Em formação

Eu adicionei etanol à minha extração de RNA TRizol


Eu adicionei etanol em vez de clorofórmio à suspensão de células em Trizol. Ainda posso obter minha fase aquosa?


Minha resposta é baseada em minha experiência no laboratório e algo como um melhor palpite - pode ou não funcionar. Mas, dado o fato de adicionar 100 µl de etanol a 500 µl do volume total e uma vez que a água e o etanol se misturam completamente, eu tentaria.

Não acho que o etanol mudaria tanto a polaridade da solução a ponto de inibir a separação de fases. A única coisa que consigo imaginar é a contaminação da fase aquosa com traços de fenol, então provavelmente faria uma limpeza mais cuidadosa e faria uma precipitação adicional de NaOAC / etanol no final do procedimento. Se você espera um pequeno pellet com poucos ácidos nucléicos, adicione um pouco de glicogênio para obter um resultado melhor. Eu agradeceria se você pudesse comentar sobre sua experiência (e o resultado) ao tentar salvar sua amostra.


5 dicas vitais para extração perfeita de RNA usando TRIzol

A extração de RNA usando TRIzol é uma das técnicas de biologia molecular mais comuns usadas em laboratório. Em comparação com os métodos de coluna de rotação, ele requer uma grande habilidade e experiência para ser dominado. Abaixo, eu compilei 5 dicas vitais que acredito podem fazer ou quebrar o processo de extração. Tente incorporar isso em seu procedimento para ver se pode melhorar sua técnica e, finalmente, dar-lhe um RNA super puro. Claro, essas dicas também são adequadas ao usar análogos de TRIzol, como TRIsure (Bioline) e QIAzol (Qiagen).


Alguém aqui fez uma extração de RNA?

No laboratório, estou trabalhando, estou trabalhando, ainda estou sendo treinado. Acabei de fazer minha terceira extração de RNA e os resultados foram horríveis. Eu sei que isso vem com a prática, mas alguém tem alguma dica útil? Eu faço extrações de RNA em raízes de Brachypodium / Oryza sativa com o mini kit de plantas RNeasy, começando com a trituração das raízes em um pilão e depois uma série de lavagens. Eu tento triturar o tecido o mais forte que posso e colocar o máximo que posso nos tubos de coleta, eu simplesmente não posso dizer se meu erro está na trituração / coleta ou nas lavagens, se eu não estou sendo cuidadoso o suficiente com minha micropipetagem. Agradecemos antecipadamente por todas as dicas úteis, gostaria de obter algumas boas amostras de RNA para que eu pudesse passar para RT-PCRs e sequenciamento.
Saúde!

[EDITAR]: Só para adicionar a isso, eu sou um estudante de graduação fazendo pesquisa - então eu realmente não tenho muito a dizer sobre o que eu uso / faço - eu tenho que usar o kit de planta e seguir o protocolo - apenas procurando por dicas para aproveitar ao máximo o que tenho. :)

De minha experiência (fiz milhares de extrações nos últimos dois anos), descarte os kits de coluna para extrações de TRIzol (também use glicogênio, incube a amostra em um -80 por 1-24 horas durante a etapa de precipitação e adicione uma segunda lavagem com etanol para o protocolo padrão, posso enviar meu protocolo modificado se você & # x27d quiser). Desde a mudança para este novo método, I & # x27ve teve uma taxa de sucesso de 100% com as últimas 300 amostras, ótimas especificações, alto rendimento e nenhuma degradação. Tive tantos problemas com os kits de coluna (taxa de sucesso de 60-80% com especificações menos do que perfeitas) que desisti deles.

Se você quiser continuar usando as colunas, tente estas coisas: Certifique-se de usar pontas filtradas para qualquer etapa que envolva RNA, certifique-se de que suas lavagens sejam completas (inverta e role os tubos para lavar todo o interior e a tampa antes de um gire) e use um aspirador ou pipeta para remover as lavagens (não apenas sacuda para fora do tubo de coleta).

* Edit: Aqui está o meu protocolo modificado, eu trabalho com células humanas, mas pode haver algumas etapas adicionais para o tecido da planta, então consulte o protocolo Thermo original para descobrir. Além disso, certifique-se de estar limpo ao redor do RNA e use alvejante 10% ou RNase Zap em suas luvas / área de trabalho / ferramentas para inibir qualquer RNase antes de trabalhar.

Indo para o segundo este protocolo. Trizol é uma merda. Também ouvi dizer que a poliacrilamida linear funciona ainda melhor do que o glicogênio como transportador de RNA.

