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Aula 13: Leitura da informação no genoma: transcrição Tradução e processos pós-tradução - Biologia


Aula 13: Leitura de informações no genoma: transcrição Tradução e processos pós-tradução

Regulação pós-tradução da transição materno-zigótica

A transição materno-zigótica (MZT) é essencial para o controle do desenvolvimento transferido de produtos maternos para o genoma zigótico recém-sintetizado nos estágios iniciais da embriogênese, incluindo degradação do componente materno (mRNAs e proteínas) e ativação do genoma zigótico (ZGA). Várias modificações pós-tradução de proteínas foram identificadas durante o MZT, como fosforilação, metilação e ubiquitinação. Mecanismos de regulação pós-tradução precisos são essenciais para a transição oportuna do desenvolvimento embrionário inicial. Nesta revisão, resumimos o progresso recente em relação aos mecanismos moleculares subjacentes à regulação pós-tradução da degradação do componente materno e ZGA durante o MZT e discutimos algumas questões importantes no campo.

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Resumo

As análises à escala do genoma nos permitiram progredir além do estudo da expressão gênica no nível de componentes individuais de um determinado processo, fornecendo informações globais sobre as conexões funcionais entre genes, mRNAs e suas proteínas regulatórias. Essas análises aumentaram muito a nossa compreensão da interação entre os diferentes eventos na regulação do gene e destacaram as conexões funcionais anteriormente não apreciadas, incluindo o acoplamento entre os processos nucleares e citoplasmáticos. Abordagens em todo o genoma também revelaram ampla coordenação dentro dos níveis regulatórios, como a organização de fatores de transcrição em motivos regulatórios. No geral, esses estudos aumentam nossa compreensão de como os muitos componentes da célula eucariótica funcionam como um sistema que permite a coordenação e versatilidade na expressão gênica.


Controle da expressão gênica em eucariotos

As células eucarióticas têm mecanismos semelhantes de controle da expressão gênica, mas são mais complexos. Considere, por exemplo, que as células procarióticas de uma determinada espécie são todas iguais, mas a maioria dos eucariotos são organismos multicelulares com muitos tipos de células, então o controle da expressão gênica é muito mais complicado. Não surpreendentemente, a expressão gênica em células eucarióticas é controlada por uma série de processos complexos que são resumidos pela lista a seguir.

  • Após a fertilização, as células do embrião em desenvolvimento tornam-se cada vez mais especializadas, em grande parte ativando alguns genes e desativando muitos outros. Algumas células do pâncreas, por exemplo, são especializadas em sintetizar e secretar enzimas digestivas, enquanto outras células pancreáticas (células & # 946 nas ilhotas de Langerhans) são especializadas em sintetizar e secretar insulina. Cada tipo de célula possui um padrão particular de genes expressos. Essa diferenciação em células especializadas ocorre principalmente como resultado do desligamento da expressão da maioria dos genes nas células maduras. As células maduras podem usar apenas 3-5% dos genes presentes no núcleo da célula.
  • A expressão gênica em eucariotos também pode ser regulada por meio de alterações no empacotamento do DNA, que modula o acesso das enzimas de transcrição da célula (por exemplo, RNA polimerase) ao DNA. A ilustração abaixo mostra que os cromossomos têm uma estrutura complexa. A hélice do DNA é envolvida em proteínas especiais chamadas histonas, e estas são envolvidas em fibras helicoidais compactas. Essas fibras são então enroladas e dobradas em estruturas cada vez mais compactas que, quando totalmente enroladas e condensadas, dão aos cromossomos sua aparência característica em metáfase.

  • Semelhante aos operons descritos acima para procariotos, os eucariotos também usam proteínas regulatórias para controlar a transcrição, mas cada gene eucariótico tem seu próprio conjunto de controles. Além disso, existem muitos mais proteínas regulatórias em eucariotos e as interações são muito mais complexas.
  • Em eucariotos, a transcrição ocorre dentro do núcleo ligado à membrana, e o transcrito inicial é modificado antes de ser transportado do núcleo para o citoplasma para tradução nos ribossomos. A transcrição inicial em eucariotos tem segmentos codificadores (exons) alternados com segmentos não codificantes (íntrons). Antes de o mRNA deixar o núcleo, os íntrons são removidos do transcrito por um processo chamado splicing de RNA (veja o gráfico e o vídeo abaixo), e nucleotídeos extras são adicionados às extremidades do transcrito. ataque por enzimas celulares e ajuda no reconhecimento pelos ribossomos.

  • A variação na longevidade do mRNA fornece mais uma oportunidade para o controle da expressão gênica. O mRNA procariótico tem vida muito curta, mas os transcritos eucarióticos podem durar horas, ou às vezes até semanas (por exemplo, mRNA para hemoglobina nos glóbulos vermelhos de pássaros).
  • O processo de tradução oferece oportunidades adicionais para a regulação por muitas proteínas. Por exemplo, a tradução do mRNA da hemoglobina é inibida, a menos que heme contendo ferro esteja presente na célula.
  • Existem também oportunidades para controles "pós-tradução" da expressão gênica em eucariotos. Alguns polipeptídeos (proteínas) traduzidos são cortados por enzimas em produtos finais ativos menores. conforme ilustrado na figura abaixo, que representa o processamento pós-tradução do hormônio insulina. A insulina é inicialmente traduzida como um grande precursor inativo, uma sequência de sinal é removida da cabeça do precursor e uma grande porção central (a cadeia C) é cortada, deixando duas cadeias peptídicas menores que são então ligadas entre si por pontes dissulfeto. A forma final menor é a forma ativa da insulina.
  • A expressão do gene também pode ser modificada pela quebra das proteínas que são produzidas. Por exemplo, algumas das enzimas envolvidas no metabolismo celular são quebradas logo após serem produzidas, o que fornece um mecanismo para responder rapidamente às mudanças nas demandas metabólicas.
  • A expressão do gene também pode ser influenciada por sinais de outras células. Existem muitos exemplos em que uma molécula de sinal (por exemplo, um hormônio) de uma célula se liga a uma proteína receptora em uma célula alvo e inicia uma sequência de mudanças bioquímicas (uma via de transdução de sinal) que resultam em mudanças dentro da célula alvo. Essas alterações podem incluir aumento ou diminuição da transcrição, conforme ilustrado na figura abaixo.

  • O sistema de interferência de RNA (RNAi) é mais um mecanismo pelo qual as células controlam a expressão gênica, desligando a tradução do mRNA. O RNAi também pode ser usado para interromper a tradução de proteínas virais quando uma célula é infectada por um vírus. O sistema RNAi também tem potencial para ser explorado terapeuticamente.

Alguns vírus de RNA invadirão as células e introduzirão RNA de fita dupla, que usará a maquinaria celular para fazer novas cópias do RNA viral e das proteínas virais. O sistema de interferência de RNA da célula (RNAi) pode impedir a replicação do RNA viral. Em primeiro lugar, uma enzima apelidada de & quotDicer & quot corta qualquer RNA de fita dupla que encontrar em pedaços com cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Em seguida, complexos de proteínas chamados RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA) se ligam aos fragmentos de RNA de fita dupla, enrolam-no e, em seguida, liberam uma das fitas, enquanto retêm a outra. O complexo RISC-RNA irá então se ligar a qualquer outro RNA viral com sequências de nucleotídeos correspondentes às do RNA anexado ao complexo. Esta ligação bloqueia a tradução de proteínas virais, pelo menos parcialmente, senão completamente. O sistema RNAi pode ser potencialmente usado para desenvolver tratamentos para genes defeituosos que causam doenças. O tratamento envolveria a produção de um RNA de fita dupla a partir do gene doente e sua introdução nas células para silenciar a expressão desse gene. Para obter uma explicação ilustrada do RNAi, consulte o breve módulo Flash interativo em http://www.pbs.org/wgbh/nova/body/rnai-explained.html

O sistema de interferência de RNA também é explicado de forma mais completa no vídeo abaixo da Nature Video.

