Em formação

2.12: Micróbio Mythbuster - Biologia


O grande inimigo da verdade muitas vezes não é a mentira, deliberada, artificial e desonesta, mas o mito, persistente, persuasivo e irreal.

O que é verdade?

A verdade é uma construção filosófica cujo significado tem sido debatido desde que os humanos inventaram a linguagem. Esse não é o foco deste esforço.

Este projeto é mais sobre a Razão, também uma construção filosófica. A razão fornece um caminho para ponderar a verdade. De acordo com alguns, a verdade surge quando as pessoas aplicam a razão de maneira apropriada sobre um assunto em questão. Este é o objetivo da ciência.

Talvez você tenha ouvido recentemente uma alegação sobre um suplemento nutricional ou visto um anúncio de um medicamento farmacêutico anunciando benefícios surpreendentes se você o tomar, e se perguntou se deveria. Ou você pensou sobre os riscos à saúde associados a tomar uma vacina contra a gripe, ou considerou tomar um probiótico porque um amigo de seu primo disse que você deveria? Como você pode saber o que seria melhor para você?

Existe um vasto corpo de estudos científicos conduzidos em um número infinito de tópicos em ciência e medicina que são publicados em periódicos acadêmicos e armazenados em bancos de dados pesquisáveis. Conduzindo uma revisão organizada da pesquisa publicada sobre o tópico e aplicando o "motivo apropriado", você pode decidir por si mesmo o que seria melhor para você, em vez de confiar em conselhos de anúncios ou pessoas que você não conhece.

A condução da pesquisa científica é guiada por práticas coletivamente chamadas de método científico, nas quais os experimentos são projetados para responder a questões sobre uma hipótese. Em um mundo perfeito, os experimentos são cuidadosamente projetados para garantir que os dados coletados e os resultados derivados deles sejam objetivos e sem preconceitos. Se os resultados forem significativos, a ciência é publicada em um jornal como forma de comunicar as descobertas a outras pessoas interessadas. Volumes de periódicos têm sido historicamente armazenados em bibliotecas, onde os artigos neles contidos podem ser lidos e copiados, se relevante. Não é mais necessário vasculhar “pilhas” empoeiradas de periódicos impressos para encontrar um artigo científico, porque um grande número agora está em “acesso aberto” ou disponível eletronicamente por meio de uma interface de biblioteca.

Existem diferenças entre os artigos publicados em periódicos acadêmicos e aqueles em outros tipos de publicações, e a principal diferença é a revisão por pares. É importante observar que o uso do termo "publicação" inclui artigos publicados em formato eletrônico, bem como impressos.

Você deve ver um pequeno vídeo disponível em http://www.library.vanderbilt.edu/peabody/tutorial_files/scholarlyfree/, que explica como saber a diferença entre uma referência de fonte de uma publicação acadêmica e uma publicada na mídia popular.

Seu instrutor fornecerá a você uma noção com o tema da microbiologia, sobre a qual você pode ter ouvido falar antes de iniciar este projeto. Dependendo das preferências de seu instrutor, você pode investigar sua ideia atribuída como uma tarefa por escrito ou pode ser solicitado a formatar a tarefa em um software de apresentação (como o PowerPoint) e fazer uma apresentação formal.

Antes de fazer qualquer pesquisa, reflita e anote suas primeiras impressões e opiniões pessoais sobre a ideia que você recebeu. Se você não está familiarizado com a ideia, ou mesmo se acha que a compreende bem, faça uma pequena pesquisa de fundo do tópico usando fontes populares (como Google e Wikipedia) para reunir informações de fundo antes de embarcar em sua pesquisa acadêmica.

Desmistifique os mitos, apóie a verdade

Muito do que você ouve no noticiário noturno relacionado a descobertas na ciência e na medicina vem de pesquisas conduzidas em universidades e faculdades de medicina. O financiamento desta pesquisa pode vir de fontes governamentais e, portanto, é custeado pelo público contribuinte. No entanto, dado o tamanho limitado do pote, a pesquisa também é conduzida por empresas privadas que lucram com a pesquisa que culmina em um produto lucrativo. Quando a pesquisa leva à publicação em um periódico "altamente classificado" (classificado de acordo com o "fator de impacto" do periódico, com base no número de vezes que os artigos publicados no periódico são citados como referência em outras publicações), uma breve descrição do estudo e seus resultados são divulgados na mídia popular para divulgação ao público em geral. Às vezes, a política governamental é desenvolvida usando estudos publicados como base para a legislação.

Relatórios acadêmicos e não acadêmicos de descobertas científicas significam que as pessoas hoje têm a oportunidade sem precedentes de tomar decisões informadas sobre coisas que podem afetar suas vidas. No entanto, também fornece um terreno fértil para a disseminação de informações destinadas a “comercializar” a ideia para obter o apoio popular. Uma vez enraizados na consciência pública, “fatos” mal aplicados podem se tornar “mitos” - persistentes, persuasivos e irrealistas. Como você diz a diferença?

Para este projeto, você investigará se uma ideia comum de microbiologia é cientificamente concebida e o grau em que é “verdadeira”, avaliando e relatando pesquisas publicadas em periódicos acadêmicos. Os componentes a serem incluídos em seu relatório ou apresentação são especificados a seguir.

1. Revise a opinião popular e desenvolva uma tese

Depois de saber o seu assunto Mythbuster, procure informações de fundo e opiniões entre fontes que não são consideradas "acadêmicas". Isso inclui fontes populares da imprensa, como jornais, revistas, fontes da Internet ou tia-avó Martha, que sabe tudo.

A partir do seu conhecimento acumulado sobre o assunto, desenvolva uma tese sobre o assunto e afirme o que você pensa sobre ele em uma declaração de tese - uma previsão de uma ou duas frases do que você acredita ser verdade. A declaração da tese deve ser focada e específica o suficiente para ser comprovada dentro dos limites de sua investigação.

Conforme você busca o "motivo" para apoiar a "verdade", pode descobrir que sua tese não pode ser apoiada pelas evidências científicas disponíveis. No entanto, você deve ser flexível, objetivo e honesto ao construir e conduzir sua pesquisa da literatura científica, e não apenas procurar maneiras de fazer sua opinião parecer verdadeira.

2. Pesquise a literatura acadêmica

Os cientistas que pensam que suas pesquisas são significativas comunicam os resultados por meio da publicação em revistas científicas. A maioria das organizações médicas e científicas publica periódicos relacionados a um campo profissional - a American Society for Microbiology, por exemplo, publica vários periódicos, como Microbiologia Aplicada e Ambiental e Journal of Clinical Microbiology, entre outros. Manuscritos submetidos a revistas científicas são enviados a um painel de outros cientistas, que os revisam quanto à legitimidade e integridade científica. Isso garante que os dados e resultados sejam obtidos de experimentos reproduzíveis e cuidadosamente planejados, e que as conclusões sejam baseadas em evidências. Depois de revisados ​​por pares e aprovados, eles são incorporados a um volume da revista e publicados.

É importante considerar que em um mundo perfeito, usar a ciência e o método científico para entender a natureza é um processo lógico, objetivo e totalmente imparcial, que os revisores são sempre honestos e que os artigos revisados ​​representam a “verdade. ” Como vários casos recentes de alto perfil ilustram, nos quais estudos publicados foram "retratados" devido a fraude por parte dos pesquisadores e / ou seus revisores, o processo não é perfeito. Isso é particularmente verdadeiro quando os riscos financeiros ou pessoais são altos.

Depois de desenvolver a declaração de sua tese, a próxima etapa é procurar estudos de pesquisa publicados relativos ao seu tópico. Você pode consultar http://www.wikihow.com/Find-Scholarly-Articles-Online/ para uma visão geral concisa de como construir e conduzir uma pesquisa de artigos acadêmicos sobre um tópico de interesse.

Muitas bibliotecas em faculdades e universidades, como o sistema de bibliotecas da State University of New York, têm acesso a enormes bancos de dados contendo milhões de artigos acadêmicos. Portanto, outro excelente ponto de partida é obter a ajuda de um bibliotecário de referência na biblioteca de sua faculdade, que pode lhe dizer quais bancos de dados de artigos estão disponíveis e pode ajudá-lo a construir sua pesquisa. Os bibliotecários de referência são particularmente úteis quando se trata de decidir as palavras ou frases certas, de modo que sua pesquisa produza um número gerenciável de retornos, não poucos ou muitos.

Seja objetivo ao decidir sobre quais artigos ler mais. Não se limite apenas àqueles que concordam 100% com sua tese. Leia o resumo e, se parecer que o artigo será relevante para a sua ideia, baixe o artigo completo (texto completo) e leia o conteúdo completo.

3. Crie uma bibliografia comentada de artigos acadêmicos selecionados

Neste ponto, você (espero) navegou por uma grande lista de artigos relativos ao seu assunto. Para aqueles que você decidiu ler com mais profundidade, prepare uma bibliografia usando o formato de citação preferido por seu instrutor. Alguns dos bancos de dados escreverão a citação para você e, novamente, seu bibliotecário de referência pode ajudá-lo a localizar e acessar o aplicativo de citações, se existir para esse banco de dados.

Você deve fornecer citações para todos os artigos selecionados. Daqueles que você incluir na bibliografia, selecione três dos artigos que você acha que exemplificam sua ideia e escreva uma breve anotação para acompanhar a citação. “Comentado” significa que após a citação, escrever um breve resumo de um a dois parágrafos dos objetivos e resultados da pesquisa apresentada no artigo. A frase final do resumo deve discutir como o artigo se relaciona com sua tese. Um exemplo de uma referência anotada é mostrado abaixo (o formato de citação é APA).

Fava, F., Lovegrove, J. A., Gitau, R., Jackson, K. G., & Tuohy, K. M. (2006) The gut microbiota and lipid metabolism: Implications for human health and coronary heart disease. Química Medicinal Atual, 13, 3005-3021.

Resumo: A doença coronariana (DCC) é a principal causa de mortalidade na sociedade ocidental, afetando cerca de um terço da população antes dos setenta anos. Este artigo revisa os fatores de risco modificáveis ​​associados à DCC e discute a hipótese de que dietas ricas em fontes de fibra alimentar e polifenóis vegetais promovem melhor saúde coronariana. As fibras vegetais são metabolizadas pela microflora intestinal e são convertidas em compostos biologicamente ativos que são complementares ao metabolismo humano. O metabolismo das fibras vegetais pela microflora intestinal pode prevenir ou de outra forma ter um impacto benéfico no metabolismo lipídico prejudicado e na disfunção vascular que tipifica a CHD e o diabetes tipo II. De modo geral, este artigo apóia minha tese de que as bactérias no intestino humano contribuem positivamente para a boa saúde geral de uma pessoa.

4. Escreva um resumo e uma conclusão

Opção de papel: Em um parágrafo (ou dois), resuma o escopo do projeto, a ideia que você está investigando e reafirme sua tese. Em dois a quatro parágrafos, resuma a pesquisa que você descobriu em sua busca da literatura acadêmica, certificando-se de incluir a citação apropriada para cada referência. Em um parágrafo final (ou dois), compare e contraste as informações não acadêmicas com o que você aprendeu com sua pesquisa da ciência e discuta se as evidências científicas apoiaram sua tese ou se as evidências não apoiaram sua opinião . Considere se você está persistindo com sua tese ou se deseja alterá-la, e quais alterações podem ser apropriadas com base nas evidências científicas.

ApresentaçãoOpção: Usando o PowerPoint (ou outro software de apresentação), desenvolva seu relatório em uma palestra de dez minutos, que pode ser programada para fazer uma apresentação oral.


Flip-flop em torno da origem e término da replicação em genomas procarióticos

Uma resposta a Evidência de inversões cromossômicas simétricas em torno da origem de replicação em bactérias por JA Eisen, JF Heidelberg, O White, SL Salzberg. Biologia Genômica 2000, 1:research0011.1-0011.9.

