 5 × 1012 a 5 × 1013 vg / kg de um vetor de vírus associado a adenovírus (AAV) que codifica uma proteína FVIII, em que a administração do vetor AAV resulta em uma redução do número de tratamentos com FVIII que o sujeito humano é submetido.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração do vetor AAV resulta em uma ou nenhuma ocorrência de episódios de sangramento espontâneo no sujeito humano entre 3-12 meses após a administração.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 1 × 1013 vg / kg a 3 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 2 × 1013 vg / kg a 4 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 3 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína FVIII compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV tem um serótipo AAV6.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV compreende um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína FVIII operacionalmente ligada a um intensificador específico do fígado e um promotor.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o potenciador específico do fígado compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 e / ou o promotor compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2 5 'e uma sequência de ITR de AAV2 3' que flanqueia o cassete de expressão.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o AAV2 5 ′ ITR compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 12 e / ou AAV2 3′ITR compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano tem hemofilia.

15. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano não recebe nenhum tratamento com FVIII 3-12 meses após a administração.

16. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a administração do vetor AAV resulta em uma ou nenhuma ocorrência de episódios de sangramento espontâneo no sujeito humano entre 3-12 meses após a administração.

17. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 1 × 1013 vg / kg a 3 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

18. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 2 × 1013 vg / kg a 4 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

19. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma ou mais doses de 3 × 1013 vg / kg do vetor AAV.

20. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína FVIII compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.


Métodos

População de pacientes

Os controles saudáveis ​​foram recrutados em 8 centros primários em Milwaukee, Atlanta, Detroit, Houston, Indianápolis, Iowa City, Nova Orleans e Pittsburgh. Os indivíduos com VWD foram recrutados desses centros primários, juntamente com vários centros secundários nos Estados Unidos (listados nos agradecimentos). Todos os indivíduos com VWD tinham um diagnóstico preexistente de VWD. Os controles saudáveis ​​foram registrados em instituições e comunidades locais. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão de Pesquisa em Seres Humanos de cada instituição, e todos os sujeitos deram consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os indivíduos inscritos receberam um questionário detalhado sobre sangramento, incluindo perguntas dos Marcadores Moleculares e Clínicos Europeus para o Diagnóstico e Gerenciamento do estudo VWD tipo 1. 11

Teste VWF

O plasma de cada sujeito foi testado usando métodos padrão do Laboratório de Referência de Hemostasia no BloodCenter de Wisconsin para VWF: Ag, VWF: RCo, atividade de FVIII, VWF: CB, VWFpp e análise de multímero como descrito anteriormente. 10 Os ensaios de ligação de plaquetas foram realizados em todos os casos de índice VWD tipo 2B suspeitos usando uma modificação do ensaio de ligação de anticorpo monoclonal "neutro" anteriormente descrito. 12 No ensaio de ligação 2B, ristocetina a uma concentração de 0,3 mg / mL foi adicionada a plaquetas lavadas fixadas em formalina para identificar amostras com ligação acentuadamente aumentada de VWF plasmático. Para avaliação de indivíduos VWD tipo 2N, a atividade de ligação de FVIII foi medida usando VWF plasmático ligado a um anticorpo monoclonal como descrito anteriormente. 13 O DNA foi coletado para genotipagem de VWF em todos os controles saudáveis ​​e casos de índice de VWD. Seqüenciamento de genes do VWF região de codificação, incluindo limites de íntron-exon, foi realizada como descrito anteriormente. 10 A sequenciação também incluiu 3,5 kb a montante do exão 1 e 1 kb a jusante do códon de parada C-terminal. As sequências dos iniciadores estão disponíveis mediante pedido.