Conteúdo & # 1692018. Todos os direitos reservados.
Data da última modificação: 2 de fevereiro de 2018.
Criado por Wayne W. LaMorte, MD, PhD, MPH,


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Como a transcrição, a tradução é controlada por proteínas que se ligam e iniciam o processo. Na tradução, antes que a síntese de proteínas possa começar, a montagem do ribossomo deve ser concluída. Este é um processo de várias etapas.

Na montagem do ribossomo, as subunidades ribossômicas grandes e pequenas e um tRNA iniciador (tRNAeu) contendo o primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica final, todos se juntam no códon de início da tradução em um mRNA para permitir que a tradução comece. Primeiro, a pequena subunidade ribossômica se liga ao tRNAeu que carrega metionina em eucariotos e arquéias e carrega N-formil-metionina em bactérias. (Porque o tRNAeu está carregando um aminoácido, diz-se que está carregado.) Em seguida, a pequena subunidade ribossômica com o tRNA carregadoeu ainda ligado varreduras ao longo da fita de mRNA até atingir o códon de início AUG, que indica onde a tradução começará. O códon de início também estabelece o quadro de leitura para a fita de mRNA, que é crucial para sintetizar a sequência correta de aminoácidos. Uma mudança no quadro de leitura resulta na tradução incorreta do mRNA. O anticódon no tRNAeu em seguida, liga-se ao códon de início por meio da comparação de bases. O complexo consiste em mRNA, tRNA carregadoeu, e a pequena subunidade ribossômica se liga à grande subunidade ribossômica, que completa a montagem do ribossomo. Esses componentes são reunidos com a ajuda de proteínas chamadas fatores de iniciação, que se ligam à pequena subunidade ribossômica durante a iniciação e são encontrados em todos os três domínios da vida. Além disso, a célula gasta energia GTP para ajudar a formar o complexo de iniciação. Uma vez que a montagem do ribossomo está completa, o tRNA carregadoeu está posicionado no local P do ribossomo e o local A vazio está pronto para o próximo aminoacil-tRNA. A síntese polipeptídica começa e sempre prossegue do terminal N para o terminal C, denominado direção N-para-C.

Em eucariotos, várias proteínas do fator de iniciação eucariótica (eIFs) auxiliam na montagem do ribossomo. O fator de iniciação eucariótico 2 (eIF-2) é ativo quando se liga ao trifosfato de guanosina (GTP). Com o GTP ligado a ele, a proteína eIF-2 se liga à pequena subunidade ribossômica 40S. Em seguida, o tRNA inicial carregado com metionina (Met-tRNAeu) se associa ao complexo de ribossomo GTP-eIF-2 / 40S e, uma vez que todos esses componentes estão ligados uns aos outros, eles são chamados coletivamente de complexo 43S.

Os fatores eucarióticos de iniciação eIF1, eIF3, eIF4 e eIF5 ajudam a traduzir o complexo 43S para o cap 5 & # 8242-m 7 G de um mRNA. Uma vez ligado ao mRNA & # 8217s 5 & # 8242 m 7 G cap, o complexo 43S começa a viajar para baixo no mRNA até atingir o códon AUG de iniciação no início do quadro de leitura do mRNA & # 8217s. As sequências em torno do AUG podem ajudar a garantir que o AUG correto seja usado como o códon de iniciação no mRNA.

Uma vez que o complexo 43S está no AUG de iniciação, o tRNAi-Met é posicionado sobre o AUG. O anticódon no tRNAeu-Conecte pares de base com o códon AUG. Neste ponto, o GTP ligado ao eIF2 no complexo 43S é hidrolisado em GDP + fosfato e a energia é liberada. Esta energia é usada para liberar o eIF2 (com o PIB vinculado a ele) do complexo 43S, deixando a subunidade ribossômica 40S e o tRNAeu-Met no local de início da tradução do mRNA.

Em seguida, eIF5 com GTP ligado se liga à subunidade ribossômica 40S complexada ao mRNA e ao tRNAeu-Conheceu. O eIF5-GTP permite que a grande subunidade ribossomal 60S se ligue. Uma vez que a subunidade ribossômica 60S chega, eIF5 hidrolisa seu GTP ligado em GDP + fosfato e energia é liberada. Esta energia alimenta a montagem das duas subunidades ribossômicas no ribossomo 80S intacto, com tRNAi-Met em seu local P, enquanto também é pareado com o códon AUG de iniciação no mRNA. A tradução está pronta para começar.

A ligação de eIF-2 à subunidade ribossomal 40S é controlada por fosforilação. Se o eIF-2 for fosforilado, ele sofre uma mudança conformacional e não pode se ligar ao GTP. Portanto, o complexo 43S não pode se formar adequadamente e a tradução é impedida. Quando o eIF-2 permanece não fosforilado, ele se liga à subunidade ribossômica 40S e traduz ativamente a proteína.

Complexo de Iniciação de Tradução: A expressão do gene pode ser controlada por fatores que ligam o complexo de iniciação da tradução.

A capacidade de montar totalmente o ribossomo afeta diretamente a taxa em que ocorre a tradução. Mas a síntese de proteínas também é regulada em vários outros níveis, incluindo a síntese de mRNA, síntese de tRNA, síntese de rRNA e síntese de fator de iniciação eucariótica. A alteração em qualquer um desses componentes afeta a taxa em que a tradução pode ocorrer.


Informação sobre o autor

Afiliações

Proteome Center Tübingen, Universidade de Tübingen, Tübingen, Alemanha

Interações Organísmicas, Universidade de Tübingen, Tübingen, Alemanha

PISSARO Proteomic Platform, University of Rouen, Rouen, França

Instituto de Biologia Molecular e Biofísica, ETH Zurique, Zurique, Suíça

Laboratório de Microbiologia Molecular e Bioquímica Estrutural, CNRS UMR 5086, Universidade de Lyon, Lyon, França

Sistemas e Biologia Sintética, Chalmers University of Technology, Gotemburgo, Suécia

Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Dinamarca

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Contribuições

B.M. pesquisou dados para o artigo, elaborou o esboço e revisou e editou o manuscrito antes da submissão. B.M., K.F., J.H, E.W.-B., C.G. e I.M. contribuíram substancialmente para a discussão do conteúdo e escreveram o artigo.

Autor correspondente


Fundo

Muitos aspectos da pesquisa biológica moderna dependem da identificação precisa dos genes codificadores de proteínas em cada genoma, bem como da natureza dos produtos proteicos funcionais maduros, um processo comumente referido como anotação do genoma. Com o aumento exponencial no número de genomas procarióticos sequenciados proporcionado pelos avanços nas tecnologias de sequenciamento de genoma na última década, a anotação do genoma procariótico atual é essencialmente um processo automatizado de alto rendimento que depende muito de de novo programas de predição de genes [1-3].