Recomendação extra se OP quiser continuar usando as colunas (este protocolo combina o alto rendimento de Trizol com a facilidade / limpeza dos kits):

Siga o protocolo / u / what_are_you_saying & # x27s até a etapa 5 e, em seguida, transfira a fase aquosa para um tubo eppendorf livre de RNAse.

Os kits freqüentemente têm um "RNA limpo usando nosso protocolo de coluna". Use esse protocolo na broca aquosa do ponto acima.

Se o seu kit não tiver um "protocolo de limpeza de RNA", adicione tampão de lise / etanol às quantidades que você normalmente precisa para uma amostra líquida de 200uL. NÃO adicione beta-mercaptoetanol ou proteinase K. Adicione esta mistura à coluna e purifique o RNA normalmente de acordo com as instruções para uma amostra normal no kit.

Este protocolo geralmente pode obter um par de RNA ultralimpo, mesmo se você tiver uma quantidade extremamente pequena de material inicial (como, digamos, 10 cabeças de Drosophila).

Você já fez extrações sem glicogênio? Em caso afirmativo, você acha que o glicogênio aumenta o rendimento? Aumenta a pureza?

Eu uso um kit de coluna, tenho 100% de taxa de sucesso, com a maioria das minhas amostras marcando um RIN de 10. Células de camundongo aqui.

Sou um geneticista molecular que trabalha com plantas. Eu fiz muitas extrações de RNA. Aqui estão algumas idéias.

-RNA degrada muito facilmente e é muito menos estável que o DNA. Pulverize sua bancada de trabalho, pipetas e luvas com etanol antes de iniciar a extração. Tocar em outra coisa enquanto a centrífuga está girando? Borrife suas luvas novamente. Também gosto de usar & quotdicas de filtro & quot especiais para evitar contaminar minhas amostras com RNases.

-Parece que você está usando um kit. Certifique-se de seguir as instruções cuidadosamente - muitos buffers têm nomes com sons semelhantes. Se houver etapas opcionais, execute-as. Na etapa final, quando você está eluindo o RNA da coluna, gosto de pegar o que sai e pipetar de volta para o topo da coluna. Esta segunda lavagem lhe dará um rendimento ligeiramente maior.

-Parece que você é novo no laboratório - bem-vindo! Tenho certeza de que há algumas pessoas mais experientes trabalhando com você que fizeram esse protocolo (não necessariamente o PI, mas talvez até um pós-doutorando ou um estudante de graduação). Peça ajuda a eles! Peça a eles para sentar com você enquanto você faz o protocolo e eles podem observar sua técnica e podem apontar algo que você está fazendo incorretamente.


  • Solução D (para a opção de protocolo nº 1):
  • 4 M de tiocianato de guanidínio,
  • Citrato de sódio 25 mM, pH 7,0
  • 0,5% (peso / vol) N-laurosilsarcosina (Sarkosyl)
  • 0,1 M 2-mercaptoetanol
  • TRIzol & reg ou produto semelhante, como TRI Reagent & reg, RNAzol & reg, QIAzol & reg (para a opção de protocolo nº 2)
  • Fenol Saturado com Água
  • 2 M de acetato de sódio pH 4
  • Clorofórmio / álcool isoamílico (49: 1)
  • 75% de etanol
  • Água livre de RNase ou solução TE
  • Tubos livres de RNase: tubos de microcentrífuga, tubos de polipropileno de 4 mL
  • Solução de descontaminação RNase como RNase AWAY & reg ou RNaseZAP & reg
  • Isopropanol (para a etapa de precipitação, Opção A)
  • Cloreto de Lítio 7,5 M (para a etapa de precipitação, Opção B)
  • Glicogênio (opcional)
  • *Cuidado* Certifique-se de ler a SDS (Folha de Dados de Segurança) para avisos de segurança e riscos para esses reagentes. Trabalhe em um espaço bem ventilado e sob uma coifa ao trabalhar com os reagentes voláteis da lista acima.

Antes de iniciar este protocolo, certifique-se de preparar a solução D (consulte a seção de reagentes acima para a receita). Se estiver usando TRIzol & reg, vá para a seção Opção # 2 - Protocolo TRIzol & reg abaixo.

  • Para tecidos: use 1 mL de Solução D por 100 mg de células.
  • Para células em cultura: use 1 mL de solução D por 1 x 10 7 células.
  • A eficácia do seu isolamento de RNA dependerá da eficácia do seu protocolo de lise celular. Embora a homogeneização simples seja eficaz para a maioria dos tecidos de mamíferos, tecidos mais resistentes, como osso ou amostras de bactérias / leveduras / plantas, exigirão etapas adicionais para lisar efetivamente e abrir as células.
  • Adicionar 0,1 mL de acetato de sódio 2 M (pH 4,0), misturar completamente por inversão.
  • Adicione 1 mL de fenol saturado com água e misture completamente por inversão.
  • Adicione 0,2 mL de clorofórmio / álcool isoamílico (49: 1) e agite vigorosamente com a mão por 10 segundos.