VWF: IbCo ELISA

Um construto GPIbα de ganho de função (tGPIbα 235Y239V) foi sintetizado contendo 2 mutações, D235Y e M239V, com um marcador de histidina para purificação e uma mutação C65A para prevenir a dimerização. D235Y é uma nova mutação, 14 e M239V foi previamente documentado como levando a um aumento na ligação do VWF. 15 A construção se estende do nucleotídeo 85 ao 960 (aminoácido 290) com base na sequência de Lopez et al. 16 Uma construção semelhante com a sequência GPIbα de tipo selvagem também foi sintetizada. A construção tGPIbα 235Y239V foi expressa em células de inseto S2 e o sobrenadante foi coletado e purificado em uma coluna de níquel (GE Healthcare). Um anticorpo monoclonal contra GPIbα humano foi ligado a uma placa de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de 96 poços (Immulon 4 HBX, ThermoScientific) e incubado a 4 ° C durante a noite. A construção tGPIbα 235Y239V foi então adicionada e incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. Plasma diluído foi adicionado como fonte de VWF e também incubado em temperatura ambiente por 1 hora. Nenhuma ristocetina foi usada neste ensaio. Uma mistura de anticorpos monoclonais anti-VWF biotinilados (AVW-1 e AVW-15) foi usada para detectar a presença de VWF. Fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina e p-nitrofenilfosfato foi adicionado e a densidade óptica medida em um leitor de ELISA. Plasma de controle normal liofilizado, reconstituído e calibrado para o padrão da Organização Mundial da Saúde foi usado para construir a curva de referência. A estabilidade da interação VWF-GPIbα foi avaliada variando os tempos de incubação e variando o número de lavagens usado entre cada etapa. Os resultados de VWF: IbCo ELISA relatados aqui usam 3 lavagens, a menos que especificado de outra forma. Para os ensaios usando o GPIbα de tipo selvagem, 1 mg / mL de ristocetina foi adicionado junto com o VWF.

Estudos de reprodutibilidade ELISA

O teste de repetibilidade foi inicialmente realizado usando uma amostra de plasma de controle normal liofilizada e reconstituída. As alíquotas foram congeladas e descongeladas no dia do teste. A amostra de controle foi processada 19 vezes, cada uma em uma placa preparada de fresco. O mesmo técnico de laboratório realizou cada ensaio. Testes de repetibilidade adicionais foram realizados em um conjunto de amostras de controle normal do ZMPCB-VWD com níveis variáveis ​​de VWF: Ag, incluindo uma amostra com VWF: Ag de 20 IU / dL. Os ensaios foram realizados ao longo de 7 dias para examinar a variabilidade do dia-a-dia. Dois técnicos diferentes realizaram um total de 13 ensaios para examinar a variabilidade de técnico para técnico.

Estatisticas

O programa estatístico Stata (StataCorp LP) foi utilizado para realizar as análises estatísticas. Comparações das proporções médias de VWF: Ag, VWF: RCo e VWF: RCo / VWF: Ag usadas Aluno t teste. Os valores de VWF: Ag e VWF: RCo foram transformados em log para atingir uma distribuição normal antes da análise. A análise de regressão linear múltipla foi usada para comparar os resultados de VWF: Ag, VWF: RCo e VWF: IbCo ELISA. Análises de efeito misto unilateral e bidirecional foram usadas para estimar a magnitude da variabilidade do dia e do técnico para cada ponto de dados com o VWF: IbCo ELISA. Como a variabilidade dependia se VWF: Ag era alto, baixo ou normal, análises separadas de variância foram realizadas para cada nível de VWF: Ag (de 14 IU / dL a 168 IU / dL). A variabilidade de técnico para técnico foi determinada após a remoção do efeito da variabilidade do dia-a-dia.

VWF: Distribuição de multímero IbCo ELISA

Para determinar se a ligação de VWF ao construto tGPIbα 235Y239V foi principalmente com multímeros de alto peso molecular, semelhante ao ensaio VWF: RCo, um VWF modificado: IbCo ELISA foi realizado usando uma amostra de plasma de controle normal reconstituída e liofilizada. Alíquotas do plasma de controle foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato com albumina de soro bovino a 1% e aplicadas aos poços de ELISA. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora, e o sobrenadante aspirado e aplicado em um poço subsequente para um total de 5 aplicações. Após a remoção do sobrenadante, os poços foram lavados. O VWF que foi ligado ao tGPIbα 235Y239V capturado foi então eluído do poço com dodecil sulfato de sódio a 5% a 95 ° C. O sobrenadante foi salvo do poço final para determinar a distribuição de multímero de VWF que ainda permanece no sobrenadante. A distribuição do multímero VWF também foi examinada usando um construto GPIbα de tipo selvagem com a adição de ristocetina a 1 mg / mL para induzir a ligação. Todas as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 0,65% contendo Tris-glicina 25% e dodecil sulfato de lítio a 0,1% e transferidas para uma membrana Immobilon-P (Millipore). O VWF foi detectado usando um anticorpo policlonal de coelho anti-VWF humano (Dako North America) e IgG anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (ThermoScientific). A membrana foi desenvolvida com SuperSignal Chemiluminescent Substrate (ThermoScientific) e exposta ao filme BioMax (Kodak) para visualização.

