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Mutagênese aleatória vs evolução dirigida como estratégias para aumentar a expressão


As pessoas usam mutagênese aleatória (digamos, usando UV) para gerar variantes do hospedeiro que têm alta expressão de um metabólito / enzima? Já vi isso ser mencionado como uma estratégia, mas me confunde o porquê.

Como isso se compara ao uso do Directed Evolution para o mesmo propósito? Intuitivamente, a mutagênese aleatória parece altamente ineficiente (uma vez que você não tem controle sobre quais genes você muda) dada a explosão combinatória, mesmo em algo como o tamanho do genoma de E. Coli. Estou cometendo um erro nesse raciocínio?

Quais são as situações em que se pode preferir a mutagênese aleatória em vez da evolução direcionada? Existem prós e contras a serem considerados?


Bem, você já mencionou isso. A mutagênese aleatória (com UV ou mutagênicos químicos) atinge todo o genoma e você seleciona o organismo para certos traços.

Em um experimento de evolução direcionada, você está apenas visando um gene ou um grupo de genes. Com o progresso da biologia sintética, pode ser possível sintetizar pequenos genomas (já mostrados por Craig Venter e grupo) e aplicar a metodologia de evolução direcionada em todo o genoma. Isso ainda não seria considerado direcionado, já que as mutações são, na verdade, aleatórias no genoma.

Os prós e os contras dependem do que exatamente você pretende fazer.


Mutagênese direcionada e aleatória de genes de plantas com editores de base dupla de citosina e adenina

A mutagênese de saturação direcionada de genes de culturas pode ser aplicada para produzir variantes genéticas com melhor desempenho agronômico. No entanto, as ferramentas para a evolução direcionada de genes de plantas, como PCR propenso a erros ou embaralhamento de DNA, são limitadas 1. Nós projetamos cinco editores de mutagênese endógena direcionada saturada (STEMEs) que podem gerar mutações de novo e facilitar a evolução direcionada de genes de plantas. Em protoplastos de arroz, STEME-1 editou citosina e adenina no mesmo local alvo com eficiência C & gt T de até 61,61% e eficiência C & gt T e A & gt G simultânea de até 15,10%. STEME-NG, que incorpora a variante de motivo adjacente ao protoespaçador Cas9-NG de nickase, foi usado com 20 RNAs guia individuais individuais em protoplastos de arroz para produzir mutagênese quase saturada (73,21%) para uma porção de 56 aminoácidos do acetil do arroz -coenzima A carboxilase (OsACC). Também aplicamos STEME-1 e STEME-NG para a evolução direcionada do OsACC gene em arroz e obteve mutações de resistência a herbicidas. Este conjunto de dois STEMEs irá acelerar o desenvolvimento de características e deve funcionar em quaisquer plantas passíveis de edição baseada em CRISPR.


Mutagênese aleatória vs evolução dirigida como estratégias para aumentar a expressão - Biologia

Na engenharia da biossíntese de produtos naturais, a engenharia de proteínas é fundamental para modificar as características de enzimas ou biossensores geneticamente codificados.

A engenharia de proteínas melhorou a biossíntese de produtos naturais por meio do aumento da atividade enzimática, colocalização de complexos enzimáticos, melhoria da estabilidade da proteína e engenharia de reguladores de sensor para melhor triagem ou regulação dinâmica.

A engenharia de proteínas existentes pode produzir variantes com novas funções catalíticas. Esses avanços ampliam o espectro de produtos e, assim, diversificam a biossíntese de produtos naturais.

As proteínas encontradas na natureza têm sido tradicionalmente os biocatalisadores mais usados ​​para produzir vários produtos naturais, desde produtos químicos básicos até produtos farmacêuticos. A engenharia de proteínas surgiu como uma poderosa caixa de ferramentas biotecnológicas no desenvolvimento da engenharia metabólica, particularmente para a biossíntese de produtos naturais. Recentemente, a engenharia de proteínas se tornou um método preferido para melhorar a atividade enzimática, aumentar a estabilidade da enzima e expandir os espectros do produto na biossíntese de produtos naturais. Esta revisão resume os avanços recentes e estratégias típicas em engenharia de proteínas, destacando o papel fundamental da engenharia de proteínas em melhorar e diversificar a biossíntese de produtos naturais. Perspectivas futuras e direções de pesquisa também são discutidas.


