Em formação

Como as células Tc CD 8+ alcançam o local dos tumores?


Na imunidade humoral normal, as células dendríticas apresentam antígenos às células Th chegando ao linfonodo. Isto é bom. Mas considere uma célula tumoral. Como a célula Tc localizada no nódulo linfático sabe que existe um problema lá fora? Considere que há uma única célula que sofreu mutações e está expressando proteínas alteradas. Isso não causaria muita inflamação para atrair a célula Tc para lá.

Então, há vigilância contínua pelas células Tc? Onde exatamente residem as células Tc? Eles vagam por aí como células Th? E as células NK? eles também vagam pelos tecidos?

Nos casos de patógenos virais e intracelulares, pode haver alguma inflamação que atrai as células Tc para lá. Pode ser. Isso não pode ser em tumores. Então, como as células Tc chegam lá?


Não me lembro de detalhes suficientes para compartilhar uma visão mecanicista.

No entanto, a quimiotaxia é uma resposta provável, o que basicamente significa mover ao longo do gradiente de concentração de determinado ligante de interesse.

Também relevante para a sua pergunta: uma hipótese chamada 'vigilância imunológica' vem ganhando apoio nos últimos anos.

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Infiltração de células T e células NK em tumores sólidos: um fator limitante chave para imunoterapia eficaz contra o câncer

Resumo: A imunoterapia contra o câncer é uma grande promessa, mas é limitada por diversos mecanismos usados ​​por tumores para prevenir respostas imunológicas antitumorais sustentadas. Os tumores interrompem a apresentação do antígeno, a ativação das células T / NK e o homing das células T / NK por meio de mediadores solúveis e de superfície celular, a vasculatura e células imunossupressoras, como células supressoras derivadas de mieloide e células T reguladoras. No entanto, muitos mecanismos moleculares que impedem a eficácia da imunidade antitumoral foram identificados e podem ser interrompidos por imunoterapia de combinação. Aqui, examinamos os mecanismos imunossupressores explorados por tumores e fornecemos insights sobre as terapias em desenvolvimento para superá-los, com foco no tráfego de linfócitos. Cancer Discov 4 (5) 522–6. © 2014 AACR.


Resumo

O microambiente tumoral desempenha um papel crítico no controle da progressão tumoral e na vigilância imunológica. Produzimos uma imunotoxina (2E4-PE38) que mata células de camundongo que expressam CD25 ao anexar a porção Fv do anticorpo monoclonal 2E4 (CD25 anti-camundongo) a uma porção de 38 kDa de Pseudomonas exotoxina A. Nós empregamos três modelos de tumor de câncer de camundongo (mesotelioma AB1, câncer de mama 66c14 e câncer de cólon CT26M). Os tumores foram implantados em dois locais em camundongos BALB / c. Nos dias 5 e 9, um tumor foi injetado diretamente com 2E4-PE38 e o outro não foi tratado. 2E4-PE38 produziu regressões completas de 85% dos tumores AB1 injetados, 100% dos tumores 66c14 e 100% dos tumores CT26M. Também produziu regressões completas de 77% dos tumores AB1 não injetados, 47% dos tumores 66c14 e 92% dos tumores CT26M. Os camundongos com regressões completas de tumores 66c14 eram imunes à nova exposição com células 66c14. Camundongos com regressões completas de tumores AB1 ou CT26M desenvolveram imunidade tumoral cruzada rejeitando ambos os tipos de tumor. A injeção de anticorpo anti-CD25 ou de uma imunotoxina mutante inativa foi geralmente ineficaz. Os tumores foram analisados ​​3 dias após a injeção de 2E4-PE38. O número de células T reguladoras (Tregs) foi significativamente reduzido no tumor injetado, mas não no baço. Os tumores injetados continham um aumento nas células T CD8 que expressam IFN-γ, os marcadores de ativação CD69 e CD25 e macrófagos e células dendríticas convencionais. O tratamento com anticorpos para CD8 aboliu o efeito antitumoral. A depleção seletiva de Tregs em tumores facilita o desenvolvimento de um efeito antitumoral dependente de células T CD8 em três modelos de camundongo.

O conceito de células T supressoras foi proposto na década de 1970 (1). No entanto, a existência de células T supressoras como uma linhagem distinta de células T era controversa (2). Em meados da década de 1990, o conceito de células T reguladoras (Tregs) foi proposto e, desde então, as Tregs têm sido extensivamente estudadas em camundongos e humanos (3). Agora está bem estabelecido que as Tregs são uma linhagem distinta de linfócitos, dotada de propriedades regulatórias que afetam uma variedade de células do sistema imunológico (4). Tregs desempenham um papel importante no escape imunológico, suprimindo a imunidade antitumoral, proporcionando assim um ambiente de tolerância imunológica. As células T que reconhecem as células cancerosas estão frequentemente presentes em grande número nos tumores, mas sua função citotóxica é suprimida pelas células imunossupressoras próximas. Tregs são abundantes em muitos cânceres diferentes (5), são altamente enriquecidos no microambiente tumoral e são bem conhecidos por seu papel na progressão tumoral.

Foi demonstrado que as Tregs contribuem para o estabelecimento e progressão precoce de tumores em modelos murinos e que sua ausência resulta em atraso na progressão do tumor (6 ⇓ ⇓ –9). A alta infiltração tumoral por Tregs e uma baixa proporção de células T efetoras (Teffs) para Tregs estão associadas a resultados ruins em tumores sólidos (10). Por outro lado, uma alta proporção de células Teff / Treg está associada a respostas à imunoterapia (11). Até o momento, a maioria dos estudos apóia a noção de que direcionar Tregs, seja por depleção ou modulação funcional, oferece um benefício terapêutico significativo, particularmente em combinação com outras intervenções imunomodulatórias, como vacinas e bloqueio de checkpoint (12 ⇓ ⇓ –15). Definir alvos apropriados para interferência seletiva com Tregs é uma etapa crítica no desenvolvimento de terapias eficazes. A este respeito, CD25, também conhecido como cadeia alfa do receptor de alta afinidade da interleucina-2 (IL-2Rα), foi o primeiro marcador de superfície usado para identificar Tregs (3) antes da descoberta de seu regulador mestre, fator de transcrição fork-head caixa p3 (Foxp3). O CD25 também é o alvo mais extensamente estudado para inibir ou eliminar Tregs e está ausente em Teffs naive. No entanto, a suprarregulação transitória de CD25 foi observada após a ativação de Teffs (16).

Vários estudos pré-clínicos em camundongos usaram um anticorpo anti-CD25, que esgota parcialmente as Tregs no sangue e em órgãos linfoides periféricos (9, 17). Quando o anticorpo foi administrado antes do desafio do tumor, houve inibição do crescimento do tumor e melhora da sobrevida (7 ⇓ –9, 14, 18, 19). No entanto, a administração de anticorpo anti-CD25 contra tumores estabelecidos não conseguiu atrasar o crescimento do tumor (7 ⇓ –9, 19). Isso tem sido atribuído a vários fatores, incluindo infiltração de células T deficiente do tumor (14) e depleção potencial de células T CD8 + e CD4 + efetoras ativadas que regulam CD25 (9). Estudos clínicos que exploram o uso de vacinas em combinação com daclizumabe, um anticorpo IgG1 anti-CD25 humano humanizado ou denileucina diftitox, uma proteína de fusão recombinante combinando IL-2 humana e um fragmento da toxina da difteria, ou LMB-2, uma proteína de fusão recombinante combinar Fv CD25 anti-humano e um fragmento de Pseudomonas a exotoxina A (PE) teve um impacto variável no número de Tregs circulantes e na imunidade induzida pela vacina (20 ⇓ ⇓ ⇓ –24). A avaliação dos níveis de transcrição de Foxp3 nos tumores não fornece nenhuma evidência clara de que as Tregs no microambiente tumoral foram efetivamente reduzidas, e a atividade antitumoral tem sido decepcionante em todos os estudos, sem benefício de sobrevivência (20 ⇓ ⇓ ⇓ -24).