O problema de rearranjos em genomas procarióticos intimamente relacionados foi discutido várias vezes recentemente [1,2,3,4]. Uma característica desses rearranjos é que muitos ortólogos (genes que codificam para a mesma função em genomas diferentes) permanecem à mesma distância da origem ou término da replicação, mas podem ser posicionados em qualquer um dos dois replichores (metades replicadas de forma oposta de o genoma [5], Figura 1). Uma imagem específica é obtida quando as posições dos genes em um genoma são plotadas contra as posições de seus ortólogos em um genoma intimamente relacionado (Figura 2a). Uma implicação prática é que as sequências ortólogas encontradas na mesma distância da origem ou término da replicação provavelmente codificam a mesma função. Também é importante do ponto de vista evolutivo. A questão é: por que os genes podem ser translocados entre replichores, mas têm sua distância da origem ou término da replicação conservada?

A topologia da replicação bidirecional de um cromossomo procariótico circular. A linha contínua é a fita de DNA replicada como a fita principal, a linha tracejada é a fita de DNA replicada como a fita atrasada Ori, a origem da replicação Ter, o término da replicação. Ori e Ter dividem o cromossomo em dois replichores, arbitrariamente chamados de esquerdo e direito.

Gráficos das posições relativas dos ortólogos no Helicobacter pylori J99 e H. pylori 26695 genomas. Os valores no x e y os eixos representam as posições dos genes nos cromossomos, em pares de bases. (uma) Os ortólogos mais próximos (melhores correspondências) que não trocaram de posição entre as fitas de DNA principais e atrasadas. (b) Todos os ortólogos que trocaram de posição entre as fitas de DNA principais e atrasadas. As sequências genômicas e ortólogos, extraídos do banco de dados de Clusters of Orthologous Groups ('COGs') [12], foram obtidos do National Center for Biotechnology Information [13].

Tillier e Collins [4] argumentaram que uma proporção substancial de rearranjos da ordem dos genes resulta de locais de recombinação que são determinados pelas posições das forquilhas de replicação. Sua teoria (plausível) é que bifurcações de replicação são pontos críticos para recombinação. Dado que os dois garfos de replicação estão aproximadamente à mesma distância da origem (durante a replicação bidirecional), as translocações são simétricas em relação ao eixo origem-término. Assim, de acordo com Tillier e Collins [4], restrições específicas sobre os mecanismos de recombinação são responsáveis ​​pelo viés observado na frequência de encontrar produtos de rearranjo particulares. Argumentamos que é a seleção que pode ser a principal responsável pelo viés observado, e a probabilidade de que um produto de rearranjo seja viável depende de sua topologia.

O primeiro aspecto da topologia que pode levar a rearranjos de genoma enviesados ​​é a distância de um gene da origem de replicação, pois isso determina o número relativo de cópias do gene em cada célula de culturas de bactérias de rápido crescimento. Se o tempo de geração for menor que o período de replicação, o número de cópias de genes próximos à origem será maior do que o número de cópias de genes próximos ao término. Assim, a pressão de seleção leva à posição ideal dos genes em relação à distância da origem de replicação [6,7]. Como resultado, além de observar um viés para rearranjos específicos, há uma assimetria na composição de nucleotídeos de sequências gênicas e uma composição de aminoácidos enviesada de proteínas codificadas por genes ao longo do cromossomo [8].

O segundo fator que pode influenciar a probabilidade de rearranjos específicos do genoma é que a pressão mutacional associada à replicação é diferente para as fitas de DNA principais e atrasadas. Diferentes taxas de acúmulo de substituições de nucleotídeos nas fitas principais e atrasadas sugerem que há diferenças qualitativas e quantitativas na composição de nucleotídeos de sequências codificadoras de proteínas situadas em diferentes fitas de DNA ([9] e referências nelas). É por isso que as sequências que mudaram recentemente de localização da fita principal para a fita atrasada, ou vice-versa, são mais propensos a acumular mutações. Assim, qualquer inversão de um gene dentro do replichore (Figura 3c) muda sua fita de sentido da fita principal para a fita atrasada durante a replicação, ou vice-versa, e aumenta a taxa de mutação desse gene [10,11]. Se a inversão abrange a origem ou o término da replicação, a posição do gene (com relação à direção da replicação) não é alterada (Figura 3a, b). Com efeito, o viés específico no rearranjo do genoma é observado apenas para os ortólogos "mais próximos" (melhores correspondências). O gráfico característico visto na Figura 2a mostra ortólogos que não mudaram de posição em relação ao comportamento de avanço ou atraso da fita de DNA. Uma inversão dentro de um replichore, entretanto, muda a posição do gene a esse respeito (Figura 3c). Taxas de mutação muito altas podem eliminar um gene que mudou de fita, a menos que a inversão esteja conectada a uma duplicação. No caso de uma duplicação, a segunda cópia do gene pode desempenhar um papel diferente e pode ser permitida a divergir muito mais rápido, por exemplo, para gerar um parálogo. Na Figura 2b, ilustramos as posições relativas dos genes que mudaram suas posições em relação à direção de replicação; a linha diagonal característica vista na Figura 2a, mostrando a orientação altamente enviesada dos rearranjos, desapareceu.

Consequências de inversões em diferentes locais em um cromossomo procariótico. As setas verdes indicam locais de recombinação. As setas pretas representam uma cadeia de sentido de um gene. Observe que, se a fita sense está na fita principal de DNA, a direção da transcrição do gene é a mesma que a direção do movimento do garfo de replicação. (uma) Uma inversão simétrica que abrange a origem de replicação. Após a inversão, as distâncias até a origem e as localizações dos genes não mudam em relação às fitas de DNA anteriores e posteriores. (b) A região invertida engloba a origem, mas a origem não está localizada no centro desta região. Como resultado, os comprimentos dos replichores mudam e as distâncias dos genes não invertidos até a origem mudam, embora as localizações dos genes não mudem em relação às fitas de DNA anteriores e posteriores. (c) Uma inversão dentro de um replichore. As localizações dos genes na sequência invertida mudam em relação às cadeias de DNA principais e atrasadas. Além disso, genes localizados fora do centro da região invertida mudam sua distância da origem.

A terceira força de seleção que pode levar a rearranjos tendenciosos pode ser a tendência de manter os dois replichores do mesmo tamanho (ver também [7]). Se houver uma pressão de seleção garantindo que o comprimento dos dois replichores nos genomas procarióticos permaneça quase o mesmo, inversões simétricas em relação à origem ou término da replicação devem ser preferidas. A Figura 3b mostra como um evento de recombinação abrangendo a origem de replicação, mas com a origem não no centro do fragmento invertido, gera replichores de comprimentos diferentes e altera as distâncias da origem para genes situados fora da sequência invertida.

Todas as explicações acima não excluem a possibilidade de que existam pontos quentes de recombinação conectados com os garfos de replicação, como sugerido por Tillier e Collins [4], mas gostaríamos de enfatizar que a seleção provavelmente desempenha um papel muito importante na produção de imagem X estranha da topologia de translocação em genomas intimamente relacionados.

Jonathan A Eisen responde:

Eu saúdo a carta de Mackiewicz et al. relacionados aos alinhamentos X do genoma inteiro (aos quais nos referimos como arquivos X). Concordo que a seleção é provavelmente um fator contribuinte nas observações, com base na genômica comparativa, de que a distância que um gene está da origem de replicação é mantida ao longo do tempo evolutivo [1,2,4]. Suas sugestões para possíveis forças seletivas são todas inteiramente razoáveis ​​e valerá a pena buscar a contribuição de cada uma em um trabalho futuro. Gostaria de apontar alguns problemas adicionais relacionados aos arquivos X, no entanto. Em primeiro lugar, é importante notar que alguns trabalhos muito importantes sobre este assunto foram realizados usando abordagens genéticas [6,7,14,15,16,17,18,19,20]. Conforme apontado em alguns desses estudos e por Mackiewicz et al., a presença de seleção não significa necessariamente que os processos de mutação também não sejam um fator contribuinte importante. É provável que algum tipo de viés de mutação (como troca de fita durante a replicação, como sugerido por Tillier e Collins [4]) leve a uma alta frequência de inversões que são simétricas em torno da origem de replicação. Muitas outras inversões também podem ocorrer. Assim, a seleção negativa (como a seleção contra mudanças no tamanho do replichore ou dosagem do gene, como sugerido por Mackiewicz et al.) é provável que então faça com que as inversões que são observadas ao longo do tempo evolutivo sejam predominantemente aquelas que são simétricas em torno da origem da replicação. O que agora precisamos do ponto de vista científico é mais informações sobre frequências e tipos de inversão do genoma que ocorrem na ausência de seleção, bem como informações sobre as diferenças de aptidão entre cepas com diferentes inversões.

Além disso, gostaria de comentar a sugestão de que a observação do padrão de alinhamento do X pode ajudar a fazer previsões funcionais para genes. Mackiewicz et al. sugerem que, se encontrarmos genes homólogos à mesma distância da origem de replicação, podemos concluir que eles têm a mesma função. Eu sugeriria que este não é um bom critério de previsão funcional. Como discutido anteriormente [1], dentro de genomas individuais, pares de genes parálogos são freqüentemente encontrados em ambos os lados da origem de replicação em distâncias iguais (levando a um padrão X dentro do genoma). Propusemos que isso provavelmente se deva a inversões que dividem genes parálogos duplicados em tandem. Como um ou ambos os genes podem ter divergido em função daquela de um ancestral comum, sua posição a partir da origem de replicação não ajudará a prever sua função quando comparada a outras espécies. Além disso, como os genes ortólogos nem sempre têm a mesma função, mesmo sem a ocorrência de duplicações em tandem, a localização do genoma por si só não é provável que seja um preditor confiável da função do gene. Assim, embora eu acredite que o padrão de alinhamento do X possa revelar muito sobre as pressões de mutação e seleção relacionadas a inversões e posição do genoma, não estou convencido de que a função de um gene pode ser prontamente prevista pela identificação de genes homólogos equidistantes das origens de replicação.

The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, EUA. E-mail: [email protected]


Uma via metabólica para catabolizar o ácido levulínico em bactérias

Os microrganismos podem catabolizar uma ampla gama de compostos orgânicos e, portanto, têm o potencial de realizar muitas bioconversões industrialmente relevantes. Uma barreira para perceber o potencial das estratégias de biorrefinação reside em nosso conhecimento incompleto das vias metabólicas, incluindo aquelas que podem ser usadas para assimilar matérias-primas naturalmente abundantes ou facilmente geradas. Por exemplo, o ácido levulínico (LA) é uma fonte de carbono que pode ser facilmente obtida como um produto de desidratação de biomassa lignocelulósica e pode servir como a única fonte de carbono para algumas bactérias. No entanto, a genética e a estrutura do catabolismo de LA permaneceram desconhecidas. Aqui, relatamos a identificação e caracterização de um operon de sete genes que permite o catabolismo de LA em Pseudomonas putida KT2440. Quando a via foi reconstituída com proteínas purificadas, observamos a formação de quatro intermediários acil-CoA, incluindo um único 4-fosfovaleril-CoA e o produto 3-hidroxivaleril-CoA previamente observado. Usando a evolução adaptativa, obtivemos um mutante de Escherichia coli LS5218 com deleções funcionais de fadE e atoC que foi capaz de crescimento robusto em LA quando expressou as cinco enzimas do operon P. putida. Esta descoberta permitirá o uso mais eficiente de hidrolisados ​​de biomassa e engenharia metabólica para desenvolver bioconversões usando LA como matéria-prima.

Figuras

Figura 1. Caracterização genética e proposta catabólica…

Figura 1. Caracterização genética e proposta de atividade catabólica do P. putida lva operon

Figura 2. Atividade enzimática e caracterização da via ...

Figura 2. Atividade enzimática e caracterização da via para lva operon


D-aminoácidos fluorescentes revelam modificações da parede celular bicelular importantes para a predação de Bdellovibrio bacteriovorus

A modificação das paredes celulares contendo peptidoglicano (PG) bacteriano essencial pode levar à resistência a antibióticos, por exemplo, resistência a β-lactama por atividades de L, D-transpeptidase. Os predadores Bdellovibrio bacteriovorus são naturalmente antibacterianos e combatem as infecções atravessando, modificando e finalmente destruindo as paredes das bactérias presas Gram-negativas, modificando seu próprio PG à medida que crescem dentro das presas. Historicamente, esses processos multienzimáticos em duas paredes PG semelhantes têm se mostrado um desafio para elucidar. Aqui, com uma abordagem de marcação PG utilizando pulsos cronometrados de múltiplos D-aminoácidos fluorescentes, iluminamos as mudanças dinâmicas pelas quais as paredes dos predadores e das presas passam durante as diferentes fases da bactéria: a invasão da bactéria. Nós mostramos a formação de um orifício circular reforçado na parede da presa, L, D-transpeptídeo aseBd-mediado D-aminoácidos modificações fortalecendo presas PG durante a invasão Bdellovibrio, e um modo zonal de alongamento do predador. Este processo é seguido por septação não convencional, multiponto e síncrona do Bdellovibrio intracelular, acomodando a formação de progênies ímpares e pares por divisão não binária.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Figuras

Fig. 1. Antecedentes e introdução ao experimental…

Fig. 1. Antecedentes e introdução aos procedimentos experimentais

Fig. 2. Imagens de microscopia de iluminação estruturada tridimensional ...