* Dica Profissional * Ter suas amostras giradas a 4 & degC ajuda a reduzir a degradação do RNA. Se você não tiver acesso a uma centrífuga refrigerada, você pode levar uma centrífuga com cuidado para uma sala fria para centrifugação. Quando terminar de usar a centrífuga, traga este equipamento de volta à temperatura ambiente, pois o armazenamento prolongado na câmara fria pode danificá-lo.

  • A mistura se separa em uma camada orgânica inferior, uma camada de interfase e uma camada aquosa superior. Tome cuidado para não perturbar ou coletar a camada de interfase com a ponta da pipeta.

* Dica Profissional * Para coletar o máximo da fase aquosa superior sem perturbar a camada de interfase, considere o uso de um pipetador de menor volume como um p200 para coletar a maior parte da fase aquosa. Você pode ter que coletar duas ou mais do mesmo tubo, mas ao contrário de usar uma ponta p1000, ela lhe dará mais controle de onde você está apontando sua ponta no tubo.

Isopropanol (Opção A) - Adicionar 1 volume de isopropanol à camada aquosa extraída. Incubar a -20 e degC por 1 hora.

Cloreto de Lítio (Opção B) - LiCl precipita seletivamente RNA contra DNA ou proteínas. Adicione a quantidade correta de solução de LiCl 7,5 M para trazer a concentração de LiCl na camada aquosa extraída para 2,5 M. Incube a -20 e degC por 1 hora.

* Dica profissional * Se você antecipar que seu rendimento de RNA será pequeno, o glicogênio livre de RNase pode ser usado como um transportador para facilitar a precipitação do RNA. Isso não afeta a qualidade do RNA ou das aplicações a jusante.

* Dica profissional * Para melhorar o rendimento do RNA, em vez de incubar a -20 e degC por 1 hora, você pode tentar incubar a -80 e degC durante a noite.

  • *Crítico* É importante não deixar o pellet secar muito antes de ressuspender, pois isso afeta a solubilidade do RNA.

* Dica profissional * Para evitar o ressecamento, observe o pellet e remova cuidadosamente qualquer resíduo de lavagem com etanol e adicione água sem RNase ou TE assim que todo o tubo estiver seco, mas enquanto o pellet branco ainda estiver visível.

* Dica profissional * Para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento de toda a sua amostra de RNA, considere fazer alíquotas menores dela e armazená-las em -80 e degC.


A etapa de lavagem com etanol 70% & # 8230

Esta etapa consiste em lavar qualquer sal residual do DNA peletizado.

Algumas dicas sobre precipitação de etanol & # 8230

  • Escolha de sal
    • Usar acetato de sódio (0,3 M conc final, pH 5,2) para precipitação de DNA de rotina.
    • Usar Cloreto de Sódio (0,2 M conc final) para amostras de DNA contendo SDS, uma vez que o NaCl mantém o SDS solúvel em etanol a 70% de modo que não precipite com o DNA.
    • Usar cloreto de lítio (0,8 M conc final) para RNA. Como 2,5–3 volumes de etanol são necessários para a precipitação do RNA e o LiCl é mais solúvel em etanol do que o acetato de sódio, ele não precipitará. Mas cuidado - os íons de cloreto inibem a síntese de proteínas e DNA polimerase, então LiCl não é bom para preparações de RNA para em vitro tradução ou transcrição reversa. Nestes casos, use acetato de sódio.
    • Usar Acetato de amónio (2 M conc final) para a remoção de dNTPs, mas não o use para a preparação de DNA para reações de polinucleotídeo quinase de T4, pois os íons amônio inibem a enzima.
    • Para aumentar o rendimento nas precipitações de baixa concentração ou pequenos pedaços de ácido nucleico (menos de 100 nucleotídeos)
      • Adicionar MgCl2 a uma concentração final de 0,01 M.
      • Aumente o tempo de incubação no gelo antes da centrifugação para 1 hora.

