Em formação

Nomenclatura de substratos para síntese de DNA


Eu li em meus livros escolares que tanto o desoxirribonucleosídeo trifosfato quanto o desoxinucleotídeo trifosfato são usados ​​na Replicação de DNA como substratos.

No entanto, não está claro para mim se os termos se referem à mesma molécula que usamos o termo nucleotídeo e o outro usa nucleosídeo. O que me confunde é que o nucleosídeo é um composto com uma base purina ou pirimidina e um açúcar e um nucleotídeo é o mesmo, mas com a inclusão de um grupo fosfato.

É possível que o “desoxinucleotídeo trifosfato“ seja usado na replicação artificial do DNA como na PCR, e o “desoxirribonucleosídeo trifosfato“ seja o substrato natural para a replicação do DNA dentro das células?


Resumo

Os nomes químicos sistemáticos de muitas moléculas biológicas importantes são muito longos para serem escritos rotineiramente na íntegra e, em qualquer caso, eram historicamente precedidos por formas abreviadas que geralmente enfatizavam as características distintivas importantes para aqueles que estudavam seu metabolismo. Assim, como o pôster aponta, uma molécula como o dATP (imagem abaixo) tem uma estrutura de base- (desoxi) açúcar-fosfato (s) e pode ser denominada um desoxinucleotídeo. Adicionando trifosfato fornece a informação adicional de que existe mais de um fosfato. Uma combinação de açúcar-base (desoxirribose) é, como afirma o pôster, um desoxinucleosídeo, mas estendendo este nome para trifosfato de desoxirribonucleosídeo, um indica a adição de fosfatos, de modo que se está, por definição, descrevendo um desoxinucleotídeo. A referência ao ribonucleosídeo indica que o açúcar é ribose, especificação ausente na outra definição. No entanto, na prática, esses dois termos são usados ​​para descrever a mesma entidade, que pode ser um pouco mais completamente descrita como trifosfato de 2'-desoxirribonucleosídeo (para indicar a posição da mudança redutiva). Essa resposta tenta explicar com precisão os aspectos da nomenclatura que provavelmente são importantes para o bioquímico ou biólogo molecular.

Isenção de responsabilidade

Pode-se considerar que a questão original não representa um problema biológico, e alguém pode argumentar em fechá-la por conta disso. No entanto, devido à própria natureza da nomenclatura trivial, é difícil para aqueles sem experiência no uso em um campo encontrar a resposta. Ao responder, tentei ampliar o escopo para incluir os aspectos da estrutura que sinto serem mais prováveis ​​de estudantes de biologia.

Responder

É conveniente começar com trifosfatos de ribonucleosídeo (em vez de trifosfatos de desoxirribonucleosídeo), e eu escolhi um exemplo específico na molécula que é geralmente conhecida como ATP:

Nomes alternativos para este trifosfato de ribonucleosídeo, em ordem decrescente de complexidade, incluem:

  1. [[(2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-aminopurin-9-il) -3,4-dihidroxioxolan-2-il] metoxi-hidroxifosforil] fosfono hidrogenofosfato
  2. 9-β-D-ribofuranosil adenina 5'-trifosfato
  3. adenosina 5'-trifosfato
  4. trifosfato de adenosina
  5. ATP

O que nos interessa são os três componentes da molécula: uma base purina (adenina), um açúcar (ribose) e três fosfatos ligados. Isso não se reflete na nomenclatura química (1), então vamos nos concentrar na, embora raramente usada, nomenclatura bioquímica (2).

  • o '9' especifica a posição do anel de adenina que está ligado ao açúcar. Isso não é de particular interesse no contexto da questão. (A numeração do anel é, no entanto, relevante para descrever diferenças entre ou modificações das bases de purina e pirimidina1.)
  • o D-ribofuranosil é uma forma de ribose (Vejo abaixo). O 'D' indica que é enantiômero D-ribose em vez da alternativa, L-ribose. No entanto, como todos os açúcares naturais são 'D', isso geralmente é omitido (embora as discussões sobre porque todos os açúcares naturais são 'D' abundantes2).
  • Ribofuranosil indica que a ribose está na forma de anel hemiacetal de cinco membros (em vez da cadeia linear ou do anel piranose de seis membros), mas este é sempre o caso em nucleosídeos e, portanto, não é de particular interesse.
  • o 5' especifica a posição do anel de açúcar ao qual os fosfatos estão ligados, o primo (') indicando que a numeração é para o anel de açúcar (não a da base). Isso é importante, pois é relevante para a ligação na ligação fosfodiéster (assimétrica) feita ao 3'-OH:

A imagem acima é de DNA, mas antes de abordarmos a nomenclatura ali, gostaríamos de ressaltar:

  • A designação α, β, γ comum das três ligações fosfo-éster. Isso é muito relevante para a formação de polinucleotídeos (DNA e RNA) a partir de seus substratos, e em geral para a utilização da energia livre a hidrólise dessas ligações para outros processos.3.