Fig. 2. Imagens de microscopia de iluminação estruturada tridimensional de predação precoce por B. bacteriovorus (pré-etiquetado com ...

Fig. 3. Imagens de microscopia de iluminação estruturada tridimensional ...

Fig. 3. Imagens de microscopia de iluminação estruturada tridimensional de predação precoce por B. bacteriovorus (pré-etiquetado com ...

Fig. 4. Efeitos quantitativos e qualitativos de ...

Fig. 4. Efeitos quantitativos e qualitativos de duas L, D-transpeptidases nas modificações da parede celular da presa por ...

Fig. 5. Gráficos mostrando a incorporação de HADA em ...

Fig. 5. Gráficos mostrando a incorporação de HADA no PG da presa E. coli mutantes em ...

Fig. 6. Epifluorescência e imagens 3D-SIM de ...

Fig. 6. Imagens de epifluorescência e 3D-SIM dos estágios posteriores de predação para mostrar PG…


MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Saccharomyces cerevisiae, pólen de pinheiro (pó de ruptura) e fibra de sumaúma foram adquiridos no mercado. O vaso de lótus foi extraído das raízes de lótus e cabelo humano foi cortado do autor X.Y. Rhodospirillum rubrum foi fornecido por P. Wu (Harbin University of Commerce) S. platensis, C. reinhardtii, T. subcordiformis, e Clorela salina foram fornecidos por Y. Zhang (Qingdao Agricultural University) e o meio de crescimento celular foi fornecido por L. Bian (Chinese University of Hong Kong). Cloreto férrico (FeCl3), tetra-hidrato de cloreto ferroso (FeCl2· 4H2O), e o monohidrato de dextrose foi adquirido da Acros Organics (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA), hidróxido de sódio (NaOH, ≥98%, pellets) foi adquirido da Aladdin (China), ácido clorídrico (HCl, 5 M) foi adquirido da BDH Prolabo (VWR International SAS, França), etanol absoluto e IPA foram adquiridos da EMSURE (EMD Millipore Corporation, Alemanha) gelatina de pele porcina (tipo A) foi adquirida da Sigma-Aldrich (EUA) e DPBS foi adquirido da Gibco (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA). Soluções tampão de pH 4,0, pH 6,86 e pH 9,18 foram preparadas usando pó de tampão de calibração de um medidor de pH CHEETAH (PHS-3C). A linha de células de fibroblastos 3T3, a linha de células de câncer SiHa e a linha de células de carcinoma hepatocelular do fígado Hep G2 foram obtidas na ATCC (EUA). Todos os regentes químicos foram usados ​​sem purificação adicional.

Síntese de Fe3O4 Suspensões NP

Fe3O4 As suspensões NP foram preparadas com base no método de co-precipitação (41, 45, 46), com um processo típico conduzido em um banho ultrassônico KUSON (degaseamento modal, 20 kHz, 0,35 W / cm 2). Primeiro, 10 ml de solução de NaOH (0,5 M) foram adicionados gota a gota a um FeCl aquoso3 (0,008 M) –FeCl2 (0,016 M) mistura a 50 ° C, resultando em uma suspensão preta. Em segundo lugar, após sonicação por 60 min, a suspensão preta foi repetidamente centrifugada (10.000 rpm, 15 min) e redispersa em água DI (via sonicação) três vezes. Por último, 100 μl de solução de HCl (5 M) foi adicionado à suspensão redispersa final, seguido por mais sonicação por 60 min. Então, Fe com carga positiva3O4 Foram obtidas suspensões de NP (cerca de pH 2,1).

Processo de revestimento por imersão

O processo de revestimento por imersão de matrizes biológicas foi realizado à temperatura e pressão ambiente em uma solução (cerca de pH 3,0) do Fe acima3O4 Suspensão de NP dispersa em 50 ml de água DI, contendo cerca de 9,28 mg de NPs de magnetita (peso seco). Todas as amostras biológicas foram lavadas três vezes com água DI antes de serem adicionadas à solução. Para encurtar o comprimento do corpo, também sonicamos o S. platensis amostra por 15 min (20 kHz, 0,35 W / cm 2). O processo de revestimento por imersão foi realizado sem qualquer agitação forte contínua. Apenas agitação suave intermitente foi aplicada para evitar a aglomeração de amostras biológicas. Após o processo de dip-coating, os produtos finais foram separados por centrifugação e estocados em água DI.

Caracterização estrutural

As imagens ópticas foram capturadas por um microscópio óptico OLYMPUS conectado a um PC com uma câmera de dispositivo de carga acoplada. As imagens FESEM foram adquiridas usando um microscópio FEI Quanta 400F com uma tensão de aceleração de 10 kV. Para aumentar sua condutividade, todas as amostras passaram por pulverização catódica de ouro a 10 mA por 45 s usando uma SC 502 Ion Sputter Coating Machine (POLARON), a menos que especificado de outra forma. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão foram adquiridas usando um microscópio eletrônico FEI Tecnai Spirit com uma tensão de aceleração de 200 kV. A análise dos elementos foi realizada com um analisador EDX (montado no FEI Quanta 400F) com uma tensão de aceleração de 20 kV. Um teste de difração de raios-X foi realizado em um difratômetro Smartlab (Rigaku) ​​usando Cu alvo (40 kV, 40 mA). O teste de infravermelho com transformada de Fourier de transmissão (FTIR) foi conduzido em um espectrômetro Thermo Scientific Nicolet iS10 FTIR usando a técnica de disco comprimido KBr típica (2 mg de amostra e 200 mg de KBr). Todas as amostras FESEM, magnetizadas ou não, foram liofilizadas em um liofilizador ilShinBioBase (TFD8503), a menos que especificado de outra forma.

Caracterização das propriedades magnéticas, de propulsão e fluorescência

As propriedades magnéticas dos microrrobôs magnéticos foram medidas usando um magnetômetro de amostra vibratória (VSM PPMS Model 6000 Quantum Design) em temperatura ambiente. Os testes de propulsão foram conduzidos usando campos magnéticos rotativos homogêneos ou variáveis ​​periodicamente gerados por um sistema de bobina helmholtz tri-axial customizado. As imagens de campo claro e fluorescência foram obtidas em água DI usando um microscópio de varredura a laser confocal Leica SP8. Os espectros de fluorescência foram registrados usando um Espectrofotômetro de Fluorescência Hitachi F-7000 equipado com uma lâmpada de Xenon L2175 (HAMAMATSU). A resolução do teste foi de 1,0 nm e os parâmetros do teste foram definidos da seguinte forma: taxa de varredura a 1200 nm / min, excitação e largura da fenda de emissão a 5,0 nm. Filtros de emissão passa-alta de 420, 500 e 580 nm foram usados ​​para a excitação de 405, 488 e 552 nm, respectivamente.

Imagem in vivo baseada em fluorescência

Experimentos de imagem in vivo baseados em MPSA autofluorescência foi realizada no tecido subcutâneo e na cavidade intraperitoneal de camundongos Balb / c atímicos, que foram criados e mantidos no Centro de Serviços de Animais de Laboratório da Universidade Chinesa de Hong Kong. A imersão de 6, 24 e 72 horas S. platensis foram dispersos em 1 ml de água DI para obtenção de soluções com concentrações de 0, 50, 100, 200, 400 e 800 μg / ml. As soluções preparadas foram então irradiadas por luz ultravioleta por 1 hora para esterilização antes da injeção. Os experimentos de imagem in vivo foram realizados da seguinte forma: (i) Os camundongos foram anestesiados com cetamina (75 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) e colocados em um suporte rígido, e (ii) todos os camundongos foram implementados com injeção subcutânea (100 μl) ou injeção intraperitoneal (300 μl). O grupo subcutâneo foi imediatamente fotografado com um filtro de excitação DsRed e um filtro de emissão de 660 nm usando um sistema de imagem IVIS 200 (Xenogen Imaging Technologies, Alameda, CA), e o grupo intraperitoneal foi fotografado a cada 5 min. Para experimentos de intensidade de fluorescência contra o tempo de residência, 12 camundongos foram injetados por via subcutânea em uma cabine de segurança biológica (1300 Series A2, Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) e, em seguida, retornaram ao Centro de Serviços de Animais de Laboratório da Universidade Chinesa de Hong Kong para continuar Reprodução. Os sinais fluorescentes foram registrados em 15, 24, 48 e / ou 72 horas, respectivamente.

T2imagiologia de ressonância magnética in vitro ponderada

Todas as imagens de RM foram capturadas em banho-maria (20 cm x 12 cm x 8 cm) colocado dentro de uma bobina de transmissão-recepção usando uma unidade de RM de corpo inteiro clínica 3.0-T (Achieva TX Philips Medical Systems, Best, Holanda). T2A imagem de RM ponderada foi medida usando uma sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill padrão, com TR (tempo de repetição) = 2.000 ms, intervalo TE (tempo de eco) = 30 a 960 ms, 32 ecos, campo de visão = 134 × 67 mm, matriz = 128 × 64, espessura de corte = 5 mm. Para garantir que a distribuição de MSP é homogêneo durante a ressonância magnética, todas as amostras testadas foram fixadas com gelatina de pele porcina (tipo A) em tubos de centrífuga de 1,5 ml (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA).

T2imagiologia de ressonância magnética in vivo ponderada

Ratos SD fêmeas (250 a 280 g), criados e mantidos no Centro de Serviços de Animais de Laboratório da Universidade Chinesa de Hong Kong, foram usados ​​para experimentos com animais. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Chinesa de Hong Kong e licenciados pelo Departamento de Saúde da Região Administrativa Especial de Hong Kong. Para imagens de RM no tecido subcutâneo, dois ratos SD foram anestesiados com cetamina (80 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) por meio de injeção intraperitoneal e colocados em um suporte rígido. Eles foram submetidos a injeção subcutânea com 100 μl cada de 4 e 8 mg / ml MSP72hSoluções -PO e, em seguida, colocadas sequencialmente dentro de um scanner de RM clínico 3.0-T para imagens de RM (Achieva TX Philips Medical Systems, Best, Holanda). O transmissor e receptor de radiofrequência era uma bobina de pulso humano. Para imagens de RM do estômago, outros três ratos foram alimentados via administração intragástrica de 1 ml de PO, 1 ml de 4 mg / ml MSP72hSolução -PO e 1 ml de 8 mg / ml MSP72hSolução -PO. Após 5 min, cada rato foi anestesiado com cetamina (80 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) por meio de injeção intraperitoneal e fixado no mesmo scanner para imagens de RM. Mais três ratos foram alimentados com 8 mg de MSP-72h por 1 ml de PO, anestesiado com cetamina e, em seguida, tratado com diferentes campos magnéticos. Os dois primeiros foram tratados por 5 e 12 min, respectivamente, com um RPM, e o terceiro rato foi tratado por 12 min com o mesmo ímã permanente, mas sem rotação. A seguir estão os principais parâmetros de imagem de RM: sequência turbo spin eco, TR = 4200 ms, TE = 80 ms, ângulo de inversão = 90 °, espessura de corte = 3 mm, número de excitações = 4, comprimento do trem de eco = 16, tamanho do pixel = 0,2 mm × 0,2 mm.