      Esta explicação deve ajudá-lo a saber como funciona a precipitação do etanol. Se você quiser saber mais sobre os prós e contras da precipitação de etanol e outras abordagens de limpeza de DNA, você pode conferir estes & # 8230


      Métodos

      Condições de crescimento de cianobactérias

      Devido à sua complexidade de metabólitos secundários e à presença de exopolissacarídeos, Nostoc punctiforme foi selecionado como alvo para extração de RNA. A cepa NHM5 de evolução de hidrogênio de Nostoc punctiforme ATCC 29133 [23] foi cultivado em frascos cilíndricos de 500 mL. Resumidamente, 400 mL de BG11 foram inoculados, em condições estéreis, a uma densidade óptica de 0,2. Os frascos foram então conectados a um suprimento de ar por um tubo de PE esterilizado. O ar de entrada foi pré-umedecido e filtrado com um filtro de membrana de PTFE e o fluxo de ar ajustado para 400 mL / minuto. As culturas foram iluminadas com lâmpadas fluorescentes trifósforo 58 W (Aura, Karlskrona, Suécia) a uma intensidade de luz de 60 μmol m -2 s -1. Após 7 dias de crescimento, cerca de 3,2 L de cultura foram centrifugados e reunidos. As células concentradas foram alíquotas em tubos com tampa de rosca de 2 mL e armazenadas a -80 ° C até serem usadas para extração de RNA.

      Extração de RNA usando o método "BPC"

      As extrações usando o método "BPC" foram realizadas conforme descrito anteriormente [24], exceto que não foram usados ​​grânulos de 0,1 mm e as configurações de batimento do grânulo não foram as mesmas. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente e centrifugações a 10.000 g. As amostras de células concentradas foram centrifugadas por 3 minutos e ressuspensas em 800 μl de água e 600 μl de tampão fenol saturado (pH 4,3). A adição de 0,5 g de contas de vidro de 0,5 mm foi seguida por homogeneização usando um Bertin Precellys 24 (velocidade máxima, 20 segundos, duas vezes). Os tubos de amostra foram centrifugados por 10 minutos após os quais 750 μl da camada aquosa foram transferidos para um tubo novo, misturado com o mesmo volume de fenol saturado com tampão (pH 4,3) e agitado em vórtex por 30 segundos. Seguiu-se centrifugação por 5 minutos e retirada de 700 μl do sobrenadante aquoso que foi então misturado com o mesmo volume de clorofórmio, em tubos novos. Após agitação em vórtex por 30 segundos, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos. Neste ponto, 650 μl da camada aquosa foram transferidos para um tubo novo ao qual foram adicionados 65 μl de acetato de sódio 3 M e 650 μl de isopropanol. Os tubos foram agitados com vórtex durante 30 segundos e armazenados a -20 ° C durante 10 minutos. Após centrifugação por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e o sedimento lavado com 1 mL de etanol 70%. Seguiu-se outra centrifugação (5 minutos) e após a remoção do sobrenadante e secagem ao ar do RNA, 50 μl de solução de armazenamento de RNA (citrato de sódio 1 mM, pH 6,4, Ambion, Austin, EUA) foram adicionados. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até serem analisadas.

      Extrações de RNA baseadas no protocolo Trizol

      Para o método "Trizol std" o protocolo fornecido pelo Molecular Research Center, foi realizado sem qualquer modificação [25]. Os métodos de extração "esferas Trizol", "Trizol 95", "esferas PGTX" e "PGTX 95" foram baseados neste protocolo, mas a etapa de homogeneização foi substituída por batimento de esferas (conforme descrito para o método "BPC") ou incubação a 95 ° C durante 5 minutos. Para os protocolos "PGTX", Trizol foi simplesmente substituído pela mistura de disrupção que propomos neste artigo.

      Quantidade de RNA e avaliação da qualidade

      A concentração e a pureza do RNA foram medidas usando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 UV / Vis de acordo com as instruções do fabricante (NanoDrop Technologies, EUA). A integridade do RNA foi verificada usando o sistema automatizado de eletroforese Experion (kit de análise RNA StdSens) da Biorad, de acordo com as instruções do fabricante.

      PCR e RT-PCR

      Para detecção de contaminação de DNA, 1 μg de RNA foi diluído em água para um volume total de 20 μl. Em seguida, 1 μl de RNase A / T1 Mix (Fermentas) mais 1 μl de RNase H (Fermentas) foram adicionados e as amostras incubadas a 37 ° C por 30 minutos. Para inativar as RNases, 28 μl de tampão TE (pH 8,0) foram adicionados e a solução incubada a 70 ° C por 10 minutos. Usando 1 μl da reação simulada de transcriptase reversa descrita como modelo, a PCR foi realizada usando primers específicos para o gene relacionado à divisão ftsZ (ver Tabela 2), usando Taq DNA Polimerase (Fermentas), de acordo com as instruções do fabricante.

      Para realizar a RT, 1 μg de RNA foi usado como molde para a transcriptase reversa RevertAid H Minus M-MuLV (Fermentas), de acordo com as instruções do fabricante. A fim de evitar a interferência da contaminação do DNA genômico durante a etapa de PCR subsequente, a rbcL primer marcado específico [26, 27] foi usado para iniciar a reação RT (Tabela 2).


