Em formação

Análise sorológica SEREX da biblioteca de expressão de cDNA


O que é a análise sorológica da biblioteca de expressão de cDNA?
Eu li este artigo:
http://cancerimmunity.org/serex/introduction/
mas não consegui decifrar. Alguém pode me explicar isso de uma maneira mais simples?
(Não estudo biologia desde os últimos 8 anos e agora estou passando por isso porque preciso dela para minha pesquisa. Portanto, se alguém puder descrevê-la em uma linguagem simples, seria muito útil)


Com este método, você deseja identificar proteínas nas células cancerosas que são imunogênicas, para que possa usá-las para impulsionar uma resposta imunológica contra as células cancerosas.

Para fazer isso, você extrai o mRNA completo de um câncer. Esses mRNAs representam todos os genes que esse câncer expressa (que também contém as proteínas imunogênicas). Esses mRNAs são clonados em bacteriófagos (vírus que infectam apenas bactérias) e são usados ​​para infectar bactérias. Durante essa infecção, o vírus expressa a proteína que foi clonada em sua sequência e que se origina da célula cancerosa. A infecção da bactéria leva à formação de placas (inteiros) nas bactérias que crescem na superfície de uma placa de cultura.

Você então usa o soro de pacientes com câncer nessas proteínas expressas para ver se há anticorpos que podem reconhecer esses antígenos cancerígenos (e poderiam ser usados ​​para detectá-los e marcá-los). Se houver proteínas que apenas reagem ao soro de pacientes com câncer, mas não aos controles (para excluir) reações inespecíficas, então essas proteínas são identificadas e podem ser usadas para gerar anticorpos contra esse tipo específico de câncer. Funciona como na figura abaixo (deste artigo):


Identificação sorológica de TROP2 por clonagem de expressão de cDNA recombinante usando soros de pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago

Aplicamos a análise sorológica de bibliotecas de expressão de cDNA recombinante (SEREX) a casos de carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) para identificar antígenos tumorais. Um dos clones identificados foi o TROP2, conhecido como transdutor de sinal de cálcio. Para avaliar a significância clínica de anticorpos anti-TROP2 séricos (s-TROP2-Abs) em pacientes com SCC esofágico, a presença de s-TROP2-Abs foi analisada por Western blotting usando proteína TROP2 expressa em bactérias. Descobrimos que 23 de 75 (31%) pacientes foram positivos para s-TROP2-Abs. A positividade em termos de s-TROP2-Abs mostrou uma associação significativa com o tamanho do tumor, mas não com outras características clínico-patológicas. Os níveis de expressão da proteína de TROP2 eram muito mais elevados nas linhas de células SCC do esôfago em comparação com aqueles na mucosa esofágica normal e suas células imortalizadas, embora os níveis de expressão de mRNA não fossem necessariamente elevados em linhas de células e tecidos malignos. Estudos imunohistoquímicos mostraram que a expressão da proteína TROP2 em espécimes de CEC do esôfago era visivelmente maior do que a encontrada em hiperplasia leve da mucosa esofágica. Assim, o s-TROP2-Abs pareceu útil no diagnóstico de SCC e pode ser um candidato a marcadores tumorais séricos. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

O carcinoma esofágico representa um dos tipos de tumor mais malignos. Apesar das melhorias nas técnicas cirúrgicas e na quimiorradioterapia adjuvante para o câncer de esôfago, muitos pacientes sofrem de recorrências rápidas da doença e têm um prognóstico ruim. 1, 2 O comportamento agressivo desse tumor foi associado ao envolvimento sistêmico no diagnóstico e seu mau prognóstico foi atribuído em grande parte ao atraso no diagnóstico. 3 Embora vários marcadores séricos tenham sido relatados como clinicamente úteis na detecção de adenocarcinomas do esôfago, 4, 5, 6 apenas alguns marcadores séricos estão disponíveis para carcinomas de células escamosas (CEC) do esôfago. 2, 7 Mesmo esses marcadores séricos são limitados em termos de detecção de cânceres de esôfago precoces, no entanto, com o anticorpo p53 sérico sendo uma exceção notável. 8 O CEC esofágico geralmente é infiltrado por linfócitos T, e uma linha de células T citotóxicas com especificidade para tumores autólogos foi obtida a partir de células mononucleares do sangue periférico. 9 Portanto, a imunoterapia pode ser um meio alternativo atraente para o tratamento do CEC de esôfago. 10 Para tanto, o desenvolvimento de novos marcadores séricos para o CEC de esôfago é necessário não apenas para o diagnóstico, mas também para aplicações de imunoterapia com antígenos identificados.

Sahin et al. 11 introduziram uma abordagem que tem ampla aplicabilidade para a análise da resposta imune humoral ao câncer em humanos. Este método, denominado SEREX (identificação sorológica de antígenos por clonagem de expressão de cDNA recombinante), envolve a triagem imunológica de bibliotecas de cDNA preparadas a partir de espécimes tumorais com soros autólogos ou alogênicos. A análise SEREX de muitas bibliotecas diferentes de cDNA de tumor humano revelou uma variedade de antígenos tumorais. 11, 12 Alguns dos antígenos definidos por SEREX (por exemplo., NY-ESO-1) 13 foram reconhecidos com clones de linfócitos T citotóxicos específicos de tumor (CTL), com outros (por exemplo., MAGE-1 e tirosinase) 11 sendo originalmente definidos como peptídeos reconhecidos por CTL. Esses estudos indicam que alguns dos antígenos tumorais detectados por SEREX são capazes de induzir respostas imunes celulares e humorais.

Recentemente, aplicamos a metodologia SEREX ao SCC esofágico para definir proteínas imunogênicas no câncer de esôfago humano. Observamos que o TROP2 foi imunogênico em pacientes com CEC de esôfago. Isso também indica que os anticorpos contra TROP2 podem ser úteis para o diagnóstico de CCE esofágico.