Enquanto de novo programas de previsão de genes melhoraram significativamente para genomas procarióticos desafios consideráveis ​​permanecem [4], como determinar o local preciso de início e parada de um gene, prever genes curtos com precisão e determinar um códon de parada que representa um aminoácido alternativo em vez de uma parada verdadeira local. À medida que os esforços para sequenciar mais ramos da árvore da vida se expandem, o nível de precisão dos programas atuais de predição de genes treinados em conjuntos de dados de proteobactérias diminuirá acentuadamente, levando a um aumento nas predições incorretas de genes codificadores de proteínas [4]. Para agravar o problema, está a falta de evidências experimentais que apóiem ​​as regiões codificantes de proteínas previstas para a grande maioria dos genomas anotados. Quando disponível, a evidência experimental é normalmente baseada em sequências de RNA expressas, como de microarray ou experimentos de Seq de RNA. No entanto, essas análises centradas no genoma não determinam de forma independente e inequívoca se um gene codificador de proteína previsto é traduzido em uma proteína ou fornecem qualquer informação confiável sobre o processamento pós-tradução.

A proteômica de baixo para cima oferece a capacidade de medir diretamente os peptídeos decorrentes de proteínas expressas que representam a melhor opção atual para identificar de forma independente e inequívoca pelo menos um subconjunto importante dos genes codificadores de proteínas em um genoma e pode ser usada para validar experimentalmente as anotações do gene [4 -9]. Em uma abordagem ascendente, as proteínas dentro de uma mistura complexa são tipicamente digeridas com uma protease, após o que os peptídeos resultantes são separados por métodos cromatográficos e, em seguida, analisados ​​usando espectrometria de massa em tandem (MS / MS) [10,11]. Cada espectro de MS / MS é uma medida de massas de fragmentos, idealmente a partir de uma única sequência de peptídeo de

6-50 aminoácidos. Este conjunto de valores de massa é análogo a uma 'impressão digital' que identifica o peptídeo. A interpretação dos espectros de peptídeos MS / MS é realizada 1) usando algoritmos como X! Tandem [12], SEQUEST [13] ou Mascot [14] para comparar as massas medidas contra um conjunto de massas teóricas de possíveis sequências de proteínas ou 2) menos comumente, por de novo análise, que não depende de nenhum conhecimento prévio das possíveis sequências [15,16]. Semelhante à pesquisa de espectros de MS / MS contra um conjunto de sequências de proteínas previstas, também é possível (e viável para genomas simples) identificar os genes que codificam proteínas em um genoma pesquisando espectros de MS / MS contra uma tradução de seis quadros do sequência de DNA genômico, impedindo assim os vieses inerentes derivados de métodos de predição de genes. Notamos que a ampliação para um banco de dados exponencialmente maior, como resultado da tradução de seis quadros de uma sequência de DNA genômico, torna as pesquisas mais lentas em potencialmente ordens de magnitude. Além disso, também resulta em maior possibilidade de identificações de falso-positivo, pois a taxa de descoberta de falsos escala com o tamanho crescente do banco de dados, diminuindo enormemente os desafios gêmeos de sensibilidade que só podem ser atendidos de forma viável com recursos de computação sofisticados / dedicados que impedem o uso de rotina no momento.

A proteômica de baixo para cima também fornece uma via para a obtenção de informações biologicamente relevantes sobre modificações pós-tradução. Mesmo para sistemas biológicos relativamente simples, como procariotos, eventos de modificação pós-tradução (PTM) estão cada vez mais sendo reconhecidos como importantes, mas são mal caracterizados em relação aos locais ou função. Embora as informações de PTM obtidas a partir de conjuntos de dados MS / MS em escala de genoma beneficiem a compreensão biológica dos organismos bacterianos, desafios tecnológicos significativos dificultam a inclusão rotineira dessas informações valiosas nas anotações primárias. Esta situação é exemplificada por apenas um único relatório de conjuntos de dados MS / MS em escala de genoma sendo usados ​​para anotar de forma abrangente eventos de modificações pós-tradução em uma sequência de genoma [17]. No entanto, a baixa resolução dos conjuntos de dados MS / MS torna a atribuição de modificações, incluindo crucialmente o local da modificação, menos confiável e inadequada para o uso rotineiro. Por exemplo, a diferença de massa de 0,036 Dalton entre Gln (Q) e Lys (K) não pode ser resolvida em espectros de MS / MS de baixa resolução, o que aumenta o número de candidatos a peptídeos possíveis a serem combinados e reduz a confiança nas atribuições. Por outro lado, a precisão de sequenciamento proporcionada por espectros de MS / MS de alta resolução pode resolver resíduos com pequenas diferenças de massa como Gln e Lys, o que reduz o espaço de busca e, portanto, a carga computacional, e aumenta a confiança nas atribuições.

Neste estudo, empregamos uma abordagem de proteômica de baixo para cima suplementada com um descrito recentemente de novo metodologia de sequenciamento usando dados de MS / MS de alta resolução e alta precisão de medição de massa [18,19] para descobrir com precisão a paisagem translacional e as características pós-translacionais do patógeno bacteriano Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM) 14028. Salmonella Typhimurium é uma das principais causas de gastroenterite bacteriana e é amplamente utilizado como um modelo para investigar mecanismos genéticos básicos, bem como a interação entre patógenos bacterianos e hospedeiros mamíferos. Apesar da relevância clínica e científica básica de Salmonella Typhimurium não houve nenhuma análise abrangente realizada para fornecer suporte experimental de seu em sílicocom base em anotação do genoma para facilitar a análise em nível de sistema. Nossos dados fornecem validação experimental em nível de proteína para aproximadamente metade dos genes codificadores de proteína previstos em STM 14028 e sugere revisões de 47 genes atribuídos a locais de início de tradução incorretos, incluindo um novo códon de início alternativo potencial. Além disso, descobrimos 12 genes não anotados perdidos por programas de predição de genes, bem como evidências que sugerem um papel para uma dessas novas ORFs em Salmonella patogênese. Também caracterizamos características pós-tradução no genoma STM 14028, incluindo modificações químicas e clivagens proteolíticas. Descobrimos que as bactérias têm um repertório muito maior e complexo de modificações químicas do que se pensava anteriormente, incluindo várias novas modificações. Nosso na Vivo dados de proteólise identificaram mais de 130 peptídeos de sinal e eventos de clivagem de metionina N-terminal críticos para a função da proteína.

Ao contrário da esmagadora maioria das análises proteogenômicas que utilizam dados proteômicos para melhorar a qualidade e integridade dos genomas anotados anteriormente, este estudo representa um dos primeiros a utilizar dados proteômicos "como parte de um processo de anotação de alto rendimento amplamente automatizado diretamente no estágio primário de anotação do genoma "[20].


M 6 A modula o metabolismo do mRNA

N A metilação da 6 -adenosina afeta quase todos os estágios do metabolismo do mRNA, desde o processamento no núcleo até a tradução e decadência no citoplasma. Dois modos distintos de função foram identificados para leitores m 6 A: leitura indireta e leitura direta. A leitura indireta envolve alterações de m 6 A nas estruturas secundárias do RNA, tornando assim o RNA acessível a um conjunto único de proteínas de ligação ao RNA (RBPs). A leitura direta envolve a ligação seletiva de m 6 A a RBPs com diversas funções celulares (TABELA 1).

