Em formação

O que acontece com o metabolismo da droga quando as enzimas CYP450 são apresentadas com dois substratos


O que acontece quando duas substâncias, ambos substratos para o metabolismo do Citocromo P450, estão presentes na corrente sanguínea?

Por exemplo, com a sertralina e o canabidiol (CBD), se alguém tomou um comprimido de sertralina e depois usou o CBD, como a presença de dois substratos de CYP afeta o metabolismo da droga? Uma droga inibe o metabolismo da outra? O que acontece com os níveis sanguíneos das drogas? A ordem de administração importa?


Acho que o OP está perguntando o seguinte:

Se uma enzima não é específica de um substrato, mas é simultaneamente apresentada a um par de substratos, qual deles 'ganha' e como decidimos?

Por exemplo, se uma enzima é apresentada com um racemato de tal forma que a forma D tem um valor 10 vezes inferior $ K_m $ do que a forma L, mas a forma L tem um 5 vezes maior $ k_ {cat} $, qual é preferencialmente metabolizado e como decidimos?

Foi Fersht quem primeiro forneceu a resposta definitiva, pelo menos para enzimas de substrato único (Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 1977; ver também aqui)

O parâmetro cinético que determina a especificidade para substratos concorrentes não é $ K_m $ nem $ k_ {cat} $, mas a (chamada) constante de especificidade: $$ frac {k_ {cat}} {K_m} $$

Se for assumido que ambos os substratos, considerados isoladamente, obedecem à cinética de Michaelis-Menten, então é muito fácil derivar (começando com a razão das respectivas equações de Michaelis-Menten) a seguinte expressão para as velocidades iniciais quando ambos os substratos estão presentes simultaneamente.

$$ {{{{v_ {i} ^ 1}} over {v_ {i} ^ 2}}} = {{{{k_ {cat} ^ 1}} over {K_ {m} ^ 1} [ S_1]}} vezes {{{{K_ {m} ^ 2} [S_2]} sobre {k_ {cat} ^ 2}}} (1) $$

(A equação é derivada, entre outros, de Cornish-Bowden (2004, pp 36-39):

Se $ V_ {max} $ é preferido para $ k_ {cat} $: $$ {{{{v_ {i} ^ 1}} over {v_ {i} ^ 2}}} = {{{{V_ {max} ^ 1}} over {K_ {m} ^ 1} [ S_1]}} vezes {{{{K_ {m} ^ 2} [S_2]} acima de {V_ {max} ^ 2}}} (2) $$

$ {{k_ {cat}}} sobre {K_m} $ tem unidades de uma constante de taxa de segunda ordem e, dando-lhe um símbolo ($ {k_ {1} ^ { prime}} $ para $ S_1 $ e $ {k_ {2} ^ { prime}} $ para $ S_2 $) para refletir seu status como uma constante cinética fundamental e não apenas uma razão, permite que a seguinte equação seja escrita:

$$ {{{{v_ {i} ^ 1}} over {v_ {i} ^ 2}}} = {{{{k_ {1} ^ { prime}}} over [S_1]}} vezes {{{[S_2]} over {k_ {2} ^ { prime}}}} (3) $$

Essa equação fornece a resposta à pergunta do OP. Para o racemato descrito acima, precisamos apenas calcular a razão das constantes de especificidade para obter a resposta:

$$ {{{{v_ {i} ^ {D_ {form}}}} over {v_ {i} ^ {L_ {form}}}}} = {{{{k_ {D_ {form}} ^ { prime} times {[D_ {form}]}}} over {k_ {L_ {form}} ^ { prime}} times {[L_ {form}]}}} = {{{{k_ { D_ {form}} ^ { prime}}} over {k_ {L_ {form}} ^ { prime}}}} = 2 (4) $$

Muito poderia ser escrito sobre a constante de especificidade (controle de difusão, 'perfeição' da enzima, relações de Haldane), mas farei apenas uma. Considerando a enzima de Michaelis-Menten de substrato único, o seguinte é válido EM TODAS AS CONCENTRAÇÕES DE SUBSTRATO

$$ {{{{v_ {i}}}}} = {{{{k_ {1} ^ { prime}}}} [{S_o}] [E]} (5) $$

Quando $ S_o $ é muito baixo, $ [E] $ = $ e_o $ (aproximadamente) e o seguinte pode ser escrito (onde, ao contrário $ [E] $, $ e_o $ geralmente é conhecido ou pode ser determinado) $$ {{{{v_ {i}}}}} = {{{{k_ {1} ^ { prime}}}} [{S_o}] e_o} (6) $$

Mas é a Eqn (5) que é importante: $ k ^ { prime} $ (a chamada constante de especificidade) pode ser considerada como a constante de taxa de segunda ordem que governa a combinação de enzima ('livre') com substrato em todas as concentrações de substrato, não apenas quando $ S_o $ << $ K_m $

Muito poderia ser escrito sobre isso também

Definições

Acho que é razoavelmente óbvio o que tudo significa. No entanto, aqui está uma lista:

  • $ K_ {m} ^ 1 $ é a constante de Michaelis para o substrato 1
  • $ K_ {m} ^ 2 $ é a constante de Michaelis para o substrato 2

  • $ k_ {cat} ^ 1 $ é constante catalítica para o substrato 1

  • $ k_ {cat} ^ 2 $ é o catalítico para o substrato 2

  • $ V_ {max} ^ 1 $ é a velocidade máxima para o substrato 1

  • $ V_ {max} ^ 2 $ é a velocidade máxima para o substrato 2

  • $ k_ {1} ^ { prime} $ é a constante de especificidade para o substrato 1

  • $ k_ {2} ^ { prime} $ é a constante de especificidade para o substrato 2

  • $ v_ {i} ^ {1} $ é a velocidade inicial devido ao substrato 1

  • $ v_ {i} ^ {2} $ é a velocidade inicial devido ao substrato 2

Referência

  • Cornish-Bowden (2004) Fundamentos da cinética enzimática 3rd Edn. Portland Press (Londres)

O que são CYPs? Como eles são diferentes de outras enzimas?

As enzimas do citocromo P450 (CYPs) são uma grande família de enzimas envolvidas no metabolismo de muitos compostos endógenos e exógenos (incluindo substâncias dietéticas e farmacêuticas típicas). Existem muitos CYPs diferentes, cada forma de CYP individual pode metabolizar muitos compostos diferentes e um único composto é normalmente metabolizado por mais de um CYP, às vezes no mesmo local, às vezes em vários locais, às vezes em uma sequência ordenada e às vezes não. Essa promiscuidade na interação substrato / enzima está em contraste com a maioria das enzimas humanas, que são altamente específicas. Seu custo, porém, é a eficiência.