Resumo

O desenvolvimento do câncer humano é um processo altamente complexo e pode ser considerado o resultado de vários eventos combinados, como alterações genéticas, distúrbios na transdução do sinal ou falha da vigilância imunológica. Bancos de dados relacionados ao câncer geralmente se concentram em campos específicos de pesquisa, por exemplo, genética do câncer ou imunologia do câncer, enquanto a complexidade da gênese do câncer requer uma análise integrada de dados heterogêneos de várias fontes. Aqui, apresentamos o banco de dados de proteínas associadas ao câncer (CAP), um novo sistema de análise para dados relacionados ao câncer. O CAP integra dados de vários bancos de dados externos, aumenta esses dados com anotações funcionais e oferece ferramentas para análise estatística desses dados. Empregamos o CAP para analisar genes que causam uma resposta autoimune no câncer. Em particular, exploramos a conexão entre a resposta autoimune, mutações e superexpressão desses genes. Nossos resultados preliminares sugerem que as mutações não contribuem significativamente para o aumento de uma resposta de anticorpos contra antígenos tumorais, enquanto a superexpressão parece desempenhar um papel mais importante. Demonstramos como diferentes tipos de dados podem ser integrados e analisados ​​com sucesso, fornecendo resultados interessantes. Como a quantidade de dados disponíveis está crescendo rapidamente, uma análise combinada terá um papel importante na exploração da base genética e imunológica do câncer. O CAP está disponível gratuitamente no seguinte site: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.

Avanços recentes em técnicas de alto rendimento levaram a um rápido aumento no volume de dados experimentais relacionados ao câncer e ao desenvolvimento de vários bancos de dados para esses dados. Exemplos de bancos de dados relacionados ao câncer são o banco de dados Mitelman para aberrações cromossômicas (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitleman), o banco de dados SEREX (análise sorológica de bibliotecas de expressão de cDNA recombinante) para respostas de células B (1) e o Cancer GeneticsWeb (CGW), que fornece informações gerais e referências da literatura para genes associados ao câncer. Além disso, dados genômicos e proteômicos abrangentes estão disponíveis em bancos de dados como SWISS-PROT (2), NCBI e Locus Link (3).

Combinar essa vasta quantidade de dados é um desafio e é a chave para revelar os complexos mecanismos de gênese e desenvolvimento do câncer. Uma coisa importante a se considerar ao realizar uma análise de cobertura são as diferenças nos formatos dos dados (diferenças sintáticas) e as diferenças no significado dos dados (diferenças semânticas) (4) nessas bases de dados. Essas diferenças devem ser resolvidas para criar uma visão unificada dos dados.

Aqui, apresentamos o banco de dados de proteínas associadas ao câncer (CAP), um novo banco de dados integrado e sistema de análise, projetado para integrar dados heterogêneos de diferentes fontes. O CAP anota esses dados com previsões da bioinformática e facilita as análises estatísticas. O CAP foi implementado como um sistema de banco de dados relacional com uma interface baseada na web para acesso portátil e amigável. Ele integra dados do banco de dados SEREX, CGW, NCBI e SWISS-PROT. Esses dados podem ser anotados posteriormente no CAP. Atualmente, as anotações adicionadas incluem previsão da função da proteína (ProtFun refs 5-6), presença de epítopos MHC (SVMHC ref 7) e localização subcelular (PSORT ref 8 e SubLoc ref 9).

O CAP fornece formulários personalizáveis ​​para importar dados experimentais específicos do usuário. Também permite o agrupamento de dados em conjuntos de dados específicos de problemas. Os dados podem ser visualizados, editados e anotados por meio de uma interface amigável baseada na web. Além disso, o CAP fornece ferramentas para a análise estatística de conjuntos de dados definidos pelo usuário. Os resultados dessas análises podem ser exportados como tabelas para uso posterior ou renderizados como gráficos.

Como primeira aplicação, examinamos um conjunto de genes e produtos gênicos relacionados ao câncer que causam uma resposta auto-imune. Estudamos a conexão entre mutações e imunogenicidade. Analisamos os dados obtidos a partir de experimentos SEREX para alterações e mutações, correlacionando-os com os dados do Cancer GeneticsWeb. De 723 de SEREX e os 606 genes contidos em CGW, encontramos apenas 17 genes ocorrendo em ambos os conjuntos de dados. Sete desses genes estavam relacionados ao mesmo tipo de câncer. Destes sete, apenas dois (TP53 e GSTT1) são conhecidos por transportar mutações ou polimorfismos específicos, enquanto os cinco restantes são superexpressos nos respectivos tumores.

Uma segunda análise correlaciona todos os genes relacionados ao câncer em CAP, encontrados por experimentos SEREX, com dados de expressão do projeto de microarray NCI60 (10). Consideramos todos os genes que apresentam uma superexpressão dupla ou superior. No total, 319 genes ocorrem em CAP e no conjunto de dados NCI60. 277 desses genes foram superexpressos em pelo menos uma das linhas de células NCI60, enquanto 69 foram superexpressos em pelo menos 10% das linhas de células. Para 13 genes superexpressos, em pelo menos 3 linhas de células específicas do tipo de tumor, encontramos concordância entre o tipo de câncer do experimento SEREX e o tipo de câncer associado à respectiva linha de células NCI60.

Neste relatório, descrevemos o desenho geral do CAP e damos uma breve visão geral de suas habilidades. Além disso, descrevemos e discutimos os resultados de nossa análise com mais detalhes. O CAP está acessível no seguinte site: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

SK-MEL-37 expressa uma ampla gama de antígenos CT.

Um painel de 12 linhas de células de melanoma foi avaliado quanto à expressão de antígenos CT conhecidos por RT-PCR. Destes, SK-MEL-37 apresentou o padrão mais amplo de expressão de CT, sendo positivo para MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, NY-ESO-1, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 e SCP1 (Fig. 1).