ELISA para medir a ligação da alça VWF A1 à ristocetina

Os construtos de domínio VWF A1 foram sintetizados para incluir a sequência do peptídeo sinal e todo o domínio A1 do nucleotídeo 3724 (aminoácido 1242) até 4434 (aminoácido 1478) em um vetor pcDNA3.1 com um epítopo myc e um marcador de histidina (Invitrogen). Duas construções mutantes, 1472H e 1467S, também foram sintetizadas. Placas de anidrido maleico (ThermoScientific) foram usadas para capturar ristocetina (American Biochemical and Pharmaceutical Ltd), plaqueadas a uma concentração de 1 mg / mL em tampão de revestimento de carbonato (carbonato de sódio 15 mM e bicarbonato de sódio 35 mM) e incubadas durante a noite a 4 ° C. Um ensaio ELISA foi realizado usando essas construções de domínio VWF A1, que foram incubadas à temperatura ambiente por 60 minutos. A detecção foi feita com um anticorpo anti-His de camundongo (AbD Serotec). Os construtos de domínio VWF A1 também foram comparados usando um ensaio VWF ELISA para determinar a quantidade presente com um anticorpo de captura anti-myc de camundongo (9E10, produzido a partir de uma linha celular cultivada no Blood Research Institute) e anticorpo de detecção anti-His de camundongo (AbD )


Discussão

O ensaio Bethesda é amplamente utilizado para monitorar o desenvolvimento e a progressão dos inibidores do FVIII. 16 Os resultados estão sujeitos a uma série de variáveis ​​de ensaio que afetam a confiabilidade e a interpretação clínica. Por exemplo, a estabilidade do FVIII em NPP é comprometida pela mudança de pH e redução da concentração de proteína resultante da diluição. Isso pode levar a títulos de Bethesda espúriosmente positivos. Este problema foi abordado pela modificação de Nijmegen, 7 que usa NPP tamponado a pH 7,4 com imidazol e substitui o plasma deficiente em FVIII por tampão na mistura de controle e, se altos títulos estiverem presentes, na preparação de diluições de plasma do paciente.

Características do ensaio relatado de inibidor do fator VIII *

Características do ensaio relatado de inibidor do fator VIII *

Fontes de plasma combinado normal comercial e plasma deficiente em FVIII *

Fontes de plasma combinado normal comercial e plasma deficiente em FVIII *

O método Nijmegen não foi amplamente adotado pelos laboratórios da NASCOLA, possivelmente devido ao custo do plasma deficiente em FVIII em relação ao tampão. No entanto, é interessante notar que mais de 60% dos laboratórios da NASCOLA usaram uma NPP comercial tamponada para a mistura de controle e para fazer as misturas de pacientes 1: 1. Esses laboratórios não estão realizando um ensaio Bethesda clássico, mas um híbrido dele e do método de Nijmegen, sugerindo que os laboratórios estão modificando as práticas.

A presença de um anticoagulante lúpico pode resultar em uma taxa de erro falso-positivo significativa. 17 Isso não foi abordado pelas pesquisas atuais sobre inibidores de FVIII. Os desafios futuros dos testes de proficiência para avaliar o efeito do anticoagulante lúpico e outras interferências seriam importantes. Em particular, as interferências pela presença de heparina, agentes de desvio de FVIII e fator VII ativado recombinante seriam de interesse.