CYPs e interações medicamentosas

Os efeitos do CYP são um subconjunto importante das interações medicamentosas, mas normalmente não são descritos em termos de condições raciais. Talvez isso se deva à relação particular entre a enzima e o substrato. Além de serem metabolizados por CYPs, muitos medicamentos e substâncias dietéticas podem inibir algumas formas de CYP e induzir outras (incluindo formas que não metabolizam a própria substância).

Para responder à pergunta específica sobre se a ordem de administração é importante, enquanto a inibição é tipicamente no nível da interação de proteínas, a indução envolve interações de genes. Como a indução envolve interações gênicas, a indução resulta em interações que não dependem de ambos os medicamentos estarem disponíveis para o CYP ao mesmo tempo. Isso significa que (para efeitos de indução) nem a alteração da ordem de administração nem o escalonamento das doses impedem a interação. Geralmente, os exemplos de interação fármaco-fármaco que são facilmente evitados por ordem de dosagem envolvem interações farmacodinâmicas, isto é, interações no alvo molecular pretendido do fármaco.

Isso é tudo que você deve considerar ao avaliar uma possível interação medicamentosa?

Para enfatizar, direi novamente: os efeitos CYP são importantes subconjunto de interações medicamentosas. Existem muitos coisas a considerar ao avaliar o efeito da polifarmácia.

Leitura adicional

Você pode ler mais sobre isso em Goodman & Gilman, the Pharmacological Basis of Therapeutics. O Capítulo 6 tem uma boa subseção sobre o metabolismo do CYP em geral, com discussão específica sobre o metabolismo de diferentes compostos em outros capítulos. A maioria dos bons livros básicos de farmacologia cobrem isso, mas acho que G&G faz um trabalho particularmente bom. As informações completas dos prescritores sobre qualquer medicamento incluirão informações sobre o metabolismo, inibição e indução do CYP450. Você pode olhar a wikipedia, mas este não é o melhor artigo da wikipedia que li.

E quanto à sertralina e ao CBD?

Não vou fazer uma declaração sobre se uma determinada combinação de drogas interage ou não, nem que seja para encorajar alguém com uma questão de interação droga-droga FALE COM SEU MÉDICO, ou quem quer que tenha prescrito o seu medicamento. Diferentes jurisdições têm diferentes leis sobre o CBD, mas os médicos não são responsáveis ​​pela aplicação da lei. Você pode e deve contar a ele / ela sobre tudo o que você leva.


Esta revisão enfoca um dos principais fatores responsáveis ​​pelas diferenças na exposição a drogas / metabólitos em pacientes pediátricos e idosos em comparação com a população adulta, ou seja, as diferenças no metabolismo da droga (qualitativa e quantitativa) e, em particular, diferenças devido a mudanças na atividade e / ou concentração de enzimas metabolizadoras de drogas. Diferenças importantes foram encontradas na população pediátrica em comparação com adultos para ambas as enzimas de fase I (por exemplo, CYP3A7 versus CYP3A4 e CYP1A2, enzimas redutoras e hidrolíticas) e de fase II (por exemplo, glucuronosiltransferases). Em idosos, algumas enzimas de fase I (por exemplo, esterases) parecem estar prejudicadas. A partir das informações coletadas até agora, parece que as reações da fase II, embora algumas vezes diminuam, não são amplamente afetadas pela idade avançada.

MARGHERITA STROLIN BENEDETTI Margherita Strolin Benedetti (PhD Chemistry, University of Bologna) é autora de 450 publicações em periódicos internacionais, a maioria na área de farmacologia bioquímica, enzimologia, farmacocinética, metabolismo de drogas e interações medicamentosas. Atualmente, ela é Diretora Associada de Assuntos Científicos do Departamento de Desenvolvimento Não Clínico da UCB. Anteriormente, ela dirigiu grupos de pesquisa em outras empresas farmacêuticas internacionais, contribuindo para o desenvolvimento de medicamentos importantes, e também trabalhou como Assistente de Pesquisa na Universidade de Genebra, onde se especializou no estudo do metabolismo de medicamentos com compostos radiomarcados.

RHYS WHOMSLEY Rhys Whomsley (PhD em Química / Farmacologia, University of Wales) é autor de mais de 30 publicações na área de metabolismo e transporte de drogas, farmacocinética e inibição ou indução enzimática. Ele tem mais de 20 anos de experiência em aspectos científicos e regulatórios do desenvolvimento de medicamentos, liderando equipes na indústria farmacêutica, contratando pesquisas e na Universidade do País de Gales, onde se concentrou no desenvolvimento de inibidores de enzimas esteroidogênicas no tratamento de cânceres dependentes de hormônio . Atualmente, é Cientista Principal Sênior de Desenvolvimento Não Clínico da UCB.

MICHAEL CANNING Michael Canning (Veterinary Science, University of Bristol) é patologista veterinário com formação e tem mais de 17 anos de experiência no desenvolvimento de medicamentos não clínicos e assuntos regulatórios, com interesses especiais em carcinogenicidade e toxicologia reprodutiva e juvenil. Ele é atualmente o vice-presidente de desenvolvimento não clínico da UCB, tendo anteriormente ocupado cargos no Reino Unido e na Europa continental.


Metabolismo no Design de Drogas

Na descoberta de medicamentos, compreender as vias do metabolismo de um medicamento candidato aumenta muito suas chances de sobreviver ao desenvolvimento. Ele nos permite prever como um medicamento pode se comportar uma vez dentro do corpo do paciente, bem como fazer modificações em sua estrutura existente.

Para simplificar, se suspeitarmos que um determinado grupo funcional o tornará instável, podemos substituí-lo por outro para aumentar sua meia-vida geral e vice-versa se for muito estável.

O fígado desempenha um papel fundamental no metabolismo e na depuração de medicamentos. A difusão passiva, assim como várias proteínas transportadoras, são responsáveis ​​por mover os compostos da droga da corrente sanguínea para as células hepáticas, que podem então fazer sua mágica. Geralmente, o papel do fígado é tornar os compostos mais hidrofílicos (ou solúveis em água) de forma que possam ser dissolvidos e excretados na urina (que é principalmente água).


Citocromo P-450

O sistema enzimático mais importante do metabolismo da fase I é o citocromo P-450 (CYP450), uma superfamília microssomal de isoenzimas que catalisa a oxidação de muitos medicamentos. Os elétrons são fornecidos pela NADPH – CYP450 redutase, uma flavoproteína que transfere elétrons do NADPH (a forma reduzida do fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina) para o CYP450.

As enzimas CYP450 podem ser induzidas ou inibidas por muitos fármacos e substâncias resultando em interações medicamentosas nas quais um fármaco aumenta a toxicidade ou reduz o efeito terapêutico de outro fármaco. Para exemplos de drogas que interagem com enzimas específicas, consulte as tabelas Substâncias comuns que interagem com enzimas e interações medicamentosas do citocromo P-450.