Resumo

Bioprocess, uma tecnologia baseada em biocatálise, está se tornando popular em muitos campos de pesquisa e amplamente aplicada na fabricação industrial. No entanto, a baixa bioconversão, a baixa produtividade e os altos custos durante os processos industriais costumam ser a limitação do bioprocesso. Portanto, muitas estratégias de biocatalisadores foram desenvolvidas para atender a esses desafios nos últimos anos. Nesta revisão, primeiro discutimos as estratégias de engenharia de proteínas, que surgiram para melhorar a atividade de biocatálise de biocatalisadores. Em seguida, resumimos as estratégias de engenharia metabólica que estão promovendo o desenvolvimento de fábricas de células microbianas. A seguir, ilustramos a necessidade de usar a estratégia de combinação de engenharia de proteínas e engenharia metabólica para biocatalisadores eficientes. Por fim, são discutidas as perspectivas futuras sobre o desenvolvimento e a aplicação de novas estratégias de biocatalisadores. Esta revisão fornece orientação teórica para o desenvolvimento de bioprocessos eficientes, sustentáveis ​​e econômicos mediados por novos biocatalisadores.


Conclusões

A progressão em direção a terapias significativas para distúrbios do neurodesenvolvimento acelerou-se muito nos últimos anos. As terapias gênicas de AAV direcionadas ao CNS, particularmente as terapias usando AAV9, estão produzindo resultados pré-clínicos promissores, especialmente quando fornecidas no início do curso da doença, e estão cada vez mais se traduzindo da bancada para os ensaios clínicos de fase I. O aumento da pesquisa para compreender a biologia subjacente dos distúrbios do neurodesenvolvimento ajudará tremendamente a definir os tipos de células relevantes e paradigmas de tratamento. Quando combinado com melhorias contínuas no projeto de construção e a criação de novas variantes de AAV com recursos de direcionamento específicos e aprimorados, há muita esperança para o tratamento de até mesmo distúrbios complexos. À medida que os tratamentos passam para a prática clínica, os esforços para prevenir as respostas imunológicas inibitórias serão uma área crítica de enfoque. Trabalhar para entender a imunidade anti-terapia no lado pré-clínico e o monitoramento cuidadoso durante os testes clínicos sem dúvida fornecerá uma riqueza de insights e ajudará a enfocar o desenvolvimento de terapias seguras e altamente eficazes.


Métodos

Cepas e vetores de expressão

D2-BGL foi expresso em Pichia pastoris SMD 1168 (Invitrogen, EUA) ou em Saccharomyces cerevisiae ATCC 4.014.317. Os plasmídeos pGAPZαC com um marcador de resistência à zeocina e YEp352 com um marcador auxotrófico URA3 (fornecido pela Prof. Frances Arnold, Divisão de Química, Caltech, Pasadena, CA, EUA) foram usados ​​para a expressão da enzima recombinante em P. pastoris e S. cerevisiae, respectivamente. Estes dois plasmídeos contêm o peptídeo sinal de secreção do fator de acoplamento α a montante de D2-BGL para a secreção de proteínas. O vetor de expressão pGAPZαC-D2 foi gerado conforme descrito em um estudo anterior [20], enquanto o vetor de expressão YEp-D2 foi gerado por clonagem do produto de PCR de D2-BGL no plasmídeo YEp352.

Expressão heteróloga de D2-BGL em levedura

P. pastoris células competentes foram preparadas por um método modificado de acetato de lítio-ditiotreitol (LiAc-DTT) [34]. Quatrocentos nanogramas de pGAPZαC-D2, linearizado usando a enzima de restrição BspHI, foi transformado em P. pastoris por eletroporação. Os transformantes foram selecionados em placas YPDS (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose, 1 M de sorbitol e 20 g / L de ágar) suplementado com 100 mg / L de Zeocina (Invivogen, Taiwan). Para a expressão de D2-BGL em cultura em frasco, uma única colônia foi inoculada em 3 mL de meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose) com zeocina e, em seguida, incubada a 30 ° C durante a noite a 250 rpm. Esta pré-cultura foi inoculada em 50 mL de meio YPD com o OD inicial600 valor ajustado para 0,05 e depois incubado a 30 ° C durante 3 dias a 250 rpm.