Análise RT-PCR da expressão do antígeno CT na linha celular de melanoma SK-MEL-37 estabelecida. SK-MEL-37 mostrou expressão de todos os produtos CT testados, isto é, NY-ESO-1, MAGE1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 e SCP1. A banda menor de massa molecular inferior em SSX4 representa uma variante de splicing alternativo (18).

Análise SEREX da biblioteca de cDNA SK-MEL-37 com soro NW38.

Uma biblioteca de expressão de cDNA de 2,3 x 10 7 clones primários foi estabelecida e a pesquisa imunológica foi realizada usando soro NW38 absorvido em uma diluição de 1: 2.000. Sessenta e um clones positivos foram identificados após triagem de 1,5 x 10 5 clones. Estes 61 clones foram purificados, excisados em vitro, e convertidos em formas de plasmídeo pBK-CMV. As inserções de cDNA foram analisadas e agrupadas com base em uma estratégia combinada de mapeamento de restrição, sequenciamento de DNA e hibridização DNA-DNA, e os resultados estão resumidos na Tabela 1. Excluindo o grupo diverso, que consistia em 10 clones derivados de 9 genes distintos, 4 conhecidos e 5 desconhecidos, os 51 clones restantes pertenciam a 4 grupos distintos de produtos tumorais: o KOC família, a família MAGE, a família NY-ESO-1 e um novo gene de antígeno CT, designado CT7. O isolamento de quatro genes do antígeno CT - MAGE-4a, NY-ESO-1, LAGE-1 e CT7 - após a triagem de apenas 1,5 × 10 5 clones de cDNA representa uma frequência que não foi observada em análises SEREX até o momento. Por exemplo, uma triagem paralela de soro NW38 contra uma biblioteca testicular rendeu apenas dois clones MAGE-4a após a triagem de 5,0 x 10 5 clones, mas nenhum outro clone que codifica CT. Este resultado fornece suporte para nossa suposição de que as linhas de células de melanoma, como SK-MEL-37, podem ser uma fonte melhor do que os testículos para a identificação de clones de cDNA de CT.

Genes definidos por SEREX identificados por triagem alogênica da biblioteca de expressão de cDNA SK-MEL-37

A família do gene KOC.

O primeiro e de longe o grupo predominante, consistindo de 33 clones, estava relacionado com KOC (K H-domínio contendo gene ou expresso no câncer) gene, um gene mostrado para ser superexpresso no câncer de pâncreas e mapeado para o cromossomo 7p11.5 (24). Entre os 33 clones, 2 foram derivados do KOC gene, enquanto os outros 31 clones foram derivados de dois genes intimamente relacionados anteriormente não identificados, indicando que KOC pertence a uma família de genes com pelo menos três membros expressos. o KOC gene contém uma ORF de 1740 bp, codificando uma proteína de 579 aa (Mr 65 kDa). Os dois outros genes homólogos codificam proteínas ligeiramente diferentes em tamanho, com 60-70% de homologia de aminoácidos entre os três produtos gênicos. Formas de splicing alternativo foram observadas em um dos dois genes semelhantes a KOC, mas não nos outros. No estudo original de Müller-Pillasch et al. (24), a análise de Northern blot mostrou que a expressão de KOC estava restrita à placenta e não foi encontrada no coração, cérebro, pulmão, fígado, rim, pâncreas ou músculo esquelético. Por análise de RT-PCR, no entanto, observamos níveis significativos de expressão de mRNA de KOC nos testículos e em tecidos normais não testiculares, incluindo fígado, cólon, rim e cérebro. A este respeito, o padrão de expressão de KOC assemelha-se ao antígeno definido por linfócitos T citotóxicos não relacionado PRAME (25), isto é, expressão restrita por Northern blotting e expressão ubíqua pelo ensaio RT-PCR mais sensível. Uma descrição detalhada dessas descobertas sobre KOC os genes da família serão relatados em outro lugar.

O MAGO Família.

O segundo grupo consistindo de 11 clones foram derivados de genes pertencentes ao MAGO família. O sequenciamento de cinco clones representativos revelou sequências sobrepostas, todas elas derivadas da MAGE-4a gene (ref. 14, número de acesso GenBank U10687). Os outros seis clones mostraram hibridização dot blot positiva para uma sonda MAGE-4a derivada das sequências 5 ', indicando que eles pertenciam ao MAGO família (dados não mostrados). O mapeamento de restrição sugeriu ainda que esses clones provavelmente eram todos derivados de MAGE-4a, já que todos eles compartilhavam o mesmo EcoSítio RI, que está presente na extremidade 3 'do cDNA de MAGE-4a (posição do nucleotídeo 10932, número de acesso do GenBank U10687).

É de interesse que MAGE-4a, mas não outros genes MAGE, foram isolados no presente estudo. Embora MAGE-1 tenha sido isolado por SEREX (2), e o soro NW38 reage com a proteína recombinante MAGE-1 em vitro (19), MAGE-4a parece ser detectado com mais frequência pelo SEREX. MAGE-4a foi isolado de uma biblioteca de câncer de ovário por triagem autóloga (3) e também de bibliotecas testiculares e SK-MEL-37 com soro NW38. Em contraste, MAGE-1 foi isolado apenas uma vez (2), e os produtos de outros genes da família MAGE não foram detectados por SEREX. Embora se possa especular que o mRNA de MAGE-4a pode ser mais abundante do que outros genes da família MAGE, o fato de MAGE-4a ter sido isolado de bibliotecas de cDNA derivadas de diferentes fontes de tecido - testículos, câncer de ovário e uma linha de células de melanoma - torna isso explicação simples improvável. Portanto, é possível que MAGE-4a seja significativamente mais imunogênico para o sistema imune humoral do que outros membros MAGE.

Família NY-ESO-1.

