Em formação

6.4A: Enriquecimento e Isolamento - Biologia


objetivos de aprendizado

  • Liste as fases de crescimento dos microrganismos e os diferentes tipos de meios de crescimento disponíveis para cultivá-los

Os meios de crescimento mais comuns para microrganismos são caldos nutritivos e placas de ágar; meios especializados são necessários para alguns microrganismos. Alguns, denominados fastidioso organismos, requerem ambientes especializados devido às necessidades nutricionais complexas. Os vírus, por exemplo, são parasitas intracelulares obrigatórios e requerem um meio de crescimento contendo células vivas.

Meio de crescimento: definido vs. indefinido

Uma distinção importante entre os tipos de mídia de crescimento é aquela de mídia definida versus indefinida.

Um meio definido terá quantidades conhecidas de todos os ingredientes. Para os microrganismos, isso consiste em fornecer oligoelementos e vitaminas exigidas pelo micróbio e, principalmente, uma fonte definida de carbono e nitrogênio. Glicose ou glicerol são freqüentemente usados ​​como fontes de carbono e sais de amônio ou nitratos como fontes de nitrogênio inorgânico.

Um meio indefinido tem alguns ingredientes complexos, como extrato de levedura ou hidrolisado de caseína, que consistem em uma mistura de muitas, muitas espécies químicas em proporções desconhecidas. Meios indefinidos às vezes são escolhidos com base no preço e às vezes por necessidade - alguns microrganismos nunca foram cultivados em meios definidos.

Tipos de mídia

Os meios enriquecidos contêm os nutrientes necessários para apoiar o crescimento de uma ampla variedade de organismos, incluindo alguns dos mais exigentes. Eles são comumente usados ​​para colher tantos tipos diferentes de micróbios quanto os presentes na amostra. O ágar sangue é um meio enriquecido no qual sangue total nutricionalmente rico complementa os nutrientes básicos. O ágar chocolate é enriquecido com sangue tratado termicamente (40-45 ° C), que fica marrom e dá ao meio a cor que dá nome.

Meios seletivos são usados ​​para o crescimento de apenas microorganismos selecionados. Por exemplo, se um microrganismo é resistente a um determinado antibiótico, como ampicilinaou tetraciclina, então esse antibiótico pode ser adicionado ao meio para evitar que outras células, que não possuem a resistência, cresçam. Meios sem um aminoácido, como a prolina em conjunto com E. coli incapaz de sintetizá-lo, eram comumente usados ​​por geneticistas antes do surgimento da genômica para mapear cromossomos bacterianos.

Os meios diferenciais / indicadores distinguem um tipo de microrganismo de outro que cresce no mesmo meio. Este tipo de mídia usa as características bioquímicas de um microrganismo que cresce na presença de nutrientes ou indicadores específicos (como vermelho neutro, vermelho de fenol, eosina ou azul de metileno) adicionadas ao meio para indicar visivelmente as características definidoras de um microrganismo. Este tipo de meio é usado para a detecção de microrganismos e por biólogos moleculares para detectar cepas de bactérias recombinantes. O ágar ferro triplo-açúcar (TSI) é um dos meios de cultura utilizados para a diferenciação da maioria das enterobactérias.

O crescimento em sistemas de cultura fechados, como uma cultura em lote em caldo LB, onde nenhum nutriente adicional é adicionado e os resíduos não são removidos, o crescimento bacteriano seguirá uma curva de crescimento prevista e pode ser modelado.

Fases de crescimento

Durante a fase de latência, as bactérias se adaptam às condições de crescimento. É o período em que as bactérias individuais estão amadurecendo e ainda não são capazes de se dividir. Durante a fase de latência do ciclo de crescimento bacteriano, ocorre a síntese de RNA, enzimas e outras moléculas.

A fase exponencial (às vezes chamada de fase logarítmica ou logarítmica) é um período caracterizado pela duplicação da célula. O número de novas bactérias que aparecem por unidade de tempo é proporcional à população atual. Em condições controladas, as cianobactérias podem dobrar sua população quatro vezes ao dia. O crescimento exponencial não pode continuar indefinidamente, entretanto, porque o meio logo fica sem nutrientes e enriquecido com resíduos.

A fase estacionária é devida a um fator limitante do crescimento; isso é principalmente o esgotamento de um nutriente e / ou a formação de produtos inibidores, como ácidos orgânicos.

Na fase de morte, as bactérias ficam sem nutrientes e morrem.

Cultura

A cultura em lote é o método de crescimento em laboratório mais comum no qual o crescimento bacteriano é estudado, mas é apenas um entre muitos. A cultura bacteriana é incubada em um recipiente fechado com um único lote de meio.

