Em formação

9.3: Cromatografia de troca iônica - Biologia


Na cromatografia de troca iônica, o suporte consiste em minúsculas contas às quais estão fixados produtos químicos que possuem uma carga. Cada molécula carregada possui um contra-íon. A figura mostra as contas (azuis) com grupos carregados negativamente (vermelho) anexados. Neste exemplo, o contra-íon é o sódio, que é carregado positivamente. Os grupos carregados negativamente são incapazes de deixar os grânulos, devido à sua ligação covalente, mas os contra-íons podem ser "trocados" por moléculas da mesma carga. Assim, uma coluna de troca catiônica terá contra-íons carregados positivamente e carregados positivamente os compostos presentes em uma mistura passada pela coluna serão trocados com os contra-íons e "grudados" nos grupos carregados negativamente nas contas. As moléculas da amostra que são neutras ou com carga negativa passarão rapidamente pela coluna. Por outro lado, na cromatografia de troca aniônica, os grupos químicos ligados aos grânulos são carregados positivamente e os contra-íons são carregados negativamente. As moléculas na amostra com carga negativa irão “grudar” e outras moléculas passarão rapidamente. Para remover as moléculas “presas” a uma coluna, basta adicionar uma alta concentração dos contra-íons apropriados para deslocá-los e liberá-los . Este método permite a recuperação de todos os componentes da mistura que compartilham a mesma carga.



Fig. 1. Carga de proteína vs. pH. A estabilidade da proteína e a ligação ao meio de troca iônica variam com a carga total de proteína, que depende do pH.

A cromatografia de troca iônica é comumente usada para separar moléculas biológicas carregadas, como proteínas, peptídeos, aminoácidos ou nucleotídeos. Os aminoácidos que constituem as proteínas são compostos zwitteriônicos que contêm grupos químicos carregados positiva e negativamente. Dependendo do pH de seu ambiente, as proteínas podem carregar um carga positiva líquida, uma carga negativa líquida, ou sem cobrança. O pH no qual uma molécula não tem carga líquida é chamado de ponto de isolação eletrica, ou pI.


Fig. 2. Seleção de resina de troca iônica.

O valor pI pode ser calculado com base na sequência primária da molécula. A escolha do pH do tampão determina então a carga líquida da proteína de interesse.

Em um tampão com um pH maior que o pI da proteína de interesse, a proteína carregará uma carga negativa líquida, portanto, uma carga positiva troca de ânions resina é escolhida para capturar essa proteína.

Em um tampão com um pH inferior ao pI da proteína de interesse, a proteína carregará uma carga líquida positiva, portanto, uma carga negativa troca catiônica resina é escolhida.

Quando uma coluna de cromatografia de troca iônica é carregada com uma amostra em um determinado pH, todas as proteínas que estão apropriadamente carregadas se ligarão à resina. Por exemplo, se uma resina de troca aniônica for escolhida, todas as proteínas que estão carregadas negativamente no pH do tampão de carga se ligarão à resina de coluna carregada positivamente. Uma boa regra para escolher um pH tampão é a seguinte:

  • Trocador de ânions & mdash 0,5 & ndash1,5 unidades de pH maior do que o pI da proteína de interesse
  • Trocador de cátions & mdash 0,5 & ndash1,5 unidades de pH Menor que o pI da proteína de interesse

Medicina Biológica

6.07.2.3 Uma plataforma mAb a jusante amplamente aplicável

CEX e AEX em seus sabores tradicionais não atendem a essa necessidade. Uma modificação importante feita a este respeito foi o uso de cromatografia multimodal como parte da plataforma mAb a jusante. A cromatografia multimodal envolve a incorporação de uma porção hidrofóbica na estrutura de ligantes para AEX ou CEX. 28 A hidrofobicidade aumentada da resina cromatográfica agora permite melhor depuração de HMW nos modos CEX e AEX, que são indiscutivelmente mais adequados para o processamento de mAb. Além disso, ambos os modos de cromatografia também são capazes de HCP e depuração de DNA. Os mAbs diferem em termos de sua própria hidrofobicidade. Como resultado, o processo a jusante da plataforma para mAbs em KBI é definido como AEX (com hidrofobicidade da resina que pode variar de Q Sepharose FF ou Capto Q para Fractogel SO3 para resinas cromatográficas multimodais, como Captoadhere e Nuvia cPrime). Esta modulação da hidrofobicidade permite que as condições ideais sejam adaptadas para cada mAb. Da mesma forma, a etapa de ligação e eluição de CEX também é operada em uma gama de hidrofobicidades que variam de leve a moderada, dependendo da resina selecionada. Embora esta abordagem implique algum grau de trabalho experimental, uma abordagem preferida usando cromatografia multimodal para AEX e CEX é empregada como a plataforma primária com recurso a fases estacionárias menos hidrofóbicas caso o mAb exija. Esta abordagem é ilustrada em Fig. 5 e tem sido útil em termos de sua amplitude de cobertura de uma ampla gama de construções de mAb, linhas de células e processos de cultura de células em KBI.

Fig. 5. Abordagem da KBI Biopharma para processamento downstream de mAb para fabricação de FIH.

Fig. 6 mostra os perfis de liberação para agregados HMW e HCPs por meio deste processo de plataforma para uma série de mAbs. Como pode ser visto na figura, níveis agregados de HMW de & lt 1% e níveis baixos de HCP & lt 50 ppm são sempre observados usando esta plataforma. A capacidade de cobrir uma ampla gama de construções de mAb é fundamental, especialmente para uma organização CDMO como a KBI.

Fig. 6. Desempenho da abordagem DSP da plataforma KBI Biopharma para vários mAbs. (A) autorização HMW e (B) autorização HCP.