Saccharomyces cerevisiae células competentes foram preparadas e transformadas usando o S.c. Kit de transformação EasyComp ™ (ThermoFisher Scientific, EUA). Cem nanogramas de Yep-D2 foram transformados em S. cerevisiae, e os transformantes foram então selecionados em placas YNB-Ura contendo 6,7 g / L de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos (Sigma-Aldrich, EUA), 0,77 g / L-Suplemento Ura DO (Clontech, EUA), 2% de glicose e 20 g / L ágar, pH 5,8. Para a expressão de D2-BGL, uma única colônia foi inoculada em 4 mL de meio SDCAA contendo 6,9 g / L de base de nitrogênio de levedura, 5 g / L de Bacto casaminoácido (BD, EUA), 5,4 g / L de Na2PO4, 8,56 g / L NaH2PO4· H2O e 20 μg / mL de L-triptofano (Sigma-Aldrich, EUA) [35] e, em seguida, incubado a 30 ° C durante a noite a 250 rpm. Esta pré-cultura foi inoculada em 40 mL de meio SDCAA com o OD inicial600 valor ajustado para 0,1 e depois incubado a 30 ° C durante 2 dias a 250 rpm.

Mutagênese dirigida ao local

As mutações pontuais foram geradas em D2-BGL usando o QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, EUA). A amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada com 20 ng de plasmídeo como molde e iniciadores back-to-back (Arquivo Adicional 1: Tabela S2). A PCR foi iniciada com uma etapa de desnaturação a 95 ° C por 2 min, seguida por 18 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 60 ° C por 30 se extensão a 68 ° C por 3 min, e a reação foi concluído após uma etapa de extensão final a 68 ° C por 5 min. O modelo de plasmídeo foi eliminado por digestão com enzima de restrição DpnI a 37 ° C por 1 h, e o produto de PCR restante foi transformado em E. coli Cepa DH5α.

Mutagênese aleatória usando ePCR

A biblioteca mutante foi gerada e triada em S. cerevisiae seguindo uma versão modificada de uma abordagem de evolução direcionada [36]. O vetor de expressão YEp-D2 foi linearizado por digestão com enzimas de restrição para remover a sequência D2-BGL. A sequência D2-BGL mutada foi gerada usando ePCR com 100 ng de YEp-D2 como modelo em 100 μL de solução de PCR contendo 0,2 mM dNTP, 0,1 μM Sc ePCR F primer sentido, 0,1 μM Sc ePCR R primer antisense, 0,5 mM MgCl2, 0,2 mM MnCl2 e 5 U GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega, EUA). Os primers Sc ePCR F e Sc ePCR R (Arquivo Adicional 1: Tabela S2) geraram regiões de sobreposição de 41 pares de bases (bp) e 47 bp com vetor yEP linearizado nas extremidades 5 ′ e 3 ′ dos produtos ePCR, respectivamente. ePCR foi iniciado com uma etapa de desnaturação a 95 ° C por 2 min, seguida por 28 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 50 ° C por 30 s e extensão a 72 ° C por 3 min, e a reação foi concluído após uma etapa de extensão final a 72 ° C por 5 min. Ambos os produtos YEp linearizados e ePCR foram purificados usando o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Alemanha).

Triagem de biblioteca mutante

Para construir a biblioteca mutante D2-BGL em S. cerevisiae, quantias iguais (

45 fmol) de produtos YEp e ePCR linearizados foram transformados juntos em 40 μL de células competentes, e os transformantes foram selecionados em placas YNB-Ura a 30 ° C por 3 dias. Colônias únicas foram isoladas e inoculadas individualmente nos poços de uma placa de 96 poços profundos contendo 50 μL de meio SDCAA em cada poço. Os transformantes gerados com produtos de PCR de D2-BGL de tipo selvagem foram inoculados em uma coluna de oito poços para servir como um controle positivo. Após uma incubação de 2 dias, 300 μL de meio SDCAA foram adicionados a cada poço e a placa foi inoculada a 30 ° C por mais 3 dias. Para a triagem de mutantes D2-BGL, 50 μL de sobrenadante de cultura foram misturados com 50 μL de 4 mM p-nitrofenil β-D-glucopiranosídeo (pNPG) em uma placa de 96 poços. A atividade da enzima foi avaliada a 55 ° C por 5 min, e a reação foi interrompida pela adição de 100 μL de Na 1 M2CO3. Valores de OD405 foram medidos usando um leitor de microplacas SynergyMx (BioTek, EUA). A média (AVE) e o desvio padrão (STDEV) foram calculados para os poços de controle positivo (WT) de cada placa. Transformantes com OD405 & gt (AVEWT + 2 × STDEVWT) foram isolados e cultivados em novas placas YNB – URA. Os plasmídeos foram extraídos de mutantes D2-BGL potencialmente melhorados usando um kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II (ZYMO RESEARCH, EUA). Os transformantes selecionados foram submetidos a cultura em frasco, e os sobrenadantes da cultura foram usados ​​para ensaio de atividade de celobiase.