Em alguns regimes experimentais, parte da cultura bacteriana é removida periodicamente e adicionada a meio estéril fresco. Em casos extremos, isso leva à renovação contínua dos nutrientes. Isto é um quimiostato, também conhecida como cultura aberta ou contínua: um estado estacionário definido pelas taxas de fornecimento de nutrientes e crescimento bacteriano. Em comparação com a cultura em lote, as bactérias são mantidas na fase de crescimento exponencial e a taxa de crescimento da bactéria é conhecida. Dispositivos relacionados incluem turbidostatos e auxostats. O crescimento bacteriano pode ser suprimido com bacteriostáticos, sem necessariamente matar as bactérias.

Em uma cultura sinecológica, uma situação natural na qual mais de uma espécie bacteriana está presente, o crescimento dos micróbios é mais dinâmico e contínuo.

Pontos chave

  • Os meios de crescimento mais comuns para microrganismos são caldos nutritivos e placas de ágar.
  • Culturas abertas permitem uma reposição de nutrientes e uma redução do acúmulo de resíduos na mídia.
  • Meios seletivos são usados ​​para o crescimento de apenas microorganismos selecionados.
  • Meios diferenciais ou meios indicadores distinguem um tipo de microrganismo de outro que cresce no mesmo meio.

Termos chave

  • cultura fechada: Uma cultura fechada não tem nutrientes adicionais adicionados ao sistema e os resíduos não são removidos. As culturas em sistema fechado seguirão uma curva de crescimento prevista.
  • Mídia enriquecida: Contém nutrientes necessários para apoiar o crescimento de uma ampla variedade de organismos.
  • cultura aberta: Uma cultura contínua em que, periodicamente, parte da cultura bacteriana é removida e adicionada a meio estéril fresco.

Abordagens recentes na produção de novas enzimas a partir de amostras ambientais por cultura de enriquecimento e abordagem metagenômica

19.2 Produção de novas enzimas a partir de amostras ambientais por cultura de enriquecimento

A cultura de enriquecimento é basicamente uma técnica de isolamento projetada para tornar as condições de crescimento muito favoráveis ​​para um organismo de interesse, embora tenha um ambiente desfavorável para qualquer competição. É a utilização de determinados meios de crescimento para favorecer o crescimento de um determinado microrganismo em detrimento de outros, enriquecendo uma amostra para o microrganismo de interesse. Este enriquecimento geralmente é feito pela introdução de nutrientes ou condições ambientais que só permitem o crescimento de um organismo de interesse. Técnicas de cultura de enriquecimento são usadas para aumentar um pequeno número dos organismos desejados para níveis detectáveis. Isso permite a detecção e identificação de microrganismos com uma variedade de necessidades nutricionais (Liu et al., 2016). A cultura de enriquecimento é freqüentemente empregada para isolar espécies microbianas de interesse do solo e habitats marinhos. A cultura de enriquecimento inclui dois métodos dependendo do tipo de meio utilizado: um é submerso (meio líquido), que é fácil de controlar e otimizar os parâmetros ambientais e nutricionais, e o outro é a fermentação em estado sólido em que materiais sólidos (brutos ou processados) são usados ​​como substratos (Mahitha e Madhuri, 2016). A produção de novas enzimas dependentes de enriquecimento no método de fermentação líquida comumente envolve a utilização de parâmetros físicos como temperatura, pH, tempo de incubação, condições estáticas e de agitação e / ou propriedades químicas como fontes de carbono e nitrogênio e concentração de substrato e inóculo como fatores determinantes para o isolados produtores de enzimas, proporcionando assim a chance de crescer e proliferar apenas as espécies que se adaptam ao fator físico e / ou químico determinante (Shah e Patel, 2014). Se o caso é a utilização de meio sólido, certos fatores não têm influência, pois não são mantidos como estático e agitação do meio de fermentação, e alguns novos fatores entram em jogo como o tipo de substrato (bruto ou processado) (Figs. 19.1 e 19.2) .

Fig. 19.1. (A) Atividade de despolimerase indicada pela formação de halo ao redor da colônia utilizando plástico como fonte de nutrientes no final da sétima semana. (B) Atividade de despolimerase em amostra purificada no final de 1 semana de incubação.

Fig. 19.2. Purificação da enzima asparaginase por cromatografia de filtração em gel.

A técnica de cultura de enriquecimento emprega principalmente substratos que são baratos (Jambul semeia agrotóxicos para enzimas como despolimerase, glutaminase, asparaginase e efluente de destilaria de bagaço - soro de leite de asparaginase e resíduos de alimentos fermentados para fibrinocinase), pois o processo de isolamento geral deve ser econômico e repetível até a espécie-alvo é isolada (Siddiqui et al., 2015 Vijayaraghavan et al., 2017). A técnica de enriquecimento também difere no procedimento de isolamento com base no tipo de enzima, como extracelular ou intracelular na natureza, se extracelular, a presença de um substrato solúvel é um método universalmente utilizado, pois dá a indicação da atividade da enzima através de halo ou desenvolvimento de zona clara que é fácil de distinguir quando comparado com o intracelular onde frequentemente requer destruição da célula, adição de múltiplos reagentes e adição separada de substrato ou substrato secundário para avaliar se a atividade alvo está presente ou não. O método de enriquecimento de isolamento foi uma técnica poderosa utilizada em muitas aplicações como o enriquecimento seletivo, imitando o habitat para enriquecer micróbios de habitações extremas em busca de muitos metabólitos, antibióticos e enzimas que são cruciais em muitos setores. A eficácia prospectiva dos métodos foi multiplicada muitas vezes, adicionando recursos como otimização do método de seleção, inovações na tecnologia de fermentação e modificações secundárias dos organismos inicialmente selecionados. A funcionalidade do composto ativo final também pode ser aumentada aumentando a pureza do composto por precipitação com sulfato de amônio, diálise e separação cromatográfica acoplada com a determinação do peso molecular usando o método SDS-PAGE. Mas, dito isto, a desvantagem fundamental que encerra é a dependência do método da cultivabilidade do microrganismo sendo estudado, infelizmente, apenas uma fração (& lt 1%) da diversidade microbiana total em um determinado habitat é cultivável, deixando de fora o resto sendo desvirado (Fig. 19.3).