Purificação de bacteriófagos usando cromatografia de troca aniônica

Na pesquisa e terapia de bacteriófagos, a maioria das aplicações pede suspensões de fagos altamente purificadas. A técnica padrão para isso é a ultracentrifugação usando gradientes de cloreto de césio. Esta técnica é complicada, elaborada e cara. Além disso, é inadequado para a purificação de grandes quantidades de suspensões de fago. O protocolo descrito aqui, usa cromatografia de troca aniônica para ligar os fagos a uma fase estacionária. Isso é feito usando um sistema FLPC, combinado com monólitos Convective Interaction Media (CIM ®). Em seguida, a coluna é lavada para remover as impurezas do disco CIM ®. Usando uma solução tampão com uma alta força iônica, os fagos são subsequentemente eluídos da coluna e coletados. Desta forma, os fagos podem ser eficientemente purificados e concentrados. Este protocolo pode ser usado para determinar os tampões ideais, a química da fase estacionária e as condições de eluição, bem como a capacidade máxima e a recuperação das colunas.

Palavras-chave: Concentração de bacteriófago CsCl Cromatografia de troca iônica Purificação.


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Determinação de sódio e potássio, empregando separação por troca iônica

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Seleção de resina de cromatografia de troca iônica

As resinas de cromatografia de troca iônica são compostas de grupos funcionais carregados positivamente ou negativamente que são covalentemente ligados a uma matriz sólida. Matrizes comuns são celulose, agarose, polimetacrilato, poliestireno e poliacrilamida. As últimas três matrizes permitem taxas de fluxo mais altas.

Vários fatores informam a escolha da resina:

Decidindo entre um trocador de ânions e um trocador de cátions

Para muitos fluxos de trabalho de purificação de proteínas, o dobramento e a estabilidade das proteínas são uma preocupação. Nesses cenários, a seleção de um trocador de ânions ou cátions depende da estabilidade da proteína de interesse.

Algumas proteínas são estáveis ​​acima e abaixo de seu pI. Essas proteínas podem ser purificadas com um trocador de ânions ou cátions. Outras proteínas são estáveis ​​apenas acima ou abaixo de seu pI. Para essas proteínas, a estabilidade dita a escolha da resina se, por exemplo, uma proteína é estável apenas acima de seu pI, uma resina de troca aniônica deve ser escolhida. Quando a estabilidade da proteína não é motivo de preocupação, um trocador de ânions ou cátions pode ser usado.

Trocadores de íons fracos vs. fortes

As resinas de troca iônica vêm em dois tipos: fortes e fracas.

O número de cobranças em um trocador de íons forte permanece constante independentemente do pH do tampão. Esses tipos de resinas retêm sua seletividade e capacidade em uma ampla faixa de pH. Exemplos de trocadores de íons fortes são resinas de amônio quaternário (Q), sulfonato (S) e sulfopropil (SP).

Trocadores de íons fracos, em contraste, exibe função dependente do pH e, portanto, oferece desempenho ideal em apenas uma pequena faixa de pH. Quando o pH do tampão não corresponde mais à constante de dissociação ácida (pKa) do grupo funcional da resina, essas resinas sofrem perda significativa de capacidade. Trocadores de ânions fracos funcionam mal acima de um pH de 9 e trocadores de cátions fracos começam a perder sua ionização abaixo de pH 6. Ao trabalhar com resinas de troca de íons fracas, como resinas de dietilaminoetil (DEAE) ou carboximetil (CM), é importante trabalhar dentro do faixa de pH de trabalho fornecida pelo fornecedor.

Apoio, suporte DEAE Q alto CM S alto
Tipo de troca Ânion fraco Ânion forte Cátion fraco Cátion forte
Grupo funcional -N + (C2H5)2 -N + (CH3)3 - COO - -TÃO 3 -
Faixa de pH * 5 & ​​ndash9 0 & ndash14 5 & ​​ndash9 0 & ndash14

* Verifique as instruções do fabricante e rsquos para a faixa de pH de cada resina individual. As proteínas de interesse podem não ser estáveis ​​em toda a faixa de pH.

Os trocadores de íons fortes são frequentemente resinas preferidas para muitas aplicações porque seu desempenho não é afetado pelo pH. No entanto, trocadores de íons fracos podem ser ferramentas de separação poderosas nos casos em que os trocadores de íons fortes falham porque as seletividades de trocadores de íons fortes e fracos costumam ser diferentes.

Forma Iônica de Resina IEX

A forma iônica de um suporte refere-se ao contra-íon que é adsorvido aos grupos funcionais da resina. Este íon pode ser alterado trocando o buffer de equilíbrio da coluna. Contra-íons comuns para trocadores de ânions e cátions são Na + e Cl -, respectivamente.

A força da interação com uma determinada resina varia para diferentes contra-íons. Quanto mais baixa for a seletividade de um contra-íon para o suporte, mais facilmente ele pode ser trocado por outro íon de carga semelhante (por exemplo, a proteína de interesse). Da mesma forma, o tampão de eluição contendo um contra-íon com uma seletividade relativamente menor para o suporte irá deslocar as proteínas da resina da coluna menos prontamente durante a eluição. Em alguns casos, essa diferença pode ser explorada, e contra-íons como Li +, Br - e SO4 2- são frequentemente usados ​​para melhorar a seletividade da resina.

Tamanho de partícula de resina

O tamanho das partículas de resina refere-se ao tamanho do suporte sólido de resina. O tamanho da partícula não afeta a seletividade da resina, mas afeta a resolução.

Fig. 6. Relação entre tamanho de partícula de resina, pressão e resolução.

Partículas menores fornecem resolução mais alta, mas normalmente também requerem taxas de fluxo mais baixas. Meios de alta resolução são comumente usados ​​para trabalhos analíticos e em pequena escala, bem como para as etapas finais de polimento da cromatografia preparativa. Amostras muito viscosas, como clareadas E. coli lisados ​​ou amostras contendo glicerol muitas vezes não podem ser separados usando resinas IEX de pequenas partículas devido ao aumento da contrapressão das resinas de pequenas partículas, que pode exceder o limite de pressão operacional da coluna e rsquos.

Partículas maiores permitem taxas de fluxo mais altas, mas produzem resolução mais baixa. Um método que produz picos nítidos e distintos usando uma resina IEX de partículas pequenas produzirá picos mais amplos e menos definidos quando uma resina de partículas maiores é usada. As resinas IEX de partículas grandes são uma ótima escolha para trabalhos preparativos e em grande escala. Tamanhos de partícula maiores também são a melhor escolha quando as amostras são viscosas, como quando IEX é usado como uma primeira etapa em um fluxo de trabalho de purificação de proteínas.