Sequência de proteínas e análises de estrutura

Alinhamento múltiplo de β-glucosidases de Chaetomella raphigera D2-BGL (código PDB: 6JXG), Aspergillus aculeatus BGL1 (código PDB: 4IIH), Aspergillus niger BGL1 (GenBank: RDH24713.1), Aspergillus niger ASKU28 (GenBank: AFW98805.1) e Trichoderma reesei (PDB: 4I8D) foi realizado com Clustal Omega [37]. Modelos de estrutura de mutantes D2-BGL F256Y e F256M foram construídos usando SWISS-MODEL [38]. As estruturas cristalinas da proteína 3D foram visualizadas usando o PyMOL Molecular Graphics System v2.2.3 (Schrodinger, LLC).

Purificação de enzima por cromatografia de imunoafinidade

A cromatografia de imunoafinidade foi realizada utilizando uma coluna de gravidade-fluxo de cromatografia Poly-Prep (Biorad, EUA) preenchida com 1 mL de resina Sepharose 4B ativada por CNBr (GE Healthcare Bio-sciences AB, Suécia) acoplada a anti-D2 policlonal de coelho purificado -BGL anticorpos (LTK BioLaboratories, Taiwan). Para preparar amostras, 100 mL S. cerevisiae sobrenadante de cultura ou 30 mL P. pastoos sobrenadantes da cultura ris foram filtrados através de filtros de disco de membrana Supor de 0,2 μm (PALL, EUA). O sobrenadante foi concentrado para 1 mL usando uma coluna Vivaspin 20 MWCO 30.000 (GE Healthcare, UK), e a troca do tampão foi realizada três vezes com 19 mL de tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM, pH 7). A amostra final foi diluída para 10 mL usando tampão de ligação. A purificação começou com uma etapa de equilíbrio usando 10 mL de tampão de ligação. Após a injeção da amostra, a coluna foi lavada com 30 mL de tampão de ligação. A eluição foi realizada com 15 mL de tampão de eluição (0,1 M de glicina, pH 2,7), antes de adicionar 700 μL de tampão de neutralização (1 M de Tris, pH 9). A solução de proteína purificada foi trocada por tampão e concentrada usando uma coluna Vivaspin 6 MWCO 10.000 com tampão de acetato de sódio 50 mM (NaOAc, pH 5).

Desglicosilação por tratamento com Endo H

Purifid D2-BGL e amostras do sobrenadante da cultura foram desglicosilados com endoglicosidase H (NEB, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, para a desglicosilação de D2-BGL purificado, 2 μg de Pp D2-BGL ou Sc D2-BGL foram adicionados em 10 μL de solução de reação em Tampão de Desnaturação de Glicoproteína (NEB, EUA). Após aquecimento a 100 ° C por 10 min, a desglicosilação foi realizada com 0,4 μL de Endo H em GlycoBuffer 3 a 37 ° C por 1 h. Para a desglicosilação de amostras usadas na análise de Western blotting, 10 μL de sobrenadante de cultura ou D2-BGL purificado diluído em série (concentração original: 0,11 mg / mL) foram adicionados à solução de reação (volume total: 50 μL) contendo 0,5 μL de Endo H em GlycoBuffer 3. A reação foi realizada a 37 ° C durante 30 min.