Fig. 19.3. Caracterização da enzima azoredutase purificada por zimograma SDS-PAGE.


Sem amplificação, Enriquecimento direcionado CRISPR-Cas9 e sequenciamento SMRT de regiões genômicas causadoras de doença de expansão repetida

O sequenciamento direcionado provou ser um meio econômico de obter informações de sequência para uma ou mais regiões definidas de um genoma maior. No entanto, a maioria dos métodos de enriquecimento de alvo requerem amplificação. Algumas regiões genômicas, como aquelas com conteúdo GC extremo e sequências repetitivas, são recalcitrantes à amplificação fiel. No entanto, muitos distúrbios genéticos humanos são causados ​​por expansões repetidas, incluindo repetições tandem difíceis de sequenciar.

Nós desenvolvemos uma nova técnica de enriquecimento sem amplificação que emprega o sistema CRISPR-Cas9 para alvos específicos em múltiplos loci genômicos. Este método, em conjunto com leituras longas geradas por meio de sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT) e cobertura imparcial, permite o enriquecimento e sequenciamento de regiões genômicas complexas que não podem ser investigadas com outras tecnologias. Usando amostras de DNA genômico humano, demonstramos o direcionamento bem-sucedido de loci causais para a doença de Huntington (HTT Repetição CAG), síndrome do X frágil (FMR1 Repetição CGG), esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência frontotemporal (C9orf72 Repetição GGGGCC), e ataxia espinocerebelar tipo 10 (SCA10) (ATXN10 repetição variável ATTCT). O método, passível de multiplexação em vários loci genômicos, usa uma abordagem livre de amplificação que facilita o isolamento de centenas de moléculas individuais no alvo em uma única célula SMRT e sequenciamento preciso através de longos trechos repetidos, independentemente da porcentagem extrema de GC ou complexidade da sequência contente. Nosso novo método de sequenciamento direcionado abre novas portas para análises genômicas independentes da amplificação por PCR, o que facilitará o estudo de distúrbios de expansão repetida.


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Os kits ProteoExtract ® cobrem as diferentes etapas na preparação de amostras de proteômica, desde a extração de proteínas e a remoção de proteínas abundantes até a concentração de misturas de proteínas, remoção de substâncias interferentes, digestão de proteínas, captura seletiva de peptídeos fosforilados e enriquecimento seletivo para classes específicas de proteínas. Todos os kits são compatíveis entre si.

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Dicas para evitar o isolamento

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Converse com as pessoas em seu círculo agora sobre relacionamentos e expectativas. Conversas abertas e honestas são o primeiro passo para um relacionamento mais próximo.

Se alguém não está fornecendo as coisas de que você precisa em uma amizade, considere priorizar seu tempo com pessoas que irão apreciá-lo melhor.

Precisa ampliar seu círculo? Participe de encontros ou grupos para pessoas que compartilham seus interesses. Não tenha medo de entrar em contato ou marcar um encontro seu!

Procure um terapeuta de relacionamento. Os problemas dos estágios anteriores podem deixar você com desconfiança, culpa ou sentimentos de inferioridade. Isso pode ter um sério impacto em sua capacidade de ser vulnerável com outras pessoas e de se tornar parte de um grupo. Um terapeuta de relacionamento pode ajudá-lo a desvendar essas experiências passadas e seguir em frente.


Isolamento de mutantes microbianos: 4 técnicas | Microbiologia

Os pontos a seguir destacam as quatro principais técnicas usadas para o isolamento de mutantes microbianos. As técnicas são: 1. Observação direta 2. Técnica de enriquecimento 3. Técnica de chapeamento de réplicas 4. O Teste de Ames.

1. Técnica de observação direta:

Em alguns casos, uma colônia crescendo em uma placa de ágar pode facilmente ser vista como diferente do tipo parental normal (tipo selvagem). Por exemplo, se a cepa parental for pigmentada, a observação de colônias não pigmentadas pode indicar a presença de mutantes. Os indicadores também podem ser incorporados ao meio para detectar microrganismos com e sem capacidades metabólicas específicas.