Quociente de vazão

Quociente de vazão refere-se a quão rápido o buffer está sendo passado sobre uma resina. A taxa de fluxo, portanto, determina a quantidade de tempo em que as proteínas podem interagir com a resina da coluna, que é chamada de tempo de residência de uma coluna particular em uma determinada taxa de fluxo. Ao contrário do tamanho da partícula, a taxa de fluxo afeta a resolução e a capacidade: tempos de residência mais longos aumentam a capacidade e a resolução de uma resina.

Fig. 7. Efeito da taxa de fluxo na resolução IEX. Separação de uma amostra de 5 ml de mioglobina (pico 1), ribonuclease A (pico 2) e citocromo c (pico 3) em uma coluna de troca catiônica Macro-Prep & reg High Q de 1 x 13 cm (8,7 ml).

As taxas de fluxo não são limitadas apenas pela perda de resolução e capacidade em taxas de fluxo mais altas, mas também pela própria resina. Conforme as taxas de fluxo aumentam, a pressão na resina aumenta. Se a contrapressão for muito alta, ela pode esmagar a resina da coluna. Assim, os fabricantes fornecem um limite de pressão para todas as suas resinas.

Geralmente, a taxa de fluxo mais rápida que ainda renderiza a capacidade e resolução desejadas é escolhida. Embora taxas de fluxo mais lentas possam fornecer resolução e capacidade ainda melhores, isso geralmente ocorre às custas da atividade da proteína, já que muitas proteínas perdem atividade com o tempo nas condições do sistema de cromatografia.

Capacidade de ligação dinâmica da resina

A capacidade de ligação dinâmica de uma resina refere-se à quantidade de proteína que a resina pode se ligar a uma determinada taxa de fluxo e é geralmente relatada como mg / ml de proteína ligada a uma determinada taxa de fluxo. Este valor varia de resina para resina e pode ser importante quando taxas de fluxo rápidas são necessárias para manter a atividade da proteína.


Cromatografia de troca iônica de complexo de borato com detecção fluorimétrica para determinação de etilenodiamina de sacarídeo

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Materiais e métodos

Aparelho

O sistema Hitachi (Tóquio, Japão) L-8500A é distribuído pela Sciencetec (Les Ulis, França). As amostras foram colocadas em frascos autovedantes na prateleira do amostrador automático (60 posições) mantida a 4 ± 2 ° C. Depois de enxaguar a agulha, um volume da amostra foi aspirado através do loop de amostra. Um volume preciso (20 μL medido com uma seringa de precisão de 0,5 mL) foi injetado através da válvula de injeção na coluna analítica. A coluna cromatográfica era uma matriz de um componente orgânico de alta massa molecular, consistindo de poliestireno reticulado por divinilbenzeno, com sulfona (SO3 -) grupos como sites de troca ativos. A coluna [60 mm x 4,6 mm (i.d.)] foi empacotada com partículas de 3 μm e equipada com uma coluna de guarda de 40 mm x 4,6 mm (d.i.) (filtro de amônia). Os AAs foram separados com quatro tampões de citrato (Tabela 1). O programa de eluição usado (Tabela 2) foi ligeiramente modificado em relação ao definido pela Hitachi para melhorar a separação de AAs específicos. A separação de Asn, Glu e Gln foi melhorada diminuindo a temperatura da coluna em 5 ° C em 9 min e em 4 ° C em 20 min, a de Gly, Ala, citrulina (Cit) e ácido α-aminobutírico (α -ABA) iniciando o fluxo aumentado do tampão 2 mais cedo (em 31,5 min em vez de 33,5 min), e o de Val iniciando a etapa de tampão 100% 2 mais tarde (em 44,1 min em vez de 43,0 min). Uma separação melhorada de Trp e etanolamina foi obtida aumentando a concentração de álcool benzílico no tampão 3. A separação correta de AAs básicos foi obtida iniciando o fluxo do tampão 4 mais cedo (em 74,1 min em vez de 77,0 min), adicionando tampão a 10% 2 a 79 min, e diminuindo a temperatura da coluna em 10 ° C a 86 min.

A detecção foi por espectrofotometria a 570 e 440 nm com a reação de ninidrina.

Antes da próxima injeção de amostra, a coluna foi equilibrada com 100% tampão 1 por 19 min (tempo total de execução 149 min).

Buffers

Todos os buffers podem ser adquiridos (Mitsubishi, Japão) como um pacote completo ou preparados. Preparamos os tampões com água grau HPLC gerada com um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Molsheim, França). Os produtos químicos e solventes eram de qualidade analítica. Citrato de trilítio tetra-hidratado, cloreto de lítio, ácido cítrico mono-hidratado, hidróxido de lítio mono-hidratado e álcool benzílico foram adquiridos na Merck (Darmstadt, Alemanha). O etanol puro foi fornecido pela Farmitalia Carlo Erba (Milano, Itália), o tiodiglicol foi adquirido da Prolabo (Paris, França) e o ácido caprílico da Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, França). Os produtos químicos foram pesados ​​com precisão para que a medição do pH não fosse necessária. Cada tampão foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (Millipore) antes do uso e mantido sob nitrogênio no aparelho. Ao longo do programa de eluição, a taxa de fluxo para as soluções tampão foi de 0,35 mL / min.

Reagente ninidrina

O reagente de ninidrina, fornecido pela Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japão), consistia em 1 L de solução de ninidrina (contendo ninidrina, borohidrato de sódio e éter monometílico de propilenoglicol) e 1 L de solução tampão (contendo dihidrato de acetato de lítio, acético glacial ácido e éter monometílico de propilenoglicol). Durante a execução da amostra, a bomba de entrega do reagente de ninidrina mistura automaticamente as duas soluções mantidas sob nitrogênio no aparelho. A taxa de fluxo para a solução de ninidrina foi de 0,30 mL / min.

Calibrador e preparação de amostra

Uma solução estoque de calibrador 100 μmol / L contendo 37 AAs fisiológicos foi preparada com soluções comerciais (Sigma-Aldrich). Gln (Sigma-Aldrich) foi adicionado na mesma concentração e acetilisina (Aclys Sigma-Aldrich) foi adicionada a 1000 μmol / L.