O terceiro grupo consistia em cinco clones do NY-ESO-1 família. Dois clones eram idênticos ao NY-ESO-1 gene que descrevemos anteriormente (5). Os outros três clones foram derivados de um segundo gene do NY-ESO-1 família. Este gene, compartilhando 94% de nucleotídeo e 87% de homologia de aminoácidos com NY-ESO-1, anteriormente foi identificado por Léthe et al. (26) usando a análise de diferença representacional comparando o mRNA testicular vs. não testicular e foi designado como LAGE-1. Esse NY-ESO-1O gene relacionado também foi isolado por hibridização de nucleotídeos com uma sonda NY-ESO-1 (dados não publicados).

Embora a proteína LAGE-1 compartilhe forte homologia com NY-ESO-1, não houve evidência direta de que LAGE-1 seja imunogênica em pacientes com tumor. O isolamento de LAGE-1 por SEREX no presente estudo documenta que o produto LAGE-1, semelhante ao NY-ESO-1, é reconhecido pelo sistema imunológico humoral. No entanto, como NY-ESO-1 também foi identificado nesta triagem, ainda é possível que apenas um dos dois NY-ESO-1 Os genes foram os principais responsáveis ​​por induzir a resposta do anticorpo no paciente NW38, e que o outro gene foi isolado como consequência da reatividade cruzada do anticorpo.

O CT7 Gene.

O quarto grupo consiste em dois clones derivados de um novo gene e este gene foi designado CT7 (4).¶

Dois clones CT7 reativos a SEREX, MNW16b e MNW25c, foram identificados. MNW25c continha uma inserção de cDNA de 2.184 pb, 219 pb a mais do que MNW16b. Uma ORF de 543 aa foi identificada em MNW25c, estendendo-se até a extremidade 5 'da sequência clonada, indicando que este é um clone de cDNA parcial. Para obter sequências de cDNA completas e procurar membros de genes relacionados, uma biblioteca de cDNA testicular humana foi pesquisada com sondas derivadas de MNW25c. Onze clones positivos foram identificados e os dados de sequenciação dos seis clones mais longos indicaram que todos eles eram derivados do mesmo gene. O transcrito CT7 de comprimento total, excluindo cauda poli (A), consiste em 4.265 nt, ou seja, 286 bp de 5 ′ região não traduzida, 550 bp de 3 ′ região não traduzida e uma região de codificação de 3.429 bp (número de acesso do GenBank AF056334 ) A proteína prevista, de 1.142 resíduos de comprimento, tem uma massa molecular prevista de 123.872 Da.

A análise de homologia de sequência de DNA e proteína indicou homologia mais forte com MAGO genes da família, MAGE-10 em particular (13). A região de homologia, no entanto, foi limitada estritamente ao trecho ≈210 aa nas extremidades carboxila desses dois produtos gênicos, especificamente, os aminoácidos 908-1115 de CT7 e 134-342 de MAGE-10 (número de acesso do GenBank P43363) . Apesar da homologia de aminoácidos de 56% (75% incluindo alterações conservadoras) nesta região, nenhuma homologia foi identificada 5 ′ com esta sequência, com a proteína CT7 prevista (1.142 resíduos aa) muito maior do que a proteína MAGE-10 (369 resíduos) .

Uma característica única de CT7, diferente de MAGO ou qualquer outro gene conhecido, reside na região 5 '. O exame das sequências de nucleotídeos e aminoácidos nesta região revelou um padrão surpreendentemente repetitivo, como ilustrado na Fig. 2. As repetições, embora inexatas, parecem ser ricas em resíduos de serina, prolina, glutamina e leucina, com uma qualidade quase invariável ( P) Núcleo QS (P) LQ (I). O elemento repetitivo mais consistente está localizado no meio da molécula, onde foram observadas 10 repetições quase exatas de 35 resíduos aa. No geral, a porção repetitiva desta molécula compreende ~ 70% de toda a sequência, iniciando logo após o códon de iniciação da tradução (posição de aminoácido 15) e terminando logo antes do MAGO-região homóloga. Uma estrutura de codificação altamente repetitiva foi anteriormente encontrada por nós em um gene que codifica para CDR34, uma proteína de 34 kDa relacionada à degeneração cerebelar que isolamos por rastreamento de anticorpos de uma biblioteca cerebelar, com soro de um paciente com degeneração cerebelar paraneoplásica (27 ) O gene CDR34 contém um elemento altamente repetitivo que consiste em 34 repetições tandem inexatas de 6 aa. CT7 e CDR34 não estão estruturalmente relacionados, e a observação de que ambos contêm repetições em tandem e foram isolados por rastreio de anticorpos sugere que as moléculas com esta característica de repetição em tandem podem ser altamente imunogênicas para o sistema imune humoral.

Sequência de aminoácidos prevista de CT7, ilustrando a estrutura repetitiva codificada pelas sequências 5 'deste gene. A sequência tem vários elementos repetidos, a maioria deles contendo uma sequência central (P) QS (P) LQ (I). O elemento de repetição mais altamente conservado consistia em uma unidade de 35-aa que foi repetida 10 vezes em tandem (posições de aminoácidos 125-475). A sequência da extremidade carboxila de 208 aa (908-1115), que é homóloga ao gene MAGE-10, está sublinhada.

Restrito CT7 Expression in Normal and Tumor Tissues.

Os ensaios de RT-PCR foram usados ​​para avaliar a expressão de mRNA de CT7 em tecidos normais, linhas de células tumorais e amostras tumorais. Dos 14 tecidos normais testados, a expressão forte foi identificada apenas no testículo, e nenhuma expressão foi detectada no cólon, cérebro, adrenal, pulmão, mama, pâncreas, próstata, timo ou útero. Traços de produtos de RT-PCR em géis corados com brometo de etídio foram observados no fígado, rim, placenta e cérebro fetal (Fig. 3). O cérebro fetal mostrou três transcritos de tamanhos diferentes, as duas bandas adicionais de peso molecular mais baixo, no entanto, mostraram-se produtos de amplificação inespecíficos. O nível de expressão de mRNA em tecidos somáticos, estimado a partir das intensidades dos sinais, foi pelo menos 20 a 50 vezes menor do que no testículo.