Por exemplo, indicadores de pH podem ser usados ​​no meio para detectar a produção de produtos ácidos. A indicação de produção de ácido por uma cepa microbiana e não por outro dos mesmos microrganismos crescendo em condições idênticas mostraria a presença de um mutante.

2. Técnica de enriquecimento:

A técnica de enriquecimento é empregada especialmente no isolamento de mutantes resistentes a fagos, antibióticos ou produtos químicos tóxicos. Mutantes resistentes a fagos podem ser isolados simplesmente por plaqueamento da população microbiana mutagenizada, fenotipicamente expressa em placas contendo partículas de fago.

As células que expressam o fenótipo parental de tipo selvagem são mortas apenas os mutantes resistentes a fagos se desenvolvem em colônias. Essas colônias são isoladas. Da mesma forma, os mutantes resistentes a um antibiótico ou um produto químico tóxico podem ser isolados por placas da população microbiana com o antibiótico ou o produto químico.

3. Técnica de chapeamento de réplicas:

A técnica de replicação é frequentemente usada para isolar mutantes nutricionais (auxotróficos), bem como vários outros tipos de mutantes, por exemplo, mutantes resistentes a antibióticos.

Por conveniência, se alguém deseja isolar mutantes nutricionais empregando técnicas de replicação (Fig. 29.13), ele deve seguir as seguintes etapas:

(i) As culturas bacterianas são diluídas e as células são espalhadas na superfície do meio de ágar nutriente semissólido em uma placa de Petri (chamada de & # 8220 placa mestre & # 8221). O meio na placa mestre é um meio completo, isto é, contendo todos os componentes nutricionais exigidos pela população bacteriana. Após um período de incubação suficiente, cada bactéria produz uma colônia visível na superfície do ágar na placa mestre.

(ii) Um pedaço de tecido de veludo estéril é esticado sobre um bloco cilíndrico de madeira ou metal que é ligeiramente menor em diâmetro do que as placas de Petri usadas no processo.

(iii) A placa mestre é agora invertida e pressionada suavemente sobre o veludo estéril. Como as fibras do veludo agem como uma agulha de inoculação fina, algumas células de cada colônia da placa-mãe grudam no veludo.

(iv) Outra placa de Petri (chamada de & # 8220 placa de réplica & # 8221) é tomada contendo um meio mínimo, ou seja, um meio deficiente com um componente nutricional específico,

(v) A réplica da placa é agora invertida e pressionada suavemente sobre o veludo, marcando assim as células bacterianas na superfície de seu meio mínimo. A réplica da placa é orientada de forma idêntica na aplicação no veludo em relação à marca colocada em sua borda, de modo que as colônias que aparecem na réplica da placa após a incubação ocupem posições congruentes com as de seus irmãos na placa mestre.

(vi) Após incubação suficiente, observa-se que uma colônia que se desenvolve no meio completo da placa mestre não se desenvolve no meio mínimo da placa mestre que carece de um componente nutricional específico. Tal colônia é marcada na placa mestre e isolada representa mutante para aquele componente nutricional específico não utilizado no meio mínimo da placa de réplica.

A técnica de replicação foi desenvolvida por Joshua e Esther Lederberg em 1952 para fornecer evidências diretas da existência de mutações pré-existentes originadas espontaneamente em microrganismos.

4. O Teste de Ames:

Este teste foi desenvolvido por Ames e colaboradores e é baseado em mutantes auxotróficos de Salmonella typhimurium que requerem histidina (his & # 8211). Diferentes mutantes his & # 8211 carregam diferentes tipos de mutações, ou seja, transições, transversões e deslocamentos de quadro.

No teste de Ames, a frequência de reversão para his + (prototrofia) é pontuada nos mutantes his & # 8211 especialmente construídos. Isso é feito colocando um número conhecido de células mutantes em meio sem histidina e marcando o número de colônias formadas. A frequência das células formando colônias dá a frequência da reversão. A frequência de reversão espontânea para his + é bastante rara, ou seja, 10 -8.

O teste de Ames é rotineiramente usado para investigar a mutagenicidade de vários produtos químicos. Alguns dos produtos químicos podem se tornar mutagênicos apenas quando são influenciados pelas enzimas hepáticas.

Por exemplo, os nitratos em si não são mutagênicos nem cancerígenos. Mas nas células eucarióticas, os nitratos são convertidos em introsaminas, que são altamente mutagênicas e cancerígenas. Além disso, alguns produtos químicos podem ser mutagênicos apenas para replicar o DNA.

O teste de Ames de rotina atende a essas duas necessidades da seguinte maneira:

1. As células his & # 8211 são semeadas em um meio que contém traços de histidina, o que é suficiente para permitir algumas divisões celulares, mas inadequado para a formação de colônias visíveis.

2. O produto químico em estudo é incubado com extrato de fígado de rato contendo as enzimas hepáticas, ou seja, a fração microssomal. Isso permite a modificação do produto químico da mesma forma que seria no fígado dos animais.