Avaliamos plasma humano agrupado de pacientes hospitalizados (ensaios de precisão intra-corrida e entre corridas), fluidos fisiológicos de várias origens, como plasma humano ou de rato, sobrenadante de homogenato de tecido de rato (comparação de regressão), soluções calibradoras comerciais (faixa de linearidade ) e plasma humano de voluntários saudáveis ​​(determinação do intervalo fisiológico no plasma). Além disso, a solução de controle de urina Bio-Rad (Ivry-sur-Seine, França) foi usada para medir as concentrações de AA na urina (ensaios de precisão intra-corrida e intra-corrida), especialmente a de 3-metil-histidina (3MH), um AA interessante para estudar em ambos os estados de desnutrição e hipercatabólico, visto que sua excreção urinária reflete o catabolismo miofibrilar no músculo( 16).

Nossos procedimentos estavam em conformidade com a Declaração de Helsinque de 1975 para seres humanos, conforme revisada em 1983. Os cuidados com os animais obedeceram às diretrizes de nossa instituição, dois de nós (CC-L. E LC) sendo oficialmente autorizados (no. 004963 e no. 005226 ) pelo Ministério da Agricultura e Florestas da França para a experimentação animal.

O sangue foi coletado em tubos heparinizados após um jejum de 5 horas para ratos, e no estado pós-absortivo para pacientes hospitalizados ou após um jejum noturno para 100 voluntários saudáveis ​​(36 ± 10 anos 41 homens, 59 mulheres). O plasma foi imediatamente separado por centrifugação a frio (4 ° C, 3500g), desproteinizado sem demora com ácido sulfossalicílico (40 g / L) e analisado ou armazenado a −80 ° C até a análise.

Tecidos de rato (fígado, músculos esqueléticos) foram rapidamente removidos no sacrifício, limpos, pesados ​​e congelados em nitrogênio líquido. As amostras de tecido foram homogeneizadas (4 ° C) em ácido tricloroacético a 10% (10 mL / g de tecido), contendo 0,5 mmol / L de EDTA, com um desregulador de tecido Ultra-Turrax T25 (Médi Sciences, Saint-Maur-des-Fossés, França). A fração solúvel em ácido foi separada por centrifugação a frio (4 ° C, 3500g) As concentrações de AA livre foram medidas no sobrenadante.

Antes da análise, o controle e as amostras foram diluídos (1: 1 por vol) em tampão 1 contendo 1000 μmol / L de Aclys como calibrador interno.

A precisão intra-corrida foi estudada realizando 10 execuções consecutivas do pool de plasma de pacientes hospitalizados e da solução de controle de urina Bio-Rad. Para ter uma ampla gama de valores para o plasma, três concentrações foram estudadas: baixo (L, pool de plasma diluído com tampão 1 1: 2 por vol), médio (M, pool de plasma) e alto (H, pool de plasma suplementado com o Solução calibradora AA fornecida pela Sigma 1: 1 por vol). A precisão intra-corrida dos tempos de retenção foi estudada por 10 injeções consecutivas do pool de plasma de concentração M e da solução de controle de urina.

Ensaios de precisão entre corridas foram realizados com a concentração de M do pool de plasma e a solução de controle de urina Bio-Rad medida em 10 séries diferentes. As séries foram definidas por novos procedimentos de calibração quando o reagente ninidrina e (ou) um ou mais tampões tiveram que ser trocados.

Uma comparação de regressão foi realizada analisando 77 fluidos fisiológicos diferentes [plasma humano ou de rato, sobrenadante de homogenato de tecido de rato (fígado e músculos esqueléticos)] com o Hitachi L-8500A e o Beckman 6300 (Palo Alto, CA), um amplamente utilizado sistema para análise de AA.

Os ensaios de linearidade e limite de detecção foram realizados por diluições em série das soluções de calibração em tampão 1. Uma solução de Gln foi diluída da mesma maneira. As concentrações estudadas variaram de 5 a 2500 μmol / L.

O carryover da amostra foi analisado conforme recomendado pela Sociedade Francesa de Biologia Clínica (17). Dois pools de plasma foram usados: AA nas concentrações L e H. Medimos a concentração inicial para cada AA em cada amostra (L1 e H1), então a concentração de H duas vezes (H2, H3) e, em seguida, concentração L duas vezes (L2, EU3) Esta sequência (H2, H3, EU2, EU3) foi testado seis vezes. Para cada AA, usamos o pareamento do aluno t-teste para comparar o valor médio obtido para L2 com aquele obtido para L1, e o valor médio de L3 com aquele de L2.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± DP.

Aluno emparelhado t-teste e regressão foram aplicados com o programa Deltasoft PCSM (Program Conversationnel de Statistiques pour les Sciences et le Marketing) (Grenoble-Meylan, França). As diferenças foram consideradas significativas quando P & lt0.05.

O teste de Kolmogorov ‐ Smirnov mostrou que as concentrações plasmáticas de AA em humanos estavam normalmente distribuídas, concordando com a literatura (18).


Conteúdo

A cromatografia iônica avançou com o acúmulo de conhecimento ao longo de muitos anos. A partir de 1947, Spedding e Powell usaram a cromatografia de troca iônica de deslocamento para a separação das terras raras. Além disso, eles mostraram a separação por troca iônica dos isótopos 14N e 15N da amônia. No início da década de 1950, Kraus e Nelson demonstraram o uso de muitos métodos analíticos para íons metálicos dependentes de sua separação de seus complexos de cloreto, fluoreto, nitrato ou sulfato por cromatografia de ânions. A detecção automática em linha foi introduzida progressivamente de 1960 a 1980, bem como novos métodos cromatográficos para separações de íons metálicos. Um método inovador de Small, Stevens e Bauman da Dow Chemical Co. desdobrou a criação da moderna cromatografia de íons. Ânions e cátions agora podem ser separados de forma eficiente por um sistema de detecção de condutividade suprimida. Em 1979, um método para cromatografia de ânions com detecção de condutividade não suprimida foi introduzido por Gjerde et al. Em seguida, em 1980, foi um método semelhante para cromatografia catiônica. [10]