É amplamente reconhecido que as terapias baseadas em anticorpos imunomoduladores podem afetar o nível de Tregs e que o isotipo do anticorpo é importante (25 ⇓ ⇓ ⇓ -29). Nós agora reavaliamos o CD25 como um alvo para a depleção de Treg in vivo, mas em vez de usar um anticorpo monoclonal (mAb), usamos uma imunotoxina recombinante (RIT) injetada localmente com potente atividade citotóxica para matar Tregs. O bloqueio sistêmico de Tregs produziu efeitos colaterais autoimunes com risco de vida e limitantes de dose em pacientes porque a expressão de CD25 não está limitada a Tregs. Teffs também expressam CD25 (30). Para manter a autotolerância e o controle adequado das respostas imunes adaptativas, deve haver um equilíbrio entre Tregs e Teffs. Consequentemente, a depleção sistêmica de Tregs pode não ser uma boa escolha para o tratamento do câncer, e usamos terapia local para evitar efeitos colaterais sistêmicos.

Publicamos anteriormente que a injeção de uma imunotoxina que tem como alvo a mesotelina diretamente nos tumores induz imunidade antitumoral quando combinada com anti-CTLA-4 (31). Também relatamos que a injeção sistêmica de uma imunotoxina direcionada a CD25 por via intravenosa causa depleção transitória de Tregs na circulação, mas nenhuma atividade antitumoral foi observada (23). No estudo atual, aproveitamos nossa observação de que a injeção intratumoral de uma imunotoxina pode ajudar a iniciar a imunidade sistêmica e que a imunotoxina injetada (2E4-PE38) mata seletivamente as células T no tumor, mas não esgota as células T fora do tumor . Usando apenas a imunotoxina anti-CD25, tratamos três tipos diferentes de câncer de camundongo: câncer de mama 66c14, mesotelioma AB1 e câncer de cólon CT26M. Verificamos que a imunotoxina causou regressões completas dos tumores injetados, bem como da maioria dos tumores não injetados distais e induziu imunidade antitumoral sistêmica.


Aminoácidos (PET e tomografia computadorizada de emissão de fóton único)

Além do FDG, os aminoácidos radiomarcados são os rastreadores PET mais comumente usados ​​para tumores cerebrais. Uma vantagem de usar aminoácidos radiomarcados em vez de FDG é a absorção relativamente baixa de aminoácidos pelo tecido cerebral normal. Portanto, os gliomas cerebrais podem ser distinguidos do tecido normal circundante com maior contraste em comparação com FDG. Muitos aminoácidos naturais e seus análogos sintéticos foram marcados e explorados como agentes de imagem tumoral. 39 A maioria dos estudos PET de gliomas cerebrais foi realizada com o aminoácido [11 C] metil-l-metionina (11 C-MET), 40 embora a meia-vida curta de 11 C (20 minutos) limite o uso deste marcador para os poucos centros PET equipados com uma instalação interna de ciclotron. O uso crescente de aminoácidos marcados com 18 F (meia-vida: 109 minutos), como O- (2- 18 F-fluoroetil) - l-tirosina (18 F-FET) provavelmente substituirá 11 C-MET no futuro. 41 Além disso, a tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) foi aplicada usando aminoácidos radioiodados, como l -3 [123 I] iodo-& # x003b1-metil tirosina (IMT) ou p- [123 I] iodo-1-fenilalanina. 42,43 Os resultados obtidos com o SPECT com marcadores de aminoácidos são, em geral, semelhantes aos do PET, mas a pior resolução espacial do SPECT representa uma grande desvantagem na prática clínica.

Como está além do escopo desta revisão considerar todos os aminoácidos radiomarcados aplicados em tumores cerebrais, este capítulo se concentra nas experiências clínicas com 11 C-MET, 18 F-FET e 123 I-IMT, que estão atualmente no melhores marcadores de aminoácidos validados para PET e SPECT.

O aumento da captação de 11 C-MET, 18 F-FET e 123 I-IMT pelo tecido de glioma cerebral parece ser causado quase inteiramente pelo aumento do transporte por meio de transportadores de aminoácidos específicos, nomeadamente o sistema de transporte de aminoácidos L para grandes aminoácidos neutros. 44,45 11 C-MET também mostra alguma incorporação em proteínas e participação em outras vias metabólicas 40 no entanto, estudos comparativos entre 11 C-MET, 18 F-FET e 123 I-IMT mostraram que a imagem de gliomas cerebrais é semelhante com esses aminoácidos. 46-48 Portanto, a participação de 11 C-MET em outras vias metabólicas que não o transporte parece ser de menor importância, e os resultados clínicos obtidos com os diferentes marcadores podem ser considerados em conjunto. Como grandes aminoácidos neutros também entram no tecido cerebral normal, uma interrupção da BBB, ou seja, o aumento do meio de contraste em tomografias computadorizadas ou ressonância magnética, não é um pré-requisito para o acúmulo intratumoral desses aminoácidos. Consequentemente, a absorção dos traçadores foi relatada em muitos LGG sem vazamento de BBB. 49-51 A sensibilidade e especificidade do PET usando 11 C-MET e 18 F-FET e SPECT usando 123 I-IMT para diferenciar entre gliomas e lesão não neoplásica está na faixa de 70% -90%, 50,52, 53 e a possibilidade de realce inespecífico em células inflamatórias ou tecido glial reativo deve ser levado em consideração. Houve relatos de captação perifocal de 11 C-MET e 18 F-FET em torno de hematomas e áreas de isquemia, bem como de casos raros de captação em ou ao redor de lesões que aumentam o anel, como abscessos cerebrais e desmielinização inflamatória aguda. 40,54 Portanto, o valor preditivo é limitado, e uma avaliação histológica por biópsia continua sendo o padrão ouro na maioria das lesões desconhecidas que ocupam espaço no cérebro.