O procedimento do teste de Ames é o seguinte. As células bacterianas his & # 8211 são incubadas com o extrato de fígado e, em seguida, semeadas em um meio contendo traços de histidina que serve como placa de controle.

As placas de teste contêm o mesmo meio, mas as células his & # 8211 não são tratadas com extrato de fígado. O produto químico em estudo é tratado com o extrato de fígado de rato e um disco de papel de filtro é embebido nesta solução. O disco de papel de filtro é colocado no meio da placa de teste (Fig. 29.14).

O produto químico presente no papel de filtro atua nas células his & # 8211 que crescem na placa de teste. A frequência de colônias formadas na placa de controle e na placa de teste é comparada. Um aumento da frequência no caso da placa de teste indicará que o produto químico em estudo é mutagênico.

Para aumentar a eficiência do teste, as cepas his & # 8211 usadas no teste são defeituosas no reparo do DNA e aumentaram a permeabilidade a produtos químicos. Foi observado que mais de 90% dos produtos químicos mutagênicos também são cancerígenos.


Protocolo para Enriquecimento de mRNAs, excluindo mRNA de Globina, de RNA Total de Sangue Total

Este protocolo descreve o enriquecimento de poli (A) mRNA seguido por mRNA de globina e depleção de amp rRNA (Seção 1 e 2). O RNA enriquecido contém apenas mRNA (excluindo globina) e não RNA não codificante. O RNA enriquecido é então usado como entrada para a preparação de biblioteca de RNA direcional para sequenciamento em um instrumento Illumina (Seção 3).

Este protocolo requer os seguintes produtos NEBNext:

  • Módulo de isolamento magnético de mRNA NEBNext Poly (A) (NEB # E7490)
  • NEBNext Globin and rRNA Depletion Kit (Human / Mouse / Rat) com RNA Sample Purification Beads (NEB # E7755)
  • NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep para Illumina com grânulos de purificação de amostra (NEB # E7765)

Requisitos de amostra de RNA

Integridade de RNA:
Avalie o tamanho e a qualidade do RNA de entrada executando a amostra de RNA em um Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip para determinar o número de integridade do RNA (RIN). Para o enriquecimento de mRNA Poly (A), é necessário RNA de alta qualidade com RIN Score & gt7.

Amostra de RNA:
A amostra de RNA deve estar livre de sais (por exemplo, Mg 2+ ou sais de guanidínio) ou orgânicos (por exemplo, fenol e etanol). O RNA deve estar livre de DNA. O gDNA é um contaminante comum em preparações de RNA. Pode ser transportado da interfase de extrações orgânicas ou quando a matriz de sílica dos métodos de purificação de RNA de fase sólida está sobrecarregada. Se a amostra de RNA total puder conter contaminação por gDNA, trate a amostra com DNase I (não fornecida neste kit) para remover todos os vestígios de DNA. Após o tratamento, a DNase I deve ser removida da amostra. Qualquer DNase I residual pode degradar os oligos necessários para o enriquecimento.

Quantidade de entrada:

Este protocolo foi testado com 100 ng de sangue total humano de RNA total (livre de DNA) em um máximo de 50 & microl de água livre de nuclease, quantificado por um método fluorométrico assistido por corante específico de RNA (Qubit & reg) e qualidade verificada por Bioanalyzer .

Mantenha todos os buffers no gelo, a menos que seja indicado o contrário.

1.0. Enriquecimento de mRNA Poly (A) usando o Módulo de Isolamento Magnético de mRNA NEBNext Poly (A) (NEB # E7490)

1.1. Diluir o RNA total com água sem nuclease para um volume final de 50 µmul em um tubo de PCR de 0,2 ml sem nuclease e manter no gelo.

1.2. Para lavar as esferas de Oligo (dT), adicione os componentes da tabela abaixo a um tubo de 1,5 ml sem nuclease. Se estiver preparando várias bibliotecas, contas para até 10 amostras podem ser adicionadas a um único tubo de 1,5 ml para lavagens subsequentes (use o ímã NEB # S1506 para tubos de 1,5 ml). O objetivo desta etapa é trazer os grânulos do buffer de armazenamento para o buffer de ligação. O tampão de ligação 2X não precisa ser diluído para esta etapa.

Tampão de ligação de RNA NEBNext (2X)

Volume total

1.3. Lave as contas pipetando para cima e para baixo seis vezes.

1.4. Coloque o tubo no ímã e incube em temperatura ambiente até que a solução esteja límpida (

1,5. Remova e descarte todo o sobrenadante do tubo. Tome cuidado para não mexer nas contas.

1.6. Remova o tubo do suporte magnético.

1.7. Adicione 100 µl de tampão de ligação de RNA (2X) às esferas e lave pipetando para cima e para baixo seis vezes. Se estiver preparando várias bibliotecas, adicione 100 µl de tampão de ligação de RNA (2X) por amostra. O tampão de ligação não precisa ser diluído.