Exame 1: princípios básicos, farmacodinâmica, farmacocinética, metabolismo de drogas, biodisponibilidade e princípios farmacológicos

CYP2C9 e CYP2C19 são muito importantes no metabolismo de drogas: os substratos incluem __ para CYP2C9 __ e __ para CYP2C19 - CYP2C9 está ausente em __% dos caucasianos, enquanto CYP2C19 está ausente em __-__% de asiáticos e __-__% de caucasianos

Substratos CYP2D6 incluem __, __, __ e __ e está ausente em __% dos caucasianos

CYP3A4 (MAJOR.) É a isoforma humana mais abundante - __% dos fármacos são metabolizados por ela.

Fenitoína, diazepam, naproxeno, 1, 15-20, 2-5

Codeína, dextrometorfano, paroxetina, desipramina, 7 (toxicidade em pessoas em que isto está ausente. - toxicidade por codeína)

Isso é responsável por 20% da oxidação do etanol em altas concentrações de alcoolemia

2. Sulfatação: a sulfotransferase catalisa para metildopa e paracetamol

3. Conjugação de glutationa: GSH-transferase catalisa para acetaminofeno

4. Acetilação: N-acetil transferase catalisa isoniazida e sulfonamidas

Vegetais crucíferos podem induzir CYP1a, mas inibem CYP2E1

Alelo CYP2D6 3 - metaboliza fracamente. É uma reação defeituosa de O-desmetilação e ocorre em 6-10% dos brancos, 2-5% dos afro-americanos e 1% dos asiáticos. Os medicamentos afetados incluem codeína (metabolismo diminuído levando à analgesia) e URM com CYP2D6 - é necessário ajuste da dose ou administrar morfina

Encontrado em 40-70% dos brancos e afro-americanos

O etanol inibe o metabolismo do metanol (!!) ao inibir o ADH

O etanol tem afinidade 10x maior para o ADH do que o metanol e desvia competitivamente o metabolismo do metanol para caminhos alternativos que não criam ácido fórmico

Drogas hidrofóbicas - & gt fígado - & gt metabólito de droga hidrofílica - & gt bile - & gt cocô

Quando o Css é atingido, a concentração plasmática do fármaco permanecerá a mesma enquanto a taxa de dosagem / taxa de infusão e depuração / taxa de eliminação forem constantes. As drogas que seguem a cinética de primeira ordem seguem esse platô!

A atividade metabólica hepática atinge, na verdade, seu pico na primeira infância (2-3 anos)

O metabolismo começa a declinar atingindo os valores adultos na puberdade (

1
AP infantil para 19, aumentado para 9

Jovem: dose de adulto x idade / (+ 12 anos)

Maior consumo de medicamentos sem prescrição (antiácidos, laxantes) e polifarmácia

2. Trimetoprim-sulfametoxazol: aumento do risco de hipercalemia na presença de diminuição da depuração da creatinina

3. Opioides interagindo com benzodiazepínicos: risco aumentado de OD

4. Varfarina interagindo com antibióticos macrolídeos (exceto azitromicina): aumento do risco de sangramento

Diminuição da água corporal total: drogas solúveis em água diminuíram Vd

Aumento da gordura corporal total: drogas solúveis em gordura como diazepam, tiopental, trazadona - Vd / meia-vida AUMENTOU

Fluxo sanguíneo do fígado diminuído

2. Não relacionado à dose (Bizarro): qualquer exposição é suficiente para desencadear tal reação - Anafilaxia ao PCN

3. Relacionado com a dose e relacionado com o tempo (crônico): devido ao acúmulo da dose ou com o uso prolongado - Supressão adrenal com corticosteróides

4. Relacionado ao tempo (atrasado): devido ao uso prolongado de uma droga que não tende a se acumular - Discinesia tardia de antipsicóticos

5. Retirada (fim do uso): os efeitos indesejáveis ​​de cessar a droga - Retirada de benzodiazepina (insônia)


Transcrição da apresentação

Polimorfismo Genético no Metabolismo de Drogas - CYP450 Isoenzymes Apresentado por: Lahari Paladugu (PharmD 09-10) Apresentado em: 7 de fevereiro de 2014

O que é polimorfismo genético? (1) A existência conjunta de muitas formas de sequências de DNA em um locus dentro da população. (2) Uma variação genética descontínua que resulta em diferentes formas ou tipos de indivíduos entre os membros de uma única espécie.

Polimorfismo genético e metabolismo de drogas • variação interindividual dos efeitos de drogas • Polimorfismos genéticos de enzimas que metabolizam drogas dão origem a subgrupos distintos na população que diferem em sua capacidade de realizar certas reações de biotransformação de drogas. • Polimorfismos são gerados por mutações nos genes para essas enzimas, que causam diminuição, aumento ou ausência de expressão ou atividade enzimática por múltiplos mecanismos moleculares.

Metabolismo de drogas • O metabolismo de drogas e outros xenobióticos em metabólitos mais hidrofílicos é essencial para sua eliminação do corpo, bem como para o término de sua atividade biológica e farmacológica. • As reações de metabolismo de drogas ou de biotransformação são classificadas como reações de funcionalização de fase I ou biossintéticas de fase II (reações de conjugação).

Metabolismo de drogas (cont.) • Os sistemas enzimáticos envolvidos na biotransformação de medicamentos estão localizados principalmente no fígado. • Outros órgãos com capacidade metabólica significativa incluem o trato gastrointestinal, rins e pulmões. • Estas reações de biotransformação são realizadas por CYPs (isoformas do citocromo CYP450) e por uma variedade de transferases.

Metabolismo de drogas (cont.) • As vias do metabolismo da droga são classificadas como: • Reações de Fase I: oxidação, redução, hidrólise • Reações de Fase II: acetilação, glucuronidação, sulfatação, metilação • Ambos os tipos de reações convertem drogas relativamente solúveis em lipídios em metabólitos relativamente inativos e mais solúveis em água , permitindo uma eliminação sistêmica mais eficiente.

Polimorfismos • As diferenças genéticas no metabolismo dos medicamentos são o resultado da variação com base genética nos alelos dos genes que codificam as enzimas responsáveis ​​pelo metabolismo dos medicamentos. • Nos polimorfismos, os genes contêm pares ou múltiplos anormais ou alelos anormais que levam à função enzimática alterada. • As diferenças na atividade enzimática ocorrem em taxas diferentes de acordo com o grupo racial.