Imagem da biópsia da extensão do tumor e planejamento de tratamento

Um dos aspectos mais importantes no diagnóstico inicial de gliomas é a identificação da extensão do tumor e das áreas metabolicamente mais ativas do tumor. Amostras de tecido representativas são importantes para o diagnóstico histológico do tumor, prognóstico e planejamento de tratamento. A capacidade da RM de mostrar as porções de proliferação mais rápida dos gliomas geralmente não homogêneos é limitada, particularmente quando o tumor não ocupa meio de contraste na TC ou na RM. Vários estudos nos quais os achados radiológicos foram comparados com os achados histológicos em amostras de tecido obtidas por biópsia ou cirurgia aberta forneceram evidências de que os aminoácidos radiomarcados detectam a massa sólida de gliomas e áreas tumorais metabolicamente ativas de forma mais confiável do que CT ou MRI. 55-59 Isso ajuda a prevenir o problema de biópsias não diagnósticas de tecido não especificamente alterado e a planejar a ressecção cirúrgica (Fig. 3). Um estudo recente demonstrou que a integração do 11 C-MET-PET na ressecção guiada por imagem de HGG forneceu um contorno alvo final diferente daquele obtido com a ressonância magnética isolada em aproximadamente 80% dos procedimentos. 60 A ressecção completa da área do tumor com aumento da captação de aminoácidos resultou em sobrevida significativamente mais longa dos pacientes, enquanto o realce da ressonância magnética na varredura pós-operatória não teve impacto na sobrevida. Da mesma forma, a quantidade de captação residual do traçador em 123 I-IMT-SPECT e 18 F-FET-PET teve uma forte influência prognóstica. 61,62 Esses dados indicam que a ressecção de gliomas malignos guiada pelo aminoácido PET pode aumentar a quantidade de tecido anaplásico removido e, portanto, a sobrevida do paciente. A melhoria da imagem do tecido de glioma usando o aminoácido PET também atraiu interesse para o planejamento do tratamento de RT. 63,64 Vários centros começaram a integrar imagens de aminoácidos no planejamento de radioterapia com base em TC e MRI, particularmente quando radioterapia de alta precisão deve ser administrada, no contexto de estudos de escalonamento de dose ou para a reirradiação de tumores recorrentes . 65-69 No entanto, a melhora do desfecho dos pacientes com planejamento de radioterapia por imagem de aminoácidos em comparação com o planejamento de terapia convencional ainda não foi comprovada.

Oligoastrocitoma, grau II da OMS: RM ponderada em T1 após aplicação de Gd-DTPA (A) não mostra realce pelo contraste. A ressonância magnética ponderada em T2 (B) mostra anormalidades generalizadas. (C) O- (2- 18 F-fluoroetil) - l-tirosina (18 FFET-PET) identifica áreas metabolicamente ativas dentro do tumor e indica um local ideal para biópsia.

Classificação de gliomas e prognóstico

A maioria dos estudos usando imagens de aminoácidos mostrou que gliomas de diferentes graus da OMS se sobrepõem em seu grau de captação de aminoácidos, portanto, o grau do tumor não pode ser previsto com segurança com esta técnica. 40,51,58,70 No entanto, uma classificação mais confiável parece ser possível com 18 F-FET-PET, uma vez que este traçador exibe diferenças nas curvas de atividade de tempo de captação do traçador dependendo do grau do tumor. 71 HGG são caracterizados por um pico inicial aproximadamente 10-15 minutos após a injeção, seguido por uma diminuição da captação de 18 F-FET, enquanto LGG tipicamente exibe captação de traçador retardada e continuamente crescente. Usando 18 F-FET-PET dinâmico, uma diferenciação de HGG e LGG foi relatada em tumores primários e em tumores recorrentes com uma precisão de & # x0003e90%. 72-75

O significado prognóstico do aumento da captação de aminoácidos em gliomas é controverso. Alguns estudos parecem mostrar que a menor captação de aminoácidos, especialmente no glioma astrocítico, está associada a um melhor prognóstico, mas pode haver uma alta captação nos oligodendrogliomas, apesar de seu prognóstico aparentemente melhor. 40,75,76 No entanto, parece haver um consenso sobre o papel clínico da imagem de aminoácidos no prognóstico de pacientes com LGG. Sobrevivência significativamente mais longa foi relatada para pacientes com menor captação de 11 C-MET nos tumores em comparação com aqueles com maior captação (ponto de corte da relação tumor / cérebro: 2,1). 77,78 Além disso, os pacientes tiveram um benefício de um procedimento cirúrgico apenas quando houve aumento da captação de 11 C-MET. 77 Usando 18 F-FET-PET, a combinação com a morfologia de RM também foi considerada um preditor prognóstico significativo para pacientes com LGG recém-diagnosticado. 49 A captação basal de 18 F-FET e um padrão de crescimento circunscrito versus difuso na ressonância magnética foram preditores altamente significativos para o curso e resultado dos pacientes & # x02019.

Avaliação de tumores recorrentes

Uma série de estudos mostraram que usando 18 F-FET-PET e 123 I-IMT-SPECT, tumores recorrentes podem ser diferenciados de alterações pós-terapêuticas não neoplásicas, com uma sensibilidade e especificidade de aproximadamente 90% (Fig. 4 e & # x200B e 5 5). 21,22,79-81 A sensibilidade do 11 C-MET-PET para recorrência do tumor é semelhante, enquanto a especificidade parece ser mais baixa e foi relatada como estando na faixa de 60% -80%. 17,20,40 Esta observação pode ser explicada por uma maior afinidade de 11 C-MET para macrófagos em comparação com 18 F-FET, conforme demonstrado em experimentos com animais. 82,83 O uso adicional de 18 F-FET-PET dinâmico permitiu uma diferenciação das recorrências de HGG e LGG com uma sensibilidade e especificidade de 92%. 74

Astrocitoma anaplásico não homogêneo, grau III da OMS: RM ponderada em T1 após aplicação de Gd-DTPA (A) não mostra realce pelo contraste. A ressonância magnética ponderada em T2 (B) mostra anormalidades generalizadas. (C) 18 F-FET-PET identifica um ponto quente na parte posterior que não pode ser identificado na ressonância magnética. A biópsia nesta área revelou um astrocitoma anaplásico, grau III da OMS.

Glioblastoma (OMS grau IV) pré-tratado por cirurgia e radioquimioterapia. A ressonância magnética ponderada em T1 após a aplicação de Gd-DTPA (A) e a ressonância magnética ponderada em T2 (B) são ambíguas. (C) 18 F-FET PET identifica o acúmulo de traçadores patológicos, que foi confirmado como recorrência do tumor. (A versão colorida da figura está disponível online.)

Monitoramento de Tratamento

O valor diagnóstico de ressonância magnética e tomografia computadorizada em relação às alterações no tamanho do tumor ou realce do contraste em resposta à terapia é limitado porque as alterações de BBB transitórias conhecidas com realce consecutivo do contraste podem imitar a progressão do tumor. Este fenômeno, denominado & # x0201cpseudoprogressão, & # x0201d é observado em 20% -47% dos casos e pode levar a um tratamento excessivo desnecessário. 84 A viabilidade e a utilidade do 11 C-MET e do 18 F-FET-PET para avaliação e acompanhamento da terapia após cirurgia, quimioterapia e radioterapia foram demonstradas em vários estudos. Os dados atualmente disponíveis sugerem que a redução da captação de aminoácidos por um glioma é um sinal de resposta ao tratamento. Recentemente, um estudo prospectivo avaliou o valor prognóstico das alterações precoces da captação do 18 F-FET após a radioquimioterapia pós-operatória em glioblastomas. 85 Pode ser demonstrado que os respondedores de PET com uma diminuição da razão tumor / cérebro de & # x0003e10% tiveram uma sobrevida livre de doença e sobrevida global (SG) significativamente maior do que pacientes com captação estável ou crescente do traçador após radioquimioterapia em glioblastomas. Um monitoramento confiável da quimioterapia também pode ser demonstrado com 11 C-MET e 18 F-FET-PET em glioblastoma recorrente durante a quimioterapia padrão com TMZ, 86,87, bem como em algumas abordagens terapêuticas experimentais, como radioimunoterapia, entrega aprimorada por convecção de paclitaxel e quimioterapia com bevacizumab e irinotecano. 88-90 Os valores de corte da razão tumor / cérebro de IMT, MET e captação de FET nas diferentes questões clínicas na literatura estão resumidos na Tabela 2.