Embora o ensaio Bethesda tenha sido usado como “padrão ouro” para quantificar os inibidores do FVIII, ele não é capaz de detectar anticorpos não inibidores, apenas quantifica aproximadamente os anticorpos inibidores encontrados em pacientes sem hemofilia e não pode determinar os isotipos do inibidor. Os ELISAs de 18 inibidores de FVIII não têm essas deficiências e também mostram melhor sensibilidade na detecção de inibidores de baixo título. Enquanto os ELISAs são adequados para triagem rápida em larga escala para detectar possíveis inibidores de FVIII, eles não podem quantificar um inibidor, se presente. Alguns autores questionam a sensibilidade do método ELISA, alegando que um resultado negativo do ELISA pode precisar ser reavaliado pelo método de Bethesda. 19 No entanto, o trabalho de Lindgren e colaboradores 20 sugere que as sensibilidades do ELISA variam devido a diferentes fontes do alvo FVIII na placa de microtitulação, com a presença do fator de von Willebrand afetando adversamente a sensibilidade.

Ensaios de inibidor de FVIII confiáveis ​​são necessários para o diagnóstico e tratamento de pacientes com hemofilia A e para facilitar a comparação interlaboratorial de títulos de inibidor em estudos realizados para monitorar a segurança da terapia de reposição de FVIII. Os resultados do presente estudo demonstram notável uniformidade nas características do ensaio entre os laboratórios da NASCOLA. Apesar desta aparente uniformidade, o CV interlaboratorial para títulos de inibidor de FVIII de baixo nível variou entre 30% e 42%. Um CV interlaboratorial ainda maior (56%) foi relatado para altos títulos de inibidor de FVIII em um estudo piloto conduzido em 2005 no qual 32 laboratórios da NASCOLA avaliaram uma amostra de teste com um título de inibidor de FVIII de 15 a 20 BU / mL. Esse nível de imprecisão torna difícil a aplicação de diretrizes consensuais internacionais para avaliação e tratamento de pacientes com base nos títulos de inibidores do FVIII.

Os CVs relatados para os títulos de inibidores de FVIII são consideravelmente maiores do que os relatados para as determinações de FVIII. Uma avaliação dos desafios de proficiência NASCOLA em 2004 indicou um CV de 19% (n = 28) e 12% (n = 30) para amostras com níveis-alvo de FVIII de 35% e 100%, respectivamente. Além disso, currículos variando de 7,5% a 20,4% foram relatados em desafios de proficiência recentes conduzidos pelo College of American Pathologists. 21 Os maiores CVs documentados para títulos de inibidores de FVIII no presente estudo não são surpreendentes, dadas as complexidades adicionais envolvidas no ensaio Bethesda. Como a maioria dos pacientes com hemofilia A recebe atendimento em um único centro de tratamento, seria interessante conhecer o CV intralaboratorial.

Embora a conformidade significativa nas condições do ensaio tenha sido relatada pelos laboratórios da NASCOLA, houve uma variação marcante na interpretação de um título positivo, ou seja, o limite inferior de corte do ensaio. Valores de 0 a 1,0 BU / mL foram relatados. O título Bethesda é calculado tradicionalmente usando valores de atividade FVIII residual entre 25% e 75%. 3, 4, 21 Os níveis de atividade residual de 75%, 50% e 25% correspondem a títulos de inibidor de 0,4, 1,0 e 2,0 BU / mL, respectivamente. Assim, por definição, a sensibilidade do ensaio Bethesda é de 0,4 BU / mL.

O limite inferior de detecção e o CV em torno desse ponto de corte são de importância clínica para a identificação de novos pacientes com inibidores. Cada laboratório deve padronizar seu próprio ensaio e determinar o que deve ser considerado um resultado anormal ou positivo. 11 Dada a variabilidade inerente aos resultados do ensaio Bethesda, os estudos de recuperação do FVIII (farmacocinética) são considerados mais confiáveis ​​11 e devem ser usados ​​para validar os resultados laboratoriais.