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) • Alterações únicas em um alelo de um gene responsável por uma variedade de processos metabólicos, incluindo o metabolismo enzimático. • A combinação de alelos que codificam o gene determina a atividade e eficácia da enzima. • A função geral da enzima é o fenótipo da função enzimática. • Fenótipo: as características físicas ou bioquímicas observáveis ​​determinadas pela composição genética e influências ambientais

Metabolizadores fracos • dois alelos defeituosos (ex: CYP2D6 * 4 / * 5 e CYP2D6 * 4 / * 4) • Combinação de alelos, incluindo um que resulta em nenhuma enzima (ex: eliminação de CYP2D6 * 5 e CYP2D6 * 4) • Metabolizadores intermediários • Heterozigotos - tendo apenas um alelo de tipo selvagem e um alelo defeituoso • Metabolizadores normais • Carregam alelos de tipo selvagem (ex: CYP2D6 * 1 / * 3). • Alelos de tipo selvagem codificam genes para função enzimática normal

Metabolizadores extensivos • Carregam um tipo selvagem e um gene amplificado • ex: CYP2D6 * 1 / * 2, CYP2D6 * A / * 1a e CYP2D6 * 1A / * 5 • Metabolizadores ultrarrápidos • Carregam duas ou mais cópias do gene amplificado • ex: CYP2D6 * 2 / * 3

Mudanças genéticas podem inativar ou reduzir a atividade enzimática levando a um aumento no substrato do medicamento. • A duplicação genética pode aumentar a atividade enzimática, resultando em níveis mais baixos do substrato do medicamento.

Inibidores e indutores de amp • Os polimorfismos afetam as interações medicamentosas, alterando o efeito dos inibidores e indutores sobre a enzima. •  resulta em um efeito exagerado ou mínimo no substrato • Inibidor: Um inibidor de enzima é uma molécula que se liga a enzimas e diminui sua atividade. • Indutor: um indutor enzimático é um tipo de medicamento que aumenta a atividade metabólica de uma enzima, seja ao se ligar à enzima e ativá-la, seja ao aumentar a expressão do gene que codifica a enzima.

Metabolizadores extensivos - inibidores • Amolizador extenso ----- o nível do substrato do fármaco é normalmente baixo devido ao rápido metabolismo pela enzima. • Um inibidor da enzima inibirá o extenso metabolismo e causará elevações significativas no substrato do medicamento. • O efeito dos inibidores é muito maior em um aumento de EM . nível de níveis de substrato

Metabolizadores fracos - inibidores • Em um metabolizador fraco, o nível do substrato do medicamento permanece alto porque o metabolismo do substrato é muito menor do que o normal. • Quando um inibidor é adicionado, a inibição adicional do metabolismo não é muito maior do que já está ocorrendo no PM. • O efeito do inibidor é menor em um PM do que em metabolizadores normais. • A interação medicamentosa pode não ocorrer.

Metabolizadores extensivos - indutores • O nível do medicamento substrato é menor do que em um metabolizador normal devido ao metabolismo rápido. • A adição de um indutor não causa uma diferença maior no nível de substrato porque o metabolismo já está bastante aumentado. • A interação medicamentosa pode não ocorrer.

Metabolizadores pobres - indutores • O nível de substrato do medicamento é maior do que o esperado no metabolizador normal devido ao metabolismo mais baixo do substrato. • A adição de indutor causará um aumento significativo no metabolismo do substrato  nível de substrato muito mais baixo do que o esperado em um metabolizador normal. • A interação medicamentosa pode ocorrer em maior extensão. • A interação medicamentosa pode resultar em níveis de substrato semelhantes aos dos metabolizadores normais.

**NOTA** • O efeito do inibidor é grande em EMs do que em PMs. • O efeito do indutor é maior em PMs do que em EMs.

Interações medicamentosas complexas • Pode ser observado quando um substrato é metabolizado por meio de mais de um sistema enzimático, onde uma ou mais enzimas são afetadas pelo polimorfismo.

Enzimas P450 no metabolismo de drogas • A superfamília de enzimas polimórficas P450 (CYP) é o sistema mais importante envolvido na biotransformação de muitas substâncias endógenas e exógenas, incluindo drogas, toxinas e carcinógenos. • A genotipagem para polimorfismos CYP fornece informações genéticas importantes que ajudam a compreender os efeitos dos xenobióticos no corpo humano. • Para o metabolismo de medicamentos, os polimorfismos mais importantes são aqueles dos genes que codificam para CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 e CYP3A4 / 5, que podem resultar em falha terapêutica ou reações adversas graves.

CITOCROMO P4502D6 • Enzima metabolizadora de drogas polimórficas mais extensivamente estudada • Debrisoquina --- hipotensão acentuada • Capacidade prejudicada de hidroxilar e, portanto, inativar a debrisoquina • 5-10% dos indivíduos brancos têm deficiência relativa na capacidade de oxidar a debrisoquina • Também têm capacidade prejudicada de metabolizar a fármaco antiarrítmico e oxitócico esparteína • PM  concentração urinária mais baixa, concentrações plasmáticas mais altas • Os indivíduos herdaram duas cópias de um gene ou genes que codificam uma enzima com atividade de CYP2D6 diminuída ou nenhuma atividade • Proeminente na população da África Oriental - frequência tão alta quanto 29%

SUBFAMÍLIA DO CITOCROMO P4502C • É responsável por aproximadamente 18% do conteúdo de CYP no fígado • Catalisa cerca de 20% do metabolismo mediado por CYP dos medicamentos CYP2C19 • O estudo usando mefenitoína como droga-sonda determinou que os indivíduos podem ser segregados em EMs e PMs. • O traço PM é autossômico recessivo - presente em 3-5% dos caucasianos e 12-23% das populações asiáticas

CYP2C19 (cont.) • Também catalisa o metabolismo de vários inibidores da bomba de prótons (ou seja, omeprazol), diazepam, talidomida e alguns barbitúricos. • Responsável pela inativação ou propranolol e ativação metabólica do antimalárico proquanil.

CYP2C19 e amp Diazepam • O diazepam é desmetilado pelo CYP2C19 • A meia-vida do diazepam plasmático é maior em indivíduos que são homozigotos para o alelo CYP2C19 * 2 defeituoso em comparação com aqueles que são homozigotos para o alelo de tipo selvagem. • A meia-vida do metabólito desmetildiazepam também é maior em metabolizadores fracos do CYP2C19. • Alta frequência na população asiática. • A toxicidade induzida pelo diazepam pode ocorrer como resultado do metabolismo mais lento - dosagem cuidadosa na população asiática.