      Conclusão

      A análise comparativa de cinco métodos de extração de RNA comumente usados ​​revelou que o kit miRVana foi o melhor executor para a produção de RNA de alta qualidade e rendimento consistente, sem comprometer os níveis de detecção de miRNA e gene alvo. Embora este kit seja o mais caro, sua saída de alta qualidade e facilidade de uso o torna um método preferível para extração de RNA, principalmente se os pesquisadores desejarem usar a mesma preparação de RNA para miRNA e análises de expressão gênica, já que os outros métodos tiveram níveis de detecção mais baixos. e mais variabilidade. Empiricamente, isso precisa ser otimizado para uma aplicação específica. Uma advertência final para os pesquisadores é que só porque um kit é descrito como isolante de RNA total e é apropriado para tecidos de mamíferos, células em cultura ou fluidos biológicos, não significa que ele produz todos os tipos de RNAs igualmente.


      Purificação de RNA usando TRIzol (reagente TRI)

      A solubilização e extração de TRIzol é um método geral desenvolvido relativamente recentemente para desproteinizar RNA. Este método é particularmente vantajoso em situações em que células ou tecidos são enriquecidos em RNases endógenas ou quando a separação de RNA citoplasmático de RNA nuclear é impraticável. TRIzol (ou TRI Reagent) é uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidínio que simultaneamente solubiliza material biológico e desnatura proteínas. Após a solubilização, a adição de clorofórmio causa separação de fases (semelhante à extração com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico), onde a proteína é extraída para a fase orgânica, o DNA se resolve na interface e o RNA permanece na fase aquosa. Portanto, o RNA, o DNA e a proteína podem ser purificados de uma única amostra (daí o nome TRIzol). A extração de TRIzol também é um método eficaz para isolar pequenos RNAs, como microRNAs, RNAs associados a piwi ou pequenos RNAs de interferência endógenos. No entanto, o TRIzol é caro e os pellets de RNA podem ser difíceis de ressuspender. Assim, o uso de TRIzol não é recomendado quando a extração regular de fenol é prática.