Ensaios de atividade de celulase

Os ensaios de atividade da β-glucosidase foram realizados de acordo com os métodos descritos em nosso estudo anterior [20]. A reação foi testada em 5, 10 e 20 min para garantir que a medição está na faixa linear. Resumidamente, a atividade β-glucosidase foi determinada com pNPG ou celobiose como substrato em NaOAc 50 mM, pH 5. Para o pNo ensaio NPGase, a reação enzimática foi realizada com 100 μL de solução de enzima misturada com 100 μL de 4 mM pNPG a 55 ° C durante 5 min. Depois de adicionar 600 μL de Na 1 M2CO3 para interromper a reação, 200 μL da solução final foram transferidos para uma placa de 96 poços, e o OD405 valor foi medido usando o leitor de microplaca SynergyMx. As concentrações do produto foram determinadas com base em uma curva padrão estabelecida por meio de pDiluição em série NP. Para o ensaio de celobiase, 100 μL de solução enzimática foram misturados com 100 μL de 20 mM de celobiose e a reação foi realizada a 55 ° C por 10 min. A reação foi interrompida por inativação por calor a 100 ° C durante 10 min. As concentrações de glicose foram determinadas usando um YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer (Yellow Springs Instruments, EUA). Uma unidade de enzima (U) foi definida como 1 μmol de produto (isto é, pNP ou glicose) liberado por minuto.

A atividade total da celulase foi determinada com papel de filtro de 50 mg NO.1 (Whatman, UK). As concentrações do produto foram determinadas usando o método do ácido dinitrosalicílico (DNS) [39], e uma diluição em série de glicose foi empregada para estabelecer a curva padrão de açúcar redutor. Para o ensaio de papel de filtro (FP), 0,5 mL de solução de enzima foram misturados com 1 mL de tampão NaOAc (pH 5) contendo o papel de filtro, e a reação foi realizada a 55 ° C por 60 min. A reação foi interrompida pela adição de 3 mL de solução DNS, e a coloração foi realizada por aquecimento a 100 ° C por 5 min. O OD540 valor foi medido usando o leitor de microplaca SynergyMx. Uma unidade de papel de filtro (FPU) foi definida como 1 μmol de açúcar redutor liberado por minuto.

Ensaios de estabilidade de temperatura e pH

Soluções enzimáticas contendo 1,2 mg / L de D2-BGL purificado foram incubadas a 25–70 ° C por 4 h para ensaio de estabilidade de temperatura, e em pH 4–8 por 24 h para ensaios de estabilidade de pH. A atividade relativa foi determinada usando o ensaio de celobiase.

Cinética enzimática

As atividades específicas foram determinadas usando 0,15 μg de enzima purificada em 100 μL de solução de enzima (ou seja, concentração de enzima: 1,5 mg / L). o pO ensaio de NPGase foi realizado a 55 ° C por 2 min com 0,25-6 mM pNPG, e o ensaio de celobiase foi realizado a 55 ° C por 5 min com 0,625-100 mM de celobiose. A inibição da glicose foi determinada via pEnsaio de NPG na presença de 0, 5 ou 10 mM de glicose. Os parâmetros cinéticos Km, Vmax, Keu glicose e Keu substrato foram determinados usando os modelos de cinética enzimática integrados do Prism 8.3.0 (GraphPad Software Inc., EUA).

Extração de proteína intracelular

Proteínas intracelulares foram extraídas de pellets celulares de cultura de 3 dias usando YeastBuster Extraction Reagent (Merck, EUA). A extração foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 5 μL de reagente de extração e 0,05 μL de solução 100X Tris (hidroxipropil) fosfina (THP) por mg de célula (peso úmido) foram usados ​​para ressuspender o pellet celular. Depois de adicionar 25 U de Benzonase Nuclease, a solução foi incubada à temperatura ambiente durante 20 min sob agitação. As proteínas solúveis foram coletadas após concentração a 16.000 g a 4 ° C por 20 min, e a concentração de proteína foi determinada usando o Pierce Detergent Compatible Bradford Assay Kit (ThermoFisher Scientific, EUA).