1.8. Coloque os tubos no ímã e incube em temperatura ambiente até que a solução esteja límpida (

1.9. Remova e descarte o sobrenadante do tubo. Tome cuidado para não mexer nas contas.

1,10. Adicionar 50 µl de RNA Binding Buffer (2X) aos grânulos e misturar pipetando para cima e para baixo até que os grânulos fiquem homogêneos. Se estiver preparando várias bibliotecas, adicione 50 µl de RNA Binding Buffer (2X) por amostra.

1,11. Adicione 50 esferas & mul a cada amostra de RNA da Etapa 1.1 Misture bem pipetando para cima e para baixo seis vezes. Esta etapa de ligação remove a maior parte do RNA não alvo.

1,12. Coloque o tubo em um termociclador e feche a tampa. Aqueça a amostra em 65 e degC por 5 minutos e resfriar até 4 & degC com a tampa aquecida ajustada em & ge 75 & degC. Esta etapa irá desnaturar o RNA e facilitar a ligação do mRNA aos grânulos.

1,13. Remova o tubo do termociclador quando a temperatura atingir 4 ºC.

1,14. Misture bem pipetando para cima e para baixo seis vezes. Coloque o tubo na bancada e incube em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir que o mRNA se ligue aos grânulos.

1,15. Coloque o tubo no suporte magnético em temperatura ambiente até que a solução esteja clara (

1,16. Remova e descarte todo o sobrenadante. Tome cuidado para não mexer nas contas.

1,17. Remova o tubo do suporte magnético.

1,18. Para remover o RNA não ligado, adicione 200 µl de tampão de lavagem ao tubo. Pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 6 vezes para misturar bem.

1.19 Gire o tubo brevemente para coletar o líquido da parede e da tampa do tubo.

Observação: é importante girar o tubo para evitar o transporte do tampão de lavagem nas etapas subsequentes.

1,20. Coloque o tubo no suporte magnético em temperatura ambiente até que a solução esteja clara (

1,21. Remova e descarte todo o sobrenadante do tubo. Tome cuidado para não perturbar os grânulos que contêm o mRNA.

1,22. Remova o tubo do suporte magnético.

1,24. Adicione 11 & mul de água sem nuclease a cada tubo. Pipete suavemente para cima e para baixo 6 vezes para misturar bem.

1,25. Coloque o tubo no termociclador. Feche a tampa e aqueça as amostras em 80 e degC por 2 minutos, em seguida, resfrie até 25 & degC com a tampa aquecida ajustada em & ge 90 & degC para eluir o mRNA dos grânulos.

1,26. Remova o tubo do termociclador quando a temperatura atingir 25 ºC.

1.27 Imediatamente coloque o tubo no ímã em temperatura ambiente até que a solução esteja límpida (

1,28. Colete o mRNA purificado transferindo 10 µl do sobrenadante para um tubo de PCR limpo sem nuclease.

1,29. Coloque o RNA no gelo e prossiga para a Depleção de globina e rRNA na Seção 2.

2.0. Depleção de globina e rRNA usando o NEBNext Globin e kit de depleção de rRNA (NEB # E7750 / E7755)

2.1 Hibridização de Sonda para RNA

2.1.2. Monte a seguinte reação de hibridização de RNA / sonda no gelo:

REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO DE RNA / SONDA

(branco) mRNA em água livre de nuclease (Etapa 1.29)

(branco) NEBNext Globin e solução de depleção de rRNA

(branco) Tampão de hibridização de sonda NEBNext

Volume total

2.1.3. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Nota: É crucial misturar bem nesta etapa.

2.1.4. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga para coletar o líquido da lateral do tubo.

2.1.5. Coloque o tubo em um termociclador pré-aquecido e execute o seguinte programa com a tampa aquecida ajustada para 105 & degC. Este programa levará aproximadamente 15 & ndash20 minutos para ser concluído:

2.1.6. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga e coloque no gelo. Prossiga imediatamente para a digestão com RNase H.

2.2. Digestão RNase H

2.2.1. Monte a seguinte reação de digestão RNase H no gelo:

(branco) NEBNext RNase H termostável

(branco) Tampão de reação RNase H

Volume total

2.2.2. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

2.2.3. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga.

2.2.4. Incube o tubo em um termociclador pré-aquecido para 30 minutos a 50 & degC com a tampa ajustada para 55 & degC.

2.2.5. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga e coloque no gelo. Prossiga imediatamente para a digestão com DNase I.

2.3. Digestão DNase I

2.3.1. Monte a seguinte reação de digestão de DNase I no gelo:

REAÇÃO DE DIGESTÃO DNASE I

RNA tratado com RNase H (Etapa 1.2.5)

(branco) Tampão de reação de DNase I

(branco) NEBNext DNase I

Volume total

2.3.2. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

2.3.3. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga.

2.3.4. Incube o tubo em um termociclador pré-aquecido para 30 minutos a 37 & degC com a tampa ajustada para 40 & degC ou desligada.