Experimentos de degradação

Os testes de biodegradabilidade foram conduzidos para imersão de 0- / 6- / 24- / 72 horas S. platensis. Cada amostra (liofilizada, 2 mg) foi adicionada a um tubo de centrífuga cônico de 50 ml Thermo Scientific Nunc contendo 20 ml de DPBS e, em seguida, incubado em um CO a 5%2–95% atmosfera umidificada com ar a 37 ° C. Em cada ponto de tempo projetado, amostras de 500, 100 e 50 μl foram removidas sucessivamente do tubo e, respectivamente, caracterizadas por espectrofotometria de fluorescência, FESEM e microscopia óptica. As amostras FESEM extraídas foram lavadas três vezes com água DI por centrifugação.

Cultura de células e subcultura

A linha celular de fibroblastos 3T3 foi cultivada com meio essencial mínimo a 37 ° C em um CO a 5%2–95% atmosfera umidificada com ar. Quando a confluência celular atingiu cerca de 75 a 80%, as células foram lavadas com PBS estéril. Em seguida, a tripsina foi neutralizada (Invitrogen, CA, EUA) por meio completo e lavada com PBS. Em seguida, as células foram coletadas por centrifugação (1000g por 5 min). Posteriormente, o pellet celular foi ressuspenso com meio completo fresco e passado para quatro placas de cultura de tecido de plástico (100 mm). Por último, eles foram incubados a 37 ° C em um CO 5%2–95% atmosfera umidificada com ar para proliferação. A linhagem de células de câncer cervical SiHa foi cultivada com o mesmo protocolo.

Ensaio MTT

O ensaio de MTT foi realizado para MSP amostras com três linhas de células, incluindo a linha de células de fibroblastos 3T3, a linha de células de câncer cervical SiHa e a linha de células de carcinoma hepatocelular hepático Hep G2. Todos os experimentos foram repetidos três vezes para verificação.As células 3T3, SiHa e Hep G2 foram semeadas separadamente em três placas de cultura de 96 poços (4000 células por poço) (Invitrogen) e cultivadas a 37 ° C em um CO a 5%2–95% atmosfera umidificada com ar. Após 24 horas de incubação para as células aderirem, o meio de cultura foi substituído por um meio fresco contendo MSP amostras com concentrações de 0, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 μg / ml (seis poços replicados para cada concentração, com um volume final de 100 μl por poço). Após outras 24 ou 48 horas de incubação, o meio de cultura foi cuidadosamente removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Posteriormente, 150 μl de MTT (0,5 mg / ml) foram adicionados. Após 4 horas de incubação, o meio de cultura foi novamente removido cuidadosamente e 150 μl de DMSO por poço foram adicionados, seguido por 10 min de agitação em um agitador horizontal. A absorvância foi lida usando equipamento de análise de marcação enzimática (Biotek Synergy 2, BioTek, EUA) a 570 nm. A absorbância média produz o resultado da viabilidade celular.

Coloração de imunofluorescência

As células 3T3 e SiHa foram semeadas em vidros colocados em placas de seis poços (10.000 células por poço). Cada poço foi preenchido com 2,5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco, incluindo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Após 24 horas de incubação, MSP-24h (0, 100 e 400 μg / ml) amostras foram adicionadas e co-cultivadas com as células 3T3 e SiHa por 24 e 48 horas. Em instantes de tempo designados (isto é, 24 e 48 horas), os vidros cobertos por células foram retirados dos poços da placa, seguido por três lavagens repetidas com PBS (Gibco). As células lavadas nos vidros foram posteriormente tratadas com 30 min de fixação em paraformaldeído 4% (Sigma-Aldrich). Depois de lavar três vezes com PBS, as células fixadas foram logo mergulhadas em 0,3% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) por 30 min. A seguir, as células permeabilizadas foram bloqueadas por 30 min com albumina de soro bovino a 2% (Sigma-Aldrich). Então, essas células pré-tratadas estavam prontas para serem coradas. A coloração do citoesqueleto foi realizada com incubação de 90 min das células pré-tratadas em PBS diluída com fluoresceína faloidina (200: 1, proporção de volume), e a contracoloração de núcleos foi realizada com incubação de 30 min em 6-diamidino-2-fenilindol diluído em PBS (1: 1000, proporção de volume) após lavagem três vezes com 0,1% em peso de Tween 20 (PBS). Para evitar fotobranqueamento, todos os processos de coloração foram realizados em um ambiente escuro. Todas as etapas para a coloração por imunofluorescência foram realizadas à temperatura ambiente. As imagens de fluorescência foram então capturadas usando um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 700.


Trabalho Prático de Aprendizagem

Notas baseadas em informações em 'Microbiologia prática básica' © Society for General Microbiology.

Consulte as técnicas assépticas de procedimento padrão antes de iniciar este ou qualquer outro trabalho prático de microbiologia.

Placas espalhadas ou "relvadas" devem resultar em um crescimento pesado, muitas vezes confluente de cultura espalhada uniformemente sobre a superfície do meio de crescimento. Isso significa que podem ser usados ​​para testar a sensibilidade das bactérias a muitas substâncias antimicrobianas, por exemplo, enxaguatórios bucais, alho, desinfetantes e antibióticos.

Em algumas situações, um prato de espalhar é melhor para trabalhar com antimicrobianos, pois é essencial ter tempo para que um prato de espalhar seque completamente antes de adicionar qualquer outro material, como discos de papel embebidos em antimicrobianos.

A placa de propagação pode ser usada para trabalho quantitativo (contagens de colônias - mas veja Nota 1) Se a diluição e o volume do inóculo forem conhecidos (o volume geralmente é 0,1 cm 3), você pode determinar a contagem viável da amostra. A contagem viável é o número de bactérias ou aglomerados de bactérias por cm 3. Você pode determinar a contagem viável se a diluição escolhida produzir entre 30 e 100 colônias contáveis ​​separadas.

Saúde, segurança e notas técnicas

1 Distribuidores estéreis são usados ​​para distribuir o inóculo sobre a superfície das placas de ágar preparadas. Você pode esterilizar um espalhador de vidro embrulhado em um forno de ar quente ou esterilizar em chamas com álcool.

2 Para inflamar um espalhador com álcool:
uma Mergulhe a extremidade inferior do espalhador em um pequeno volume de álcool (70% IDA) contido em um recipiente com tampa (uma tampa de rosca ou folha de alumínio) ou em uma placa de Petri de vidro (não de plástico) com tampa. Mantenha o recipiente de álcool coberto e a 1 metro de distância da chama do bico de Bunsen.

b Passe rapidamente pela chama de um bico de Bunsen para acender o álcool. Certifique-se de que o espalhador está apontando para baixo quando e depois de acender o álcool para evitar que você se queime.

c Remova o espalhador da chama e deixe o álcool queimar. O álcool em chamas esterilizará o vidro.

d Não coloque o espalhador na bancada.

3 Cotonetes de algodão podem ser usados ​​em vez de espalhadores de vidro. Eles podem ser preferíveis, pois evitam a necessidade de usar álcool como agente esterilizante. Prepare-os enrolando pequenos pedaços de algodão absorvente em torno de uma das pontas de um palito de coquetel. Embrulhe individualmente em papel alumínio ou coloque dentro de uma garrafa Universal para esterilizar em autoclave ou panela de pressão. Esses cotonetes estéreis podem ser mergulhados na solução ou cultura a ser transferida, esfregados na superfície da placa de ágar e imediatamente descartados no desinfetante. (Observação: cotonetes de um farmacêutico não são estéreis e podem estar impregnados com um agente antimicrobiano.)

4 Use placas de ágar com uma superfície bem seca para que o inóculo seque rapidamente. Seque a superfície das placas de ágar incubando por várias horas (talvez durante a noite) ou coloque-as em um forno de ar quente (a 55-60 ° C) por 30-60 minutos com as duas metades separadas e as superfícies internas direcionadas para baixo.

5 A seção 15.2.12 do Manual do Laboratório CLEAPSS sugere alguns métodos alternativos para fazer uma propagação ou prato de gramado e considera seus prós e contras.

6 O método de gota calibrado (Miles e Misra) para contagens de colônias de culturas puras de bactérias e leveduras é um método mais econômico do que despejar ou espalhar placas. No entanto, o método Miles e Misra geralmente não é adequado para culturas mistas obtidas de amostras naturais, como solo. O procedimento é o mesmo para a placa espalhada, mas menos placas são necessárias porque:

  • o inóculo é fornecido como gotas de uma pipeta que é calibrada (pelo diâmetro externo da ponta) para fornecer gotas do volume medido (por exemplo, 0,02 cm 3)
  • muitas gotas (seis ou mais) podem ser colocadas em um prato.

Procedimento

Preparação

uma Afrouxe a tampa do frasco / tubo de ensaio que contém o caldo de cultura.

b Retire uma pipeta Pasteur esterilizada do seu recipiente e coloque uma tetina com a mão direita.

c Segure a pipeta esterilizada em sua mão direita e o frasco / tubo de ensaio contendo o caldo de cultura em sua mão esquerda.

d Remova a tampa / tampão de algodão do frasco / tubo de ensaio com o dedo mínimo de sua mão direita e flambe o gargalo.

e Aperte a tetina da pipeta e retire uma pequena quantidade de caldo.

f Flameje o gargalo do frasco / tubo de ensaio e recoloque a tampa / plugue.

g Com a mão esquerda, levante parcialmente a tampa de uma placa de Petri contendo o meio nutriente sólido.

h Coloque algumas gotas de cultura na superfície - cerca de 0,1 cm 3 / cerca de 5 gotas /
o suficiente para cobrir uma moeda de 5 pence.

eu Recoloque a tampa da placa de Petri.

j Coloque a pipeta em um frasco de descarte de desinfetante.

k Mergulhe um difusor de vidro em álcool (70% IDA), flame e deixe o álcool queimar (Nota 2).

eu Levante a tampa da placa de Petri para permitir a entrada do espalhador.

m Coloque o espalhador na superfície do ágar inoculado. Mova o espalhador de cima para baixo ou de um lado para o outro para espalhar o inóculo sobre a superfície do ágar. Certifique-se de que toda a superfície do ágar esteja coberta.

n Recoloque a tampa da placa de Petri.

o Flameje o espalhador usando álcool (Nota 2).

p Deixe o inóculo secar (Nota 4) Isso vai levar algum tempo.

q Se a placa não foi feita para avaliar a população em uma diluição em série, agora ela pode ser tratada posteriormente, por exemplo, para teste de antimicrobianos, antes da aplicação de fita adesiva e incubação.

r Feche a placa com fita e incube-a na posição invertida.

Links da web

Recursos para professores de microbiologia
Society for General Microbiology - fonte de Basic Practical Microbiology, um excelente manual de técnicas de laboratório e Practical Microbiology para escolas secundárias, uma seleção de práticas experimentadas e testadas usando microrganismos.

Microbiologia online
MiSAC (Microbiology in Schools Advisory Committee) é apoiado pela Society for General Microbiology (veja acima) e seus sites incluem mais informações de segurança e um link para pedir conselhos por e-mail.

(Sites acessados ​​em outubro de 2011)

© 2019, Royal Society of Biology, 1 Naoroji Street, London WC1X 0GB Registered Charity No. 277981, Incorporated by Royal Charter


Práticas e procedimentos de segurança de laboratório

  1. Lembre-se de que todas as bactérias são patógenos potenciais que podem causar danos em circunstâncias inesperadas ou incomuns. Se você, como estudante, tem um sistema imunológico comprometido ou uma doença prolongada recente, você deve compartilhar essas circunstâncias pessoais com seu instrutor de laboratório.
  2. Saiba onde estão localizados os equipamentos de segurança específicos do laboratório, como extintor de incêndio e lava-olhos.
  3. Reconhecer o símbolo internacional de risco biológico e saber onde e como descartar todos os materiais residuais, especialmente os de risco biológico. Observe que todos os resíduos de risco biológico devem ser esterilizados por autoclave antes que possam ser incluídos no fluxo de resíduos.
  4. Mantenha tudo, exceto as culturas e ferramentas de que você precisa, FORA da bancada do laboratório.
  5. Todos os equipamentos e suprimentos usados ​​em experimentos envolvendo culturas bacterianas devem ser esterilizados. Isso inclui a mídia que você usa e também as ferramentas usadas para a transferência de mídia ou bactérias, como os instrumentos de inoculação (alças e agulhas) e pipetas para transferência de líquidos.
  6. A transferência de culturas líquidas por pipeta NUNCA deve envolver a sucção fornecida pela boca.
  7. Desinfete sua área de trabalho ANTES e DEPOIS de trabalhar com culturas bacterianas.
  8. No caso de um derramamento acidental envolvendo uma cultura bacteriana, sature completamente a área do derramamento com desinfetante, cubra com toalhas de papel e deixe o derramamento assentar por 10 minutos. Em seguida, remova cuidadosamente as toalhas de papel saturadas, descarte-as no lixo de risco biológico e limpe a área novamente com desinfetante.
  9. Use luvas ao trabalhar com culturas e, quando seu trabalho for concluído, descarte-as no lixo de risco biológico. Óculos de segurança ou óculos de proteção também são recomendados.
  10. Cabelo comprido deve ser puxado para trás para mantê-lo longe de culturas bacterianas e chamas abertas.
  11. Certifique-se de que as bancadas do laboratório estejam completamente limpas (tudo jogado fora ou devolvido à área de armazenamento) antes de deixar o laboratório.