Western blotting

As amostras de proteína foram separadas usando um gel de SDS-PAGE a 10%. O Western blotting foi realizado usando Amersham Hybond 0,2 μm de membrana de difluoreto de polivinilideno PVDF (GE Healthcare Life Science, Alemanha) e o sistema de células Mini Trans-Blot (Bio-Rad, EUA). Após a transferência a 100 V e 200 mA com a fonte de alimentação de eletroforese PowerPac 1000 (Bio-Rad, EUA) por 1,5 h em gelo, a membrana de PVDF foi imersa durante a noite a 4 ° C em uma solução de bloqueio contendo 30 mL de solução salina tamponada com Tris (TBS Omics Bio, Taiwan), 1,5 g de leite em pó desnatado e 0,05% de Tween 20 (JTBaker, EUA). Os anticorpos anti-D2-BGL do soro foram então adicionados a uma diluição de 1: 30.000 na solução de bloqueio, e a imersão continuou à temperatura ambiente por mais 1 h. A membrana foi lavada três vezes com 30 mL de TBS-T (TBS e 0,05% Tween 20), em seguida, a membrana foi imersa em 10 mL de TBS-T contendo 0,1 g de leite em pó desnatado e anti-coelho IgG HRP (Perkin Elmer, EUA 1 : 10.000). Após imersão por 1 h, a membrana de PVDF foi lavada três vezes com TBS-T, e a presença de D2-BGL foi revelada por quimioluminescência usando Western Lightning ECL Pro (Perkin Elmer, EUA). As quantidades de proteínas foram quantificadas usando o software de imagem ImageJ [40].

Reações quantitativas em cadeia da polimerase (qPCR)

RNA total de P. pastoris as células coletadas após incubação de 24 h a 30 ° C foram isoladas usando TRIzol Reagent (ThermoFisher Scientific, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Um micrograma de RNA total tratado com DNase I (Invitrogen, EUA) foi usado para gerar cDNA usando SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, EUA). A solução de reação qPCR foi preparada com Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA), e a amplificação foi realizada usando o sistema QuantStudio ™ 12 K Flex (Applied Biosystems, EUA). o P. pastoris gene da actina (ATO 1 GenBank: AF216956.1) foi usado como um gene de referência, e o método - 2 ΔΔCT foi aplicado para determinar a expressão relativa de D2-BGL e genes relacionados à resposta de proteína não dobrada (UPR) HAC1, KAR2, PDI1, ERO1 e CNE1 (com primers listados no Arquivo Adicional 1: Tabela S2).

Ensaios de sacarificação de biomassa

A biomassa pré-tratada com ácido foi fornecida pelo Instituto de Pesquisa de Energia Nuclear (Taoyuan, Taiwan). O teor de celulose no bagaço de cana pré-tratado e na palha de arroz foi estimado em 44,7% e 48,17%, respectivamente. Os ensaios de sacarificação foram realizados com 1, 2, 5 ou 7,5% de bagaço de cana-de-açúcar (p / v) em 1 mL de solução de reação em um tubo Safe-Lock de 2 mL (Eppendorf). A solução de reação foi preparada, por 1% de biomassa , com 10 μL de Tween 80, 0,06 FPU de C1.5L (Sigma-Aldrich, EUA) e 0,3 μg de WT D2 ou Mut M em NaOAc 50 mM (pH 5). A sacarificação foi ensaiada a 50 ° C durante 72 h e a 250 rpm. A concentração de glicose foi determinada usando o analisador de glicose YSI 2700.


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Resumo

Na evolução experimental, os cientistas desenvolvem organismos no laboratório, normalmente desafiando-os a novas condições ambientais. Qual a melhor forma de desenvolver uma característica desejada? O desafio deve ser aplicado de forma abrupta, gradual, periódica, esporadicamente? Deve-se aplicar mutagênese química, e as cepas com alta taxa de mutação inata evoluem mais rápido? Quais são os tamanhos populacionais ideais de populações em evolução? Existem inúmeras estratégias, além daquelas que podem ser expostas por laboratórios individuais. Portanto, organizamos um desafio comunitário, Evolthon, no qual alunos e cientistas de diferentes laboratórios foram convidados a evoluir Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae para um estresse abiótico - baixa temperatura. Cerca de 30 participantes de todo o mundo exploraram diversos regimes ambientais e genéticos de evolução. Após um período de evolução em cada laboratório, todas as linhagens de cada espécie competiram entre si. Na levedura, as estratégias de maior sucesso foram aquelas que utilizaram o acasalamento, ressaltando a importância do sexo na evolução. Em bactérias, a cepa mais apta usou uma estratégia baseada na exploração de diferentes taxas de mutação. Diferentes estratégias exibiram níveis variáveis ​​de desempenho e estabilidade em desafios e condições adicionais. Este estudo, portanto, revela princípios de regimes evolutivos experimentais eficazes e pode ser útil também para o desenvolvimento biotecnológico de novas cepas e para a compreensão de estratégias naturais em corridas armamentistas evolutivas entre espécies. Evolthon constitui um modelo de exploração científica baseada na comunidade que incentiva a criatividade e a cooperação.