Como resultado, um período de extrema competição começou dentro do mercado de IC, com suportes para detecção de condutividade suprimida e não suprimida. Esta competição levou ao rápido crescimento de novas formas e à rápida evolução do IC. [11] Um desafio que precisa ser superado no desenvolvimento futuro de CI é a preparação de colunas monolíticas de troca iônica altamente eficientes e superar esse desafio seria de grande importância para o desenvolvimento de CI. [12]

O boom da cromatografia de troca iônica começou principalmente entre 1935-1950 durante a Segunda Guerra Mundial e foi por meio do "projeto Manhattan" que os aplicativos e IC foram significativamente estendidos. A cromatografia de íons foi originalmente introduzida por dois pesquisadores ingleses, o agrícola Sir Thompson e o químico J T Way. Os trabalhos de Thompson e Way envolveram a ação de sais de fertilizantes solúveis em água, sulfato de amônio e cloreto de potássio. Esses sais não podiam ser extraídos facilmente do solo devido à chuva. Eles realizaram métodos iônicos para tratar argilas com os sais, resultando na extração de amônia além da liberação de cálcio. [13] [ fonte não confiável? ] Foi nos anos cinquenta e sessenta que os modelos teóricos foram desenvolvidos para IC para maior compreensão e não foi até os anos setenta que os detectores contínuos foram utilizados, pavimentando o caminho para o desenvolvimento da cromatografia de baixa pressão para a cromatografia de alto desempenho. Somente em 1975 a "cromatografia de íons" foi estabelecida como um nome em referência às técnicas, e foi posteriormente usada como um nome para fins de marketing. Hoje, IC é importante para investigar sistemas aquosos, como água potável. É um método popular para analisar elementos ou complexos aniônicos que ajudam a resolver problemas ambientalmente relevantes. Da mesma forma, também tem grande utilidade na indústria de semicondutores.

Por causa das abundantes colunas de separação, sistemas de eluição e detectores disponíveis, a cromatografia se tornou o principal método para análise de íons. [14]

Quando essa técnica foi desenvolvida inicialmente, ela era usada principalmente para tratamento de água. Desde 1935, a cromatografia de troca iônica rapidamente se manifestou em uma das técnicas mais alavancadas, com seus princípios sendo frequentemente aplicados à maioria dos campos da química, incluindo destilação, adsorção e filtração. [15]

A cromatografia de troca iônica separa as moléculas com base em seus respectivos grupos carregados. A cromatografia de troca iônica retém moléculas de analito na coluna com base nas interações coulômbicas (iônicas). A matriz da cromatografia de troca iônica consiste em íons carregados positiva e negativamente. [16] Essencialmente, as moléculas sofrem interações eletrostáticas com cargas opostas na matriz de fase estacionária. A fase estacionária consiste em uma matriz imóvel que contém grupos funcionais ionizáveis ​​carregados ou ligantes. [17] A superfície da fase estacionária exibe grupos funcionais iônicos (R-X) que interagem com íons analitos de carga oposta. Para atingir a eletroneutralidade, essas cargas inertes se acoplam a contra-íons trocáveis ​​na solução. As moléculas ionizáveis ​​que devem ser purificadas competem com esses contra-íons trocáveis ​​pela ligação às cargas imobilizadas na fase estacionária. Essas moléculas ionizáveis ​​são retidas ou eluídas com base em sua carga. Inicialmente, as moléculas que não se ligam ou se ligam fracamente à fase estacionária são as primeiras a serem eliminadas. Condições alteradas são necessárias para a eluição das moléculas que se ligam à fase estacionária. A concentração dos contra-íons trocáveis, que competem com as moléculas pela ligação, pode ser aumentada ou o pH pode ser alterado. Uma mudança no pH afeta a carga nas moléculas particulares e, portanto, altera a ligação. As moléculas então começam a eluir com base nas mudanças em suas cargas a partir dos ajustes. Além disso, esses ajustes podem ser usados ​​para liberar a proteína de interesse. Além disso, a concentração de contra-íons pode ser gradualmente variada para separar moléculas ionizadas. Este tipo de eluição é denominado eluição gradiente. Por outro lado, a eluição em etapas pode ser usada em que a concentração de contra-íons varia em uma etapa. [1] Este tipo de cromatografia é subdividido em cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica. As moléculas com carga positiva ligam-se às resinas de troca catiônica, enquanto as moléculas com carga negativa se ligam às resinas de troca aniônica. [18] O composto iônico que consiste nas espécies catiônicas M + e as espécies aniônicas B- pode ser retido pela fase estacionária.

A cromatografia de troca catiônica retém cátions carregados positivamente porque a fase estacionária exibe um grupo funcional carregado negativamente:

A cromatografia de troca aniônica retém os ânions usando um grupo funcional carregado positivamente:

Observe que a força iônica de C + ou A- na fase móvel pode ser ajustada para mudar a posição de equilíbrio, portanto, o tempo de retenção.

O cromatograma de íons mostra um cromatograma típico obtido com uma coluna de troca aniônica.