As bactérias apresentam vários graus de risco em um ambiente de laboratório controlado e em seus ambientes naturais. Portanto, o nível de contenção necessário para trabalhar com segurança com culturas bacterianas também varia de acordo com um sistema que classifica os micróbios em um dos quatro níveis de biossegurança (BSL), que fornece padrões mínimos para o manuseio seguro de micróbios em cada nível. BSLs são definidos e as práticas de contenção são detalhadas pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) para laboratórios nos Estados Unidos. O documento completo, “Biossegurança no Microbiológico e Biomédica Laboratories,”Pode ser visto na íntegra em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm.

Antes da primeira reunião do laboratório, navegue até a seguinte página da web para revisar as diretrizes BSL conforme descrito pelo CDC, que inclui um questionário interativo:

A maioria das culturas bacterianas com as quais trabalharemos são classificadas como BSL-1. Abaixo, liste três práticas que devem ser usadas enquanto você estiver trabalhando com a bactéria BSL-1:

Em alguns dos laboratórios, estaremos trabalhando com bactérias classificadas como BSL-2. Que práticas de segurança adicionais você deve adotar ao trabalhar com essas bactérias?

Depois que seu instrutor tiver discutido quaisquer procedimentos adicionais de segurança para seu laboratório, conclua a avaliação do conceito de biossegurança na página seguinte (ou uma fornecida por seu instrutor) e assine a declaração. Devolva o documento preenchido ao seu instrutor.


A definição atual de higiene

A palavra higiene se origina com Hygieia, a deusa grega da saúde. O Oxford English Dictionary (OED) define-o como: “Aquele departamento de conhecimento ou prática que se relaciona com a manutenção da saúde um sistema de princípios ou regras para a preservação ou promoção das ciências sanitárias” [1]. O OED também nos dá algum contexto do uso da palavra em inglês, observando que suas origens estão na primeira parte da definição (o uso inicial da palavra se relaciona inteiramente à prática da medicina), enquanto o uso mais moderno tende a se referir especificamente para a prática de limpeza no que se refere à manutenção da boa saúde. Na prática, entretanto, a higiene raramente é definida explicitamente. O termo geralmente se refere a higiene das mãos, que a Organização Mundial da Saúde define como “um termo geral que se refere a qualquer ação de higienização das mãos” [2]. A higiene também pode referir-se a higiene ambiental, o que pode significar a limpeza de superfícies dentro do ambiente de uma pessoa (mais comumente um paciente) [3] ou, mais amplamente, mudanças infraestruturais que alteram o ambiente de uma forma percebida como benéfica para a saúde humana (como a instalação de água e instalações de tratamento de esgoto) [4]. Nesta revisão, enfocamos principalmente a higiene das mãos, uma vez que esse aspecto da higiene é mais comumente usado na literatura científica moderna.

Apesar do reconhecimento precoce da importância da higiene das mãos para controlar a propagação de doenças (Tabela 1) [5,6,7], pouca atenção foi dada aos detalhes durante a maior parte do século XX. Embora o CDC tenha aumentado gradualmente a regulamentação das práticas de higiene das mãos [8,9,10], particularmente em ambientes de saúde, foi somente em 2009 que um padrão internacional para práticas de higiene das mãos foi estabelecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) no abrangente Diretrizes sobre higiene das mãos [2].

A OMS define explicitamente a higiene das mãos como “qualquer ação de higienização das mãos” e, em seguida, delineia muitas “práticas de higiene das mãos” específicas, que incluem tudo, desde lavar as mãos com sabão e água até a anti-sepsia cirúrgica das mãos. É digno de nota que a maioria das regulamentações e recomendações relativas à higiene das mãos enfoca o aspecto da higiene como o ato de limpar, concentrando-se na redução da carga microbiana em massa, ao invés da redução da transmissão da infecção.

Pesquisa atual sobre higiene das mãos

O foco na redução do volume na carga microbiana é aparente na maioria dos estudos de higiene - mesmo aqueles conduzidos por microbiologistas clínicos [11,12,13,14]. Os conceitos de higiene e esterilização são frequentemente confundidos, o que talvez não seja surpreendente, dada a história das práticas de saneamento hospitalar, que buscam remover todos os micróbios do meio ambiente [8]. Há uma ligação lógica entre a redução em massa na carga microbiana e a redução na disseminação do patógeno, entretanto, relativamente poucos estudos vão além da limpeza e vinculam a higiene diretamente aos resultados de saúde, e muitos deles estão especificamente relacionados com a infecção nosocomial [12].

A pesquisa de higiene das mãos tem se concentrado amplamente em ambientes hospitalares e na disseminação de infecção nosocomial (revisado em [2, 12]), em parte devido à história do campo, mas, além disso, devido ao reconhecimento do aumento do risco de infecção em locais potencialmente contagiosos e pessoas imunocomprometidas são reunidas. Onde o trabalho de higiene das mãos ocorreu fora dos ambientes hospitalares, ele se concentrou em outras áreas com alto risco de transmissão de patógenos, como creches [15,16,17] ou situações de manipulação de alimentos [18], ou foi realizado em combinação com esforços para melhorar a higiene ambiental da comunidade, como melhor infraestrutura de saneamento nos países em desenvolvimento (revisado em [19]).

Aiello e Larson encontraram apenas 53 estudos publicados entre 1980 e 2001, de milhares de estudos que correspondiam aos seus critérios de pesquisa, que vinculavam explicitamente a higiene aos resultados de saúde fora dos ambientes de saúde [19]. Estudos ligando a intervenção de higiene à saúde demonstram a eficácia da lavagem das mãos na redução do risco de doenças diarréticas [20, 21] e infecção respiratória superior [21, 22]. A redução nas taxas de lavagem das mãos em resposta aos temores de contaminação por chumbo tem sido sugerida como um fator que contribui para um recente Shigella surto em Flint, Michigan [23].

A falta de uma definição clara e consistente de higiene gerou confusão na literatura científica. Um exemplo dessa confusão é aparente na literatura de higiene relacionada a secagem de mãos. Embora previamente ignorado [24], a secagem das mãos é um aspecto crucial da higiene das mãos devido ao papel significativo que a umidade residual desempenha na transferência de micróbios entre as superfícies [25,26,27,28]. Os diferentes métodos de secagem das mãos têm vantagens e preocupações higiênicas variadas. Por exemplo, secar com toalhas de papel é o método recomendado para profissionais de saúde pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças [29] e pela OMS [2], devido em grande parte aos dados de contagem bacteriana em massa indicando que as toalhas de papel são eficazes na remoção bactérias de superfície transitórias [24, 30,31,32,33,34,35]. No entanto, é possível que os resíduos de toalhas de papel possam servir como um reservatório bacteriano que pode facilitar a propagação de doenças [36, 37]. Novas alternativas para toalhas de papel, como secadores de ar a jato (por exemplo, o Dyson Airblade ™) são comercializadas como projetadas com um filtro de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) embutido no sistema de fluxo de ar, o que reduz o risco de redistribuição de micróbios aerotransportados para o mãos [13]. No entanto, há preocupação sobre a propensão de tal movimento rápido do ar para aerossolizar micróbios das mãos dos usuários ou do ambiente circundante [14, 34, 37,38,39].

Grande parte do trabalho existente sobre secagem de mãos examinou a eficácia higiênica de vários métodos. O que se entende por "higiene" em qualquer estudo, no entanto, muitas vezes não é declarado e geralmente é inconsistente entre estudos de diferentes grupos de pesquisa [40], mas geralmente é medido pela mudança na carga microbiana [13, 34], dispersão de micróbios de as mãos ou algum proxy dela [38, 39], e / ou eficácia da secagem [13, 36, 37]. A utilização de uma definição de higiene que se baseia explicitamente na redução da disseminação de doenças e leva em consideração a dinâmica da comunidade microbiana permitiria que futuros experimentos abordassem adequadamente as possíveis preocupações higiênicas de reservatórios bacterianos ou micróbios aerossolizados por secadores de papel toalha.


Introdução

Os ruminantes são um dos grupos de mamíferos herbívoros mais bem-sucedidos do planeta, com cerca de 200 espécies representadas por aproximadamente 75 milhões de selvagens e 3,5 bilhões de indivíduos domesticados em todo o mundo 1. Os ruminantes são definidos por seu modo de digestão das plantas e desenvolveram um estômago anterior, o rúmen, que permite a digestão microbiana parcial da ração antes de entrar no estômago verdadeiro.Os próprios ruminantes não produzem as enzimas necessárias para degradar a maioria dos polissacarídeos vegetais complexos e o rúmen fornece um ambiente para um consórcio rico e denso de micróbios anaeróbios que cumprem esse papel metabólico. Esses micróbios do rúmen fermentam a ração para formar ácidos graxos voláteis que são as principais fontes de nutrientes para o animal hospedeiro e contribuem significativamente para a produtividade dos ruminantes. O hospedeiro também usa biomassa microbiana e alguns componentes da ração não fermentados, uma vez que estes saem do rúmen para o restante do trato digestivo. Os ruminantes desenvolveram várias anatomias e comportamentos ruminais para se desenvolverem em uma variedade de espécies de plantas e essa flexibilidade permitiu que ocupassem muitos habitats diferentes, abrangendo uma ampla variedade de climas 2. Esses também foram fatores importantes em sua domesticação, permitindo a conversão de material vegetal indigestível para o homem em produtos de origem animal prontamente acessíveis, especialmente laticínios, carne e fibras úteis. Os ruminantes, portanto, desempenharam um papel vital no sustento e no desenvolvimento de muitas culturas humanas, além de serem usados ​​como animais de tração e terem valores religiosos e de status.

Micróbios ruminais podem ser atribuídos a diferentes grupos funcionais, como celulolíticos, amilolíticos, proteolíticos, etc., que degradam a grande variedade de componentes da alimentação ou metabolizam ainda alguns dos produtos formados por outros micróbios 3. Por exemplo, os metanogênios, as arquéias formadoras de metano, estão entre aqueles que metabolizam o hidrogênio formado por alguns micróbios fermentativos para formar o metano. O metano gerado durante esta fermentação contribui para as emissões antropogênicas globais de gases de efeito estufa 4 e representa uma perda de 2–12% da energia alimentar do animal 5. As diferenças nas comunidades microbianas do rúmen estão subjacentes às variações na formação de metano 6 e na conversão de ração em produtos de origem animal 7,8. Portanto, compreender essas comunidades é a chave para entender as transformações ruminais de material vegetal em produtos ruminantes indesejáveis ​​e úteis.

O objetivo deste estudo foi determinar a composição da microbiota em amostras de rúmen e intestino anterior de 742 animais individuais de todo o mundo. O conjunto de dados resultante nos permitiu determinar que os fatores dietéticos dominam as espécies hospedeiras na determinação da composição da comunidade microbiana, identificar os micróbios dominantes e suas associações potenciais e descrever o grau de similaridade das comunidades microbianas do rúmen em todo o mundo.