M 6 A altera o dobramento e a estrutura do RNA

O grupo metil no NA posição 6 de m 6 A não altera o emparelhamento de bases Watson & # x02013Crick A & # x02022U, mas enfraquece o RNA duplex em até 1,4 kcal por mol 68. Em posições desemparelhadas, m 6 A empilha melhor do que uma base não modificada, desse modo estabilizando as estruturas de RNA circundantes 69,70 ou promovendo o dobramento de sequências de RNA adjacentes 71. O mapeamento da estrutura de RNA em todo o transcriptoma confirmou que as regiões de RNA metiladas preferem estruturas de fita simples a estruturas de fita dupla 70,72 & # x0201374. Além disso, um relatório recente revelou que o m 6 A dentro das regiões codificantes pode induzir restrições estéricas que desestabilizam o emparelhamento entre os códons e os anticódons do tRNA, afetando assim a dinâmica da tradução 75.

Devido a esses efeitos termodinâmicos, a remodelação estrutural desencadeada por m 6 A pode alterar a acessibilidade dos motivos de interação RBP ao RNA, um fenômeno denominado m 6 A switch 67. A metilação de um motivo RRACH em uma estrutura de haste em vários genes, por exemplo, na metástase associada ao transcrito de adenocarcinoma pulmonar 1 (MALAT1) e CDP-diacilglicerol sintase 2 (CDS2), causa sua desestabilização e a abertura do duplex. Um trato U de fita simples é então exposto, o que pode ser reconhecido por HNRNPC para regular o splicing desses transcritos 67,76 (FIG. 2a). Os interruptores m 6 A podem estar espalhados por todo o transcriptoma e, portanto, podem ter papéis profundos na mediação das interações entre o RNA e os RBPs 67,76.

uma| Depois de ser depositado pelos componentes catalíticos do núcleo da metiltransferase, como metiltransferase-like 3 (METTL3) e METTL14, N 6-metiladenosina (m 6 A) é reconhecida por várias proteínas de leitura. No núcleo, a ribonucleoproteína C nuclear heterogênea (HNRNPC) funciona como um leitor m 6 A indireto ligando regiões de troca m 6 A não estruturadas e regulando o splicing, enquanto a homologia YT521-B (YTH) contendo o domínio 1 (YTHDC1) regula o splicing alternativo por ligação m 6 A diretamente e recrutamento dos fatores de splicing serina e fator de splicing rico em arginina 3 (SRSF3) enquanto bloqueia a ligação por SRSF10. HNRNPA2B1 também medeia splicing alternativo de uma maneira semelhante a YTHDC1. No citoplasma, o YTHDF1 medeia a iniciação da tradução de transcritos contendo m 6 A ligando-se diretamente a m 6 A e recrutando o fator de iniciação eucariótico 3 (eIF3), facilitando assim o carregamento da pequena subunidade ribossômica eucariótica (40S). YTHDF2 promove o decaimento do mRNA ligando-se à subunidade 1 do complexo de transcrição CCR4 & # x02013NOT (CNOT1), facilitando assim o recrutamento do complexo CCR4 & # x02013NOT e induzindo a deadenilação acelerada. b | Os transcritos metilados podem ser classificados por proteínas de leitura em uma via rápida (direita) para processamento, tradução e decadência. Este rastreamento rápido agrupa efetivamente transcrições com propriedades marcadamente diferentes para garantir sua tradução e degradação oportuna e coordenada, possivelmente gerando um impulso & # x02018pulse & # x02019 nítido de expressão gênica para satisfazer a necessidade de rajadas de tradução e eliminação subsequente dessas transcrições.

M 6 A afeta a maturação do mRNA

O processamento do pré-mRNA para o mRNA maduro consiste em três etapas principais: 5 & # x02032 capeamento, 3 & # x02032 poliadenilação e splicing. O m 6 A foi inicialmente proposto para funcionar como um regulador de splicing, pois os primeiros estudos descobriram que ele era mais abundante no pré-mRNA do que no mRNA 77 maduro, com muitos sítios m 6 A concentrados nos íntrons 78,79. mRNAs que sofrem splicing alternativo também têm mais sítios de ligação de METTL3 e mais N Locais de metilação da 6-adenosina 39,49. Escritores e apagadores de m 6 A localizam-se predominantemente em manchas nucleares 39,43,44,63, que são locais de splicing e armazenamento de mRNA. Dados de PAR-CLIP (reticulação fotoativável reforçada com ribonucleosídeo e imunoprecipitação) mostraram que a maioria dos sítios de ligação de METTL3 residem nos íntrons 39 e a depleção de Mettl3 em células-tronco embrionárias de camundongo (células ES de camundongo) geralmente favorece o salto de exon e a retenção de intron 80. Estes resultados indicam que o recrutamento de METTL3 para pré-mRNA é um evento co-transcricional, com metilação potencialmente precedendo e influenciando o splicing. O FTO também modula o splicing alternativo removendo m 6 A em torno dos locais de splicing e evitando a ligação do fator de splicing 2 rico em serina e arginina (SRSF2) 81. Os leitores m 6 A também afetam o splicing. YTHDC1 recruta SRSF3 enquanto bloqueia a ligação por SRSF10, levando à inclusão do exon 63 (FIG. 2a). HNRNPA2B1 e HNRNPC também são reguladores de splicing ativos 67,82,83. HNRNPA2B1 regula eventos de splicing alternativo de maneira semelhante a METTL3 (REF. 66), bem como biogênese de microRNA (miRNA) de sequências intrônicas, que é um processo intimamente acoplado com splicing 66,84 (Informações suplementares S2 (caixa)).

A poliadenilação alternativa (APA) é acoplada ao splicing do último íntron 85 e associada ao mRNA N Metilação de 6 -adenosina. Dois terços dos sites m 6 A no último exon são encontrados na UTR 3 & # x00374, onde os sites APA residem em 56, e o knockdown dos gravadores m 6 A pode causar APA 56. Estudos recentes de isoformas de mRNA de APA revelaram que isoformas com m 6 A tendem a utilizar sítios APA proximais e têm UTRs 3 & # x02032 mais curtos em comparação com isoformas não metiladas 86. Coletivamente, esses resultados demonstram que a metilação de m 6 A está intimamente ligada ao processamento inicial de mRNA.

M 6 A aumenta o processamento nuclear e exportação de mRNAs

A exportação nuclear de mRNA é um processo chave que conecta a transcrição e o processamento no núcleo à tradução no citosol e pode modular seletivamente a expressão gênica 87. N A metilação de 6 -adenosina foi sugerida para promover a exportação de mRNA: depleção de METTL3 inibiu a exportação de mRNA 88, enquanto a depleção de ALKBH5 exportação de mRNA aprimorada para o citoplasma 44. Detalhes mecanísticos ainda não foram relatados, mas é concebível que os leitores nucleares tenham um papel ativo neste processo. Facilitar a exportação de mRNA para o citoplasma pode ser um mecanismo importante pelo qual m 6 A regula a expressão gênica.