Análise RT-PCR da expressão de CT7 em tecidos normais. A expressão de alto nível é vista apenas nos testículos. Vestígios de produtos de PCR foram detectados nos rins, fígado, placenta e cérebro fetal. Duas bandas adicionais de massa molecular inferior também foram observadas no cérebro fetal por sequenciamento; esses produtos foram comprovados como produtos de amplificação inespecíficos.

Das 12 linhas celulares de melanoma examinadas, 7 apresentaram expressão forte (NW38, SK-MEL-13, 19, 23, 30, 37, 179), uma apresentou expressão fraca (SK-MEL-33) e 4 foram negativas (MZ2- MEL-3.1, MZ2-MEL-2.2, SK-MEL-29, SK-MEL-31).

A Tabela 2 resume o padrão de expressão de mRNA de CT7 em tumores malignos de vários tipos. De 70 espécimes testados, transcrições CT7 foram detectadas em 26 dos casos (37%). Semelhante à nossa experiência com outros antígenos CT (ref. 28 e resultados não publicados), o nível de transcrição variou substancialmente entre as amostras positivas, com expressão de baixo nível (intensidades de sinal estimadas & lt1 / 10 dos expressores mais fortes usando dois pares de primers diferentes) visto em 12 das 26 amostras positivas: 2 de 7 melanomas positivos, 1 de 3 cânceres de mama, 1 de 3 cânceres de pulmão, 3 de 5 cânceres de cabeça e pescoço, 1 de 4 carcinomas de células transicionais, 1 de 1 leiomiossarcoma, 2 de 2 sinovial sarcomas e 1 de 1 câncer de cólon. A frequência geral de tumores com forte expressão de CT7 é, portanto, de 20% (14/70) neste grupo.

CT7 Expressão de mRNA em vários tumores humanos por RT-PCR

Análise de Southern Blot de CT7.

A análise de Southern blot genômica com sonda CT7 mostrou duas a quatro bandas em EcoRI, e HindIII digere, sugerindo a possibilidade de dois genes (Fig. 4). No entanto, o sequenciamento de seis clones de cDNA testicular mostrou sequências idênticas em regiões sobrepostas, com a única variação na posição 360 do nucleotídeo (número de acesso do GenBank AF056334). De quatro clones testiculares contendo esta região, esta posição era adenina em dois clones e guanina em dois outros clones. Esta diferença, provavelmente representando polimorfismo alélico, também resultaria em uma variação correspondente na sequência de aminoácidos, isto é, tirosina (TAT) versus cisteína (TGT).

Análise de Southern blot de CT7 gene. O DNA genômico extraído de tecidos normais de dois indivíduos foi digerido com EcoRI e HindIII e analisado com uma sonda CT7 derivada das sequências 5 'não relacionadas com MAGE. Duas bandas de intensidade semelhante foram vistas em HindIII digere, enquanto EcoAs digestões de RI mostraram uma banda forte e três bandas mais fracas, indicando que CT7 não pertence a uma família multigênica.

CT7 e MAGE-C1.

Usando a análise de diferença representacional para identificar genes expressos seletivamente em testículos e melanoma, Lucas et al. (29) definiram recentemente um gene com & gt99% de identidade para CT7 em sequências de codificação, que designaram como MAGE-C1. As sequências CT7 diferiam de MAGE-C1 por ter 30 nucleotídeos adicionais na região 5 'não traduzida, e também em 14 diferenças de nucleotídeo único na região de codificação, resultando em 11 diferenças de aminoácidos correspondentes. Dez de 11 resíduos de aminoácidos diferentes agrupados em 2 de 10 unidades de repetição de núcleo de 35-aa, e CT7 e MAGE-C1 provavelmente representam alelos diferentes do mesmo gene. MAGE-C1 foi mapeado para o cromossomo Xq26 (29) e, portanto, se junta aos outros genes codificadores de CT que também foram mapeados para o cromossomo X: MAGE, GAGE, SSX e NY-ESO-1.


Discussão

A triagem SEREX foi realizada em carcinomas esofágicos por Chen et al. [12] e Tureci et al. [26], que identificou com sucesso NY-ESO-I e NY-ESO-II. No presente estudo, identificamos ECSA-1, -2 e -3 como novos antígenos SEREX do CEC de esôfago. Estudos recentes demonstraram que autoanticorpos séricos, como p53 e AFP, são marcadores tumorais úteis [13-15, 27]. Os níveis de s-ECSA-Ab examinados por ELISA foram maiores do que o valor de corte em 15 - 21% dos pacientes com CEC de esôfago (Tabela 3). Embora essa taxa não tenha sido maior do que as taxas positivas de marcadores tumorais convencionais, como CYFRA 21-1, CEA e SCC-Ag (24 - 39%) [14], as taxas positivas de s-ECSA-Abs em doadores saudáveis ​​foram menores de 2%, indicando taxas de falso-positivo muito baixas. Com base nas sequências de aminoácidos conservadas entre os membros da família ECSA, três peptídeos foram sintetizados e usados ​​para ELISA. Um desses peptídeos, HCA-81/97, foi detectado com uma sensibilidade de 22% e uma especificidade de 100%. Essa alta especificidade sugere a utilidade de s-ECSA-Abs no diagnóstico de CEC de esôfago.

Até identificarmos três membros da família ECSA, apenas um membro, HCA25a, havia sido notificado, mas sem informações detalhadas. No entanto, três genes semelhantes ao HCA25a do chimpanzé foram registrados recentemente no banco de dados do NCBI. Assim, a família ECSA / HCA25a pode ser conservada entre primatas. Além de ECSA-1, -2 e -3, três membros, FAM119A, GOSR1 e BBS5, foram identificados por uma pesquisa de homologia (Figura 6). Designamos esta família como ECSA (e sopágico c arcinoma S EREX uma ntigen), mas não incluiu o nome da família HCA25a porque o HCA25a não estava aparentemente relacionado ao SCC esofágico (Figura 7).