Mesa 2

Limiares quantitativos para imagens de gliomas com traçadores de aminoácidos

MarcadorQuestão ClínicaCortarMétodoReferência
EU SOU TGlioma vs lesão não neoplásica1.78Razão tumor / cérebro a 52
Glioma recorrente vs radionecrose1.8Razão tumor / cérebro a 22
CONHECEUGlioma vs lesão não neoplásica1.47Razão média tumor / cérebro50
Glioma vs tecido peritumoral1.3Razão média tumor / cérebro56
Glioma recorrente vs radionecrose2.2Razão tumor / cérebro máxima17
FETGlioma vs tecido peritumoral1.6Razão tumor / cérebro média58
Glioma recorrente vs radionecrose2.0Razão tumor / cérebro máxima21
Avaliação de terapiaDiminuir & # x0003e10%Razão tumor / cérebro máxima85

Imagiologia de tumores cerebrais em crianças

Os subtipos histológicos de tumores cerebrais em crianças diferem consideravelmente dos adultos. Apenas alguns estudos principalmente retrospectivos foram realizados em crianças com tumores cerebrais. Em crianças, a determinação do grau do tumor com aminoácidos parece ser ainda menos confiável do que em adultos. Uma ampla sobreposição de captação de aminoácidos é observada em tumores de baixo e alto grau. 91 Semelhante ao metabolismo da glicose, a captação de aminoácidos pode ser alta em tumores de baixo grau, como astrocitomas pilocíticos e a captação de gangliogliomas pode ser relativamente baixa nos meduloblastomas altamente agressivos (OMS grau IV), um diagnóstico comum em tumores cerebrais infratentorial. 92 Foi relatado o potencial dos aminoácidos para determinar o local da biópsia estereotáxica ou para a ressecção cirúrgica guiada por imagem de tumores cerebrais infiltrativos de baixo grau em crianças. 93 A presença de captação de aminoácidos após a cirurgia indica tumor residual em caso de achados ambíguos na ressonância magnética pós-operatória precoce. 94


Resultados

O TC reativo ao tumor na BM está correlacionado com um risco reduzido de mortalidade por câncer

De 181 dos 207 pacientes do estudo, foi obtida a classificação clínico-patológica (Tabela 1 complementar). Nenhum dos pacientes recebeu tratamento neoadjuvante. BM foi retirado de 123 pacientes com câncer de mama operados primários, sem metástase, durante a ressecção do tumor. Determinamos a presença de TC tipo 1 reativo ao tumor funcional por ensaios ELISPOT de IFN-γ. Como antígenos de teste, usamos epítopos restritos a HLA-A * 0201 de antígenos associados a tumor de mama MUC1, Her2 / neu, MAGE-2, antígeno específico da próstata, BA46, ciclina D1, heparanase (Hepa), bcl-2 ou p53 (4, 13-22), lisados ​​de tecido de tumor de mama autólogo (4) ou lisado da linha celular de tumor de mama alogênico MCF7 (4). Antígenos derivados de células tumorais reestimulam com eficiência um amplo repertório de T-Helper tumor-específico e TC citotóxico preexistentes (25). As DC autólogas carregadas com os respectivos antígenos foram utilizadas para a reestimulação de ex vivo BMTC isolado durante ensaios ELISPOT de 40 h. De acordo com nossos achados anteriores neste curto período de estimulação, o IFN-γ específico do antígeno é secretado exclusivamente por TC de memória preexistente (26). O TC estimulado com antígenos de controle irrelevantes serviu para a determinação do fundo inespecífico. Como antígenos de controle serviram um epítopo de HIV restrito a HLA-A * 0201mordaça, lisado de PBMC autólogas e lisado da linha celular de leucemia alogênica U937 (4). Os dados ELISPOT de IFN-γ exemplificativos são mostrados na Fig. 1UMA. As respostas específicas do antígeno, definidas por um número de pontos significativamente aumentado em poços de teste em triplicado em comparação com os poços de controle correspondentes, são indicadas por asteriscos.

Detecção de respostas imunes específicas de tumor. UMA, Ensaios ELISPOT de IFN-γ com BMTC de pacientes exemplares usando como antígenos de teste (colunas pretas) Peptídeos tumorais restritos a HLA-A2 (principal), tumor autólogo ou lisado de pele (inferior esquerdo), ou lisado de tumor de mama alogênico (MaCa canto inferior direito) em comparação com os respectivos antígenos de controle negativo de HIV ou insulina, lisado de PBMC autólogo (PB-L), ou lisado U937 (Leuk colunas brancas). Colunas, meio de poços triplicados bares, SEM. *, significativo (P & lt 0,05) diferença para poços de controle negativo por Student de dois lados t teste. Hepa, heparanase. B, pontos médios de IFN-γ em poços de teste e controle de pacientes ELISPOT-positivos e ELISPOT-negativos. TAA, Peptídeos tumorais restritos a HLA TU-L, lisado de tumor autólogo PB-L, PBMC-lisado autólogo Leuk, lisado de leucemia U937 alogênico MaCa, lisado de células alogênicas de câncer de mama MCF7. P, diferença estatística entre os grupos de teste de pacientes positivos e os grupos de controle indicados. C, resultados representativos de ELISA de dois pacientes com câncer de mama que demonstram a presença (paciente positivo, deixou) ou ausência (paciente negativo, direito) de IgG específico de MUC1. OD, absorbância *, diferenças significativas conforme determinado por Student's bilateral t teste.

Para verificar se as respostas de TC específicas do tumor observadas não foram causadas por diminuições ou aumentos inespecíficos de manchas de IFN-γ em poços de controle, comparamos as manchas totais em pacientes que responderam e não responderam. Os pontos de IFN-γ foram semelhantes nos poços de controle e de teste de pacientes que não responderam, enquanto os poços de teste dos pacientes que responderam mostraram aumento significativo de pontos de IFN-γ em comparação com os outros grupos (Fig. 1B).

TC reativo a TA foi detectado em 17 de 32 pacientes (53%) para peptídeos restritos a HLA-A * 0201 e altamente individual em relação à especificidade do antígeno. Isso está de acordo com estudo anterior (27) e pode ser devido a diferenças individuais na taxa de expressão dos respectivos ATs. Detectamos reatividade TC contra antígenos tumorais autólogos em 19 de 58 pacientes (33%) e reatividade TC contra TAs de mama alogênicos em 19 de 33 pacientes (58% Suplementar Fig. S1). No total, 55 de 123 pacientes (45%) apresentaram a presença de BMTC tipo 1 reativo ao tumor. A reatividade de TC contra TAs foi significativamente aumentada na BM de pacientes em comparação com 19 mulheres saudáveis, seja no que diz respeito às proporções de indivíduos que responderam (45% versus 21%, P = 0,03) e às proporções de resultados de teste positivos (Figs. S1 e S2 complementares).

Respostas IgM e IgG específicas de tumor de mama foram analisadas por ELISA, usando o peptídeo sintético MUC1tr (137-157) 5 como teste e HIVmordaça como antígeno de controle negativo. A presença de anticorpos específicos para MUC1 foi assumida no caso de diferenças significativas na ligação do anticorpo entre os poços triplicados de teste e controle. Os resultados representativos de pacientes com e sem anticorpos IgG específicos para MUC1 são mostrados na Fig. 1C. Trinta e um de 59 pacientes (53%) continham anticorpos IgG específicos para MUC1 ou IgM específicos para MUCI (Fig. Suplementar S1). Noventa por cento deles (28 de 59) eram do isótipo IgM e 42% (13 de 59) eram do isótipo IgG. Em contraste, detectamos em soros de 11 mulheres saudáveis ​​nenhum IgG específico para MUC1 e IgM específico para MUC1 em apenas 2 casos (18%, P & lt 0,05 Fig. S1 suplementar).