Antes que a cromatografia de troca iônica possa ser iniciada, ela deve ser equilibrada. A fase estacionária deve ser equilibrada com certos requisitos que dependem do experimento com o qual você está trabalhando. Uma vez equilibrados, os íons carregados na fase estacionária serão anexados aos seus íons trocáveis ​​carregados opostos. Íons trocáveis ​​como Cl- ou Na +. Em seguida, um tampão deve ser escolhido no qual a proteína desejada pode se ligar. Após o equilíbrio, a coluna precisa ser lavada. A fase de lavagem ajudará a eluir todas as impurezas que não se ligam à matriz, enquanto a proteína de interesse permanece ligada. Este tampão de amostra precisa ter o mesmo pH que o tampão usado para equilíbrio para ajudar a ligar as proteínas desejadas. Proteínas não carregadas serão eluídas para fora da coluna a uma velocidade semelhante ao tampão que flui através da coluna. Uma vez que a amostra foi carregada na coluna e a coluna foi lavada com o tampão para eluir todas as proteínas não desejadas, a eluição é realizada para eluir as proteínas desejadas que estão ligadas à matriz. As proteínas ligadas são eluídas utilizando um gradiente de concentração de sal linearmente crescente. Com o aumento da força iônica do tampão, os íons de sal irão competir com as proteínas desejadas para se ligar a grupos carregados na superfície do meio. Isso fará com que as proteínas desejadas sejam eluídas para fora da coluna. As proteínas que têm uma carga líquida baixa serão eluídas primeiro à medida que a concentração de sal aumenta, fazendo com que a força iônica aumente. Proteínas com carga líquida alta precisarão de uma força iônica maior para serem eluídas para fora da coluna. [16] É possível realizar cromatografia de troca iônica em massa, em camadas finas de meio, como placas de vidro ou plástico revestidas com uma camada da fase estacionária desejada, ou em colunas de cromatografia. A cromatografia em camada fina ou a cromatografia em coluna compartilham semelhanças no sentido de que ambas agem dentro dos mesmos princípios governantes; há troca constante e frequente de moléculas à medida que a fase móvel viaja ao longo da fase estacionária. Não é imperativo adicionar a amostra em volumes de minuto, pois as condições predeterminadas para a coluna de troca foram escolhidas de modo que haverá uma forte interação entre as fases móvel e estacionária. Além disso, o mecanismo do processo de eluição causará uma compartimentação das diferentes moléculas com base em suas respectivas características químicas. Esse fenômeno é devido a um aumento nas concentrações de sal no topo ou próximo ao topo da coluna, deslocando assim as moléculas naquela posição, enquanto as moléculas limitadas mais abaixo são liberadas em um ponto posterior, quando a maior concentração de sal atinge aquela área. Esses princípios são os motivos pelos quais a cromatografia de troca iônica é um excelente candidato para as etapas iniciais de cromatografia em um procedimento de purificação complexo, pois pode produzir rapidamente pequenos volumes de moléculas alvo, independentemente de um volume inicial maior. [2]

Comparatively simple devices are often used to apply counterions of increasing gradient to a chromatography column. Counterions such as copper (II) are chosen most often for effectively separating peptides and amino acids through complex formation. [19]

A simple device can be used to create a salt gradient. Elution buffer is consistently being drawn from the chamber into the mixing chamber, thereby altering its buffer concentration. Generally, the buffer placed into the chamber is usually of high initial concentration, whereas the buffer placed into the stirred chamber is usually of low concentration. As the high concentration buffer from the left chamber is mixed and drawn into the column, the buffer concentration of the stirred column gradually increase. Altering the shapes of the stirred chamber, as well as of the limit buffer, allows for the production of concave, linear, or convex gradients of counterion.

A multitude of different mediums are used for the stationary phase. Among the most common immobilized charged groups used are trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoethyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulpho (S), sulphomethyl (SM), sulphopropyl (SP), carboxy (C), and carboxymethyl (CM). [1]

Successful packing of the column is an important aspect of ion chromatography. Stability and efficiency of a final column depends on packing methods, solvent used, and factors that affect mechanical properties of the column. In contrast to early inefficient dry- packing methods, wet slurry packing, in which particles that are suspended in an appropriate solvent are delivered into a column under pressure, shows significant improvement. Three different approaches can be employed in performing wet slurry packing: the balanced density method (solvent’s density is about that of porous silica particles), the high viscosity method (a solvent of high viscosity is used), and the low viscosity slurry method (performed with low viscosity solvents). [20]

Polystyrene is used as a medium for ion- exchange. It is made from the polymerization of styrene with the use of divinylbenzene and benzoyl peroxide. Such exchangers form hydrophobic interactions with proteins which can be irreversible. Due to this property, polystyrene ion exchangers are not suitable for protein separation. They are used on the other hand for the separation of small molecules in amino acid separation and removal of salt from water. Polystyrene ion exchangers with large pores can be used for the separation of protein but must be coated with a hydrophilic substance. [21]

Cellulose based medium can be used for the separation of large molecules as they contain large pores. Protein binding in this medium is high and has low hydrophobic character. DEAE is an anion exchange matrix that is produced from a positive side group of diethylaminoethyl bound to cellulose or Sephadex. [22]

Agarose gel based medium contain large pores as well but their substitution ability is lower in comparison to dextrans. The ability of the medium to swell in liquid is based on the cross-linking of these substances, the pH and the ion concentrations of the buffers used. [21]

Incorporation of high temperature and pressure allows a significant increase in the efficiency of ion chromatography, along with a decrease in time. Temperature has an influence of selectivity due to its effects on retention properties. The retention factor (k = (tR g − tM g )/(tM g − text)) increases with temperature for small ions, and the opposite trend is observed for larger ions. [23] [24]

Despite ion selectivity in different mediums, further research is being done to perform ion exchange chromatography through the range of 40–175 °C. [25]

An appropriate solvent can be chosen based on observations of how column particles behave in a solvent. Using an optical microscope, one can easily distinguish a desirable dispersed state of slurry from aggregated particles. [20]

A "strong" ion exchanger will not lose the charge on its matrix once the column is equilibrated and so a wide range of pH buffers can be used. "Weak" ion exchangers have a range of pH values in which they will maintain their charge. If the pH of the buffer used for a weak ion exchange column goes out of the capacity range of the matrix, the column will lose its charge distribution and the molecule of interest may be lost. [26] Despite the smaller pH range of weak ion exchangers, they are often used over strong ion exchangers due to their having greater specificity. In some experiments, the retention times of weak ion exchangers are just long enough to obtain desired data at a high specificity. [27]

Resins (often termed 'beads') of ion exchange columns may include functional groups such as weak/strong acids and weak/strong bases. There are also special columns that have resins with amphoteric functional groups that can exchange both cations and anions. [28] Some examples of functional groups of strong ion exchange resins are quaternary ammonium cation (Q), which is an anion exchanger, and sulfonic acid (S, -SO2OH), which is a cation exchanger. [29] These types of exchangers can maintain their charge density over a pH range of 0–14. Examples of functional groups of Weak ion exchange resins include diethylaminoethyl (DEAE, -C2H4N(CH2H5)2), which is an anion exchanger, and carboxymethyl (CM, -CH2-COOH), [30] which is a cation exchanger. These two types of exchangers can maintain the charge density of their columns over a pH range of 5–9. [ citação necessária ]

In ion chromatography, the interaction of the solute ions and the stationary phase based on their charges determines which ions will bind and to what degree. When the stationary phase features positive groups which attracts anions, it is called an anion exchanger when there are negative groups on the stationary phase, cations are attracted and it is a cation exchanger. [31] The attraction between ions and stationary phase also depends on the resin, organic particles used as ion exchangers.