O presente estudo serve como um ponto de partida para o desenvolvimento de diretrizes de consenso para a quantificação do inibidor do FVIII. Existem duas fontes importantes de variação nos métodos de inibidores do FVIII que afetam a inativação do FVIII. A estabilização do pH em 7,4, por meio do uso de NPP tamponado para a preparação de misturas de plasma do paciente / NPP 1: 1 e da mistura de controle, leva a uma melhor sensibilidade do teste ao reduzir a inativação aumentada de FVIII observada ao usar NPP não tamponado. Além disso, o uso de plasma com substrato deficiente em FVIII mantém uma comparação “semelhante a semelhante” entre as misturas de diluição de plasma do paciente e a mistura de controle (as concentrações de proteína em ambas são semelhantes). A variabilidade na preparação técnica das diluições do plasma do paciente também pode impactar os métodos do inibidor de FVIII ao afetar a labilidade do FVIII. Isso não foi abordado nessas pesquisas, mas é importante porque a preparação das diluições de plasma do paciente não é um processo automatizado. Variáveis ​​como tempo, temperatura e tipo de diluição (serial vs independente) afetam potencialmente os resultados.

O presente estudo também identificou variáveis ​​de ensaio que afetam a interpretação dos resultados. Estes incluem a variabilidade inerente aos ensaios de atividade de FVIII, definição do limite inferior de detecção do ensaio de inibidor de FVIII e o nível de FVIII em NPP. Além disso, as inconsistências nos gráficos de conversão de BU usados ​​em diferentes laboratórios chamaram a atenção. A origem dessas inconsistências ainda não foi identificada.

Este estudo oferece informações importantes sobre a sensibilidade, precisão e variabilidade do ensaio do inibidor de FVIII nos laboratórios da NASCOLA. Ele representa o maior estudo desse tipo conduzido na América do Norte para examinar a quantificação do inibidor de FVIII usando amostras verdadeiro-positivas e verdadeiro-negativas em pesquisas sucessivas.

Os membros do Comitê de Teste de Proficiência da NASCOLA incluem os seguintes: Agnes Aysola, Departamento de Medicina Laboratorial e Patologia, Universidade de Minnesota, St Paul Larry Brace, Departamento de Patologia, Universidade de Illinois em Chicago David Chance, Hospital da Universidade de St Louis, St Louis, MO Wayne L. Chandler, Departamento de Medicina Laboratorial, Universidade de Washington, Seattle Jeffrey S. Dlott, Quest Diagnostics, Chantilly, VA Charles Eby, Departamento de Patologia e Imunologia, Washington University, St Louis, MO Kenneth D. Friedman, Blood Center of Wisconsin, Milwaukee John Heit, Departamento de Pesquisa de Hematologia, Clínica Mayo, Rochester, MN Stephen Johnson, Laboratório de Hematologia, Tufts Medical Center, Boston, MA Joan C. Mattson, East Lansing, MI George M. Rodgers, Divisão de Hematologia, Universidade de Utah Medical Center, Salt Lake City e Rita Selby, Sunnybrook e Women's College Health Science Centre, Toronto, Canadá.


Testes de anticoagulante lúpico

O anticoagulante lúpico (LA 2017 ICD-10-CM: D68.312) é um autoanticorpo que se liga a fosfolipídios e proteínas da membrana celular que podem levar a efeitos protrombóticos. Por outro lado, LA in vitro está associado a tempos de coagulação aumentados usando o ensaio aPTT como resultado da ligação a fosfolipídios na reação. 5

Testes mais sensíveis para confirmar a presença de anticorpos antifosfolipídeos LA incluem o tempo de veneno de víbora de Russel diluído (dRVVT), procedimento de neutralização de plaquetas (PNP) e tempo de coagulação do caulim (KCT).

Diluir o tempo do veneno da víbora Russel 6

O veneno de víbora Russel (RVV) ativa diretamente a coagulação FX, que por sua vez converte a protrombina em trombina na presença de FVa e fosfolipídios.

O plasma normal agrupado ou plasma de teste é incubado com fosfolípidos a 37 ° C seguido pela adição de RVV diluído e cálcio para iniciar a coagulação e o tempo de coagulação é medido. A proporção do tempo de coagulação normal: plasma de teste determina se a coagulação é afetada. Uma proporção de & gt1,05 sugere a presença de LA, uma vez que uma deficiência em fatores comuns da via de coagulação (I, II, V, X) é excluída.