Os níveis de expressão de mRNA de ECSA-1, -2 e -3 e FAM119A em tecidos tumorais foram frequentemente mais elevados do que aqueles em tecidos normais (Figura 7). Consistentemente, a análise imuno-histoquímica usando um mAb pan-ECSA mostrou que os níveis de expressão das proteínas ECSA eram baixos em tecidos normais, mas altos no SCC (Figura 8). Tal expressão tumor-específica sugere que esses membros da família ECSA podem desempenhar um papel crucial na carcinogênese. No entanto, nenhum dos clones ECSA isolados (ECSA-1, -2 e -3) continham códons de iniciação aparentes (Arquivo Adicional 1), e a sequência conservada foi identificada frequentemente nas regiões 3 'não traduzidas dos membros da família (Figura 6 ) É plausível que sejam expressos por splicing alternativo sob certas condições em células tumorais. O desenvolvimento de autoanticorpos séricos contra a sequência conservada da família ECSA sugere que o domínio conservado em alguns membros da família ECSA foi traduzido em proteínas. No entanto, não se pode descartar que o RNA ECSA pode não exercer um efeito por meio de seu produto peptídico, mas, em vez disso, pode atuar como RNA antisense ou moléculas de microRNA [28]. Alternativamente, a região de DNA que abriga a sequência conservada de ECSA pode ser um local de ligação de modificadores da cromatina, como a histona acetiltransferase e, assim, aumentar a expressão do gene.

TROP-2 [16], SURF1 [17], SLC2A1 [18], TRIM21 [19], miomegalina [21], UBE2I [22], AISEC [23], CUEC-23 [24] e makorin1 [25] são novos marcador tumoral SEREX antígenos de SCC esofágico. Entre esses marcadores, ECSA mostrou a maior especificidade. Embora a presença de s-ECSA-Abs tenha sido parcialmente associada a um mau prognóstico (Figura 4), outros dados do ensaio podem verificar a validade do ECSA como um marcador diagnóstico.

Avaliamos a significância clínica de s-ECSA-Abs em pacientes com CEC de esôfago. A presença de s-ECSA-Abs foi parcialmente associada a um mau prognóstico (Figura 4). A reatividade falso-positiva muito baixa de s-ECSA-Abs (Tabela 2) sugere que eles são úteis como novos marcadores de diagnóstico para CCE esofágico, não apenas por si próprios, mas também em combinação com outros marcadores tumorais convencionais.


RESULTADOS

SEREX definiu clones de cDNAs. O rastreamento imunológico das quatro bibliotecas de expressão de cDNA de câncer de cólon primário com soros autólogos ou alogênicos produziu um total de 48 clones soropositivos. A análise de sequência de cDNAs de clones isolados revelou 22 genes diferentes que foram depositados no banco de dados LICR SEREX (http://www.licr.org/SEREX.html) sob a designação KY-CC-1-KY-CC-22. Para as bibliotecas 1C-3C rastreadas com soros autólogos foram isolados 9 clones que representam 5 genes diferentes. Para a biblioteca 4C rastreada com pool de 6 soros alogênicos obtidos de câncer de cólon (estágios II-IV), os pacientes foram isolados 37 clones que representam 17 genes diferentes. A maior proporção de antígenos foi isolada durante o rastreamento imunológico alogênico da biblioteca 4C, em contraste com as outras bibliotecas livres rastreadas com soros autólogos (ver Tabela 1). Todos os antígenos isolados, exceto KY-CC-20, são genes com função conhecida (Tabela 2). A pesquisa de homologia com genes previamente definidos por SEREX no banco de dados LICR SEREX (http://www.licr.org/SEREX.html) revelou que 6 (KY-CC-2, 5, 6, 15, 16, 21) a 22 antígenos isolados neste trabalho foram identificados anteriormente em diferentes tumores e apenas KY-CC-16, 21 encontrados para câncer de cólon. Apesar de terem sido analisadas até cinco bibliotecas, os clones definidos por SEREX eram únicos para cada biblioteca imuno rastreada (ver Tabela 2). A análise das funções moleculares do antígeno mostrou que pelo menos 8 antígenos estão envolvidos na realização da informação genética (KY-CC-1 / RPL18, KY-CC-2 / se2–2, KY-CC-5 / EEF1A1, KY-CC -8 / BRCA2, KY-CC-13 / RPLP0, KY-CC-15 / PLRG1, KY-CC-18 / GNB2L1, KY-CC-22 / TRIP11) (ver Tabela 2). Os 7 antígenos participam da proliferação celular, desenvolvimento e apoptose (KY-CC-7 / PDAP1, KY-CC-8 / BRCA2, KY-CC-10 / TRIM2, KY-CC-11 / BTN3A3, KY-CC-18 / GNB2L1, KY-CC-19 / TSGA2, KY-CC-21 / UACA), outros 2 (KY-CC-3 / COX1, KY-CC-4 / TALDO1) revelaram atividade metabólica, 6 antígenos (KY-CC-9 / CXCR4, KY-CC-11 / BTN3A3, KY-CC-12 / FKBP4, KY-CC-16 / BRAP, KY-CC-18 / GNB2L1, KY-CC-22 / TRIP11) estão envolvidos na sinalização celular e 5 antígenos (KY-CC-6 / COL1A1, KY-CC-12 / FKBP4, KY-CC-14 / ACTR1A, KY-CC-16 / BRAP, KY-CC-17 / ACTB) participam da reestruturação do citoesqueleto e da célula adesão (ver Tabela 2). It should be noted that some antigens at least KY-CC-8/BRCA2, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/TRIP11exhibit multiple functions and were classified in different categories.