Usamos o algoritmo de prognóstico ADJUVANT! 8 (23) para comparar as respostas imunes antitumorais com a mortalidade estimada relacionada ao câncer. Os pacientes com TC reativa ao tumor tiveram um risco de mortalidade reduzido (peptídeos HLA-A2, P = 0,006 lisados ​​de tumor, P = 0,046 Fig. 2UMA e B) Em contraste, os pacientes com anticorpos específicos para MUC1 tinham tendência a um maior risco de mortalidade relacionada ao câncer (Fig. 2C, n.s.).

Correlação da imunidade TC e mortalidade estimada por câncer. Redução do risco de mortalidade por câncer de mama para pacientes com respostas de TC contra lisado de células tumorais (UMA, +, coluna cinza claro) ou peptídeos tumorais restritos a HLA-A * 0201 (B, +, coluna cinza claro) em comparação com pacientes TC-negativos (UMA e B, −, colunas cinza escuro). C, o risco de mortalidade não foi correlacionado com a presença (+ coluna cinza claro) ou ausência ( coluna cinza escuro) de anticorpos específicos de MUC1. Colunas, quer dizer bares, SEM. *, diferença significante, P & lt 0,05 Aluno de dois lados t teste. n.s., não significativo.

As respostas imunes específicas do tumor se correlacionam com a patobiologia do tumor

Realizamos uma análise de subgrupo de parâmetros clínico-patológicos para identificar fatores prognósticos que se correlacionam com as respostas imunes espontâneas. A reatividade de TC não foi correlacionada com os principais fatores prognósticos, tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo ou estágio do tumor (Fig. 3UMA), mas em vez disso, com uma diferenciação de células tumorais alta a moderada, expressão de receptor de hormônio e baixa atividade proliferativa (P = 0.05, P = 0.02, P = 0,05, respectivamente Fig. 3B) Como o HER-2 é um fator prognóstico no câncer de mama e um alvo das respostas imunes do tumor, também avaliamos uma correlação potencial da expressão de Her-2 com a reatividade antitumoral. Em nosso grupo de estudo, 24 entre 176 pacientes eram Her-2 positivos e 152 Her-2 negativos por imunohistoquímica e / ou fluorescência no local análise de hibridização (dados não mostrados). Detectamos TC específico do tumor em 25% dos pacientes com Her-2-positivo, mas em 42% dos pacientes com Her-2 negativo (não significativo).

Imunidade antitumoral e características clínico-patológicas. UMA, proporções de pacientes com TC específica do tumor (deixou) ou anticorpos (direito) de acordo com o tamanho do tumor (T), envolvimento de linfonodos (N), estágio (St.) e idade (& lt ou & gt60 y). B e C, correlação das respostas do TC com características patobiológicas. Proporções de pacientes contendo TC reativa ao tumor (deixou) ou anticorpos (direito) de acordo com o grau (G), Expressão de ER ou atividade proliferativa (% Ki67 + células tumorais B), ou estratificado em grupos que combinam alta diferenciação tumoral (G1,2) com expressão ER (ER+) ou baixa diferenciação tumoral (G3) e falta de expressão ER (ER− C). D, dicotomia de TC antitumoral e respostas imunes anti-tumorais. Proporções de pacientes contendo anticorpos específicos para MUC1 de acordo com a presença (+) ou ausência (-) de TC reativa ao tumor. *, diferenças significativas pelo teste χ 2 (UMAC) ou teste exato de Fisher (D) n, número de pacientes.

Em contraste com as respostas de TC, os anticorpos específicos de MUC1 se correlacionaram com o aumento do tamanho e do estágio do tumor (P = 0,005 e P = 0,03, respectivamente, Fig. 3UMA) e eram predominantemente detectáveis ​​em pacientes com tumores pouco diferenciados e receptores negativos (não significativo Fig. 3B) Estas descobertas mostram que as respostas TC específicas do tumor espontâneas se correlacionam com um determinado fenótipo de células tumorais em vez de com o tamanho do tumor ou a presença de células tumorais no sistema linfóide. Consequentemente, a taxa de respostas de TC contra peptídeos tumorais restritos a HLA-A2 ou lisado tumoral foi fortemente aumentada em pacientes com tumores bem diferenciados e ER-positivos (78% e 63%, respectivamente) quando comparados com pacientes com hormônio pouco diferenciado tumores receptores negativos (16%, P = 0,05 e 5%, P = 0,004, respectivamente). Em contraste, as respostas humorais diminuíram no primeiro grupo de pacientes (19%, não significativo Fig. 3C) A maioria de 70% dos pacientes sem TC reativo a TA mostrou anticorpos específicos para TA, enquanto apenas alguns pacientes (21%) com uma resposta BMTC tipo 1 específica de tumor continham anticorpos específicos para TA (P = 0,03 Fig. 3D).

A patobiologia do tumor determina a capacidade funcional de linhas CD8 + TC específicas de TA

A falta observada de reatividade de TC específico de TA tipo 1 em pacientes com tumores de alto grau pode ser explicada pelo número reduzido de TC específico de TA nesses pacientes. Alternativamente, tal TC pode ter permanecido não detectado no ensaio IFN-γ ELISPOT devido ao bloqueio funcional. Portanto, comparamos os números de CD8 + TC específicos de Her-2 / neu por citometria de fluxo usando tetrâmeros HLA-A * 0201 carregados com Her-2 / neu. Conforme mostrado na Fig. 4UMA, the frequencies of Her-2/neu–specific TC were increased in poorly differentiated tumors. Thus, reduced frequencies of TA-specific TC did not account for the observed lack of type-1 TC responses in patients with high-grade tumors. We therefore established Her-2/neu–specific CD8 TC lines from BM of 12 different HLA-A2+ breast cancer patients. TC lines were established by repeated isolation of antigen-specific cells with magnetic beads coupled to Her-2/neu-peptide–loaded HLA-A2 complexes ( 28) and subsequent polyclonal expansion of the cells. We used as antigen-presenting cells in subsequent functional assays T2 cells loaded with a defined high amount of Her-2 peptide (20 μg/mL) to reduce the risk that insufficient TCR signaling (caused by different TCR avidities among the TC lines) accounted for putative functional differences. The TC lines were tested for their capacity to lyse Her-2/neu–loaded HLA-A2+ T2 target cells and/or to secrete IFN-γ upon specific stimulation. None of the TC lines were derived from patients with Her-2/neu overexpression. Figura 4B shows for one representative TC line the proportion of Her-2/neu–specific TC, its capacity to lyse Her-2–loaded target cells and to secrete IFN-γ in response to antigen-specific stimulation. In total, six TC lines showed functional capacity, whereas six were tolerant ( Fig. 4C) Four of six lines from patients with low-grade tumors, and five of six lines from hormone receptor–positive patients showed functional capacity, whereas all six TC lines from patients with high-grade or hormone receptor–negative tumors were tolerant (P = 0.03 and P = 0.01, respectively Fig. 4D).