CYP2C9 • Membro principal da subfamília CYP2C no fígado • Principalmente responsável pelo metabolismo oxidativo de compostos importantes - varfarina, fenitoína, tolbutamida, glipizida, losartan, etc. • 6 polimorfismos diferentes - CYP2C9 * 1, * 2, * 3, * 4, * 5, * 6 • CYP2C9 * 1 - alelo de tipo selvagem, CYP2C9 * 2- * 6 - variantes • Variantes * 2 e * 3 alelos são comuns em caucasianos (≈35%) • CYP2C9 * 2 e * 3 alelos associados com redução significativa no metabolismo e depuração de substratos CYP2C9 selecionados

CYP2C9 e varfarina • Polimorfismos associados à toxicidade e aos requisitos de dosagem para uma anticoagulação ideal com varfarina. • Variantes * 2 e * 3 - maior risco de complicações hemorrágicas agudas do que pacientes com genótipo * 1 tipo selvagem. • Requer dose de manutenção 15-30% menor de varfarina para atingir INR alvo • Pacientes com genótipo variante CYP2C9 levam em média 95 dias a mais para atingir dosagem estável em comparação com o grupo do tipo selvagem

Dihidropirimida desidrogenase • Metabolismo do agente antineoplásico fluorouracil. • Na década de 1980, a toxicidade fatal para o SNC se desenvolveu em vários pacientes após o tratamento com doses padrão de fluorouracil. • Os pacientes tinham deficiência hereditária de dihiropirimidina desidrogenase. • DPD metaboliza fluorouracil e pirimidinas endógenas. • Grave toxicidade de fluorouracil ocorre quando a atividade DPD & lt 100 pmol / min / mg de proteína. • 3% da população carrega mutações heterozigotas que inativam DPD e 1% são homozigotos para as mutações inativadoras. • Indivíduos heterozigotos não exibem nenhum fenótipo até serem desafiados com fluorouracil.

SUBFAMÍLIA CITOCROMA P4503A • A subfamília CYP3A desempenha um papel crítico no metabolismo de mais medicamentos do que qualquer outra enzima de fase I. • Expressa no fígado e intestino delgado • Contribui para a absorção oral, primeira passagem e metabolismo sistêmico • A expressão é altamente induzível - influência da atividade enzimática por fatores como mecanismos de controle homeostático variáveis, regulação para cima ou para baixo por fatores ambientais e polimorfismos .

CYP3A4 • Mais de 30 SNPs foram identificados para o gene CYP3A4 • Ao contrário de outros P450s, não há evidência de alelo eliminado ou nulo para CYP3A4. • A variante mais comum no CYP3A4, CYP3A4 * 1B é uma transição A392G na região do promotor referida como o elemento de resposta à nifedipina. • Um estudo mostra que essa variante pode estar associada a uma depuração mais lenta da ciclosporina. • Este é um achado bastante controverso.

CYP3A5 • Polimorficamente expresso em adultos em cerca de 10-20% em caucasianos, 33% em japoneses e 55% em afro-americanos. • A variável CYP3A5 * 3 é um resultado de splicing impróprio de mRNA e tradução reduzida de proteína funcional. • CYP3A5 é a principal isoforma extra-hepática do CYP3A, sua expressão polimórfica foi implicada no risco de doença e no metabolismo de esteróides endógenos ou drogas em outros tecidos além do fígado. • O CYP3A5 foi associado aos requisitos de dose de tacrolímus para manter a imunossupressão adequada em pacientes com transplante de órgãos sólidos.

CYP3A7 • Expressa no fígado fetal durante o desenvolvimento • A expressão hepática é geralmente regulada para baixo após o nascimento, mas a proteína CYP3A7 foi detectada em alguns adultos • A expressão aumentada de CYP3A7 foi associada à substituição do fragmento de 60 nucleotídeos do promotor CYP3A7 pela região correspondente forma do promotor CYP3A4 (alelo CYP3A7 * 1C.) • Essa troca de promotor resulta em aumento da expressão gênica do elemento de resposta do receptor pregnano X.

A sinalização PXR serve como um regulador central de indução Expressão de CYP3A4, bem como vários outros genes envolvidos na desintoxicação de drogas. • Os polimorfismos no PXR sugerem que a variabilidade observada na atividade enzimática do CYP3A4 pode ser devida, em parte, a diferenças herdadas nas proteínas de sinalização a montante que controlam a indução da expressão gênica.

N-ACETILTRANSFERASE • N-acetilação de isoniazida em acetilisoniazida • Os indivíduos são acetiladores lentos ou rápidos • Variação étnica é observada • Acetilação lenta: japoneses (10%), chineses (20%), caucasianos (60%) • A proteína NAT2 é a isoforma de proteína específica que acetilatos isoniazida. • 27 alelos NAT2 exclusivos identificados • NAT2 * 4 é o alelo de tipo selvagem • Alelos NAT2 contendo as substituições associadas missense G191A, T341C, A434C, G590A e / ou G857A estão associadas ao fenótipo acetilador lento.


C onclusão

Nosso objetivo foi apontar a possível interferência dos flavonóides com a coloração e sinal das sondas de fluorescência e avaliar os resultados de estudos de intervenção humana quanto à avaliação de OB com essas sondas (Tabela 2).

O uso de métodos de sangue total foi recomendado anteriormente para evitar a introdução de artefatos devido ao processo de purificação e para reproduzir a situação in vivo mais de perto 24. No entanto, nessas condições experimentais, a presença de flavonóides no plasma pode interferir na coloração da sonda de fluorescência. Os valores plasmáticos de flavonóides após a ingestão de alimentos (Tabela 1) estão longe da concentração alcançada para detectar uma inibição de OB in vitro (10 −5 M a 10 −4 M), mas em concentrações próximas aos níveis circulantes pós-ingestão de alguns flavonóides e seus metabólitos podem interferir na coloração das sondas e sinal de fluorescência por meio de diferentes mecanismos (Fig. 1 e Tabela 3), como inibição de esterases (10 -6 M a 10 -4 M), inibição do efluxo das sondas mediadas por MDR (10 −6 M a 10 −5 M) e inibição da oxidação das sondas (10 −8 M a 10 −5 M). Esses efeitos podem explicar os resultados contrastantes obtidos por estudos de intervenção humana com quercetina e bebidas ricas em flavonóides (Tabela 4). É difícil estabelecer o efeito final na fluorescência das sondas devido às múltiplas interações que ocorrem entre diferentes flavonóides e metabólitos e diferentes sondas (Fig. 1). O deslocamento de etídio foi relatado para a quercetina devido às suas propriedades intercalantes 161, 162, tornando a interpretação dos dados com HE (Tabela 4) difícil.