A presença de um anticoagulante lúpico interfere nessa reação ao se ligar aos fosfolipídios, resultando em tempos de coagulação prolongados. Um tempo de coagulação corrigido durante os estudos de mistura usando uma mistura 1: 1 de plasma de teste e normal sugere uma deficiência de fator, no entanto, como o RVV ativa o FX diretamente, o teste não é afetado pela via intrínseca (ou ativação por contato). Uma falha em corrigir o tempo de coagulação usando estudos de mistura e correção com a adição de fosfolipídeo em excesso indica a presença de LA.

O tempo de coagulação da sílica (SCT) é essencialmente um ensaio aPTT que usa sílica como ativador de contato na presença de plasma pobre em placas e uma baixa concentração de fosfolipídios seguido pela adição de cálcio como um teste sensível para rastrear LA. 7

Procedimento de neutralização de plaquetas 8

O procedimento de neutralização de plaquetas usa membranas de plaquetas rompidas e lavadas como fonte de fosfolipídio em excesso para testar se o aPTT pode ser normalizado neutralizando o efeito de um anticorpo LA.

O KCT é sensível para a detecção de LA e segue o mesmo princípio do aPTT, mas carece de fosfolipídios, baseando-se em lipídios plasmáticos e fragmentos de membrana celular. O teste pode ser usado para detectar todas as classes de inibidores da coagulação, incluindo anticorpos dirigidos contra fosfolipídios e FVIII.

O plasma normal e o plasma do paciente são misturados em proporções que variam de 1:10 a 10: 1 na presença de caulim e cálcio e o tempo de coagulação é medido. Uma amostra de teste: razão de controle & gt1.2 sugere a presença de um inibidor. Uma deficiência de fator pode ser excluída na presença de um KCT prolongado pela adição de plasma normal em excesso. Um KCT que não corrige na presença de fatores de coagulação normais sugere um inibidor da coagulação, mas pode não excluir um autoanticorpo do fator de coagulação. O índice de Rosner ou razão de Chang pode ser aplicado a uma análise KCT para calcular os limites que distinguem entre correção e nenhuma correção.


Termo aditivo

S. Arkin, F. Hua e M. Scaramozza contribuíram para o desenho do estudo. R. A. Gruppo, A. von Drygalski, L. Boggio, G. Tagariello, L. Nemes e P. Chowdary foram investigadores do estudo e sujeitos inscritos. R. A. Gruppo, A. von Drygalski, G. Tagariello e P. Chowdary participaram da coleta e montagem dos dados. R. A. Gruppo, S. Arkin, F. Hua, and M. Scaramozza performed data analysis and interpretation. All authors participated in the preparation of this manuscript, provided critical review and revisions, and granted approval for submission.


Assays of Procoagulant Coagulation Factors

One-stage coagulation assays

In clinical laboratories, coagulation factor levels are predominantly measured by one-stage assays based on the ability of test samples to correct either the PT (for factors VII, X, V, II), or the APTT (for factors XII, XI, VIII, IX), of a factor-deficient substrate plasma. PT reagents vary in their source of tissue factor (e.g. rabbit brain, human placenta and relipidated recombinant human tissue factor). Human tissue factor reagents usually give the best sensitivity in coagulation factor assays (see Bolton-Maggs et al. 2 for further discussion in relation to diagnosis of rare bleeding disorders). Some of these preparations also contain a heparin neutralizing agent. APTT reagents vary in type of contact activator (e.g. ellagic acid, kaolin, or micronized silica) and phospholipid composition (e.g. rabbit brain cephalin, soy bean phospholipid extract, or synthetic phospholipid mixtures). Some preparations are relatively insensitive to LA 23-25 , and these may be advantageous, making the assay more specific. Factor-deficient substrate plasmas are available from congenitally deficient human donors or after specific depletion (chemical inactivation or immunoadsorption) of normal plasma and are available lyophilized or frozen. Wherever possible, the specificity of the deficient plasma should be checked to ensure that there is a single factor deficiency. The deficient plasma should have normal levels of the nondeficient factors and <1 U/dL of the deficient factor. It has been reported that some FVIII immune-depleted plasmas (also deficient in VWF) can give anomalous results in the Nijmegen modification of the Bethesda assay of FVIII inhibitors 26 . When cooled reagent positions on coagulometers are used for deficient plasma, the plasmas should be allowed to equilibrate before use to avoid temporal drift.