Conteúdo

A bioinformática se tornou uma parte importante de muitas áreas da biologia. Na biologia molecular experimental, as técnicas de bioinformática, como processamento de imagem e sinal, permitem a extração de resultados úteis de grandes quantidades de dados brutos. No campo da genética, auxilia no sequenciamento e anotação de genomas e suas mutações observadas. Ele desempenha um papel na mineração de texto da literatura biológica e no desenvolvimento de ontologias biológicas e genéticas para organizar e consultar dados biológicos. Ele também desempenha um papel na análise da expressão e regulação de genes e proteínas. As ferramentas de bioinformática auxiliam na comparação, análise e interpretação de dados genéticos e genômicos e, de maneira mais geral, na compreensão dos aspectos evolutivos da biologia molecular. Em um nível mais integrado, ele ajuda a analisar e catalogar as redes e caminhos biológicos que são uma parte importante da biologia de sistemas. Em biologia estrutural, auxilia na simulação e modelagem de DNA, [2] RNA, [2] [3] proteínas [4], bem como nas interações biomoleculares. [5] [6] [7] [8]

Edição de História

Historicamente, o termo bioinformática não quis dizer o que significa hoje. Paulien Hogeweg e Ben Hesper o cunharam em 1970 para se referir ao estudo dos processos de informação em sistemas bióticos. [9] [10] [11] Esta definição colocou a bioinformática como um campo paralelo à bioquímica (o estudo de processos químicos em sistemas biológicos). [9]

Edição de Sequências

Os computadores tornaram-se essenciais na biologia molecular quando as sequências de proteínas se tornaram disponíveis depois que Frederick Sanger determinou a sequência da insulina no início dos anos 1950. Comparar várias sequências manualmente acabou sendo impraticável. Uma pioneira nesse campo foi Margaret Oakley Dayhoff. [12] Ela compilou um dos primeiros bancos de dados de sequência de proteínas, inicialmente publicado como livros [13] e métodos pioneiros de alinhamento de sequência e evolução molecular. [14] Outro contribuidor inicial da bioinformática foi Elvin A. Kabat, que foi o pioneiro na análise de sequências biológicas em 1970 com seus volumes abrangentes de sequências de anticorpos lançadas com Tai Te Wu entre 1980 e 1991. [15] Na década de 1970, novas técnicas para sequenciamento de DNA foram aplicados ao bacteriófago MS2 e øX174, e as sequências de nucleotídeos estendidas foram então analisadas com algoritmos informativos e estatísticos. Esses estudos ilustraram que recursos bem conhecidos, como os segmentos de codificação e o código tripleto, são revelados em análises estatísticas diretas e foram, portanto, a prova do conceito de que a bioinformática seria criteriosa. [16] [17]

Edição de metas

Para estudar como as atividades celulares normais são alteradas em diferentes estados de doença, os dados biológicos devem ser combinados para formar um quadro abrangente dessas atividades. Portanto, o campo da bioinformática evoluiu tanto que a tarefa mais urgente agora envolve a análise e interpretação de vários tipos de dados. Isso também inclui sequências de nucleotídeos e aminoácidos, domínios de proteínas e estruturas de proteínas. [18] O processo real de análise e interpretação de dados é conhecido como biologia computacional. Subdisciplinas importantes dentro da bioinformática e biologia computacional incluem:

  • Desenvolvimento e implementação de programas informáticos que permitem o acesso, gestão e utilização eficientes de vários tipos de informação.
  • Desenvolvimento de novos algoritmos (fórmulas matemáticas) e medidas estatísticas que avaliam as relações entre os membros de grandes conjuntos de dados. Por exemplo, existem métodos para localizar um gene dentro de uma sequência, para prever a estrutura e / ou função da proteína e para agrupar as sequências de proteínas em famílias de sequências relacionadas.

O objetivo principal da bioinformática é aumentar a compreensão dos processos biológicos. O que o diferencia de outras abordagens, no entanto, é seu foco no desenvolvimento e na aplicação de técnicas intensivas de computação para atingir esse objetivo. Os exemplos incluem: reconhecimento de padrões, mineração de dados, algoritmos de aprendizado de máquina e visualização. Os principais esforços de pesquisa no campo incluem alinhamento de sequência, descoberta de genes, montagem do genoma, design de drogas, descoberta de drogas, alinhamento da estrutura da proteína, previsão da estrutura da proteína, previsão da expressão gênica e interações proteína-proteína, estudos de associação de todo o genoma, modelagem da evolução e divisão celular / mitose.

A bioinformática agora envolve a criação e o avanço de bancos de dados, algoritmos, técnicas computacionais e estatísticas e teoria para resolver problemas formais e práticos decorrentes do gerenciamento e análise de dados biológicos.

Nas últimas décadas, os rápidos desenvolvimentos em genômica e outras tecnologias de pesquisa molecular e desenvolvimentos em tecnologias da informação se combinaram para produzir uma enorme quantidade de informações relacionadas à biologia molecular. Bioinformática é o nome dado a essas abordagens matemáticas e computacionais usadas para colher a compreensão dos processos biológicos.

As atividades comuns em bioinformática incluem mapear e analisar sequências de DNA e proteínas, alinhar sequências de DNA e proteínas para compará-las e criar e visualizar modelos 3-D de estruturas de proteínas.

Relação com outros campos Editar

Bioinformática é um campo da ciência semelhante, mas distinto da computação biológica, embora seja frequentemente considerada sinônimo de biologia computacional. A computação biológica usa bioengenharia e biologia para construir computadores biológicos, enquanto a bioinformática usa computação para entender melhor a biologia. A bioinformática e a biologia computacional envolvem a análise de dados biológicos, particularmente DNA, RNA e sequências de proteínas. O campo da bioinformática experimentou um crescimento explosivo a partir de meados da década de 1990, impulsionado em grande parte pelo Projeto Genoma Humano e pelos rápidos avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA.

Analisar dados biológicos para produzir informações significativas envolve escrever e executar programas de software que usam algoritmos da teoria dos grafos, inteligência artificial, computação suave, mineração de dados, processamento de imagens e simulação de computador. Os algoritmos, por sua vez, dependem de fundamentos teóricos, como matemática discreta, teoria de controle, teoria de sistema, teoria da informação e estatística.

Desde que o Phage Φ-X174 foi sequenciado em 1977, [19] as sequências de DNA de milhares de organismos foram decodificadas e armazenadas em bancos de dados. Essas informações de sequência são analisadas para determinar genes que codificam proteínas, genes de RNA, sequências regulatórias, motivos estruturais e sequências repetitivas. Uma comparação de genes dentro de uma espécie ou entre espécies diferentes pode mostrar semelhanças entre funções de proteínas ou relações entre espécies (o uso de sistemática molecular para construir árvores filogenéticas). Com a crescente quantidade de dados, há muito tempo tornou-se impraticável analisar manualmente as sequências de DNA. Programas de computador como o BLAST são usados ​​rotineiramente para pesquisar sequências - a partir de 2008, em mais de 260.000 organismos, contendo mais de 190 bilhões de nucleotídeos. [20]

Edição de sequenciamento de DNA

Antes que as sequências possam ser analisadas, elas devem ser obtidas no banco de armazenamento de dados, como o Genbank. O sequenciamento de DNA ainda é um problema não trivial, pois os dados brutos podem ser ruidosos ou afetados por sinais fracos. Algoritmos foram desenvolvidos para a chamada de base para as várias abordagens experimentais de sequenciamento de DNA.

Edição de montagem de sequência

A maioria das técnicas de sequenciamento de DNA produz pequenos fragmentos de sequência que precisam ser montados para obter sequências completas do gene ou do genoma. A chamada técnica de sequenciamento shotgun (que foi usada, por exemplo, pelo The Institute for Genomic Research (TIGR) para sequenciar o primeiro genoma bacteriano, Haemophilus influenzae) [21] gera as sequências de muitos milhares de pequenos fragmentos de DNA (variando de 35 a 900 nucleotídeos de comprimento, dependendo da tecnologia de sequenciamento). As extremidades desses fragmentos se sobrepõem e, quando alinhadas corretamente por um programa de montagem do genoma, podem ser usadas para reconstruir o genoma completo. O sequenciamento Shotgun produz dados de sequência rapidamente, mas a tarefa de montar os fragmentos pode ser bastante complicada para genomas maiores. Para um genoma tão grande quanto o genoma humano, pode levar muitos dias de tempo de CPU em computadores com grande memória e multiprocessadores para montar os fragmentos, e a montagem resultante geralmente contém várias lacunas que devem ser preenchidas posteriormente. O sequenciamento Shotgun é o método de escolha para praticamente todos os genomas sequenciados hoje [ quando? ], e algoritmos de montagem de genoma são uma área crítica da pesquisa de bioinformática.

Edição de anotação de genoma

No contexto da genômica, a anotação é o processo de marcar os genes e outras características biológicas em uma sequência de DNA. Esse processo precisa ser automatizado porque a maioria dos genomas são muito grandes para serem anotados à mão, sem mencionar o desejo de anotar o maior número possível de genomas, já que a taxa de sequenciamento deixou de ser um gargalo. A anotação é possível pelo fato de que os genes têm regiões de início e parada reconhecíveis, embora a sequência exata encontrada nessas regiões possa variar entre os genes.

A primeira descrição de um sistema de anotação do genoma abrangente foi publicada em 1995 [21] pela equipe do The Institute for Genomic Research que realizou o primeiro sequenciamento e análise completos do genoma de um organismo de vida livre, a bactéria Haemophilus influenzae. [21] Owen White projetou e construiu um sistema de software para identificar os genes que codificam todas as proteínas, RNAs de transferência, RNAs ribossômicos (e outros locais) e para fazer atribuições funcionais iniciais. A maioria dos sistemas de anotação de genoma atuais funcionam de maneira semelhante, mas os programas disponíveis para análise de DNA genômico, como o programa GeneMark, são treinados e usados ​​para encontrar genes que codificam proteínas em Haemophilus influenzae, estão constantemente mudando e melhorando.

Seguindo as metas que o Projeto Genoma Humano deixava de atingir após seu fechamento em 2003, surgiu um novo projeto desenvolvido pelo Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano dos EUA. O chamado projeto ENCODE é uma coleta colaborativa de dados dos elementos funcionais do genoma humano que usa tecnologias de sequenciamento de DNA de última geração e matrizes genômicas, tecnologias capazes de gerar automaticamente grandes quantidades de dados a um custo por base drasticamente reduzido mas com a mesma precisão (erro de chamada de base) e fidelidade (erro de montagem).

Biologia evolutiva computacional Editar

Biologia evolutiva é o estudo da origem e descendência das espécies, bem como sua mudança ao longo do tempo. A informática tem ajudado os biólogos evolucionistas, permitindo aos pesquisadores:

  • rastrear a evolução de um grande número de organismos medindo as mudanças em seu DNA, em vez de apenas por meio de taxonomia física ou observações fisiológicas,
  • comparar genomas inteiros, o que permite o estudo de eventos evolutivos mais complexos, como duplicação de genes, transferência horizontal de genes e a previsão de fatores importantes na especiação bacteriana,
  • construir modelos computacionais de genética populacional complexos para prever o resultado do sistema ao longo do tempo [22]
  • rastrear e compartilhar informações sobre um número cada vez maior de espécies e organismos

O trabalho futuro se empenha em reconstruir a agora mais complexa árvore da vida. [ de acordo com quem? ]

A área de pesquisa em ciência da computação que usa algoritmos genéticos às vezes é confundida com biologia evolutiva computacional, mas as duas áreas não estão necessariamente relacionadas.

Edição de genômica comparativa

O núcleo da análise comparativa do genoma é o estabelecimento da correspondência entre genes (análise ortológica) ou outras características genômicas em diferentes organismos. São esses mapas intergenômicos que permitem rastrear os processos evolutivos responsáveis ​​pela divergência de dois genomas. Uma multidão de eventos evolutivos atuando em vários níveis organizacionais moldam a evolução do genoma. No nível mais baixo, as mutações pontuais afetam os nucleotídeos individuais. Em um nível superior, grandes segmentos cromossômicos sofrem duplicação, transferência lateral, inversão, transposição, deleção e inserção. [23] Em última análise, genomas inteiros estão envolvidos em processos de hibridização, poliploidização e endossimbiose, geralmente levando à rápida especiação. A complexidade da evolução do genoma apresenta muitos desafios emocionantes para desenvolvedores de modelos e algoritmos matemáticos, que recorrem a um espectro de técnicas algorítmicas, estatísticas e matemáticas, que vão desde algoritmos exatos, heurísticos, parâmetros fixos e algoritmos de aproximação para problemas baseados em modelos de parcimônia até Markov algoritmos de Monte Carlo em cadeia para análise bayesiana de problemas baseados em modelos probabilísticos.