Por outro lado, como pode haver sobreposição da distribuição celular e especificidade do substrato de vários transportadores, uma interação complexa pode determinar a disposição de DHR123, Rho123 e DCF, conforme observado para drogas. Em células HCT-15 de adenocarcinoma colorretal humano, a quercetina diminuiu o acúmulo, enquanto a naringenina e a hesperidina dos citros aumentaram o acúmulo do substrato Pgp fexofenadina 55. No entanto, em um estudo cruzado randomizado em indivíduos saudáveis, os sucos de toranja, laranja e maçã diminuíram a área de fexofenadina sob a curva de concentração plasmática-tempo (AUC), a concentração plasmática máxima de fármaco (Cmax), e a excreção urinária, sugerindo que os sucos de frutas são inibidores mais potentes da OAT do que as atividades da Pgp 185. Aumentos no acúmulo de sondas foram relatados in vitro com quercetina, mas não com suco cítrico, catequina e naringenina (Tabela 3). Além disso, os diferentes efeitos observados com DHR123 após bolus e consumo de vinho tinto a longo prazo (Tabela 4), podem ser devido aos efeitos moduladores dos flavonóides nas proteínas MDR. Na administração aguda, o antagonismo competitivo em MDR pode prevalecer, enquanto em longo prazo a indução de proteínas MDR pode ocorrer 138.

Considerando que o Tmax de metabólitos é muito variável, em particular para a soja variando entre 0,5 h e 17 h 32, o jejum noturno típico pode não ser suficiente para evitar interferências alimentares. Portanto, o hábito alimentar pode ter implicação em todos os estudos que visam avaliar o BO. Finalmente, também o uso de outro substrato de proteínas MDR 68, bem como os estados inflamatórios 107-109, poderiam afetar a avaliação de OB com sondas intracelulares.


Interações medicamentosas

As interações medicamentosas significativas com a lamotrigina estão resumidas nesta seção.

Uridine 5´-diphospho-glucuronyl transferases (UGT) have been identified as the enzymes responsible for metabolism of Lamotrigine. Drugs that induce or inhibit glucuronidation may, therefore, affect the apparent clearance of Lamotrigine. Strong or moderate inducers of the cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) enzyme, which are also known to induce UGT, may also enhance the metabolism of Lamotrigine.

Those drugs that have been demonstrated to have a clinically significant impact on Lamotrigine metabolism are outlined in Table 13. Specific dosing guidance for these drugs is provided in the Dosage and Administration section [see Dosage and Administration (2.1)].

Additional details of these drug interaction studies are provided in the Clinical Pharmacology section [see Clinical Pharmacology (12.3)].

Effect on Concentration of Lamotrigine or Concomitant Drug

Estrogen-containing oral contraceptive preparations containing 30 mcg ethinylestradiol and 150 mcg levonorgestrel

Decreased Lamotrigine concentrations approximately 50%.

Decrease in levonorgestrel component by 19%.

Carbamazepine and epoxide

Addition of carbamazepine decreases Lamotrigine concentration approximately 40%.

May increase
Carbamazepine epoxide levels.

Decreased Lamotrigine concentration approximately 50%.

Decreased Lamotrigine AUC approximately 32%.

Decreased Lamotrigine concentration approximately 40%.

Decreased Lamotrigine concentration approximately 40%.

Decreased Lamotrigine AUC approximately 40%.

Increased Lamotrigine concentrations slightly more than 2-fold.

There are conflicting study results regarding effect of Lamotrigine on valproate concentrations: 1) a mean 25% decrease in valproate concentrations in healthy volunteers, 2) no change in valproate concentrations in controlled clinical trials in patients with epilepsy.

Effect of Lamotrigine on Organic Cationic Transporter 2 Substrates

Lamotrigine is an inhibitor of renal tubular secretion via organic cationic transporter 2 (OCT2) proteins [see Clinical Pharmacology (12.3)] . This may result in increased plasma levels of certain drugs that are substantially excreted via this route. Coadministration of Lamotrigine with OCT2 substrates with a narrow therapeutic index (e.g., dofetilide) is not recommended.


Materiais e métodos

The essential and adjuvant components Chinese medicines employed in this invention are purified chemical components from commonly used Chinese medicines (Table 3). Their chemical structures can be classified into five (5) categories: flavones, flavanones, chalcones, isoflavones and coumarins.

1. Preparation of Liver Microsomes

This invention use rat as the experimental animal model, therefore, in vitro enzymes used for metabolism studies are also prepared from rat liver.

After sacrifice, the liver is removed from the rats and placed in 1.15% potassium chloride at 4° C. The tissue is thoroughly rinsed with cold 1.15% potassium chloride solution to remove any residual blood, blot and weighed. The rinsed tissue is then homogenized in a high speed tissue homogenizer until a complete homogenate (no residual tissue chunks) is obtained (homogenizing tubes are pre-chilled on ice).

The homogenate is transferred to centrifuge tubes and centrifuged at 12,500×g for 20 minutes to remove cellular debris, nuclei, mitochondria and lysosomes. The supernatant fractions are harvested and placed into ultracentrifuges tubes (5 to 6 mL per tube). The tubes are then centrifuged in an ultracentrifuge at 100,000×g for 2 hours. The resulting supernatant (cytosol fractions) is discarded and the residual supernatant inside the centrifuge tubes are rinsed and removed cold 1.15% potassium chloride. The pellets (microsomes) are then harvested and resuspended in 0.1 M pH 7.4 phosphate buffer (one mL/g liver tissue).

    • (1) Animal sacrifice
    • (2) Removal of liver tissue
    • (3) Rinse liver tissue and record weigh of the tissue
    • (4) Cut the tissue into small pieces and mix with 1.15% KCL (1 mL/g tissue)
    • (5) Completely homogenize the tissue
    • (6) Place in high speed centrifuge tubes (12 to 15 mL per tube)
    • (7) Centrifuge at −4° C., 12,500×g, 20 minutes
    • (8) Place the supernatant into ultracentrifuge tubes
    • (9) Ultracentrifuge at −4° C., 100,000×g, 2 hours
    • (10) Discard supernatant, rinse the inside of centrifuge tubes with 1.15% KCL
    • (11) Remove the pellets from the centrifuge tubes
    • (12) Add pH 7.4 phosphate buffer, one mL per g of original tissue
    • (13) After respansion in phosphate buffer, dispense into micocentrifuge tubes (1 mL/tube)
    • (14) Store frozen at approximately −80° C. (−80° C. freezer)

    2. In Vitro CYP2C9 Activity Assay for Screening of the Essential and Adjuvant Components of Chinese Medicines

    After preparation and determination of microsomal protein concentrations, CYP2C9 activity assay are performed using the microsomes preparation, as a screen CYP2C9 inhibitors. Prior to screening, in vitro assay conditions are established based on enzyme kinetic principals and relevant kinetic parameters.