      Protocolo de extração de RNA de trizol

      2 kb (18S) e RNA de baixo peso molecular entre 0,1 e 0,3 kb (tRNA, 5S). o
      o RNA isolado tem uma razão A260 / A280 ≥1,8 quando diluído em TE.
      Precauções para prevenir a contaminação por RNase:
      RNases podem ser introduzidas acidentalmente na preparação de RNA em qualquer ponto do isolamento
      procedimento através de técnica inadequada. Como a atividade da RNase é difícil de inibir, é essencial
      para evitar a sua introdução. As seguintes diretrizes devem ser observadas ao trabalhar com RNA.
      • Sempre use luvas descartáveis. A pele geralmente contém bactérias e fungos que podem contaminar
      uma preparação de RNA e ser uma fonte de RNases. Pratique boas técnicas microbiológicas para
      prevenir a contaminação microbiana.
      • Use utensílios de plástico descartáveis ​​estéreis e pipetas automáticas reservadas para o trabalho de RNA para prevenir
      contaminação cruzada com RNases de equipamentos compartilhados. Por exemplo, um laboratório que é
      usar sondas de RNA provavelmente usará RNase A ou T1 para reduzir o fundo em filtros, e qualquer
      itens não descartáveis ​​(como pipetas automáticas) podem ser fontes ricas de RNases.
      • Na presença do reagente TRIZOL, o RNA é protegido da contaminação por RNase. Rio abaixo
      o manuseio de amostras exige que os utensílios de vidro ou plástico não descartáveis ​​sejam livres de RNase. Copo
      itens podem ser cozidos a 150 ° C por 4 horas, e itens de plástico podem ser embebidos por 10 minutos em 0,5
      NaOH M, enxaguado abundantemente com água e autoclavado.
      Outras precauções:
      • O uso de tubos descartáveis ​​feitos de polipropileno transparente é recomendado ao trabalhar com menos
      volumes de 2 ml de reagente TRIZOL.
      • Para volumes maiores, use tubos de vidro (Corex) ou polipropileno e teste para ter certeza de que os tubos
      pode suportar 12.000 × g com reagente TRIZOL e clorofórmio. Não use tubos que vazem ou
      rachadura.
      • Equilibre cuidadosamente os pesos dos tubos antes da centrifugação.
      • Os tubos de vidro devem ser selados com parafilme coberto com uma camada de papel alumínio e tubos de polipropileno
      deve ser tampado antes da centrifugação.
      INSTRUÇÕES PARA ISOLAMENTO DE RNA:
      Cuidado: Ao trabalhar com o Reagente TRIZOL, use luvas e proteção para os olhos (escudo, segurança
      óculos). Evite o contato com a pele ou roupas. Use em uma capela química. Evite respirar
      vapor.
      Salvo indicação em contrário, o procedimento é realizado a 15 a 30 ° C e os reagentes são a 15 a 30 ° C.
      Reagentes necessários, mas não fornecidos:
      • Clorofórmio
      • Álcool isopropílico
      • 75% de etanol (em água tratada com DEPC)
      • Água livre de RNase ou solução de SDS a 0,5% [Para preparar água livre de RNase, puxe água para dentro
      Frascos de vidro sem RNase. Adicionar dietilpirocarbonato (DEPC) a 0,01% (v / v). Vamos descansar
      durante a noite e autoclave. A solução SDS deve ser preparada usando tratamento DEPC, autoclavado
      agua.]
      1. HOMOGENIZAÇÃO (ver notas 1-3)
      uma. Tecidos
      Homogeneizar amostras de tecido em 1 ml de reagente TRIZOL por 50-100 mg de tecido usando um
      glass-Teflon® ou homogeneizador de potência (Polytron, ou TISSUMIZER® da Tekmar ou
      equivalente). O volume da amostra não deve exceder 10% do volume de TRIZOL
      Reagente usado para homogeneização.
      b. Células cultivadas em monocamada
      Lise as células diretamente em um prato de cultura, adicionando 1 ml de reagente TRIZOL a uma placa de 3,5 cm
      prato de diâmetro, e passando o lisado celular várias vezes através de uma pipeta. A quantidade de
      O reagente TRIZOL adicionado é baseado na área da placa de cultura (1 ml por 10 cm2) e não
      no número de células presentes. Uma quantidade insuficiente de reagente TRIZOL pode resultar em
      contaminação do RNA isolado com DNA.
      c. Células cultivadas em suspensão
      Pellet células por centrifugação. Lise as células no reagente TRIZOL por pipetagem repetitiva. Usar
      1 ml do reagente por 5-10 × 106 de células animais, vegetais ou de levedura, ou por 1 × 107 bactérias
      células. A lavagem das células antes da adição do reagente TRIZOL deve ser evitada, pois
      aumenta a possibilidade de degradação do mRNA. Perturbação de algumas leveduras e bactérias
      as células podem exigir o uso de um homogeneizador.
      OPCIONAL: Uma etapa de isolamento adicional pode ser necessária para amostras com alto teor de
      proteínas, gordura, polissacarídeos ou material extracelular, como músculos, tecido adiposo e tuberoso
      partes de plantas. Após a homogeneização, remova o material insolúvel do homogenato por
      centrifugação a 12.000 × g por 10 minutos a 2 a 8 ° C. O pellet resultante contém
      membranas extracelulares, polissacarídeos e DNA de alto peso molecular, enquanto o
      o sobrenadante contém RNA. Em amostras de tecido adiposo, um excesso de gordura se acumula como uma camada superior
      que deve ser removido. Em cada caso, transfira a solução de homogenato limpa para um novo
      tubo e prossiga com a adição de clorofórmio e separação de fases conforme descrito.
      2. SEPARAÇÃO DE FASE
      Incubar as amostras homogeneizadas por 5 minutos a 15 a 30 ° C para permitir a completa
      dissociação de complexos de nucleoproteínas. Adicione 0,2 ml de clorofórmio por 1 ml de TRIZOL
      Reagente. Tampe os tubos de amostra com segurança. Agite os tubos vigorosamente com a mão por 15 segundos e
      incubar a 15 a 30 ° C por 2 a 3 minutos. Centrifugue as amostras em no máximo 12.000
      × g por 15 minutos a 2 a 8 ° C. Após a centrifugação, a mistura se separa em um inferior
      vermelha, fase fenol-clorofórmio, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor. RNA
      permanece exclusivamente na fase aquosa. O volume da fase aquosa é de cerca de 60% de
      o volume de reagente TRIZOL usado para homogeneização.
      3. PRECIPITAÇÃO DE RNA
      Transfira a fase aquosa para um tubo novo e salve a fase orgânica se o isolamento de DNA ou
      proteína é desejada. Precipite o RNA da fase aquosa misturando-o com isopropil
      álcool. Use 0,5 ml de álcool isopropílico por 1 ml de reagente TRIZOL usado para o
      homogeneização. Incube as amostras a 15 a 30 ° C por 10 minutos e centrifugue a não mais que
      12.000 × g por 10 minutos a 2 a 8 ° C. O precipitado de RNA, muitas vezes invisível antes
      centrifugação, forma um grânulo semelhante a um gel na lateral e no fundo do tubo.
      4. LAVAGEM DE RNA
      Remova o sobrenadante. Lave o pellet de RNA uma vez com etanol 75%, adicionando pelo menos 1 ml de
      75% de etanol por 1 ml de reagente TRIZOL usado para a homogeneização inicial. Misture a amostra
      por agitação em vórtex e centrifugação a não mais do que 7.500 × g por 5 minutos entre 2 e 8 ° C.
      5. REDISSOLVENDO O RNA
      No final do procedimento, seque brevemente o pellet de RNA (seque ao ar ou a vácuo por 5-10
      minutos). Não seque o RNA por centrifugação sob vácuo. É importante não deixar o
      O pellet de RNA seca completamente, pois isso diminuirá muito sua solubilidade. RNA parcialmente dissolvido
      as amostras têm uma razão A260 / 280 de 200 μg de DNA ou grandes quantidades de um material que não seja de DNA.
      3. REDISSOLVENDO O DNA
      Seque o DNA ao ar por 5 a 15 minutos em um tubo aberto. (NÃO SEQUE SOB
      CENTRIFUGAÇÃO será mais difícil de dissolver.) Dissolva o DNA em NaOH 8 mM
      de modo que a concentração de DNA seja de 0,2 - 0,3 μg / μl. Normalmente adicione 300 - 600 μl de 8 mM
      NaOH para DNA isolado de 107 células ou 50-70 mg de tecido. Ressuspender na base fraca é
      ALTAMENTE recomendado, pois o DNA isolado não ressuspende bem em água ou em Tris
      buffers. O pH do NaOH 8 mM é apenas