Muitos desses estudos são baseados na detecção de homologia de sequência para atribuir sequências a famílias de proteínas. [24]

Editar Pan genomics

Pan genomics é um conceito introduzido em 2005 por Tettelin e Medini que eventualmente se enraizou na bioinformática. Pan genoma é o repertório completo de genes de um determinado grupo taxonômico: embora inicialmente aplicado a cepas estreitamente relacionadas de uma espécie, pode ser aplicado a um contexto maior como gênero, filo etc. É dividido em duas partes- O genoma central: Conjunto de genes comuns a todos os genomas em estudo (esses geralmente são genes domésticos vitais para a sobrevivência) e O Genoma Dispensável / Flexível: Conjunto de genes não presentes em todos, exceto em um ou alguns genomas em estudo. Uma ferramenta de bioinformática BPGA pode ser usada para caracterizar o Pan Genoma de espécies bacterianas. [25]

Genética da doença Editar

Com o advento do sequenciamento de próxima geração, estamos obtendo dados de sequência suficientes para mapear os genes de doenças complexas, infertilidade, [26] câncer de mama [27] ou doença de Alzheimer. [28] Os estudos de associação do genoma são uma abordagem útil para identificar as mutações responsáveis ​​por essas doenças complexas. [29] Por meio desses estudos, milhares de variantes de DNA foram identificadas e estão associadas a doenças e características semelhantes. [30] Além disso, a possibilidade de os genes serem usados ​​no prognóstico, diagnóstico ou tratamento é uma das aplicações mais essenciais. Muitos estudos estão discutindo as maneiras promissoras de escolher os genes a serem usados ​​e os problemas e armadilhas do uso de genes para prever a presença ou o prognóstico de doenças. [31]

Análise de mutações no câncer Editar

No câncer, os genomas das células afetadas são reorganizados de maneiras complexas ou mesmo imprevisíveis. Esforços massivos de sequenciamento são usados ​​para identificar mutações pontuais anteriormente desconhecidas em uma variedade de genes no câncer. Os bioinformáticos continuam a produzir sistemas automatizados especializados para gerenciar o grande volume de dados de sequência produzidos e criam novos algoritmos e software para comparar os resultados do sequenciamento à coleção crescente de sequências do genoma humano e polimorfismos da linha germinativa. Novas tecnologias de detecção física são empregadas, como microarranjos de oligonucleotídeos para identificar ganhos e perdas cromossômicas (chamados de hibridização genômica comparativa) e matrizes de polimorfismo de nucleotídeo único para detectar mutações pontuais. Esses métodos de detecção medem simultaneamente várias centenas de milhares de locais em todo o genoma e, quando usados ​​em alto rendimento para medir milhares de amostras, geram terabytes de dados por experimento. Mais uma vez, as enormes quantidades e novos tipos de dados geram novas oportunidades para os bioinformáticos. Os dados costumam conter considerável variabilidade, ou ruído, e, portanto, o modelo de Markov Oculto e os métodos de análise de ponto de mudança estão sendo desenvolvidos para inferir mudanças no número de cópias reais.

Dois princípios importantes podem ser usados ​​na análise de genomas de câncer bioinformaticamente relativos à identificação de mutações no exoma. Primeiro, o câncer é uma doença de mutações somáticas acumuladas nos genes. O segundo câncer contém mutações de driver que precisam ser diferenciadas dos passageiros. [32]

Com os avanços que esta tecnologia de sequenciamento de última geração está proporcionando ao campo da bioinformática, a genômica do câncer pode mudar drasticamente. Esses novos métodos e software permitem que os bioinformáticos sequenciem muitos genomas de câncer de forma rápida e acessível. Isso poderia criar um processo mais flexível para classificar os tipos de câncer por meio da análise de mutações causadas pelo câncer no genoma. Além disso, o rastreamento de pacientes enquanto a doença progride pode ser possível no futuro com a sequência de amostras de câncer. [33]

Outro tipo de dado que requer novo desenvolvimento de informática é a análise de lesões consideradas recorrentes em muitos tumores.

Análise da expressão gênica Editar

A expressão de muitos genes pode ser determinada medindo os níveis de mRNA com várias técnicas, incluindo microarrays, sequenciamento de tag de sequência de cDNA expresso (EST), sequenciamento de tag de análise em série de expressão gênica (SAGE), sequenciamento de assinatura massivamente paralela (MPSS), RNA-Seq, também conhecido como "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing" (WTSS) ou várias aplicações de hibridização in-situ multiplexada. Todas essas técnicas são extremamente propensas a ruídos e / ou sujeitas a vieses na medição biológica, e uma importante área de pesquisa em biologia computacional envolve o desenvolvimento de ferramentas estatísticas para separar o sinal do ruído em estudos de expressão gênica de alto rendimento. [34] Esses estudos são frequentemente usados ​​para determinar os genes implicados em um distúrbio: pode-se comparar dados de microarranjos de células epiteliais cancerosas com dados de células não cancerosas para determinar os transcritos que são regulados para cima e para baixo em uma determinada população de células cancerosas.

Análise da expressão da proteína Editar

Microarrays de proteínas e espectrometria de massa (MS) de alto rendimento (HT) podem fornecer um instantâneo das proteínas presentes em uma amostra biológica. A bioinformática está muito envolvida em dar sentido aos dados de microarray de proteínas e HT MS - a primeira abordagem enfrenta problemas semelhantes aos de microarrays direcionados a mRNA, a última envolve o problema de combinar grandes quantidades de dados de massa contra massas previstas de bancos de dados de sequência de proteínas, e o análise estatística complicada de amostras onde vários, mas péptidos incompletos de cada proteína são detectados. A localização de proteínas celulares em um contexto de tecido pode ser alcançada por meio de proteômica de afinidade exibida como dados espaciais baseados em imunohistoquímica e microarranjos de tecido. [35]

Análise do regulamento Editar

A regulação gênica é a orquestração complexa de eventos pela qual um sinal, potencialmente um sinal extracelular como um hormônio, acaba levando a um aumento ou diminuição na atividade de uma ou mais proteínas. Técnicas de bioinformática têm sido aplicadas para explorar as várias etapas desse processo.

Por exemplo, a expressão do gene pode ser regulada por elementos próximos no genoma. A análise do promotor envolve a identificação e o estudo de motivos de sequência no DNA em torno da região codificadora de um gene. Esses motivos influenciam a extensão em que essa região é transcrita em mRNA. Elementos estimuladores distantes do promotor também podem regular a expressão gênica, por meio de interações de looping tridimensionais. Essas interações podem ser determinadas por análise bioinformática de experimentos de captura de conformação cromossômica.

Os dados de expressão podem ser usados ​​para inferir a regulação do gene: pode-se comparar os dados de microarranjos de uma ampla variedade de estados de um organismo para formar hipóteses sobre os genes envolvidos em cada estado. Em um organismo unicelular, pode-se comparar estágios do ciclo celular, juntamente com várias condições de estresse (choque térmico, fome, etc.). Pode-se então aplicar algoritmos de agrupamento aos dados de expressão para determinar quais genes são coexpressos. Por exemplo, as regiões a montante (promotores) de genes co-expressos podem ser pesquisados ​​por elementos reguladores sobre-representados. Exemplos de algoritmos de agrupamento aplicados no agrupamento de genes são agrupamento k-means, mapas de auto-organização (SOMs), agrupamento hierárquico e métodos de agrupamento de consenso.

Várias abordagens foram desenvolvidas para analisar a localização de organelas, genes, proteínas e outros componentes dentro das células. Isso é relevante porque a localização desses componentes afeta os eventos dentro de uma célula e, portanto, nos ajuda a prever o comportamento dos sistemas biológicos. Uma categoria de ontologia genética, componente celular, foi desenvolvido para capturar a localização subcelular em muitos bancos de dados biológicos.

Microscopia e análise de imagem Editar

Imagens microscópicas nos permitem localizar tanto organelas quanto moléculas. Também pode nos ajudar a distinguir entre células normais e anormais, por ex. no câncer.

Edição de localização de proteína

A localização de proteínas nos ajuda a avaliar o papel de uma proteína. Por exemplo, se uma proteína for encontrada no núcleo, ela pode estar envolvida na regulação ou no splicing do gene. Por outro lado, se uma proteína for encontrada na mitocôndria, ela pode estar envolvida na respiração ou em outros processos metabólicos. A localização da proteína é, portanto, um componente importante da previsão da função da proteína. Existem recursos de previsão de localização subcelular de proteínas bem desenvolvidos disponíveis, incluindo bancos de dados de localização subcelular de proteínas e ferramentas de previsão. [36] [37]

Organização nuclear da cromatina Editar

Dados de experimentos de captura de conformação cromossômica de alto rendimento, como Hi-C (experimento) e ChIA-PET, podem fornecer informações sobre a proximidade espacial de loci de DNA. A análise desses experimentos pode determinar a estrutura tridimensional e a organização nuclear da cromatina. Os desafios da bioinformática neste campo incluem a partição do genoma em domínios, como domínios de associação topológica (TADs), que são organizados em um espaço tridimensional. [38]

A previsão da estrutura da proteína é outra aplicação importante da bioinformática. A sequência de aminoácidos de uma proteína, a chamada estrutura primária, pode ser facilmente determinada a partir da sequência do gene que a codifica. Na grande maioria dos casos, essa estrutura primária determina exclusivamente uma estrutura em seu ambiente nativo. (Claro, há exceções, como o príon da encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca).) O conhecimento dessa estrutura é vital para a compreensão da função da proteína. As informações estruturais são geralmente classificadas como uma de secundário, terciário e quaternário estrutura. Uma solução geral viável para tais previsões permanece um problema aberto. A maioria dos esforços até agora foram direcionados para heurísticas que funcionam na maior parte do tempo. [ citação necessária ]

Uma das idéias-chave da bioinformática é a noção de homologia. No ramo genômico da bioinformática, a homologia é usada para prever a função de um gene: se a sequência do gene UMA, cuja função é conhecida, é homóloga à sequência do gene B, cuja função é desconhecida, pode-se inferir que B pode compartilhar a função de A. No ramo estrutural da bioinformática, a homologia é usada para determinar quais partes de uma proteína são importantes na formação da estrutura e na interação com outras proteínas. Em uma técnica chamada modelagem de homologia, essa informação é usada para prever a estrutura de uma proteína, uma vez que a estrutura de uma proteína homóloga é conhecida. Atualmente, essa é a única maneira de prever estruturas de proteínas de maneira confiável.

Um exemplo disso é a hemoglobina em humanos e a hemoglobina em leguminosas (leghemoglobina), que são parentes distantes da mesma superfamília de proteínas. Ambos têm o mesmo propósito de transportar oxigênio no organismo. Embora ambas as proteínas tenham sequências de aminoácidos completamente diferentes, suas estruturas de proteínas são virtualmente idênticas, o que reflete seus propósitos quase idênticos e ancestrais compartilhados. [39]

Outras técnicas para prever a estrutura da proteína incluem encadeamento de proteínas e de novo (do zero) modelagem baseada na física.

Outro aspecto da bioinformática estrutural inclui o uso de estruturas de proteínas para modelos de triagem virtual, como modelos de relação estrutura-atividade quantitativa e modelos proteoquimétricos (PCM). Além disso, a estrutura de cristal de uma proteína pode ser usada na simulação de, por exemplo, estudos de ligação de ligante e em sílico estudos de mutagênese.

Análise de rede busca entender as relações dentro de redes biológicas, como redes metabólicas ou de interação proteína-proteína. Embora as redes biológicas possam ser construídas a partir de um único tipo de molécula ou entidade (como genes), a biologia da rede muitas vezes tenta integrar muitos tipos de dados diferentes, como proteínas, pequenas moléculas, dados de expressão gênica e outros, que estão todos conectados fisicamente , funcionalmente ou ambos.

Biologia de sistemas envolve o uso de simulações de computador de subsistemas celulares (como as redes de metabólitos e enzimas que compõem o metabolismo, as vias de transdução de sinal e as redes regulatórias de genes) para analisar e visualizar as conexões complexas desses processos celulares. A vida artificial ou evolução virtual tenta entender os processos evolutivos por meio da simulação de computador de formas de vida simples (artificiais).