Citação: Kaminski Strauss S, Schirman D, Jona G, Brooks AN, Kunjapur AM, Nguyen Ba AN, et al. (2019) Evolthon: Um esforço da comunidade para evoluir a evolução do laboratório. PLoS Biol 17 (3): e3000182. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000182

Editor Acadêmico: Laurence D. Hurst, University of Bath, REINO UNIDO

Publicados: 29 de março de 2019

Direito autoral: © 2019 Kaminski Strauss et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.

Financiamento: YP foi apoiado pelo Minerva Center for Live Emulation de Genome Evolution AZ 5746940763, TD foi apoiado por SPP1819 Adaptação rápida Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Abreviações: DREAM, Diálogo para Avaliações e Métodos de Engenharia Reversa iGEM, OD internacional de máquinas geneticamente modificadas, densidade óptica

Proveniência: Não comissionado externamente revisado por pares.


Evolução das ferramentas de mutagênese de plantas: uma mudança de paradigma de edição aleatória para edição de genoma direcionada

As mutações são a base de toda variação genética, e o melhoramento clássico de plantas tem explorado o poder das mutações naturais no desenvolvimento de variedades de alto rendimento. Desde a descoberta de mutagênicos químicos e de radiação, vários métodos de mutagênese têm sido empregados efetivamente no melhoramento molecular de plantas para estudar as funções dos genes, para identificar mutações genéticas cruciais para conferir novas características às plantas. Aqui, revisamos o desenvolvimento histórico e o uso de ferramentas de mutagênese de plantas, principalmente mutagênicos físicos e químicos, métodos baseados em PCR, inserções de T-DNA, inserções de transposon, interferência de RNA e meganucleases. A característica única das meganucleases, como o sistema CRISPR / Cas, é o controle das alterações de DNA direcionadas ao local. Destacamos os avanços recentes nas ferramentas de mutagênese baseadas em CRISPR / Cas que permitem várias aplicações de manipulações genéticas, incluindo knock-out de gene, substituição de gene, substituições de base direcionadas e diversificação de nucleotídeos de locais definidos pelo usuário. Além disso, revisamos o uso de ferramentas de mutagênese baseadas em CRISPR / Cas na agricultura.

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Materiais e métodos

Plasmids, Strains, Reagents, and Growth Media. O plasmídeo "presa" pGAD424-SRC1 contendo o coativador coativador 1 (SRC-1) do receptor de esteróide de comprimento total foi construído conforme descrito na ref. 20 e foi um gentil presente de Benita S. Katzenellenbogen (Universidade de Illinois). Os aminoácidos 312-595 contendo o domínio LBD e F de hERα foram inseridos a jusante do domínio de ligação ao DNA Gal4 no plasmídeo pBD-Gal4-Cam "isca" (Stratagene), conforme descrito na ref. 21. A cepa de dois híbridos de levedura (Y2H) YRG2 (Stratagene) foi usada para este trabalho. A clonagem de construções mutantes hERα LBD no vetor de expressão de mamífero pCMV5 foi descrita na ref. 21. O meio rico usado para o crescimento de células de levedura foi meio de extrato de levedura-peptonedextrose mais adenina (22), enquanto o meio mínimo foi meio de eliminação completo sintético (SC) (23) sem os aminoácidos apropriados. Taq A DNA polimerase foi obtida da Promega, e PfuTurbo A DNA polimerase foi adquirida à Stratagene. 4,4'-Dihidroxibenzil foi sintetizado como descrito na ref. 24. A menos que especificado de outra forma, todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich.