      9 e deve ser facilmente ajustado com TE ou
      HEPES assim que o DNA estiver em solução. Nesta fase, as preparações de DNA (especialmente de
      tecidos) podem conter material semelhante a gel insolúvel (fragmentos de membranas, etc.) Remova o
      material insolúvel por centrifugação a> 12.000 × g por 10 minutos. Transfira o sobrenadante
      contendo o DNA para um novo tubo. O DNA solubilizado em NaOH 8 mM pode ser armazenado durante a noite
      a 4 ° C para armazenamento prolongado, as amostras devem ser ajustadas com HEPES para pH 7-8 (ver tabela)
      e suplementado com EDTA 1 mM. Uma vez que o pH é ajustado, o DNA pode ser armazenado a 4 ° C ou -
      20 ° C.
      Quantificação e rendimentos esperados de DNA
      Pegue uma alíquota da preparação de DNA solubilizada em NaOH 8 mM, misture com água e meça
      o A260 da solução resultante. Calcule o conteúdo de DNA usando o valor de A260 para fita dupla
      DNA. Uma unidade A260 equivale a 50 μg de DNA de fita dupla / ml. Para cálculo de célula
      número em amostras analisadas, suponha que a quantidade de DNA por 1 × 106 células diplóides de humanos, ratos,
      e a origem do camundongo é igual a: 7,1 μg, 6,5 μg e 5,8 μg, respectivamente (3).
      Formulários:
      Amplificação de DNA por PCR:
      Depois de redissolver o DNA em NaOH 8 mM, ajuste o pH para 8,4 com HEPES 0,1 M (ver tabela).
      Adicione 0,1 a 1,0 μg da amostra de DNA à sua mistura de reação de PCR e execute o PCR padrão
      protocolo.
      Reações de restrição de endonuclease:
      Ajuste o pH da solução de DNA para um valor necessário usando HEPES (ver tabela). Alternativamente,
      as amostras podem ser dialisadas contra EDTA 1 mM, pH 7 a pH 8,0. Use 3-5 unidades de enzima por
      micrograma de DNA. Use as condições recomendadas pelo fabricante para o
      enzima e permitir que a reação prossiga por 3 a 24 h. Em um ensaio típico, 80-90% do DNA é
      digestível.
      Ajuste de pH de amostras de DNA dissolvidas em NaOH 8 mM:
      (Para 1 ml de NaOH 8 mM, use as seguintes quantidades de HEPES 0,1 M ou 1 M, ácido livre.)
      PH final 0,1 M HEPES (μl) pH final 1 M HEPES (μl)
      8.4 86 7.2 23
      8.2 93 7.0 32
      8.0 101
      7.8 117
      7.5 159
      Notas de isolamento de DNA:
      1. A fase fenólica e a interfase podem ser armazenadas de 2 a 8 ° C durante a noite.
      2. As amostras suspensas em etanol 75% podem ser armazenadas de 2 a 8 ° C por meses.
      3. As amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser armazenadas durante a noite a 2 a 8 ° C. Para armazenamento de longo prazo,
      ajuste o pH para 7-8 e ajuste a concentração de EDTA para 1 mM.
      INSTRUÇÕES PARA ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS:
      As proteínas são isoladas do sobrenadante fenol-etanol obtido após precipitação do DNA com
      etanol (etapa 1, PRECIPITAÇÃO DE DNA). A preparação resultante pode ser analisada para o
      presença de proteínas específicas por Western blotting (2).
      Reagentes necessários, mas não fornecidos:
      • Álcool isopropílico
      • Cloridrato de guanidina 0,3 M em etanol a 95%
      • Etanol
      • 1% SDS
      1. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
      Proteínas precipitadas do sobrenadante de fenol-etanol (volume aproximado de 0,8 ml por 1 ml
      do Reagente TRIZOL) com álcool isopropílico. Adicione 1,5 ml de isopropanol por 1 ml de TRIZOL
      Reagente usado para a homogeneização inicial. Armazene as amostras por 10 minutos a 15 a 30 ° C, e
      sedimentar o precipitado de proteína a 12.000 × g por 10 minutos a 2 a 8 ° C.
      2. LAVAGEM DE PROTEÍNAS
      Remova o sobrenadante e lave o pellet de proteína 3 vezes em uma solução contendo 0,3 M
      cloridrato de guanidina em etanol a 95%. Adicione 2 ml de solução de lavagem por 1 ml de TRIZOL
      Reagente usado para a homogeneização inicial. Durante cada ciclo de lavagem, armazene o pellet de proteína
      na solução de lavagem por 20 minutos a 15 a 30 ° C e centrifugar a 7.500 × g por 5 minutos a 2
      a 8 ° C. Após a lavagem final, vortex o pellet de proteína em 2 ml de etanol. Armazene a proteína
      pellet em etanol por 20 minutos a 15 a 30 ° C e centrifugar a 7.500 × g por 5 minutos a 2 a
      8 ° C.
      3. REDISSOLVENDO O PELLET DE PROTEÍNA
      Seque a vácuo o pellet de proteína por 5-10 minutos. Dissolva-o em 1% SDS por pipetagem. Completo
      a dissolução do pellet de proteína pode exigir a incubação da amostra a 50 ° C. Sedimentar qualquer
      material insolúvel por centrifugação a 10.000 × g por 10 minutos a 2 a 8 ° C, e transferir o
      sobrenadante para um tubo novo. A amostra está pronta para uso em Western blotting ou pode ser armazenada em
      -5 a -20 ° C para uso futuro.
      Notas de isolamento de proteína:
      1. O pellet de proteína suspenso em 0,3 M de cloridrato de guanidina-etanol 95% ou em etanol pode
      ser armazenado por pelo menos um mês a 2 a 8 ° C, ou por pelo menos um ano a -5 a -20 ° C.
      2. O protocolo a seguir é uma abordagem alternativa que permite uma recuperação mais eficiente de
      proteínas. Dialise o sobrenadante de fenol-etanol contra três mudanças de 0,1% SDS em 2 a
      8 ° C. Centrifugue o material dialisado a 10.000 × g por 10 minutos. Use o sobrenadante transparente
      para Western blotting.
      3. As proteínas podem ser quantificadas pelo método de Bradford, desde que a concentração de SDS seja baixa
      o suficiente (