Each resin features relative selectivity which varies based on the solute ions present who will compete to bind to the resin group on the stationary phase. The selectivity coefficient, the equivalent to the equilibrium constant, is determined via a ratio of the concentrations between the resin and each ion, however, the general trend is that ion exchangers prefer binding to the ion with a higher charge, smaller hydrated radius, and higher polarizability, or the ability for the electron cloud of an ion to be disrupted by other charges. [32] Despite this selectivity, excess amounts of an ion with a lower selectivity introduced to the column would cause the lesser ion to bind more to the stationary phase as the selectivity coefficient allows fluctuations in the binding reaction that takes place during ion exchange chromatography.

Following table shows the commonly used ion exchangers [33]

Sr. Não Name Modelo Functional group
1 DEAE Cellulose (Anion exchanger) Weakly basic DEAE (Diethylaminoethyl)
2 QAE Sephadex (Anion exchanger) Strongly basic QAE (Quaternary aminoethyl)
3 Q Sepharose (Anion exchanger) Strongly basic Q (Quaternary ammonium)
4 CM- Cellulose (Cation exchanger) Weakly acidic CM (Carboxymethyl)
5 SP Sepharose (Cation exchanger) Strongly acidic SP (Sulfopropyl)
6 SOURCE S (Cation exchanger) Strongly acidic S (Methyl sulfate)

A sample is introduced, either manually or with an autosampler, into a sample loop of known volume. A buffered aqueous solution known as the mobile phase carries the sample from the loop onto a column that contains some form of stationary phase material. This is typically a resin or gel matrix consisting of agarose or cellulose beads with covalently bonded charged functional groups. Equilibration of the stationary phase is needed in order to obtain the desired charge of the column. If the column is not properly equilibrated the desired molecule may not bind strongly to the column. The target analytes (anions or cations) are retained on the stationary phase but can be eluted by increasing the concentration of a similarly charged species that displaces the analyte ions from the stationary phase. For example, in cation exchange chromatography, the positively charged analyte can be displaced by adding positively charged sodium ions. The analytes of interest must then be detected by some means, typically by conductivity or UV/visible light absorbance.

Control an IC system usually requires a chromatography data system (CDS). In addition to IC systems, some of these CDSs can also control gas chromatography (GC) and HPLC.

A type of ion exchange chromatography, membrane exchange [34] [35] is a relatively new method of purification designed to overcome limitations of using columns packed with beads. Membrane Chromatographic [36] [37] devices are cheap to mass-produce and disposable unlike other chromatography devices that require maintenance and time to revalidate. There are three types of membrane absorbers that are typically used when separating substances. The three types are flat sheet, hollow fibre, and radial flow. The most common absorber and best suited for membrane chromatography is multiple flat sheets because it has more absorbent volume. It can be used to overcome mass transfer limitations [38] and pressure drop, [39] making it especially advantageous for isolating and purifying viruses, plasmid DNA, and other large macromolecules. The column is packed with microporous membranes with internal pores which contain adsorptive moieties that can bind the target protein. Adsorptive membranes are available in a variety of geometries and chemistry which allows them to be used for purification and also fractionation, concentration, and clarification in an efficiency that is 10 fold that of using beads. [40] Membranes can be prepared through isolation of the membrane itself, where membranes are cut into squares and immobilized. A more recent method involved the use of live cells that are attached to a support membrane and are used for identification and clarification of signaling molecules. [41]

Ion exchange chromatography can be used to separate proteins because they contain charged functional groups. The ions of interest (in this case charged proteins) are exchanged for another ions (usually H + ) on a charged solid support. The solutes are most commonly in a liquid phase, which tends to be water. Take for example proteins in water, which would be a liquid phase that is passed through a column. The column is commonly known as the solid phase since it is filled with porous synthetic particles that are of a particular charge. These porous particles are also referred to as beads, may be aminated (containing amino groups) or have metal ions in order to have a charge. The column can be prepared using porous polymers, for macromolecules over 100,000 the optimum size of the porous particle is about 1 μm 2 . This is because slow diffusion of the solutes within the pores does not restrict the separation quality. [42] The beads containing positively charged groups, which attract the negatively charged proteins, are commonly referred to as anion exchange resins. The amino acids that have negatively charged side chains at pH 7 (pH of water) are glutamate and aspartate. The beads that are negatively charged are called cation exchange resins, as positively charged proteins will be attracted. The amino acids that have positively charged side chains at pH 7 are lysine, histidine and arginine. [43]

The isoelectric point is the pH at which a compound - in this case a protein - has no net charge. A protein’s isoelectric point or PI can be determined using the pKa of the side chains, if the amino (positive chain) is able to cancel out the carboxyl (negative) chain, the protein would be at its PI. Using buffers instead of water for proteins that do not have a charge at pH 7, is a good idea as it enables the manipulation of pH to alter ionic interactions between the proteins and the beads. [44] Weakly acidic or basic side chains are able to have a charge if the pH is high or low enough respectively. Separation can be achieved based on the natural isoelectric point of the protein. Alternatively a peptide tag can be genetically added to the protein to give the protein an isoelectric point away from most natural proteins (e.g., 6 arginines for binding to a cation-exchange resin or 6 glutamates for binding to an anion-exchange resin such as DEAE-Sepharose).

Elution by increasing ionic strength of the mobile phase is more subtle. It works because ions from the mobile phase interact with the immobilized ions on the stationary phase, thus "shielding" the stationary phase from the protein, and letting the protein elute.

Elution from ion-exchange columns can be sensitive to changes of a single charge- chromatofocusing. Ion-exchange chromatography is also useful in the isolation of specific multimeric protein assemblies, allowing purification of specific complexes according to both the number and the position of charged peptide tags. [45] [46]

Gibbs–Donnan effect Edit

In ion exchange chromatography, the Gibbs–Donnan effect is observed when the pH of the applied buffer and the ion exchanger differ, even up to one pH unit. For example, in anion-exchange columns, the ion exchangers repeal protons so the pH of the buffer near the column differs is higher than the rest of the solvent. [47] As a result, an experimenter has to be careful that the protein(s) of interest is stable and properly charged in the "actual" pH.