Functional tolerance of tumor-specific TC in patients with high-grade ER breast tumors. UMA, mean + SD proportions of Her-2.tetramer–binding CD8+TC in patients with breast carcinomas of high (G1), intermediate (G2), or low (G3) differentiation. One exemplary tetramer staining is shown. B, left, proportion of Her-2/neu–specific CD8+TC after antigen-specific isolation and expansion and corresponding Her-2/neu–specific TC function analyzed by ELISPOT assay (meio) and 4-h chromium-release assay (direito) using selected, Her-2/neu–specific CD8+TC (black columns) or unselected TC (gray columns) as responder cells and Her-2/neu-, HIV-, or insulin (Ins)-loaded T2 cells as target cells. C, Her-2/neu–specific lysis (black columns) and/or Her-2–specific IFN-γ secreting TC (gray columns) in Her-2/neu–specific TC lines according to differentiation (G) of respective primary tumors. D, correlation of functional reactivity (pos. gray columns) or tolerance (neg. white columns) of Her-2/neu–specific CD8+TC lines from 12 patients with high/moderate differentiation and/or ER expression of corresponding tumors. *, significant difference, by Student's t test (UMA e B) or Fisher's exact test (D) n, number of different patients tested.

Intratumoral cytokine patterns correlate with systemic tumor immune responses and tumor pathobiology

To assess potential reasons for the observed correlation of tumor pathobiology with systemic tumor-specific immune responses, we determined in lysates from 36 tumors the concentrations of 27 immune-modulatory cytokines, chemokines, and growth factors (Supplementary Table S2) by multiplex analysis. The results were statistically compared with the calculated frequencies of TA-reactive TC. These were calculated in positive samples by subtracting mean IFN-γ spots in negative control wells from mean spots in test wells. Figura 5UMA shows a heat map analysis of the cumulative results. Among all tested factors, only IFN-α was positively associated with increased TC responses, whereas intratumoral TGFβ1 was correlated with reduced TC frequencies. We also evaluated the presence or absence of tumor-reactive BMTC or MUC1-specific antibodies according to intratumoral expression of IFN-α and TGFβ1. Seventy-eight percent of patients with tumors containing TGFβ1 levels below the median concentration of 176 pg/mL together with detectable amounts (>0.1 pg/mL) of IFN-α, but only 21% of patients with increased intratumoral TGFβ1 and undetectable IFN-α showed the presence of tumor-reactive BMTC (P = 0.003 Fig. 5B) In contrast, MUC1-specific antibody responses were highly correlated with increased TGFβ1 and absence of IFN-α (P = 0.009 Supplementary Fig. S1 Fig. 5B) Accordingly, IFN-α was significantly increased in tumors of patients with TC responses, whereas increased TGFβ1 correlated with reduced frequencies of tumor-reactive TC ( Fig. 5C) Importantly, the concentrations of both cytokines in tumor tissue showed no correlation to the respective cytokine levels in corresponding PB samples (Supplementary Figs. S2 and S3). Thus, the local contents of TGFβ1 and IFN-α in breast tumor tissues were inversely correlated with the presence and frequencies of systemic tumor-reactive TC or tumor-specific antibodies.

Correlation of systemic antitumor immune responses and cytokine content in breast carcinomas. UMA, heat map analysis of mean cytokine concentrations in 36 breast tumors and corresponding frequencies of tumor-reactive BMTC. B, proportion of patients containing (black columns) or lacking (white columns) tumor-reactive TC (deixou) or MUC1-specific antibodies (direito) in patient groups characterized by TGFβ1 increased above the median value and undetectable IFN-α or reduced TGFβ1 and detectable IFN-α. *, significant difference (deixou, χ 2 test direito, Fisher's exact test). C, left, presence of tumor-reactive TC correlates with increased intratumoral IFN-α. *, significant difference (two-sided Student's t teste). Middle graph, reduced frequencies of tumor-reactive TC correlate with increased TGFβ1 levels above the median of the whole group. Columns, mean frequencies bars, SD. *, significant difference (χ 2 test). Right graph, Spearman's rank correlation demonstrating a significant inverse correlation between TGFβ1 contents in primary breast tumors and frequencies of tumor-reactive TC. D, concentrations of IFN-α (deixou), TGFβ1 (meio), or of IFN-α and TGFβ1 (direito) in tumor lysates from 51 primary breast tumor tissues or in lysates of normal breast tissue (donors) determined by ELISA. Dots, different patients or donors. *, significant difference (two-sided Student's t teste).

IFN-α was increased in tumors of patients with well differentiated (G1/2) primary breast tumors (P = 0.03 Fig. 5D) compared with normal breast tissue and poorly differentiated (G3) breast tumors. In contrast, TGFβ1 was enhanced in poorly differentiated (G3) tumors (P = 0.04). Accordingly, the expression patterns of IFN-α and TGFβ1 in 51 primary breast tumors revealed two major subgroups containing either high levels of IFN-α together with low concentrations of TGFβ1, or the opposite pattern ( Fig. 5D).

TGFβ1 and IFN-α influence priming of tumor-specific TC responses em vitro

We hypothesized that TGFβ1 and IFN-α in the tumor environment regulate systemic immunity by influences on immature DC (iDC) during antigen uptake. In this case, their respective concentrations should be sufficient to modify the capacity of iDC to prime type-1 TC responses. We therefore generated iDC from patients and pulsed them with autologous tumor lysate or with the synthetic long peptide MUC1tr(137-157)5 ( 7) for 18 hours in the presence or absence of 20 pg/mL IFN-α or 200 pg/mL TGFβ1 at concentrations detectable in breast tumors. DC were then carefully washed and cocultured with separated autologous naïve (CD45RO − ) or memory (CD45RA − ) TC for 7 days. Priming of tumor-reactive TC was then evaluated by IFN-γ ELISPOT-assay. Representative results of two independent experiments are shown in Fig. 6UMA e B. In 3 of 11 cases, we detected an induction of tumor-reactive TC only when DC had been pretreated with IFN-α ( Fig. 6UMA e C) Seven of 18 cultures spontaneously contained tumor-reactive effector TC ( Fig. 6D) In six of these cases, TGFβ pretreatment inhibited the capacity of DC to prime tumor-reactive TC ( Fig. 6B e D) DC-pretreatment with neither TGFβ1 nor IFN-α had no effect on memory TC of the same patients (data not shown). These findings indicate that IFN-α and TGFβ1 are present in breast carcinomas at sufficient amounts to regulate the capacity of iDC to induce primary TA-specific TC.

TGFβ1 and IFN-α influence priming of tumor-specific TC. Isolated naïve TC were stimulated for 7 d with TA-pulsed DC (black columns) In some cases, DC were coincubated during antigen uptake with 20 pg/mL IFN-α (UMA e C) or 200 pg/mL TGFβ1 (B e D) After 7 d, TCs were tested by IFN-γ ELISPOT assay for reactivity against TAs (MUC1tr(137-157)5 or autologous tumor cell lysate (black e dark gray columns) or corresponding negative control antigens (huIgG or autologous PB-lysate Branco ou light gray columns). UMA e B, representative experiments show TC priming by pretreatment of DC with IFN-α (UMA) or abrogation of TC priming by DC pretreatment with TGFβ1 (B). C, cumulative frequencies of tumor-reactive TC induced by antigen-pulsed DC pretreated with IFN-α. D, cumulative frequencies of tumor-reactive TC induced by TA-pulsed DC pretreated with TGFβ1. Dots, samples of different patients. Dashed lines, connect samples from the same patients. Horizontal full lines, the mean frequencies of tumor-reactive TC. *, significant difference (two-sided Student's t teste).