      Algum labrats de extração de RNA experiente? Estou enlouquecendo aqui com minhas extrações de RNA de Trizol.

      Tenho tido muitos problemas recentemente em perder RNA durante minhas extrações de RNA de Trizol e precipitações subsequentes (com acetato de sódio e etanol).

      Em cada grupo, há sempre algumas amostras em que o rendimento é uma fração do resto das amostras.

      Eu sei que não é as próprias células ou a lise incompleta. Portanto, provavelmente é durante as aspirações entre as lavagens.

      ** O maior problema é que às vezes eu vejo uma bolinha branca e outras vezes não vejo nada. Às vezes, entre as tentativas, mas não estou mudando nada no meu protocolo, então é incompreensível. E apenas em geral aspirando / sugando o etanol 70%, devo estar sugando RNA. **

      Eu vou do lado oposto do tubo para ver onde o RNA deveria estar. Inclino o tubo primeiro para sugar a maior parte antes de trazer o pipetor / aspirador para mais perto do fundo para retirar o resto do etanol, mas como não consigo ver o pellet, é difícil tirar o resto do etanol sem arriscando sugar a pelota.

      Alguém sabe o que determina se você vê uma bolinha branca ou não? Eu sei que se você secar demais, ele ficará transparente / translúcido, mas estou falando quando o RNA ainda está em etanol 70%.


      Assista o vídeo: Extração RNA - TRIzol (Janeiro 2022).