This effect comes as a result of two similarly charged particles, one from the resin and one from the solution, failing to distribute properly between the two sides there is a selective uptake of one ion over another. [48] [49] For example, in a sulphonated polystyrene resin, a cation exchange resin, the chlorine ion of a hydrochloric acid buffer should equilibrate into the resin. However, since the concentration of the sulphonic acid in the resin is high, the hydrogen of HCl has no tendency to enter the column. This, combined with the need of electroneutrality, leads to a minimum amount of hydrogen and chlorine entering the resin. [49]

Clinical utility Edit

A use of ion chromatography can be seen in the argentation ion chromatography. [ citação necessária ] Usually, silver and compounds containing acetylenic and ethylenic bonds have very weak interactions. This phenomenon has been widely tested on olefin compounds. The ion complexes the olefins make with silver ions are weak and made based on the overlapping of pi, sigma, and d orbitals and available electrons therefore cause no real changes in the double bond. This behavior was manipulated to separate lipids, mainly fatty acids from mixtures in to fractions with differing number of double bonds using silver ions. The ion resins were impregnated with silver ions, which were then exposed to various acids (silicic acid) to elute fatty acids of different characteristics.

Detection limits as low as 1 μM can be obtained for alkali metal ions. [50] It may be used for measurement of HbA1c, porphyrin and with water purification. Ion Exchange Resins(IER) have been widely used especially in medicines due to its high capacity and the uncomplicated system of the separation process. One of the synthetic uses is to use Ion Exchange Resins for kidney dialysis. This method is used to separate the blood elements by using the cellulose membraned artificial kidney. [51]

Another clinical application of ion chromatography is in the rapid anion exchange chromatography technique used to separate creatine kinase (CK) isoenzymes from human serum and tissue sourced in autopsy material (mostly CK rich tissues were used such as cardiac muscle and brain). [ citação necessária ] These isoenzymes include MM, MB, and BB, which all carry out the same function given different amino acid sequences. The functions of these isoenzymes are to convert creatine, using ATP, into phosphocreatine expelling ADP. Mini columns were filled with DEAE-Sephadex A-50 and further eluted with tris- buffer sodium chloride at various concentrations (each concentration was chosen advantageously to manipulate elution). Human tissue extract was inserted in columns for separation. All fractions were analyzed to see total CK activity and it was found that each source of CK isoenzymes had characteristic isoenzymes found within. Firstly, CK- MM was eluted, then CK-MB, followed by CK-BB. Therefore, the isoenzymes found in each sample could be used to identify the source, as they were tissue specific.

Using the information from results, correlation could be made about the diagnosis of patients and the kind of CK isoenzymes found in most abundant activity. From the finding, about 35 out of 71 patients studied suffered from heart attack (myocardial infarction) also contained an abundant amount of the CK-MM and CK-MB isoenzymes. Findings further show that many other diagnosis including renal failure, cerebrovascular disease, and pulmonary disease were only found to have the CK-MM isoenzyme and no other isoenzyme. The results from this study indicate correlations between various diseases and the CK isoenzymes found which confirms previous test results using various techniques. Studies about CK-MB found in heart attack victims have expanded since this study and application of ion chromatography.

Industrial applications Edit

Since 1975 ion chromatography has been widely used in many branches of industry. The main beneficial advantages are reliability, very good accuracy and precision, high selectivity, high speed, high separation efficiency, and low cost of consumables. The most significant development related to ion chromatography are new sample preparation methods improving the speed and selectivity of analytes separation lowering of limits of detection and limits of quantification extending the scope of applications development of new standard methods miniaturization and extending the scope of the analysis of a new group of substances. Allows for quantitative testing of electrolyte and proprietary additives of electroplating baths. [52] It is an advancement of qualitative hull cell testing or less accurate UV testing. Ions, catalysts, brighteners and accelerators can be measured. [52] Ion exchange chromatography has gradually become a widely known, universal technique for the detection of both anionic and cationic species. Applications for such purposes have been developed, or are under development, for a variety of fields of interest, and in particular, the pharmaceutical industry. The usage of ion exchange chromatography in pharmaceuticals has increased in recent years, and in 2006, a chapter on ion exchange chromatography was officially added to the United States Pharmacopia-National Formulary (USP-NF). Furthermore, in 2009 release of the USP-NF, the United States Pharmacopia made several analyses of ion chromatography available using two techniques: conductivity detection, as well as pulse amperometric detection. Majority of these applications are primarily used for measuring and analyzing residual limits in pharmaceuticals, including detecting the limits of oxalate, iodide, sulfate, sulfamate, phosphate, as well as various electrolytes including potassium, and sodium. In total, the 2009 edition of the USP-NF officially released twenty eight methods of detection for the analysis of active compounds, or components of active compounds, using either conductivity detection or pulse amperometric detection. [53]

Drug development Edit

There has been a growing interest in the application of IC in the analysis of pharmaceutical drugs. IC is used in different aspects of product development and quality control testing. For example, IC is used to improve stabilities and solubility properties of pharmaceutical active drugs molecules as well as used to detect systems that have higher tolerance for organic solvents. IC has been used for the determination of analytes as a part of a dissolution test. For instance, calcium dissolution tests have shown that other ions present in the medium can be well resolved among themselves and also from the calcium ion. Therefore, IC has been employed in drugs in the form of tablets and capsules in order to determine the amount of drug dissolve with time. [54] IC is also widely used for detection and quantification of excipients or inactive ingredients used in pharmaceutical formulations. Detection of sugar and sugar alcohol in such formulations through IC has been done due to these polar groups getting resolved in ion column. IC methodology also established in analysis of impurities in drug substances and products. Impurities or any components that are not part of the drug chemical entity are evaluated and they give insights about the maximum and minimum amounts of drug that should be administered in a patient per day. [55]


Assista o vídeo: Cromatografia por troca ionica (Janeiro 2022).