M 6 A promove tradução de mRNA

A tradução é promovida por N Metilação da 6 -adenosina por vários mecanismos. YTHDF1 promove globalmente a tradução de mRNAs metilados m 6 A ligando mRNA modificado por m 6 A e recrutando fatores de iniciação de tradução, melhorando assim significativamente a eficiência da tradução dependente de cap 61. YTHDF1 não apenas acopla transcritos metilados com ribossomos, mas também recruta o fator de iniciação complexo de fator de iniciação de tradução 3 (eIF3) (FIG. 2a) para promover a etapa de limitação de taxa de tradução. METTL3 foi recentemente mostrado para funcionar também como um leitor de m 6 A, aumentando a tradução dependente de eIF4E em um subconjunto específico de mRNAs, recrutando eIF3 durante o início da tradução 89. Este efeito foi independente de sua atividade de metiltransferase ou da via 89 de YTHDF1 & # x02013eIF3. Dois estudos recentes indicaram ainda que a presença de m 6 A no 5 & # x02032 UTR melhora a tradução independente do cap 52,90, e eIF3 foi proposto para interagir com m 6 A e facilitar o carregamento do ribossomo 90. Coletivamente, essas descobertas sugerem vários mecanismos distintos pelos quais o m 6 A promove a tradução do mRNA.

M 6 A marca mRNA para decadência

O decaimento é a etapa final no metabolismo do mRNA, durante o qual o mRNA é desestabilizado e degradado. m 6 A tem sido associado à estabilidade reduzida do mRNA, como knockdown de METTL3 e METTL14 em células humanas e de camundongo, mostrou levar a aumentos na expressão de seus respectivos mRNAs alvo 37,38. Embora a maioria dos locais m 6 A pareçam acelerar a decadência do mRNA, o impacto no transcriptoma, incluindo transcritos metilados e não metilados, pode ser mais complexo. Esse raciocínio é porque muitos mRNAs que codificam repressores de transcrição são substratos alvo do complexo de metiltransferase. A metilação reduzida desses transcritos pode causar repressão da transcrição.

Estudos mecanísticos do leitor citoplasmático m 6 A YTHDF2 (REFS 49,60) forneceram a primeira evidência direta de uma via de decaimento de mRNA dependente de m 6 A 60. Semelhante ao YTHDF1, o YTHDF2 é uma proteína de dois domínios: o domínio YTH do terminal carboxi se liga seletivamente aos transcritos metilados, enquanto o domínio funcional do terminal amino entrega os transcritos ligados ao YTHDF2 à maquinaria de decaimento do RNA citoplasmático para degradação dedicada 60. Knockdown de YTHDF2 prolongou a estabilidade de seus mRNAs alvo, indicando que promove a decadência de mRNA de N Metilação de 6 -adenosina. Foi demonstrado que YTHDF2 se associa com a subunidade 1 do complexo de transcrição CCR4 & # x02013NOT (CNOT1) 60, o que facilita o recrutamento do complexo CCR4 & # x02013NOT e induz a deadenilação acelerada de mRNA ligado a YTHDF2 91. A degradação dependente de YTHDF2 de N Os mRNAs metilados em 6-adenosina representam um papel crucial para m 6 A, que está de acordo com o aumento da expressão gênica observada com o knockdown de escritores m 6 A 37,38.

Além disso, os locais m 6 A ligados a YTHDF2 também podem ser reconhecidos por outros efetores da estabilidade do mRNA, como a proteína 1 de ligação de RNA semelhante a ELAV (ELAV1 também conhecido como HuR) 38,92, miRNAs 93 e o receptor semelhante a Toll ( TLR) membros da proteína da família TLR3 e TLR7 (REF. 94). Considerando o papel proposto de m 6 A na biogênese de miRNA (informações suplementares S2 (caixa)), essas vias poderiam se cruzar para controlar cooperativamente a estabilidade de mRNAs alvo. O decaimento de transcritos metilados parece ser um fator importante na promoção da diferenciação de células ES de camundongo e na facilitação da embriogênese de camundongo 80. Em resumo, m 6 A geralmente funciona como um desestabilizador de mRNAs e facilita a degradação de transcritos metilados em vários contextos biológicos.

M 6 A classifica as transcrições em uma via rápida para o metabolismo do mRNA

O ciclo de vida dos mRNAs é regulado por processos regulatórios transcricionais e pós-transcricionais, incluindo processamento, exportação, tradução e decadência. Recent studies have revealed that m 6 A and its related factors influence each of these steps. As these processes are generally coupled, we propose that mediators of N 6 -adenosine methylation may work in concert to shape the methylation pattern and protein binding of specific transcripts, thereby affecting their metabolism. One example of such cooperation is the co-regulation of translation and decay by YTHDF1 and YTHDF2 of their shared targets 61 . Both the translation efficiency and the degradation of these mRNAs are reduced by double knockdown of YTHDF1 and YTHDF2. The combined function of the YTHDF1-dependent translation promotion and YTHDF2-dependent decay may result in a spike in protein production 61 ( FIG. 2b ). This effect, along with other m 6 A-mediated effects such as accelerated export of certain methylated mRNA, suggests a critical function for m 6 A-based gene regulation: writers and erasers dictate the levels of target-specific m 6 A. In turn, readers decode these messages and may functionally sort methylated mRNAs into distinct functional groups. During cell differentiation and development, when the translation of groups of transcripts is accomplished within a short time span, methylation could sort these transcript groups into a fast track for processing, translation and decay. Methylation could be particularly beneficial in grouping and synchronizing the expression of hundreds to thousands of mRNAs that otherwise may possess markedly different properties with varied stabilities and translation efficiencies. Such a mechanism may also help in generating translation ‘pulses’ to satisfy the need for bursts of protein synthesis as well as rapid decay to regulate cell differentiation during early development ( FIG. 2b ).


Lecture 13: Reading information in the genome: transcription Translation and post-translational processes - Biology

C2006/F2402 '11 OUTLINE OF LECTURE # 12

(c) 20 11 Dr. Deborah Mowshowitz, Columbia University, New York, NY . Last update 03/02/2011 11:49 AM

Handouts: 12A -- processamento de mRNA
12B
-- Alternative processing of mRNA
12C
-- Signal Hypothesis -- Co-translational Import
12
D -- How proteins insert into ER membrane.

I. Wrap up TFs and Development -- What is the molecular basis of testes cell fate determination? See handout 11A, bottom.

1. Is master regulatory gene for Testes

2. Is expressed in Sertoli cells

3. Gene is on Y chromosome

B. What Sry turns on, either directly or indirectly:

2. Signaling molecules:

uma. From Sertoli Cells -- Paracrines

-Paracrine that turns on enzymes for testosterone production in Leydig cells

b. From Leydig cells -- Testosterone (endocrine)


II. Overview of Regulation of Euk. Síntese proteíca

A. If cells make different proteins, how is that regulated? Is the difference due entirely to differences in transcription?

1. Transcription é different in different cells.

uma. How could it be otherwise? It could be that all cells transcribe all genes, but only some RNA's are exported to the cytoplasm and the remaining nuclear RNAs are degraded. Isto é não the case. Only selected genes are transcribed in each cell type, and RNA's from those genes are processed to make mRNA. (For an experiment that shows this, see figure 23-19 in Becker.)

b. A consequence -- cDNA libraries. cDNA = complementary DNA = DNA made em vitro by enzymes (including reverse transcriptase), from an mRNA template. Since mRNA is different in different tissues, you can get tissue specific sequences from a cDNA library. (cDNA library = collection of all cDNA's from a particular cell type.) DNA from each cell type is the same mRNA and therefore cDNA is not. See Becker fig. 23-20.