Triagem baseada no sistema Y2H. Transformantes de placas de biblioteca de mutagênese de saturação de local individual e placas de biblioteca de PCR propensas a erros foram colhidos com palitos de dente estéreis e incubados durante a noite (≈16–20 h) a 30 ° C em placas de 96 poços de fundo redondo (Evergreen Scientific, Los Angeles) contendo 50 μl de meio líquido mínimo SC-Leu-Trp em cada poço. Como controle, um poço em cada placa de microtitulação foi inoculado com uma colônia de levedura que expressa a construção parental hERα LBD. Após esta incubação durante a noite, 250 μl de H duplamente destilado estéril2O foi adicionado a todos os poços e 5 μl de cada cultura diluída foram então transferidos para os poços correspondentes de duas placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano estéreis (Rainin Instruments) contendo 200 μl de meio SC-Leu-Trp-His com um concentração apropriada de qualquer ligante alvo (DHB) ou E2. As concentrações de ligando apropriadas para este rastreio foram escolhidas com base na resposta da construção hERα LBD parental. Para cada rodada de triagem, uma concentração de DHB foi selecionada na qual o construto hERα LBD parental responde fracamente ou nada, enquanto a concentração de E2 para a triagem foi selecionado de forma que a construção parental responda moderadamente. Estas placas de microtitulação contendo ligante foram incubadas a 30 ° C por 24 h, após as quais foram inspecionadas visualmente para identificação de mutantes com resposta reforçada para o ligante alvo (densidade celular mais alta do que o controle mutante parental) e resposta enfraquecida para E2 (menor densidade celular do que os pais). Cento e noventa mutantes foram rastreados por biblioteca de mutagênese de saturação usando esta abordagem, com 95 variantes da biblioteca e uma levedura expressando uma construção parental sendo usada como um controle por placa de microtitulação.

Ensaio de resposta à dose de ligante. Culturas durante a noite das células de levedura apropriadas foram diluídas em meio mínimo SC-Leu-Trp-His para uma OD final600 de 0,002. Alíquotas (190 μl) desta cultura diluída foram adicionadas aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano estéril (Rainin Instruments), seguido pela adição de 10 μl de ligante apropriadamente concentrado consistindo em uma diluição de 50 vezes de estoque de etanol solução em mídia mínima SC-Leu-Trp-His. Estas placas de microtitulação foram incubadas a 30 ° C por 24 h, após o que as culturas foram misturadas por pipetagem e OD600 as leituras foram feitas usando um leitor de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices).

Mammalian Transfection and Luciferase Assay. Os métodos usados ​​para cultura de células, transfecção e desempenho do ensaio de luciferase foram descritos na ref. 25

Materiais e métodos de apoio. A criação de bibliotecas, clonagem e transformação de bibliotecas e modelagem molecular são descritas em Materiais e métodos de apoio, que é publicado como informação de apoio no site da PNAS.


Figura 1

Figura 1. A modelagem matemática sugere a possibilidade de gerar comportamento biestável com os circuitos de feedback positivo inicial e evoluído. a) Esquemático do PFL sob o controle de um sinal OHHL (S). O fator de transcrição LuxR (R), ao se ligar a S, forma um complexo C ativado que forma um homodímero e se liga ao promotor PluxI para ativar a expressão LuxR, efetuando um feedback positivo. Este sistema pode ser modelado por duas equações adimensionais: dR / dτ = α (C n / 1 + C n)) - βR - kSR + α0 dC / dτ = kSR– C. Aqui, S, R e C nas equações representam as concentrações de OHHL, LuxR e complexo C, respectivamente. A síntese de R é modelada por uma única função de Hill, agrupando a transcrição e a tradução. O coeficiente de Hill é definido como 2 para refletir a dimerização rápida de C e a ligação do dímero a PluxI . α é a constante da taxa de síntese de R devido ao feedback. α0 é a constante de taxa de síntese basal ou constitutiva de R. β é a constante da taxa de degradação de R. k é a constante de ligação de R com S. Para tornar o modelo adimensional, o tempo é dimensionado em relação à constante de taxa de decaimento de C e as concentrações são dimensionadas em relação ao limite de meia ativação de C. Valores de parâmetros biologicamente viáveis ​​são usados ​​para bifurcação análise, com valores de base de β = 5, α0 = 1, e k = 1. b) Os comportamentos dinâmicos do PFL são determinados por α. Quando α é maior que o valor crítico (linha tracejada azul), o sistema exibe biestabilidade (inserção superior). Para cada α, as duas linhas vermelhas definem os limites da região biestável em termos de S.

Mudanças genéticas biestáveis ​​controladas por feedback positivo foram examinadas experimentalmente em alguns contextos celulares (19, 20). Os dados atuais na ref 16, que foram medidos ao nível da população, não podem indicar se o sistema é biestável. Análises adicionais, examinando o comportamento de uma única célula e detectando a presença de histerese, são necessárias para elucidar essas dinâmicas interessantes. Se este se tornar o objetivo do projeto dos autores, novas rodadas de evolução no LuxR, outros componentes do circuito ou o circuito podem ajudar.


Assista o vídeo: Mutagênese (Dezembro 2021).