Snake venoms have been used as activators instead of PT and APTT reagents to improve specificity 27, 28 and some forms of factor X deficiency not detected by the conventional assays have been identified using Russell's viper venom as activator 29 .

Amidolytic and two-stage assays of factor VIII:C

Factor VIII:C is most commonly assayed by one-stage APTT-based assay (reviewed by 30 ), but two-stage coagulation and amidolytic methods are sometimes used. Amidolytic assays are available for many coagulation factors 19 , but their use other than for FVIII assay is usually limited to prekallikrein (where one-stage assays have poor sensitivity) and factor X (used for monitoring oral anticoagulant therapy, particularly in patients with LA 31-33 .

The results obtained by the different types of FVIII assay are concordant in most instances, but in certain situations may differ significantly 34 , particularly in DIC and to a lesser extent in pregnancy. In mild and moderate haemophilia A, the assays usually, but not always, yield concordant results 35, 36 . There are reports of a twofold discrepancy between results of one-stage and other assays in up to 40% of mild haemophilia A cases 37, 38 . Importantly, up to 10% of mild/moderate haemophilia A cases have a normal one-stage activity and APTT, but a reduced activity determined by the two-stage coagulation 39 or amidolytic assay 40 . In these circumstances, the bleeding symptoms are usually in accord with the two-stage or amidolytic assay result and the discrepancy is associated with FVIII gene mutations destabilizing the interaction between the A1 and A2 domains.

The opposite discrepancy (one-stage activity is reduced and two-stage coagulation or amidolytic activity is normal) has also been described. At least some of these cases 41 are not associated with a bleeding disorder, but have been identified when investigating chance findings of an isolated prolonged APTT 39, 42 , although other such cases with different genetic defects may have a mild bleeding disorder.

  • Recommendation
    • APTT reagents with low LA sensitivity should be used in one-stage assays to improve specificity, unless the presence of LA has been excluded.
    • Two-stage or amidolytic FVIII assays should be performed in addition to a one-stage assay, to ensure detection of all mild/moderate haemophilia A cases and to correctly assess the severity.
    • Concentrate-specific standards should be used when recommended by the manufacturer for FVIII assays in patients treated for haemophilia A.

    Factor XIII assays

    The most widely used procedure for the detection of factor XIII (FXIII) deficiency is the clot solubility test. Patient plasma is incubated with thrombin in the presence and in the absence (abnormal control) of calcium ions until a clot is formed. The clots are then suspended in 5 m urea, 2% acetic acid, or 1% monochloroacetic acid. A survey conducted by UK NEQAS suggested that the most sensitive combination was thrombin and acetic acid. The test is poorly standardized relatively insensitive, detecting only severe deficiency (i.e. <5% FXIII) 45 and may be misleading. Specific assays 46 are required to detect mild deficiency and should be used in preference.

    • Recomendações
      • Clot solubility screening tests for FXIII deficiency have poor sensitivity and may be unreliable therefore, specific assays of activity should be used.
      • Immunoassays of FXIII-A and FXIII-B subunits should be performed to confirm and further categorize any deficiency.

      CH has received speaker fees or honoraria for consultancy or advisory boards from Takeda, Pfizer, Bayer, Octapharma, LFB, CAF-DCF, Roche, Novo Nordisk, CSL Behring, Sobi, Biogen and Biomarin. MEM has acted as a paid consultant/advisor/speaker for Bayer Healthcare, CSL Behring, Novo Nordisk, Roche, Sobi, Takeda, Octapharma, Pfizer, Kedrion, Grifols, Biomarin, Catalyst and Bioverativ. BN has received speaker fees from Sobi and led sponsored clinical trials for Sanofi, Sobi, Bioverativ, Biogen, CSL Behring and Bayer. KJP has received speaker fees or honoraria for consultancy or advisory boards from Biotest, Takeda, Pfizer, Octapharma, Biomarin, Catalyst Bio, Roche, Novo Nordisk, Sobi, Apcintex and Sanofi.

      Data sharing is not applicable to this article as no new data were created or analysed in this study.


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