    Tolbutamide is a specific substrate for human CYP2C9. CYP2C9 catalyzes the conversion of tolbutamide to a hydrophilic metabolite, 4′-hydroxytolbutamide. This metabolic reaction has been shown to be CYP2C9 specific and does not involved other P450 isozymes. Thereby, it is considered as a reliable measurement for CYP2C9 activity. The initial substrate concentration used is 1 mM, under a enzyme saturating condition (Tang et al., Effect of albumin on phenytoin and tolbutamide metabolism in human liver microsomes: an impact more than protein binding. Drug Metabolism and Disposition. 30:648-654, 2002).

      • (1) 0.1M phosphate buffer, pH 7.4
      • (2) 0.5 mg microsomal protein
      • (3) 5 mM magnesium chloride
      • (4) 10 mM glucose 6-phosphate
      • (5) 2 IU G6P dehydrogenase
      • (6) 1 mM β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
      • (7) 1 mM tolbutamide
      • (8) 1% methanol

      The activity assay mixture is placed on ice to maintain a 4° C. After the addition of the cofactor cocktails, it is pre-incubated in a 37° C. water bath for 1 minute. Reaction is initiated by the addition of the substrate and is terminated by 1N hydrochloric acid (0.1 mL). The metabolic reaction product is extracted using 2 mL methylene chloride. After separation by centrifugation, the organic fraction is concentrated to dryness, constituted in appropriate solvent and then analyzed for the metabolite (product) concentration.

      The assay conditions are established as such product formation is linear with respect to incubation time and protein concentrations. In additions, initial substrate concentrations are selected based on the values of kinetic parameters, Km and Vmax.

      The reaction product (metabolite) is analyzed using high performance liquid chromatotograhy (Shimadzu Model LC-10AD), UV detector (Shimadsu SPD-10A) at wavelength 230 nm (Miners et. al 1988). The LC conditions are, C-18 column (150×4.6 mm), mobile phase (10 mM acetate, pH 4.4/acetonitrile 25:75 v/v), flow rate 1.3 mL/min, ambient temperature. The retention time for the metabolite, internal standard and the substrate is 4.6, 14.2 and 26.5 minutes, respectively.

      Ketoconazole is used as the positive control and are tested under different concentrations to demonstrate concentration dependency (Results shown in FIG. 1). At 100 μM concentrations, ketoconazole completely abolished the activity of the microsomes, exhibiting 100% inhibition. A 80.1 and 45.9% inhibition is observed at 10 and 1 μM, respectively.

      On the basis of inhibitory activity observed for the positive control, screening of inhibitors from essential and adjuvant components of Chinese medicines is carried out at high, mid and low concentrations. However, the aqueous solubility of the essential and adjuvant components of Chinese medicines is relatively poor, and organic co-solvents (such as methanol, ethanol, acetonitrile) are usually used under the assay conditions. Consequently, solvents effects (vehicle control) on the enzymatic activities are assessed to eliminate experimental artifacts due to organic co-solvents.

      3. In Vivo Study in Rodents

      Potential inhibitors identified from the in vitro screen (using rat liver microsomes as an enzyme source and triglyceride lowering drug tolbutamide as a probe substrate) are subject to further in vivo evaluation in small animals. The test system used is the Sprague-Dawley rat. However, since the oral bioavailability of tolbutamide in rats is 90%, therefore, it is not an appropriate model compound for in vivo assessment. Blood cholesterol lowering agent, fluvastatin is used as a model compound. Fluvastatin is a synthetic HMG-CoA reductase inhibitor, its oral bioavailability is about 25 to 30% and it is predominantly metabolized by CYP2C9. Absorption of fluvastatin sodium following oral administration is about 90%, therefore, the low bioavailability of 25 to 30% is due to high first pass effects. Fluvastatin is metabolized in liver, forming four major metabolites (Scripture et. al 2001). Liver CYP2C9 is responsible for approximately 80% of fluvastatin metabolism, and other isozymes are responsible for 20%.

      After overnight fast, rats are anesthetized and prepared with a jugular catheter. Dosing group received 9.32 mg/kg tamarixetin (dissolved in DMSO at 10 mg/mL), control group received only DMSO. After 30 minutes, both groups are administered fluvastatin at a dose of 1.5 mg/kg (dissolved in water at 2 mg/mL). Twelve blood samples (including pre dose blank) are collected over 24 hours—0, 10, 20, 40, 60, 120, 240, 360, 480, 720, 1080 and 1440 minutes. Each sample (0.5 to 0.6 mL blood) is collected into microfuge tubes containing 20 uL of 10 IU heparin (anti-coagulant). After separation, plasma samples are protected from light and stored at −80° C. freezer.

        • (1) thaw samples on ice
        • (2) pippet 250 μL plasma sample into screw cap test tube
        • (3) add 50 μL of internal standard (celecoxib, 20 μg/mL in MeOH)
        • (4) add 250 μL of acetonitrile and vortex mixing for 5 seconds
        • (5) add 250 μl of 0.5 M phosphate buffer, pH 5.0
        • (6) add 2.5 mL MTBE (methyl tert-butyl ether), shake for 30 minutes
        • (7) transfer the organic levels into another test tube, evaporate under reduced pressure
        • (8) dissolve extracted residue in mobile phase
        • (9) transfer the extract and centrifuge at 13000 rpm for 5 minutes
        • (10) remove the clear supernatant (150 μL) and inject onto HPLC

        In vitro screening is conducted the essential and adjuvant components of Chinese medicines HUCHE001 to HUCHE070 depicted as Table 3. Inhibition of tolbutamide metabolism in liver microsomes are evaluated at three different concentration range, 1, 10 and 100 μM. For compounds with limited solubility, the highest testing concentration is the highest soluble concentration. The inhibition potential of test compounds is ranked within each testing concentration. The best inhibitors found are: isoliquritigenin 95.5% inhibition at 100 μM, Tamarixetin 88.2% at 10 μM, Genistein 49.6% at 1 μM. (Tables 4 to 6).

        Student T-test is performed on the inhibition data to assess the statistical significance of observed effects relative to the control group. Results from the best 10 test compounds at 100, 10 or 1 μM concentration are depicted in FIGS. 2 to 4.


        Discussão

        In this study, we employed a LC–MS-based metabolomic approach to profile sepin-1 (a potent separase inhibitor and an investigational chemotherapeutic drug candidate) metabolism and bioactivation in HLM, MLM, and RLM. Metabolomic approaches could readily screen out the sepin-1-related metabolites and reactive intermediates from the biomatrix (Li et al., 2011, 2012). We identified seven sepin-1 metabolites and adducts, including reduced metabolites M1 and M2, dimer metabolites M3–M5, and cysteine–sepin-1 adduct (Cys–sepin-1) M6 and GSH–sepin-1 adduct M7, using the metabolomic technology. All the metabolites were presented in HLM, MLM, and RLM. M4 was the most abundant dimer in RLM, but only a trace amount was observed in HLM. However, the Cys–sepin-1 adduct M6 was mainly formed in HLM and MLM (Figure 1B). M1 and M2 are dominant metabolites in all the three species of HLM, MLM, and RLM (Figure 1). Among these metabolites, one Cys–sepin-1 adduct (M6) was detected and characterized. The formation of M6 was also NADPH dependent. In HLM, sepin-1 is metabolized rapidly to the dominant-reduced metabolites M1 and M2. Therefore, the most abundant metabolite M1 was synthesized (Do et al., 2016) and the inhibitory activity of M1 on separase will be assayed next.