How Vaccines Work

Claire-Anne Siegrist MD , Paul-Henri Lambert MD , in The Vaccine Book (Second Edition) , 2016

9 Vaccine-induced T-cell memory

T-cell memory is a critical component of immune responses to intracellular pathogens. Following the antigen-driven expansion and the death of effector cells after antigen clearance, some of the remaining T cells differentiate into memory T cells of two different types: central memory and effector memory T cells. 24 The first ones are located in lymphoid organs and bone marrow and have a high proliferative potential whereas the second ones stay in peripheral tissues in a preactivated form that enables them with immediate action on pathogen recognition. A third type of memory T cells (resident memory cells) was recently recognized as memory T cells which remain settled within specific organs such as the intestine, the lungs, and the skin. They appear important for the protection against mucosal infections. 25

It is useful to know that the establishment of T-cell memory requires some time after the initial priming. Secondary T-cell responses are lower if vaccine boosters are given too early. Through homeostatic proliferation, memory T cells may persist lifelong, even without antigen exposure. 26

A number of T-cell parameters can be measured during vaccine studies. Some are quantitative for example, measurement of T-cell proliferation following antigen stimulation with a dye and quantification of T-cell frequencies by ELISPOT or flow cytometry. Some assays add a functional component, for example, assessment of the production of cytokines by ELISPOT or flow cytometry, or cytotoxic assays.


Prevalence of Syndecan-1 (CD138) Expression in Different Kinds of Human Tumors and Normal Tissues

Syndecan-1 (CD138) is a transmembrane proteoglycan known to be expressed in various normal and malignant tissues. It is of interest because of a possible prognostic role of differential expression in tumors and its role as a target for indatuximab, a monoclonal antibody coupled with a cytotoxic agent. To comprehensively analyze CD138 in normal and neoplastic tissues, we used tissue microarrays (TMAs) for analyzing immunohistochemically detectable CD138 expression in 2,518 tissue samples from 85 different tumor entities and 76 different normal tissue types. The data showed that CD138 expression is abundant in tumors. At least an occasional weak CD138 immunostaining could be detected in 71 of 82 (87%) different tumor types, and 58 entities (71%) had at least one tumor with a strong positivity. In normal tissues, a particularly strong expression was found in normal squamous epithelium of various organs, goblet and columnar cells of the gastrointestinal tract, and in hepatocytes. The highly standardized analysis of most human cancer types resulted in a ranking order of tumors according to the frequency and levels of CD138 expression. CD138 immunostaining was highest in squamous cell carcinomas such as from the esophagus (100%), cervix uteri (79.5%), lung (85.7%), vagina (89.7%) or vulva (73.3%), and in invasive urothelial cancer (76.2%). In adenocarcinomas, CD138 was also high in lung (82.9%) and colorectal cancer (85.3%) but often lower in pancreas (73.3%), stomach (54.2% in intestinal type), or prostate carcinomas (16.3%). CD138 expression was usually low or absent in germ cell tumors, sarcomas, endocrine tumors including thyroid cancer, and neuroendocrine tumors. In summary, the preferential expression in squamous cell carcinomas of various sites makes these cancers prime targets for anti-CD138 treatments once these might become available. Abundant expression in many different normal tissues might pose obstacles to exploiting CD138 as a therapeutic target, however.

1. Introdução

Syndecan-1 (CD138) is one of four members of the syndecan family. It is a cell surface protein consisting of three structural domains, one of which is extracellular and binds heparin sulfates and chondroitin sulfates [1]. Syndecan-1 has relevance for cell-cell and cell-matrix interactions [1]. It is involved in the regulation of cell proliferation, migration, and the organization of the cytoskeleton [1]. In normal tissues, CD138 is known to be expressed on plasma cells and various epithelial cell types.

CD138 expression in cancer is of potential clinical interest as specific drugs targeting CD138 are currently being evaluated in clinical trials. In a phase II trial on plasmocytoma, clinical efficacy and low side effects have been reported [2, 3]. In preclinical studies, these antibodies also showed efficacy against triple negative breast cancer and melanoma [4, 5]. If anti-CD138 therapies should prove successful, other CD138-positive cancer types might as well benefit from such treatments.

Altered CD138 expression has been described in various malignant tumors. For example, overexpression of CD138 has been reported in breast, urinary bladder, gallbladder, pancreatic, ovarian, endometrial, and prostate cancer [1]. In other cancer types, such as lung, head/neck, gastric, renal, and colorectal cancer, CD138 expression was found to be reduced as compared to adjacent normal epithelium [1]. In several of these tumor types, either reduced or increased CD138 expression was linked to unfavorable tumor phenotype and poor patient prognosis [6–9]. Previous studies on CD138 in cancer have applied various different reagents and protocols for their immunohistochemical staining. It is probably because of this that the existing literature is highly discrepant with respect to the prevalence of CD138 expression in different tumor types. For example, the range of the reported CD138 positivity ranges from 26% [10] to 100% [11] in urinary bladder cancer, from 23% [10] to 89% [12] in squamous lung cancer, from 33% [13] to 100% [14] in breast cancer, from 50.5% [15] to 87% [10] in squamous cell carcinoma of the esophagus, and from 24.7% [16] to 89.7% [17] in squamous cell carcinoma of the cervix.

Given these heterogeneous data, the existing literature does not easily allow to determine these cancer types, where CD138 plays a particularly important role. To compare the prevalence and intensity of CD138 expression between tumor entities and to identify these cancer types that might be optimal candidates for anti-CD138 drugs, we thus analyzed more than 2500 cancers and 76 normal tissues using one standard protocol. For this purpose, a multitumor tissue microarray (TMA) was used containing up to 50 different tumors from 85 different tumor types and subtypes. The results of our study identify a broad range of highly CD138-expressing tumor entities.

2. Materiais e métodos

2.1. Tissue Microarrays (TMAs)

We used two different sets of preexisting TMAs to study CD138 expression in normal human and cancerous human tissues. The first TMA was composed of one sample of 76 different normal tissue types (608 samples on one slide). The second TMA contained a total of 3,642 primary tumors from 85 tumor types and subtypes. The samples were distributed among 7 different TMA blocks (containing between 414 and 522 samples). The composition of the TMA is described in Table 1 in Results. All samples were derived from the archives of the Institute of Pathology, University Hospital of Hamburg (Hamburg, Germany). Each TMA block contains an identical standard control section with 40 normal and tumor tissue spots in order to control for possible slide-to-slide variability of the immunostaining. Tissues were fixed in 4% buffered formalin and then embedded in paraffin. TMA tissue spot diameter was 0.6 mm. All works were compliant with the Helsinki Declaration. Informed consent was not necessary.

2.2. Imunohistoquímica

Freshly cut TMA sections were immunostained on one day and in one experiment. Slides were deparaffinized and exposed to heat-induced antigen retrieval for 5 minutes in an autoclave at 121°C in pH 9 Dako Target Retrieval Solution buffer. Primary antibody specific for total Syndecan-1 (mouse monoclonal antibody, clone JASY1, Dianova, Hamburg, Germany, dilution 1 : 200) was applied at 37°C for 60 minutes. Bound antibody was then visualized using the EnVision Kit (Dako, Glostrup, Denmark) according to the manufacturer’s directions. For tumor tissues, the percentage of positive epithelial cells was estimated and the staining intensity was semiquantitatively recorded (0, 1+, 2+, and 3+). For statistical analyses, the staining results were categorized into four groups. Tumors without any staining were considered as negative. Tumors with 1+ staining intensity in ≤70% of cells and 2+ intensity in ≤30% of cells were considered weakly positive. Tumors with 1+ staining intensity in >70% of cells, 2+ intensity in 30% to 70%, or 3+ intensity in ≤30% were considered moderately positive. Tumors with 2+ intensity in >70% or 3+ intensity in >30% of cells were considered strongly positive. These categories represent standard cutoffs that others and us have used in numerous IHC studies [18].