For a problem about DNA & cDNA libraries, see 14A-6.

2. Processing can be different: Splicing and processing of same primary transcripts can be different (in different cells or at different times). Different mRNA's (& therefore proteins) can be produced from the same transcript by alternative splicing and/or poly A addition. Details & example below.

B. How can amount of protein synthesized be controlled? If cell makes more or less protein, which step(s) are regulated?

1. In prokaryote (for comparison) -- process relatively simple.

uma. Most regulation at transcription.

b. Translation in same compartment as transcription translation follows automatically.

c. Most mRNA has short half-life.

2. In eukaryote -- Gene expression has many more steps & complications than in prokaryotes -- more additional points of regulation -- not just at transcription. See Becker fig. 23-11 or Sadava fig. 16.13 (14.12).

uma. Transcription is main point of control, but other steps are often regulated too.

b. Transcription & translation occur in separate compartments. Translation does not follow automatically.

(1). 2. Transcript must be processed (capped, spliced, polyadenylated, etc.) -- any of these steps can be regulated, and there is more than one way to process most primary transcripts.

(2) mRNA must be transported to cytoplasm.

(3). Translation can be regulated (independently of transcription) -- can control usage and/or fate of mRNA, not just supply of mRNA. For any particular mRNA, can regulate 1 or both of following:

(uma). Rate of initiation -- can control how often ribosomes attach and start translation.

(b). Rate of degradation -- can control half life of mRNA.

c. Different eukaryotic mRNAs have different half-lives. Some mRNA's are long lived and some have a very short half life.

To review regulation, try Problems 4-11 & 4-12.


III. Post Translational Regulation. Don't forget: regulation occurs after translation too -- after proteins are made, their activity can be modulated. Many examples of post translational modification have already come up and more will be discussed later. Here is a summary (mostly review):

A. Covalent Modification. Proteins can be modified covalently either reversibly (for ex. by phosphorylation and dephosphorylation), or permanently (for ex. by removal of N-terminal met., addition of sugars -- glycosylation, etc.)

B. Noncovalent Modification. Proteins can be activated or inhibited by reversible noncovalent binding of other factors -- small molecule allosteric effectors, other proteins such as calmodulin (an important Ca 2+ binding protein to be discussed later), etc.

C. Degradation. Proteins can be selectively destroyed or 'turned over'.

1. Half Lives Vary. Not all proteins have the same half life.

2. Significance: Important example of a family of proteins that all have a short half life = cyclins control progression through cell cycle. Different cyclins control transitions from G1 to S, G2 to M etc. Cyclins are made as needed and degraded immediately after use. (Note: Both mRNA's for cyclins and cyclins themselves are degraded after use. More on this when we cover the details of the cell cycle.)

D. Location. Proteins can activated or inhibited by a change of location. For example, transporters like GLUT4 only work if positioned in the plasma membrane if they are sequestered in vesicles they are inactive. Transport of glucose into the cell can be regulated by moving the GLUT4 in and out of the membrane.


4. Processing of Eukaryotic mRNA transcripts Once transcription gets started, what does it take to get a functioning eukaryotic mRNA? All necessary details are included here and on handout, but splicing was discussed last term and will be covered only briefly in class.

A. Caps and poly A -- See handout 12A.

Most eukaryotic transcripts that will be used as mRNA must be modified on both ends (as well as spliced) before they can be transported to the cytoplasm and used for translation. A "cap" is usually added to the 5' end and a "poly A tail" to the 3' end. The steps involved are shown on handout 12A. (Numbers below match steps on handout.)

(1) Beginning of transcription.

uma. The start of transcription is usually indicated by a bent arrow.

b. The boxed areas of the DNA = exons plain DNA between them = intron.

uma. A modified G is added to the 5' end of the transcript shortly after transcription begins, while the transcript is still being made.

b. The G is added "backwards" so there is a 5' to 5' connection. (For the curious: The structure of the cap and how it is connected to the transcript is shown in your texts see fig. Becker 21-18.)

c. The cap is represented on the handout as a filled circle.

(3) Transcription continues to or slightly beyond the end of the gene or transcription unit.

uma. There may be no fixed stop for transcription in eukaryotes (for production of most mRNA) the addition of poly A (see below) may determine the exact 3' end of the transcript.

b. Most but not all eukaryote mRNA's contain poly A.

c. Reminder: in eukaryotes production of rRNA & tRNA are carried out by different RNA polymerases which have somewhat different properties. these RNA's do not have poly A. (For details see texts.)

uma. A poly A tail -- a string of A's a few hundred long -- is added to the 3' end of the RNA.

b. Growth of AA. is 5' to 3' using ATP, enzyme, and splitting off pyrophosphate as usual. No template is used.

c. The sequence AAUAAA is the signal for the appropriate enzyme to cut the transcript a bit downstream and add the string of A's. (Downstream = in the 3' direction on the mRNA or sense strand.)

d. Note that the A's on the 3' end and the G of the cap are not encoded in the template DNA.

e. On the handout cleavage of transcript = step 4 addition of poly A = step 5. These two steps may occur simultaneously.

(6) Set up for Splicing. Nothing has happened to the RNA in step 6 except that it has been labeled to indicate exons and introns (so we can explain splicing).

uma. By the time the transcript is released from the DNA it already has a cap on the 5' end and a poly A tail on the 3' end. This RNA -- modified on both ends but not spliced -- is usually called the primary transcript or pre-mRNA.

b. Some texts refer to unmodified RNA as the primary transcript, but such a state doesn't really exist, since the pre-mRNA is modified before it is released from the DNA.

c. The RNA is now ready for splicing (steps 7-9 on handout). See also Becker fig. 21-22 (21-23) or Sadava fig. 14.10.

Note: Splicing may begin prior to polyA addition see below.

B. Splicing of Eukaryotic mRNA -- Review from last term

1. A typical picture of a gene with introns and exons (for reference) . The picture below shows a section of the sense strand of the DNA that includes a gene with 3 exons and 2 introns. (The picture on the handout has 2 exons and one intron.) Conventions:

The picture on the handout shows double stranded DNA, but genes are often shown as in the picture below, with only the sense strand actually drawn in.

Transcription would start at the 5' (left) end of exon 1 and go to the right.

Important features of intron: Branch point, 5' splice site (also called the donor site) and 3' splice site (also called acceptor site). These are shown for the first intron only. (See also fig. 21-22 (21-23) in Becker or 14.11 in Sadava.)

Also note that the region to the left of exon 1 is NOT an intron -- it is not part of the gene. It is part of a spacer in between this gene and the previous one.


2. Splicing Details -- See bottom of handout 12A.

(1). Splicing out of each intron occurs in 3 steps (see handout 12A, steps 7-9). At each step the parts of the transcript are held in place by the spliceosome. The steps are repeated for splicing of each intron -- many RNA's have many introns. Details are below.

(2) Terminologia The splice junction at the 5' end of an intron is called the 5' or donor site the splice junction at the 3' end of an intron is called the 3' or acceptor site.

b. Steps of splicing. See handout 12A at bottom. See also Becker fig. 21-24 or Sadava 14.11 (14.10). All the steps are catalyzed by the spliceosome. Steps on handout are as follows:

(7) RNA transcript forms loop for removal of intron.

(8). Cut at 5' end of intron

(uma). 5' splice site (donor site) is cleaved

(b). loose end of intron (5' end of intron) attaches to branch point in the middle of the intron, forming lariat-shaped structure.