Redes de interação molecular Editar

Dezenas de milhares de estruturas tridimensionais de proteínas foram determinadas por cristalografia de raios-X e espectroscopia de ressonância magnética nuclear de proteínas (NMR de proteínas) e uma questão central em bioinformática estrutural é se é prático prever possíveis interações proteína-proteína apenas com base nestes Formas 3D, sem realizar experimentos de interação proteína-proteína. Uma variedade de métodos foram desenvolvidos para lidar com o problema de docking proteína-proteína, embora pareça que ainda há muito trabalho a ser feito neste campo.

Outras interações encontradas no campo incluem proteína-ligante (incluindo drogas) e proteína-peptídeo. A simulação dinâmica molecular do movimento dos átomos sobre ligações rotativas é o princípio fundamental por trás dos algoritmos computacionais, denominados algoritmos de docking, para estudar as interações moleculares.

Análise de literatura Editar

O crescimento no número de literatura publicada torna virtualmente impossível a leitura de todos os artigos, resultando em subcampos de pesquisa desarticulados. A análise da literatura visa empregar linguística computacional e estatística para explorar essa biblioteca crescente de recursos de texto. Por exemplo:

  • Reconhecimento de abreviatura - identifica a forma longa e a abreviatura dos termos biológicos
  • Reconhecimento de entidade nomeada - reconhecer termos biológicos, como nomes de genes
  • Interação proteína-proteína - identifica quais proteínas interagem com quais proteínas do texto

A área de pesquisa baseia-se na estatística e na linguística computacional.

Análise de imagem de alto rendimento Editar

As tecnologias computacionais são usadas para acelerar ou automatizar totalmente o processamento, quantificação e análise de grandes quantidades de imagens biomédicas com alto conteúdo de informação. Os sistemas modernos de análise de imagens aumentam a capacidade do observador de fazer medições a partir de um conjunto grande ou complexo de imagens, melhorando a precisão, objetividade ou velocidade. Um sistema de análise totalmente desenvolvido pode substituir completamente o observador. Embora esses sistemas não sejam exclusivos das imagens biomédicas, as imagens biomédicas estão se tornando mais importantes para diagnósticos e pesquisas. Alguns exemplos são:

  • quantificação de alto rendimento e alta fidelidade e localização subcelular (triagem de alto conteúdo, cito-histopatologia, informática de bioimagem)
  • análise e visualização de imagens clínicas
  • determinar os padrões de fluxo de ar em tempo real nos pulmões de respiração de animais vivos
  • quantificar o tamanho da oclusão em imagens em tempo real a partir do desenvolvimento e da recuperação durante a lesão arterial
  • fazer observações comportamentais a partir de gravações de vídeo extensas de animais de laboratório
  • medições infravermelhas para determinação da atividade metabólica
  • inferir sobreposições de clones no mapeamento de DNA, e. a pontuação Sulston

Análise de dados de célula única de alto rendimento Editar

Técnicas computacionais são usadas para analisar dados de célula única de alto rendimento e baixa medição, como os obtidos por citometria de fluxo. Esses métodos geralmente envolvem a localização de populações de células que são relevantes para um determinado estado de doença ou condição experimental.

Edição de informática sobre biodiversidade

A informática sobre biodiversidade lida com a coleta e análise de dados de biodiversidade, como bancos de dados taxonômicos ou dados de microbiomas. Exemplos de tais análises incluem filogenética, modelagem de nicho, mapeamento de riqueza de espécies, código de barras de DNA ou ferramentas de identificação de espécies.

Ontologias e integração de dados Editar

Ontologias biológicas são gráficos acíclicos direcionados de vocabulários controlados. Eles são projetados para capturar conceitos e descrições biológicas de uma forma que possam ser facilmente categorizados e analisados ​​por computadores. Quando categorizado desta forma, é possível obter valor agregado de uma análise holística e integrada.

A OBO Foundry foi um esforço para padronizar certas ontologias. Uma das mais difundidas é a ontologia Gene, que descreve a função do gene. Existem também ontologias que descrevem fenótipos.

Os bancos de dados são essenciais para pesquisas e aplicações de bioinformática. Existem muitas bases de dados, abrangendo vários tipos de informação: por exemplo, sequências de DNA e proteínas, estruturas moleculares, fenótipos e biodiversidade. Os bancos de dados podem conter dados empíricos (obtidos diretamente de experimentos), dados previstos (obtidos de análises) ou, mais comumente, ambos. Eles podem ser específicos para um determinado organismo, via ou molécula de interesse. Como alternativa, eles podem incorporar dados compilados de vários outros bancos de dados. Esses bancos de dados variam em seu formato, mecanismo de acesso e se são públicos ou não.

Alguns dos bancos de dados mais comumente usados ​​estão listados abaixo. Para uma lista mais abrangente, verifique o link no início da subseção.

  • Usado na análise de sequência biológica: Genbank, UniProt
  • Usado na análise de estrutura: Protein Data Bank (PDB)
  • Usado na descoberta de famílias de proteínas e descoberta de motivos: InterPro, Pfam
  • Usado para Sequenciamento de Próxima Geração: Arquivo de Leitura de Sequência
  • Usado em Análise de Rede: Bancos de Dados de Via Metabólica (KEGG, BioCyc), Bancos de Dados de Análise de Interação, Redes Funcionais
  • Usado no projeto de circuitos genéticos sintéticos: GenoCAD

As ferramentas de software para bioinformática variam de ferramentas de linha de comando simples a programas gráficos mais complexos e serviços da Web autônomos disponíveis em várias empresas de bioinformática ou instituições públicas.

Software de bioinformática de código aberto Editar

Muitas ferramentas de software livre e de código aberto existem e continuam a crescer desde a década de 1980. [40] A combinação de uma necessidade contínua de novos algoritmos para a análise de tipos emergentes de leituras biológicas, o potencial de inovação em sílico experimentos e bases de código aberto disponíveis gratuitamente ajudaram a criar oportunidades para todos os grupos de pesquisa contribuírem tanto com a bioinformática quanto com a variedade de software de código aberto disponível, independentemente de seus arranjos de financiamento. As ferramentas de código aberto geralmente atuam como incubadoras de ideias ou plug-ins com suporte da comunidade em aplicativos comerciais. Eles também podem fornecer de fato padrões e modelos de objetos compartilhados para auxiliar no desafio da integração da bioinformação.

A gama de pacotes de software de código aberto inclui títulos como Bioconductor, BioPerl, Biopython, BioJava, BioJS, BioRuby, Bioclipse, EMBOSS, .NET Bio, Orange com seu complemento de bioinformática, Apache Taverna, UGENE e GenoCAD. Para manter essa tradição e criar mais oportunidades, a Open Bioinformatics Foundation [40] sem fins lucrativos apoiou a Bioinformatics Open Source Conference (BOSC) anual desde 2000. [41]

Um método alternativo para construir bancos de dados públicos de bioinformática é usar o mecanismo MediaWiki com o WikiOpener extensão. Este sistema permite que o banco de dados seja acessado e atualizado por todos os especialistas da área. [42]

Serviços da Web em bioinformática Editar

As interfaces baseadas em SOAP e REST foram desenvolvidas para uma ampla variedade de aplicativos de bioinformática, permitindo que um aplicativo em execução em um computador em uma parte do mundo use algoritmos, dados e recursos de computação em servidores em outras partes do mundo. As principais vantagens derivam do fato de que os usuários finais não precisam lidar com sobrecargas de manutenção de software e banco de dados.

Os serviços básicos de bioinformática são classificados pelo EBI em três categorias: SSS (Sequence Search Services), MSA (Multiple Sequence Alignment) e BSA (Biological Sequence Analysis). [43] A disponibilidade desses recursos de bioinformática orientada a serviços demonstra a aplicabilidade de soluções de bioinformática baseadas na web e variam de uma coleção de ferramentas autônomas com um formato de dados comum em uma interface única, autônoma ou baseada na web, até integrativa, distribuída e sistemas de gerenciamento de fluxo de trabalho de bioinformática extensíveis.

Sistemas de gerenciamento de fluxo de trabalho de bioinformática Editar

Um sistema de gerenciamento de fluxo de trabalho de bioinformática é uma forma especializada de um sistema de gerenciamento de fluxo de trabalho projetado especificamente para compor e executar uma série de etapas computacionais ou de manipulação de dados, ou um fluxo de trabalho, em um aplicativo de Bioinformática. Esses sistemas são projetados para

  • fornecem um ambiente fácil de usar para os próprios cientistas de aplicativos criarem seus próprios fluxos de trabalho,
  • fornecem ferramentas interativas para os cientistas, permitindo-lhes executar seus fluxos de trabalho e visualizar seus resultados em tempo real,
  • simplificar o processo de compartilhamento e reutilização de fluxos de trabalho entre os cientistas e
  • permitem que os cientistas rastreiem a proveniência dos resultados da execução do fluxo de trabalho e as etapas de criação do fluxo de trabalho.

Edição de objetos BioCompute e BioCompute

Em 2014, a US Food and Drug Administration patrocinou uma conferência realizada no National Institutes of Health Bethesda Campus para discutir a reprodutibilidade em bioinformática. [44] Nos próximos três anos, um consórcio de partes interessadas se reuniu regularmente para discutir o que se tornaria o paradigma BioCompute. [45] Essas partes interessadas incluíam representantes do governo, indústria e entidades acadêmicas. Os líderes da sessão representaram vários ramos dos Institutos e Centros do FDA e do NIH, entidades sem fins lucrativos, incluindo o Projeto Variome Humano e a Federação Europeia de Informática Médica, e instituições de pesquisa como Stanford, o Centro Genoma de Nova York e a Universidade George Washington.

Foi decidido que o paradigma BioCompute seria na forma de 'cadernos de laboratório' digitais que permitem a reprodutibilidade, replicação, revisão e reutilização de protocolos de bioinformática. Isso foi proposto para permitir uma maior continuidade dentro de um grupo de pesquisa ao longo do fluxo normal de pessoal, ao mesmo tempo em que promove a troca de ideias entre os grupos. O FDA dos EUA financiou esse trabalho para que as informações sobre dutos fossem mais transparentes e acessíveis para sua equipe reguladora. [46]

Em 2016, o grupo se reuniu novamente no NIH em Bethesda e discutiu o potencial de um objeto BioCompute, uma instância do paradigma BioCompute. Este trabalho foi copiado como um documento de "uso de teste padrão" e um papel pré-impresso carregado no bioRxiv. O objeto BioCompute permite que o registro JSON seja compartilhado entre funcionários, colaboradores e reguladores. [47] [48]

As plataformas de software projetadas para ensinar conceitos e métodos de bioinformática incluem Rosalind e cursos online oferecidos pelo Portal de Treinamento do Instituto Suíço de Bioinformática. Os workshops canadenses de bioinformática fornecem vídeos e slides de workshops de treinamento em seu site sob uma licença Creative Commons. O projeto 4273π ou projeto 4273pi [49] também oferece materiais educacionais de código aberto gratuitamente. O curso funciona em computadores Raspberry Pi de baixo custo e tem sido usado para ensinar adultos e alunos em escolas.[50] [51] 4273π é desenvolvido ativamente por um consórcio de acadêmicos e equipes de pesquisa que executaram bioinformática de nível de pesquisa usando computadores Raspberry Pi e o sistema operacional 4273π. [52] [53]

As plataformas MOOC também fornecem certificações online em bioinformática e disciplinas relacionadas, incluindo a Coursera's Bioinformatics Specialization (UC San Diego) e Genomic Data Science Specialization (Johns Hopkins), bem como a Data Analysis for Life Sciences XSeries da EdX (Harvard). A University of Southern California oferece um mestrado em bioinformática translacional com foco em aplicações biomédicas.

Existem várias grandes conferências que se preocupam com a bioinformática. Alguns dos exemplos mais notáveis ​​são Sistemas Inteligentes para Biologia Molecular (ISMB), Conferência Europeia sobre Biologia Computacional (ECCB) e Pesquisa em Biologia Molecular Computacional (RECOMB).


Assista o vídeo: Jamie Hyneman Answers: Whats One Myth Youve Always Wanted to Test? (Janeiro 2022).