3. Resultados

3.1. Technical Issues

A total of 2,518 (69%) of the 3,642 tumor tissue samples were interpretable in our TMA analysis. Reasons for analysis failure included a fraction of missing samples or samples lacking unequivocal tumor cells. A sufficient number of samples were analyzable for all 76 normal tissue types enabling a complete normal tissue evaluation.

3.2. Syndecan-1 in Normal Tissues

All positive CD138 immunostainings in normal tissues are summarized in Table 2. CD138 was abundantly expressed, mostly in various epithelial cell types. A particularly strong expression of CD138 was observed in squamous epithelial cells of various organs (Figure 1(a)), goblet cells of the gastrointestinal tract (Figure 1(b)), columnar cells in the gall bladder (Figure 1(c)), and hepatocytes (Figure 1(d)). No CD138 staining was detected in the following tissues: aorta/intima, aorta/media, heart (left ventricle), skeletal muscle, skeletal muscle/tongue, myometrium, muscular wall appendix, esophagus, stomach, ileum, colon descendens, kidney pelvis and urinary bladder, penis (glans/corpus spongiosum), ovary (stroma), fat tissue (white), spleen, thymus, ovary (corpus luteum), ovary (follicular cyst), thyroid, cerebellum, cerebrum, pituitary gland (posterior lobe), pituitary gland (anterior lobe), and bone marrow.


11.1. CARCINOMA

Carcinoma in dogs and cats is characterized by different stromal reactions depending on the subject. A simpler classification that can allow histopathologists to establish rapid diagnosis and, to a certain extent, prediction, includes in the group of epithelial tumors: papillary, tubular, solid and anaplastic carcinomas. Precancerous lobules and ductal hyperplasia are found at the periphery of carcinogenic nodules, in adjacent tissues, in both dogs (73.6%) and cats (56.3%) [4].

Macroscopically, carcinoma is characterized by rapid growth, doubling its volume in a short time, with local invasion, infiltrating the surrounding normal tissue. Sometimes, mammary neoplasms are delimited, a capsule appearing on palpation, but they present fibrous adhesions to the epidermis and the muscle fasciae or the neighboring muscles, and they cannot be freely moved. The skin is frequently ulcerated and the tumor invades the lymphatic vessels and lymph nodes, skin and the adjacent gland on the same side.

Mammary neoplasms can have diameters between 2 and 20 cm, and round, ovoid, discoid, fungiform or poorly defined shapes. The tumor extends rapidly and occupies the whole gland, as well as adjacent glands, and carcinomas can coexist with benign tumors in the same gland and/or the neighboring glands.

Adenocarcinomas are usually soft, and in section, a diffuse or lobular structure of homogeneous tissue of white-cream color appears. Papillary carcinomas have a firm or soft-bloody structure. Scirrhous carcinomas have irregular shapes, they are poorly delimited and occasionally invade adjacent mammary glands. They are of a dense-ligneous, even hard consistency, white-gray or brown-yellow color, and they adhere to skin or the basic musculature. Solid carcinomas are soft and in section they have a lobular structure, of white or gray color. Squamous cell carcinomas are of irregular shapes, hard, in section their structure is lobular, color being gray or white, with yellow spots [37].

Carcinomas generally develop rapidly, and they are detected by the owner in 2𠄶 months. If, following diagnosis, the mammary tumor is not removed, tumor growth lasts for a longer time before the dog’s death. Carcinomas may develop over a period of 3 months to 6 years. The conclusions drawn by FOWLER et al. (1974), based on a large number of mammary neoplasms in bitches, regarding the behavior of carcinomas after diagnosis and treatment, are extremely interesting. The mean survival time after the diagnosis of infiltrating papillary carcinomas was 5.6 months, less than for other carcinomas. The mean duration after the diagnosis of infiltrating solid carcinoma was 7.3 months. Scirrhous carcinoma had a longer duration than non-scirrhous carcinoma, 9.7 months. Most dogs with infiltrating papillary carcinoma died following metastases. The behavior of scirrhous carcinoma was similar to that of papillary carcinoma.

Epithelial carcinomas may develop from intralobular ductal or alveolar epithelium, appearing as non-infiltrating or infiltrating tumor structures. The evolution duration of non-infiltrating carcinomas was 36 months and that of infiltrating carcinomas 13 months.

Metastases of mammary carcinomas occur in 25% of cases. The metastatic process is facilitated by both blood flow and lymphatic flow, distributed in the mammary parenchyma.

11.1.1. Adenocarcinoma

Simple tubular adenocarcinoma is a relatively frequent tumor in dogs, the tubular type being predominant. The microscopic structure is dominated by tubular epithelial cells, in which pleomorphism and mitotic activity is estimated from low to high, and necrotic foci are frequent. The connective stroma can be in limited or moderate amounts. Tumor proliferation is surrounded by variable lymphocytic infiltration. The histological differentiation between tubular adenocarcinoma and benign lesion forms is difficult. Benign lesions can have in some cases a high mitotic activity or they can stimulate local invasive growth. In cats, these tumors represent the most frequent type. Tubular adenocarcinoma has in 70% of cases an invasive character, or expansive nodular character in 30%. The lymphocytic infiltration of the tumor is frequent, in approximately 50% of cases (Fig. 11.1, 11.2, 11.4, 11.5, 11.6, 11.30).


Evolution of CAR T-Cell Therapies

Other refinements or reconfigurations of CAR T cells are being tested. One approach is the development of CAR T-cell therapies that use immune cells collected not from patients, but from healthy donors. The idea is to create so-called off-the-shelf CAR T-cell therapies that are immediately available for use and don't have to be manufactured for each patient.

The French company Cellectis, in fact, has launched a phase I trial of its off-the-shelf CD19-targeted CAR T-cell product in the United States for patients with advanced acute myeloid leukemia. The company's product—which is made using a gene-editing technology known as TALEN—has already been tested in Europe, including in two infants with ALL who had exhausted all other treatment options. In both cases, the treatment was effective.

Numerous other approaches are under investigation. Researchers, for example, are using nanotechnology to create CAR T cells inside the body, developing CAR T cells with "off switches" as a means of preventing or limiting side effects like CRS, and using the gene-editing technology CRISPR/Cas9 to more precisely engineer the T cells.

But there is still more to do with existing CAR T-cell therapies, Dr. Fry said.

He is particularly enthusiastic about the potential to use CAR T cells earlier in the treatment process for children with ALL, specifically those who are at high risk (based on specific clinical factors) of their disease returning after their initial chemotherapy, which typically is given for approximately 2 and a half years.

In this scenario, he explained, if early indicators suggested that these high-risk patients weren't having an optimal response to chemotherapy, it could be stopped and the patients could be treated with CAR T cells.

For patients who respond well, "they could be spared 2 more years of chemotherapy," Dr. Fry said. "That's amazing to think about."


Afiliações

School of Medicine, Shandong University, 250012, Jinan, People’s Republic of China

Department of Medicine, Center for Molecular Medicine (CMM) and Bioclinicum, Karolinska Institutet and Karolinska University Hospital Solna, 171 64, Solna, Sweden

Department of Oncology-Pathology and Bioclinicum, Karolinska Institutet and Karolinska University Hospital Solna, 171 64, Solna, Sweden

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Autores correspondentes


Assista o vídeo: Ressecção de tumor ósteo-condral benigno de fêmur distal (Janeiro 2022).