(uma). The 5' donor site attaches to the 3' acceptor site, joining the two exons and releasing the intron in the form of lariat.

(b). The lariat will be degraded and the nucleotides will be recycled.

(c). The RNA containing the exons (without the introns) will be transported to the cytoplasm and translated.

c. N.B: Prokaryotes do not have introns and lack the machinery needed to remove them.

3. Do exons and translated regions coincide? See diagram at bottom of 12A. Review from last term:

uma. Exons = sections of genes that are represented in the mRNA.

Exons include untranslated 5' and 3' regions as well as the translated regions.

Exons and amino acid coding regions do not coincide, because there are extra untranslated sections in the mRNA.

Exons and mRNA regions do coincide.

b. Exons are not = protein coding sequences , as some texts imply. (The diagram in Sadava fig. 14.7 (14.5) is incorrect.) Exons include protein coding sequences, but also include sequences (UTRs) that are represented in the mRNA but do not code for amino acids. (The Sadava diagrams have no UTRs.)

(1). Leaders. At the 5' end of the mRNA, there is a 5' untranslated region (UTR) or leader before translation begins (before the first AUG). The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 5' UTR is encoded in one or more exons.

( 2). Trailers. At the 3' end of the mRNA, there is a 3' UTR or trailer that is after the stop codon. The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 3'UTR is encoded in one or more exons.


V. Regulation at Splicing -- Results of Alternative Processing

A. There are two ways to get a collection of similar proteins

1. Gene families -- multiple, similar genes exist due to duplication and divergence of genes. Example: the globin genes constitute a family. Different family members code for myoglobin, beta-chains, alpha-chains, delta-chains, etc. Other gene families include the GLUT, SGLT, and IF families.

2. Alternative splicing or processing (See below) -- only one gene, but primary transcript spliced in more than one way. Examples: fibronectin, soluble and membrane bound antibodies.

B. The Genome vs the Proteome -- You can get many different mRNAs from a single gene by the processes listed below. Therefore the number of possible proteins (the proteome) greatly exceeds the number of possible genes (the genome).

1. Starting transcription at different points

2. Ending transcription (adding poly A) at different points

3. Splicing out different sections (exons as well as introns) of the primary transcript -- alternative splicing.

C. An example of alternative processing -- Production of antibody (immunogloblin) in B cells. See handout 12B and Becker fig. 23-31 -- how to get either soluble or membrane-bound antibody from alternative processing of the same transcript. (See Sadava fig. 16.22 (14.21) for another example.)

1. Antibody can be membrane bound or secreted. Fate of antibody depends on whether peptide has a hydrophobic sequence near one end or not. Hydrophobic sequence can anchor the protein in the membrane -- becomes a transmembrane (TM) sequence.

uma. If Ab has a potential TM sequence : Hydrophobic section locks into membrane of ER as protein is made. Vesicle buds off ER and protein travels through cell as part of vesicle. Protein remains in membrane of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab stays in membrane.

b. If Ab has no TM : Ab enters lumen of ER as protein is made. Vesicle buds off ER, and protein ends up in lumen of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab is secreted.

2. Gene has two alternative polyA addition sites. Which one is used determines final location of protein.

uma. Opção 1: If poly A addition site #1 (at start of 'intron 4') is used, protein contains no hydrophobic potential TM sequence, and protein is secreted. (Note: 'intron 4' is spliced out in option 2, but the beginning of 'intron 4' is included in the mRNA in option 1.)

b. Opção 2: If other poly A addition site (at end of exon 6) is used, protein contains hydrophobic sequence encoded by exons 5 & 6, and protein stays in plasma membrane.

3. mRNA can be spliced and/or poly A added in two alternate ways. Location of protein (antibody) depends on whether splicing of intron 4 or poly A addition happens first. Think of it as a competition. Qualquer

uma. Poly A adding enzymes get there before the spliceosome. In that case, poly A is added to site #1 near end of exon 4, and rest of intron 4 (and rest of gene) is never transcribed, or

b. The spliceosome gets there first . In that case, Intron 4 is transcribed and spliced out before poly A can be added. (In this case, poly A is added at the end of exon 6 instead.)

4. Why are 2 forms of antibody needed?

uma. Membrane-bound form of antibody: Serves as receptor for antigen = trap to detect when antigen is present. Binding of antigen (ligand) to antibody (receptor) serves as trigger to start secreting antibody.

b. Secreted (soluble) form: Acts as effector -- carries out major function of immune system -- binds to soluble antigen in body fluids and triggers destruction of antigen in multiple ways.

To review regulation & alternative splicing, try problems 4-13 & 4-14.

VI. Regulation at translation.

A. How to control rate of translation? In principle:

1. Can regulate half life of mRNA (control rate of degradation).

uma. In prokaryotes most mRNA's have a short 1/2 life in eukaryotes this is not necessarily so.

b. Different eukaryotic mRNA's have very different half lives.

2. Can regulate rate of initiation of translation (control how effectively translation starts).

B. Some Famous Examples of Regulation of Translation. (The principles are important we will not go into the details.)

  • Function: Ferritin is an intracellular protein that stores excess iron. (Transferrin & its receptor were discussed in the section on RME.)
  • Overall: Regulatory system is similar to induction/repression, but it is translation, not transcription, that is affected by the regulatory protein.
  • This is another example of coordinate control. There is one trans-acting factor here (regulatory protein), but both mRNA's have the same cis acting sequence.
  • See Becker, figs. 23-33 & 23-34 if you are curious about the details.

*A question to think about: Regulatory protein binds to mRNA for protein A at 5' end (blocking initiation) and to mRNA for protein B at 3' end (blocking degradation). Given the information above, which is protein A, and which is protein B? Which one is ferritin and which one is the transferrin receptor? You can check your answer in Becker or using this diagram.

  • In the absence of heme, inhibition occurs, and translation is blocked. No globin produced.
  • Heme blocks the inhibition. Therefore, in the presence of heme translation proceeds. Heme relieves the block in translation, and globin is made.

2. Use of a regulatory RNA -- RNA interference (RNAi)

uma. Trans acting factors can be RNA . Not all regulatory factors are protein -- some are short RNA's. (These are usually derived from double stranded RNA -- See Becker figs. 23-35 & 23-36.)

b. How does a short RNA affect translation?

(1). Inhibition (usual case): Small RNA binds to mRNA → Formation of double stranded RNA. This triggers degradation &/or inhibition of translation of the mRNA.

(2) Stimulation: Some recent cases have been discovered in which small RNA binds to mRNA and 'up regulates' translation. Mechanism so far unknown.

c. Use in Regulation: Cells naturally produce micro-RNA's that bind to mRNA's and regulate translation as above. The use of short regulatory RNA's to block translation appears to be important during regulation of development. (See Becker 23-36.)

d. Use in the Lab as a tool: Called RNAi = RNA interference. The use of artificially added short double stranded (ds) RNA to block transcription * /translation and turn genes off is very common. (See Becker 23-35.) Enzymes of cell convert added ds RNA into short single stranded RNA that interferes with translation and/or transcription* as in b. Same effect as adding antisense RNA (but works better).

* We have concentrated on effects of RNAi on translation. However, some short RNAs inhibit transcription by affecting the state of chromatin -- they stimulate methylation of the histones and/or DNA.