        The reactive metabolites play a critical role in the pathogenesis of idiosyncratic adverse drug reactions (Attia, 2010 Park et al., 2011 Thompson et al., 2016). The formation of Cys–sepin-1 adduct (M6) indicated that sepin-1 could be bioactivated to generate the reactive metabolite in HLM. The mechanism of the formation of Cys–sepin-1 adduct in HLM is not known yet, but the adduct M6 is derived from the major metabolite M1 by conjugating with cysteine in HLM. Reduced GSH is an abundant physiological nucleophile and frequently used to capture soft electrophiles (e.g., epoxides, quinones, quinone imines, and quinone methides) in em vitro systems (Evans et al., 2004). Our study revealed one GSH–sepin-1 adduct (M7) in the incubations of sepin-1 in HLM with GSH. Although the mechanisms of formation of GSH–sepin-1 adducts in HLM are not clear, the formation of GSH–sepin-1 adduct further suggested that the sepin-1 could produce the reactive electrophiles in HLM. Generally, excess reactive electrophiles are capable of covalent binding to protein, DNA, and other biomolecules. It is thought that cellular function is compromised in certain cases, followed by organ toxicity (O𠆛rien et al., 2005). These reactive metabolites from sepin-1 may induce some adverse effects. In drug development, researchers attempt to reduce the risk factors of toxicity by minimizing the formation of reactive metabolites. This information will be helpful for medicinal chemists to further optimize the structure of sepin-1 to improve its safety. For example, medicinal chemists could decrease the formation of reactive metabolites by blocking their metabolic sites via the structural modifications.

        The mechanisms of sepin-1 reduction (M1 and M2) and dimer formation (M3–M5) are not clear yet. The liver microsomes involved in the formation of reduced metabolite is known (Leskovac and Popovic, 1980 Placidi et al., 1993 Wang et al., 2005). Our study suggested that multiple P450s enzymes contribute to sepin-1 metabolism. CYP3A4 and CYP2D6 are the primary enzymes responsible for the generation of metabolites M2–M5 (Table 2). For M1, all the test isoenzymes make similar contributions to the formation of M1. Because CYP3A4 is the most abundant drug-metabolizing enzyme in the liver, the formation of M1 should be mainly mediated by CYP3A4. The role of CYP3A4 in the formation of M1 can be investigated further using Cyp3a-null mice. As the GSH–sepin-1 adduct was formed by GSH conjugating with the major metabolite M1, the formation of GSH–sepin-1 could have been mediated by multiple P450 enzymes as well. Other enzymes (e.g., cytochrome b5 reductase in the microsomes) have been reported to be implicated in the reduction of N-oxide (Zheng et al., 2011). In addition, the reduction of N-oxide (e.g., quinoxaline-1,4-dioxide) could be mediated by aldehyde oxidase and xanthine oxidase in the cytosol as well (Zheng et al., 2011 Mu et al., 2014). The exact role of P450s and reductases in the sepin-1 reduction will be further investigated using CYPP450 inhibitor (1H-benzotriazol-1-amine and carbon monoxide) and the liver microsomes from CYP450 reductase-knock out mice. Non-enzymatic reduction of N-oxide by heme of P450 will be tested using the boiled microsomes as well in the future study (Takekawa et al., 2001).

        As discussed as above, sepin-1 could be metabolized by multiple enzymes, other drugs thus may have little effect on the metabolism of sepin-1, when sepin-1 is co-administrated. However, sepin-1 may have significant effects on the metabolism of co-administrated drugs and cause drug𠄽rug interactions by inhibiting their major drug-metabolizing enzymes. In the current study, the inhibitory effects of sepin-1 on seven main CYP450 isoenzymes (CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, and 3A4) were evaluated. These seven enzymes metabolize >90% of marked drugs. Typically, inhibition potency of a compound can be categorized into three classification bands: (1) potent inhibition with IC50 < 1 μM (2) moderate inhibition with 1 μM < IC50 < 10 μM or (3) no or weak inhibition with IC50 > 10 μM [Food and Drug Administration (FDA) draft guide for industry, 2012]. Using the corresponding substrates recommended by FDA and monitoring their specific metabolites by LC–MS/MS, we unraveled that sepin-1 has moderate inhibition on CYP1A2 (IC50 = 8.1 μM), CYP2C19 (IC50 = 8.9 μM), and CYP3A4 (IC50 = 8.7 μM). Our data also indicate that sepin-1 has weak inhibition on CYP 2B6 (IC50 = 14.5 μM), CYP2C8 (IC50 = 17.8 μM), CYP2C9 (IC50 = 21.3 μM), and CYP2D6 (IC50 = 42.5 μM). These data suggest that sepin-1 may have some moderate interaction with the drugs mainly metabolized by CYP1A2, 2C19, and/or CYP3A4. For example, GEF, a tyrosine kinase inhibitor, is mainly metabolized by CYP3A4 (Liu et al., 2015). The pharmacokinetics of GEF may be moderately altered by sepin-1 if GEF is taken together with sepin-1. In the current study, we only evaluated the co-incubation of sepin-1 and enzyme substrates to evaluate the inhibitory effects of sepin-1. The metabolism-/mechanism-based inhibition was not performed here.

        In summary, the metabolism of sepin-1 in HLM, MLM, and RLM was extensively studied using LC–MS-based metabolomic approaches. This study identified a total of seven metabolites and adducts related to sepin-1 (Figure 6) including Cys–sepin-1 and GSH–sepin-1 adducts. The enzyme contributing to the formation of sepin-1 metabolism was identified using recombinant P450 isoenzymes. Additionally, the inhibitory effects of sepin-1 on the seven main CYP450 isoenzymes were evaluated. This study provides the foundation for optimizing the structures and predicting the possible drug𠄽rug interactions from the metabolic prospective of sepin-1, our lead separase inhibitor for cancer therapy. Further studies are suggested to illustrate the role of other enzymes contributing to reduced metabolites of sepin-1, metabolism of sepin-1 na Vivo, and the inductive effects of sepin-1 on CYP450 isoenzymes em vitro e na Vivo.

        FIGURE 6. Summary of putative structures of GEF metabolites and adducts. All structures were determined based on the exact mass (mass error 㰐 ppm) and MS/MS fragments.