Table 2. Characterization of antigens identified by immunoscreening of colon cancer cDNA expression libraries

Antigen Gene homology Molecular Function
KY-CC-1/RPL18 Ribosomal protein L18 (RPL18) RNA synthesis. Part of the 60S ribosomal subunit
KY-CC-2/se2–2 CEP290 gene, Aliase CTCL tumor antigen se2–2 Part of the tectonic-like complex which is required for tissue-specific ciliogenesis and may regulate ciliary membrane composition. Activates ATF4-mediated transcription
KY-CC-3/COX1 Cytochrome c oxidase subunit I (COX1) Cytochrome c oxidase is the component of the respiratory chain that catalyzes the reduction of oxygen to water
KY-CC-4/TALDO1 Transaldolase 1 (TALDO1) The key enzyme of the pentose phosphate pathway and important for the balance of metabolites in the pentose-phosphate pathway
KY-CC-5/EEF1A1 Translation elongation factor 1 alpha 1 (EEF1A1) Promotes the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of ribosomes during protein biosynthesis
KY-CC-6/COL1A1 Collagen, type I, alpha 1
(COL1A1)
The collagen type I, alpha 1, play role in fibril forming, putative downregulated c-Myc target gene
KY-CC-7/PDAP1 PDGFA associated protein 1 (PDAP1) Enhances PDGFA-stimulated cell growth in fibroblasts, but inhibits the mitogenic effect of PDGFB
KY-CC-8/BRCA2 BRCA2 region, mRNA sequence CG016 Important for cell cycle control and DNA repair through homologous recombination, also involved in embryonic cellular proliferation
KY-CC-9/CXCR4 Chemokine (C-X-C motif), receptor 4 (fusin) (CXCR4) Receptor for the CХC chemokine. Acts as a receptor for extracellular ubiquitin. Involved in hematopoiesis, cardiac ventricular septum formation and mediates LPS-induced inflammatory response
KY-CC-10/TRIM2 Tripartite motif-containing 2 (TRIM2) UBE2D1-dependent E3 ubiquitin-protein ligase that mediates the ubiquitination of NEFL and of phosphorylated BCL2L11. Plays a neuroprotective function
KY-CC-11/BTN3A3 Butyrophilin, subfamily 3, member A3 (BTN3A3) Plays a role in T-cell responses in the adaptive immune response. Also, the proteins of this family play role in cell proliferation and development
KY-CC-12/FKBP4 FK506 binding protein 4 (59kD) (FKBP4) Immunophilin protein with PPIase and co-chaperone activities. Component of steroid receptors heterocomplexes through interaction with heat-shock protein 90 (HSP90). Acts also as a regulator of microtubule dynamics
KY-CC-13/RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 (RPLP0) Ribosomal protein (60S) is the functional equivalent of E. coli protein L10
KY-CC-14/ACTR1A ARP1 actin-related protein 1 homolog A, centractin alpha (yeast) (ACTR1A) Component of a multi-subunit complex involved in microtubule based vesicle motility. It is associated with the centrosome
KY-CC-15/PLRG1 Pleiotropic regulator 1 (PRL1 homolog) (PLRG1) Component of the PRP19-CDC5L complex that forms an integral part of the spliceosome and is required for activating pre-mRNA splicing
KY-CC-16/BRAP BRCA1 associated protein (BRAP) Negatively regulates MAP kinase activation by limiting the formation of Raf/MEK complexes probably by inactivation of the KSR1 scaffold protein. May also act as a cytoplasmic retention protein with a role in regulating nuclear transport
KY-CC-17/ACTB Actin, beta (ACTB) Actins are highly conserved proteins that are involved in various types of cell motility and are ubiquitously expressed in all eukaryotic cells
KY-CC-18/GNB2L1 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 (GNB2L1) Involved in the recruitment, assembly and/or regulation of a variety of signaling molecules and plays a role in many cellular processes. It is a part of the 40S ribosomal subunit
KY-CC-19/TSGA2 H. sapience testes specific A2 homolog (mouse) (TSGA2) May play an important role in male meiosis (By similarity). It is necessary for proper building of the axonemal central pair and radial spokes
KY-CC-20/IMAGE:4893383 EST: IMAGE: 4893383 No data available for molecular function
KY-CC-21/UACA Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats (UACA) Regulates APAF1 expression and plays an important role in the regulation of stress-induced apoptosis. Promotes apoptosis by regulating three pathways, apoptosome up-regulation, LGALS3/galectin-3 down-regulation and NF-kappa-B inactivation
KY-CC-22/TRIP11 TRIP11 H. sapiens thyroid hormone receptor interactor 11 Binds the ligand binding domain of the thyroid receptor (THRB) in the presence of triiodothyronine and enhances THRB-modulated transcription. Golgi auto-antigen

Allogeneic immunoscreening of SEREX-defined antigens. In order to determine colon cancer related serological profile of identified antigens allogeneic immunoscreening have been performed with sera obtained from 14 colon cancer and 6 gastric tract cancer patients, as well as 18 healthy donors. Eight of 22 tested antigens reacted with both normal and cancer sera samples two antigens were positive only for normal sera seven antigens showed no reaction with any sera and five antigens solely positive only for colon cancer sera (Table 3). For some antigens reacted with cancer and normal sera previously showed their association with autoimmune, inflammatory-related or non-cancerous (viral) diseases (see Table 3). In addition, KY-CC-1/RPL18, KY-CC-8/CG016, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/FLJ20542 may represent novel tumor-independent occurring autoantigens firstly isolated in this work. KY-CC-21/UACA, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-6/COL1A1 autoantigens revealed the highest percentage reactivity with both normal and cancer serums tested, ranging from 29% to 100% (see Table 3). Five antigens with colon-cancer specific serological profile, namely KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1, KY-CC-19/TSGA2, KY-CC-17/β-actin were reacting totally for 14% of tested colon cancer sera samples (Table 4). Through these antigens only KY-CC-15/PLRG1 was previously identified by SEREX-analysis in hepatocellular carcinoma (data unpublished), for the others have not been documented their reactivity with any tumor patients sera.