VII. ER -- How does Co-translational Import Work?

A. Signal hypothesis -- How ribosomes get to the ER & Protein enters ER -- See handout 12C. Steps listed below refer to handout. See Becker fig. 22-16 or Sadava fig. 14.21 (12.16).

  • Role: temporarily blocks translation ferries nascent protein to ER.
  • Structure: SRP contains proteins + RNA = Large particle containing both ribonucleic acid & protein like a ribosome or spliceosome .
  • Helps attach ribosome to ER, so growing chain can enter pore (translocon) in ER.

3. How does Growing Chain enter ER? Takes two steps (3 & 4)

uma . ER has SRP receptor . Receptor is also called docking protein. SRP binds to SRP receptor/docking protein, not directly to pore. (Step 3.)

b. ER has Translocon (gated pore or channel through membrane) which allows growing chain to pass through membrane as chain is made. Pore is closed until ribosome with growing chain gets into position.

Note on terminology: The term "translocon" is used in (at least) 2 different ways. Sometimes it is used to mean only the channel itself, and sometimes it is used to mean the whole complex of proteins required for translocation of proteins across the membrane -- the channel, SRP receptor, etc. It should be clear from context which usage is meant at any one time.

c . Ribosome/translocon complex formation occurs. (step 4 = complex step involving several events)

  • SRP is released, recycles -- GTP split
  • Ribosome binds to pore/translocon
  • Translocon opens & peptide enters (as loop).
  • Ribosome resumes translation.

d. Role of Middleman. Middleman needed for entry into ER through translocon or entry into nucleus through nuclear pores. Processes probably similar. In each case there is a protein system with three components -- Protein with LS (NLS or SP) binds to "middle man" or "ferry proteins" (importins or SRP) which bind to pore. Additional proteins (that we will ignore) are required as well, and GTP is used to drive transport in both cases. See Becker fig. 18-30 for a model.

*A middle man protein is required to enter or exit the nucleus, but different ones are used in for entry vs exit. Exportin is needed to get out of the nucleus, while importin is needed to get in.

** This is how solúvel nuclear proteins are imported into the nucleus. Integral (transmembrane) proteins of the nuclear membrane (nuclear envelope) are probably made on the ER, and slide laterally into the outer & inner nuclear membranes (continuous with the ER). Once in place, TM proteins are anchored by binding to lamins or other internal nuclear proteins.

4. How does a new protein end up in the lumen?

Now try problem 3-13, especially part D. (If some of the parts are not obvious, wait until later.)

B. How do proteins cross or enter the ER membrane? (See handout 12D and/or fig. 22-17 of Becker)

1 . How proteins enter/pass through the membrane -- important points

uma. SP probably forms loop not arrow. Loop enters channel (translocon) in membrane. SP loop is probably what opens (gates) the channel on the cytoplasmic side.

b. Protein enters as it is made. In humans, growing protein chains usually enter the ER as the chains are synthesized (co-translational import).

Note: In unicellular organisms, soluble proteins destined for the ER lumen often enter the ER after they are finished (post-translational import). Post translational import into the ER will be ignored here, but is covered at length in cell biology.

c . How do transmembrane proteins get anchored in the membrane? A hydrophobic sequence may trigger opening of the pore sideways, so protein slides out of pore, laterally, into lipid bilayer. These hydrophobic sequences are usually called 'stop-transfer' sequences and/or 'anchor' sequences.

d. Where will protein end up? Protein can go all the way through the membrane and end up as a soluble protein in the lumen (as in example above, on 12B) ou protein can go part way through and end up as a transmembrane protein. Depends on sequence of protein.

2 . Types of Proteins that can result (see handout 12D)

uma. Soluble protein in lumen . Happens if protein passes all the way through the membrane and SP (on amino end) is removed, as above.

b. Integral membrane protein anchored in membrane by SP with no cytoplasmic domain. This happens if SP is on the amino end and is not removed.

c. Single Pass transmembrane protein -- get one of 2 possibilities:

(1). Type 1: Amino end is on lumen side of membrane (on E side) Carboxyl end is in cytoplasm (on P side of membrane)
One way this could happen: If SP is on amino end, and SP removed, and there is a hydrophobic sequence (acting as a stop-transfer or anchor sequence) in the middle of the peptide.

(2) Type 2: Carboxyl end is on lumen side of membrane (on E side) Amino end is in cytoplasm (on P side)
One way this could happen: If SP is in the middle, not on amino end. SP in this case is not removed -- it becomes the transmembrane domain of the protein. (SP doubles as stop-transfer or anchor sequence.)

d. Multipass transmembrane protein. (Requires one SP and several hydrophobic (start/stop) sequences.

(1). Hydrophobic sequences can stop the process (of moving through pore) and anchor protein in membrane, as explained above.

(2) Hydrophobic sequence s in the middle of the peptide can restart looping → multipass protein. These are usually called "start-transfer" sequences (see 4).

(3). 'Start-transfer' and 'stop-transfer' sequences are probably equivalent. Role depends on where in protein they occur. (Both start- and stop-transfer sequences are also called 'topogenic sequences' as they determine the topology of the finished peptide.)

(4) A sequence that starts or restarts passage of a protein through the translocon is usually called a 'start transfer sequence' even if it also doubles as a stop or anchor in the membrane.

e. Lipid Anchored Proteins (FYI): Proteins to be anchored to lipids on the lado de fora of the plasma membrane are generally made as follows: Protein is made on RER and inserted into the ER membrane. After the protein reaches the plasma membrane, the extracellular domain is detached from the rest of the protein and attached to lipid. (Proteins to be anchored to the plasma membrane on the dentro are made on cytoplasmic ribosomes.) See Becker if you are curious about the details.

By now you should be able to do problems 3-1 to 3-3 & 3-4, A-B.

Next time -- What else happens in/on the ER? What happens in the Golgi?


Transcriptional networks in the nitrate response of Arabidopsis thaliana

Systems analyses allowed for the identification of TGA1/TGA4 and NAC4, important transcription factors controlling root system architecture in response to nitrate.

Nitrate controls rapid changes in transcript levels by post-translational activation of transcription factors including NLP7 and bZIP1.

Nitrate promotes nuclear retention of NLP7 to regulate gene transcriptional changes.

Nitrate induces rapid binding and transient interaction of bZIP1 and its targets.

Root system architecture modification in response to nitrate depends partly on transcriptional changes mediated by a network of nitrate-dependent transcription factors.

Nitrogen is an essential macronutrient for plants and its availability is a key determinant of plant growth and development and crop yield. Besides their nutritional role, N nutrients and metabolites are signals that activate signaling pathways that modulate many plant processes. Because the most abundant inorganic N source for plants in agronomic soils is nitrate, much of the work to understand plant N-signaling has focused on this nutrient. Over the last years, several studies defined a comprehensive catalog of nitrate-responsive genes, involved in nitrate transport, metabolism and a variety of other processes. Despite significant progress in recent years, primarily using Arabidopsis thaliana as a model system, the molecular mechanisms by which nitrate elicits changes in transcript abundance are still not fully understood. Here we highlight recent advancements in identifying key transcription factors and transcriptional mechanisms that orchestrate the gene expression response to changes in nitrate availability in A. thaliana.


Assista o vídeo: Zastosowanie technologii odczytywania pełnych genomów ludzkich w diagnostyce medycznej - Genomed (Dezembro 2021).