2.3.5. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga e coloque no gelo. Prossiga imediatamente para a etapa de purificação do RNA.

2.4. Purificação de RNA usando esferas Agencourt RNAClean XP ou NEBNext RNA Sample Purification Beads

2.4.1. Agencourt no vórtex as esferas Agencourt RNAClean XP ou NEBNext RNA Sample Purification Beads para ressuspender.

2.4.2. Adicione 90 & mul (1.8X) esferas à amostra de RNA da etapa 2.3.5 e misture completamente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

2.4.3. Incubar o tubo para 15 minutos no gelo para ligar o RNA às contas.

2.4.4. Coloque o tubo em uma cremalheira magnética para separar as contas do sobrenadante.

2.4.5. Depois que a solução estiver límpida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar os grânulos que contêm o RNA.

2.4.6. Adicione 200 µl de etanol 80% recém-preparado ao tubo enquanto está no suporte magnético. Incube em temperatura ambiente por 30 segundos e, em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar os grânulos, que contêm o RNA.

2.4.7. Repita a etapa 2.4.6 uma vez para um total de duas lavagens.

2.4.8. Remova completamente o etanol residual e seque as esferas por até 5 minutos enquanto o tubo está no suporte magnético com a tampa aberta.

Cuidado: Não seque demais as contas. Isso pode resultar em menor recuperação do RNA alvo. Elua as amostras quando as contas ainda estiverem marrom-escuras e com aparência brilhante, mas quando todo o líquido visível tiver evaporado. Quando as contas ficam marrons mais claras e começam a rachar, elas estão muito secas.

2.4.9. Remova o tubo do suporte magnético. Elua o RNA dos grânulos adicionando 7 & mul de água sem nuclease. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes e gire o tubo brevemente.

2.4.10. Incube o tubo por 2 minutos em temperatura ambiente.

2.4.11. Coloque o tubo no suporte magnético até que a solução esteja clara (

2.4.12. Remova 5 µg do sobrenadante contendo RNA e transfira para um tubo sem nuclease.

2.4.13. Coloque o tubo no gelo e prossiga com a construção da biblioteca RNA-Seq (protocolo abaixo) ou outra aplicação posterior. Alternativamente, a amostra pode ser armazenada a -80 e degC.

Nota: A próxima etapa fornece um tempo de incubação de fragmentação, resultando em uma inserção de RNA de

200nt. Consulte o Apêndice (Seção 4 do Manual NEBNext Ultra II Directional RNA Library para Illumina) para condições de fragmentação se você estiver preparando bibliotecas com grandes inserções (& gt200 bp).

3.1.3. Incubar a amostra para 15 minutos a 94& degC em um termociclador com a tampa aquecida ajustada a 105 & degC.

3.1.4. Transfira imediatamente o tubo para o gelo por 1 minuto.

3.1.5 Realize uma rotação rápida para coletar todo o líquido das laterais do tubo e prossiga para a síntese do primeiro filamento de cDNA.

3.2. Síntese de cDNA da primeira cadeia

3.2.1. Monte a reação de síntese da primeira fita no gelo, adicionando os seguintes componentes ao fragmento
e RNA iniciado da Etapa 3.1.5:

REAÇÃO DE SÍNTESE DE PRIMEIRA LINHA

ARN fragmentado e preparado (Etapa 3.1.5)

(marrom) Reagente de especificidade de cadeia NEBNext

(lilás) NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix

Volume total

3.2.2. Mix thoroughly by pipetting up and down 10 times.

3.2.3. Incubate the sample in a preheated thermocycler with the heated lid set at &ge 80°C as follows:

Note: If you are following recommendations in Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual for libraries with longer inserts (>200 bases), increase the incubation at 42°C from 15 minutes to 50 minutes at Step 2 below.

3.2.4. Proceed directly to Second Strand cDNA Synthesis.

3.3. Second Strand cDNA Synthesis

3.3.1. Assemble the second strand cDNA synthesis reaction on ice by adding the following components into the first strand synthesis product from Step 3.2.4.

SECOND STRAND SYNTHESIS REACTION

First-Strand Synthesis Product (Step 3.2.4)

(orange) NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer
with dUTP Mix (10X)

(orange) NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix

Total Volume

3.3.2. Keeping the tube on ice, mix thoroughly by pipetting up and down at least 10 times.

3.3.3. Incubate in a thermocycler for 1 hour at 16°C with the heated lid set at &le 40°C (or off).

3.4. Purification of Double-stranded cDNA Using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

3.4.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

3.4.2. Add 144 &mul (1.8X) of resuspended beads to the second strand synthesis reaction (

80 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.4.3. Incubate for 5 minutes at room temperature.

3.4.4. Briefly spin the tube in a microcentrifuge to collect any sample on the sides of the tube. Place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear, carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads, which contain DNA. Caution: do not discard beads.

3.4.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.4.6. Repeat Step 3.4.5 once for a total of 2 washing steps.