Table 3. SEREX-defined antigens with not colon cancer related serological profile

Antigen Serum reactivity (number of positive sera/number of sera analysed) Association with autoimmune disease2/reference
Colon tumor1 Gastrict tract tumor Healthy donors
KY-CC-1/RPL18 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-2/se2–2 0/14 2/6 1/18 No data
KY-CC-3/COX1 0/14 0/6 0/18 HT [16]
KY-CC-4/TALDO1 0/14 0/6 0/18 MS [17]
KY-CC-5/EEF1A1 2/14 0/6 3/18 No data
KY-CC-6/COL1A1 12/12 NT 11/11 PBC [18], AP [19]
KY-CC-7/PDAP1 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-8/CG016 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-9/CXCR4 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-10/TRIM2 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-11/BTN3A3 0/14 0/6 0/18 MS [20]
KY-CC-13/RPLP0 0/14 0/6 1/18 SLE [21]
KY-CC-16/BRAP 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-18/GNB2L1 5/9 NT 9/11 No data
KY-CC-20/IMAGE:4893383 1/7 NT 2/11 No data
KY-CC-21/UACA 5/14 1/6 5/18 Panuveitis [22]
KY-CC-22/FLJ20542 1/14 0/6 2/18 No data

Note: 1Data of serum reactivity not include reactivity with autologous or pool of allogeneic sera used for initial SEREX-analysis. 2Abbreviations: PBC — primary biliary cirrhosis AP — adult periodontitis MS — multiple sclerosis SLE — systemic lupus erythematosus HT — Hashimoto’s thyroiditis.

mRNA expression profile of serologically defined colon cancer specific antigens. KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 defined by allogeneic immunoscreening as colon cancer specific antigens were tested RT-PCR and real-time RT-PCR for 6 normal colon cDNAs and 9 colon cancer cDNAs.

Antigens tested by RT-PCR were positive for all colon cancer cDNAs KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 were positive for all 6 normal colon cDNAs, therefore KY-CC-12/FKBP4 and KY-CC-14/ACTR1A were positive only for 4 normal colon cDNAs and very weak bands observed for these genes for the other 2 normal colon cDNAs (data not shown). The relationship between tested antigens mRNA expression levels and serological reactivity was not examined for respective colon cancer patients due to their sera were not available for typing.

According to the result of real-time RT-PCR, KY-CC-14/ACTR1A mRNA showed increased expression level at 2.5–7.7 times for 8 through 9 tested colon cancer cDNAs compare to normal colon (Figure, a). So, KY-CC-14/ACTR1A may have slightly upregulated mRNA expression level as mean at 3.5 times in colon tumors.

Figure. Real-time RT-PCR results for relative expression level of identified colon cancer related antigens in 9 tested colon cancer cDNA samples. Expression level of antigens in normal colon referred as 1 in all cases

KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 showed heterogeneous mRNA expression profile in colon tumor samples with exceptionally high levels of transcripts compare to normal colon associated with the colon cancer case N7 (80 and 88 times elevation, correspondently) (Figure, b, c). KY-CC-19/TSGA2 mRNA expression also increased at 7 times in tumor case N3 and at 10 times in tumor case N9, despite for colon cancer cases NN 1, 2, 4, 5, 8 its normal expression down regulated at 2–3.5 times (Figure, b). KY-CC-15/PLRG1 mRNA in addition to tumor case N7 have slightly increased expression at 3 times in tumor case N3 and near the same level of expression compare to normal colon in tumor cases NN 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 (difference range at 0.48–1.96) (Figure, c). KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 represent the genes with selective activation of normal expression in some cases of colon cancer and may be immunogenic as aberrantly expressed.

By real-time RT-PCR result KY-CC-12/FKBP4 mRNA normal expression down regulated at 11–25 times in tumor cases NN 2, 3, 8 and at 3.1 and 3.7 times in tumor cases NN 4, 6, respectively (Figure, d). In the others four cases of tested tumors, KY-CC-12/FKBP4 mRNA expression was near at the same range (difference at 0.7–1.2 times) as in normal colon. KY-CC-12/FKBP4 showed a great down regulation of normal expression in approximately of ⅓ of colon cancer cases.


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In: Biotechnology Letters , Vol. 26, No. 7, 04.2004, p. 585-588.

Research output : Contribution to journal › Article › peer-review

T1 - SEREX identification of the autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease

N1 - Funding Information: This study was partly supported by grants from the Seoul National University Hospital (03-2003-0060). This study was also supported by a grant from Korea Research Foundation and Vascular System Research Center.

N2 - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.

AB - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Autor (es): Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Afiliação:

Nome do jornal: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Resumo:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Título: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

VOLUME: 15 EDIÇÃO: 3

Autor (es):Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Afiliação:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Resumo: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.


Panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection

Contente: Identification of panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection.

Objective: To create panel of antigens that can differentiate breast cancer patients and healthy individuals.

Métodos: SEREX (serological analysis of cDNA expression libraries) method, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), qPCR (quantitative polymerase chain reaction).

Resultados: In large-scale screening of 16 SEREX-antigens by sera of breast cancer patients and healthy donors, a combination of six antigens (RAD50, PARD3, SPP1, SAP30BP, NY-BR-62 and NY-CO-58) was identified, which can differentiate breast cancer patients and healthy donors with 70% sensitivity and 91% specificity. Elevated mRNA expression of SPP1 gene was revealed in breast tumors (2–7-fold) that correlated with SPP1 antigen immunoreactivity in autologous patients’ sera.

Conclusões: The new panel of six SEREX-antigens was proposed, which enables creation of serological assay for breast cancer diagnostics and/or prognosis.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Autor (es): Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Afiliação:

Nome do jornal: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Resumo:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Título: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

VOLUME: 15 EDIÇÃO: 3

Autor (es):Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Afiliação:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Resumo: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.


Assista o vídeo: DNA libraries u0026 generating cDNA. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Janeiro 2022).