3.4.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.4.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA from the beads by adding 53 &mul 0.1X TE Buffer (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube on the magnetic rack until the solution is clear.

3.4.9. Remove 50 µl of the supernatant and transfer to a clean nuclease-free PCR tube.

Note: If you need to stop at this point in the protocol samples can be stored at &ndash20°C.

3,5. End Prep of cDNA Library

3.5.1. Assemble the End Prep reaction on ice by adding the following components to the second strand synthesis product from
Step 3.4.9.

Second Strand cDNA Synthesis Product (Step 3.4.9)

(green) NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer

(green) NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix

Total Volume

If a master mix is made, add 10 µl of master mix to 50 µl of cDNA for the End Prep reaction.

3.5.2. Set a 100 &mul or 200 &mul pipette to 50 &mul and then pipette the entire volume up and down at least 10 times to mix thoroughly. Perform a quick spin to collect all liquid from the sides of the tube.

Note: It is important to mix well. The presence of a small amount of bubbles will not interfere with performance.

3.5.3. Incubate the sample in a thermocycler with the heated lid set at &ge 75°C as follows.

3.5.4. Proceed immediately to Adaptor Ligation.

3.6. Adaptor Ligation

Note: If you are selecting for libraries with larger insert size (>200 nt) follow the size selection recommendations in Appendix, Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual.

3.7.1. Add 87 &mul (0.9X) resuspended SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads and mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.7.2. Incubate for 10 minutes at room temperature.

3.7.3. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (

5 minutes), discard the supernatant that contains unwanted fragments. Caution: do not discard beads.

3.7.4. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.7.5. Repeat Step 3.7.4 once for a total of 2 washing steps.

3.7.6. Briefly spin the tube and put the tube back in the magnetic rack.

3.7.7. Completely remove the residual ethanol, and air-dry beads until the beads are dry for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.7.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute DNA target from the beads by adding 17 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex or by pipetting up and down. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnet until the solution is clear.

3.7.9. Without disturbing the bead pellet, transfer 15 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and proceed to PCR enrichment.

Note: If you need to stop at this point in the protocol, samples can be stored at &ndash20°C.

3.8. PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

Check and verify that the concentration of your oligos is 10 &muM on the label.

Use Option A for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in tubes. These kits have the forward and reverse primers supplied in separate tubes.

Use Option B for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in a 96-well plate format. These kits have the forward and reverse primers (i7 and i5) combined.

3.8.1. Set up the PCR reaction as described below based on the type of oligos (PCR primers) used.

3.8.1A. Forward and Reverse Primers Separate

Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

(blue) NEBNext Ultra II Q5 ® Master Mix

Universal PCR Primer/i5 Primer*,**

Total Volume

* NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
for determining valid barcode combinations.

** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample.

3.8.1B. Forward and Reverse Primers Combined

Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

(blue) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

Index (X) Primer/i7 Primer Mix*

Total Volume

* NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
for determining valid barcode combinations.

** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample

3.8.2. Mix well by gently pipetting up and down 10 times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge.

3.8.3. Place the tube on a thermocycler with the heated lid set to 105°C and perform PCR amplification using the following PCR cycling conditions (refer to Table 3.8.3A and Table 3.8.3B):

* The number of PCR cycles should be adjusted based on RNA input.

** It is important to limit the number of PCR cycles to avoid overamplification.
If overamplification occurs, a second peak

1,000 bp will appear on the Bioanalyzer trace (See Figure 5.2 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual).

Table 3.8.3B: Recommended PCR cycles based on total RNA input amount:

* The PCR cycles are recommended based on high quality human whole blood total RNA. To prevent over-amplification, the number of cycles may require optimization based on the sample quality and the fraction of globin mRNA. For RNA where globin mRNA is > than 50% of the transcripts (once rRNA is removed), follow the higher cycle recommendation for that input.

3.9. Purification of the PCR Reaction using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

3.9.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

3.9.2. Add 45 &mul (0.9X) of resuspended beads to the PCR reaction (

50 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.9.3. Incubate for 5 minutes at room temperature.

3.9.4. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (about 5 minutes), carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads that contain DNA targets. Caution: do not discard beads.

3.9.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.9.6. Repeat Step 3.9.5 once for a total of 2 washing steps.

3.9.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.9.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA target from the beads by adding 23 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down ten times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnetic rack until the solution is clear.

3.9.9. Transfer 20 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and store at &ndash20°C.

3.10. Library Quantification

3.10.1. Use a Bioanalyzer or TapeStation to determine the size distribution and concentration of the libraries.

3.10.2. Check that the electropherogram shows a narrow distribution with a peak size approximately 300 bp.

80 bp (primers) or 128 bp (adaptor-dimer) is visible in the bioanalyzer traces, bring up the sample volume (from Step 3.9.9) to 50 &mul with 0.1X TE buffer and repeat the SPRIselect Bead or NEBNext Sample Purification Bead Cleanup Step (Section 3.9).

Figure 3.9.1 Example of RNA library size distribution on a Bioanalyzer.


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