Finalmente chegamos a uma estrutura de interesse para o autor do pôster, dATP:

  • Na designação, 2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato, o 2'-desoxi indica que é a posição 2 no anel de ribose (') que teve o oxigênio removido (desoxi), ou seja, OH é reduzido a H. Embora seja de conhecimento comum, é importante que o aluno novo no assunto entenda isso, como se foi a posição 3 'que foi reduzida, não poderia formar as ligações fosfodiéster do DNA. E é relevante em muitos outros contextos. Por exemplo, o método de terminação de cadeia de sequenciamento de DNA usa 2 ', 3'-didesoxi nucleotídeos para inibir a formação de tais ligações4, a única diferença entre a ribose e a desoxirribose nos permite entender o profundo efeito sobre a suscetibilidade do RNA à hidrólise alcalina na natureza5, e certas moléculas de RNA são hidroximetiladas nesta posição.

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Espectrometria de massa e metabolômica quantitativa baseada em espectroscopia de NMR

Análise de coenzimas e antioxidantes no sangue total, tecidos e células

Coenzimas como coenzima A, acetil coenzima A, coenzimas redox celulares: NAD + (dinucleotídeo de adenina de nicotinamida oxidado), NADH (dinucleotídeo de adenina de nicotinamida reduzido), NADP + (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato de nicotinamida oxidado) e NADPH coenzimas de energia: ATP (adenosina trifosfato), ADP (adenosina difosfato) e AMP (adenosina monofosfato) e antioxidantes: GSSG (glutationa oxidada) e GSH (glutationa reduzida) são fundamentais para o funcionamento de praticamente todas as células vivas. O maior interesse em analisar essas moléculas decorre de seu papel cada vez mais percebido na saúde humana, bem como em doenças importantes. Atualmente, a análise dessas coenzimas em uma etapa usando MS é um desafio devido a vários fatores, incluindo supressão de íons, na fragmentação da fonte e diferenças de massa unitária entre muitas coenzimas. 111 O desafio mais crítico, que não está relacionado com o método analítico, é a natureza extremamente instável das coenzimas - muitas coenzimas escapam por completo da detecção ou seus níveis são atenuados significativamente dependendo do procedimento de colheita e extração usado. Desenvolvimentos metodológicos recentes na coleta de amostra, processamento e análise de NMR aliviaram esses grandes desafios e permitiram sua análise em uma etapa no sangue total, tecido e células 111-114 (Fig. 5). As identidades de coenzimas e antioxidantes nessas amostras foram estabelecidas combinando técnicas 1D / 2D NMR, bancos de dados de mudanças químicas, medições de pH e, finalmente, aumento com compostos autênticos. É importante ressaltar que, além das coenzimas, os novos métodos permitem a análise quantitativa de um vasto pool de outros metabólitos usando o mesmo espectro de 1D NMR, sem a necessidade de experimentos adicionais. Isto é importante uma vez que, por exemplo, a metabolômica convencional do sangue emprega soro ou plasma. No entanto, as concentrações de coenzimas são muito baixas no soro ou plasma, enquanto coenzimas e antioxidantes importantes estão presentes nas células vermelhas e brancas do sangue e, portanto, no sangue total. O método relatado pode medir simultaneamente as coenzimas e antioxidantes, além dos quase 70 metabólitos que se mostraram quantificados no soro / plasma. 110

Fig. 5. Porções de espectros de RMN de 1 H de 800 MHz típicos de extratos de (A) plasma sanguíneo, (B) sangue total e (C) tecido de coração de camundongo. É indicada a identificação de redox e coenzimas energéticas e antioxidantes no extrato de sangue total / tecido. NAD + , dinucleotídeo de nicotinamida adenina, oxidado NADH, dinucleotídeo de nicotinamida adenina, reduzido NADP + , fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina, oxidado NADPH, fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina, oxidado ATP, trifosfato de adenosina ADP, difosfato de adenosina AMP, monofosfato de adenosina GSH, glutationa, reduzida GSSG, glutationa, oxidada. Observação: nenhum destes compostos foi detectado no plasma sanguíneo.


Visão estrutural da especificidade do substrato da DNA polimerase μ

A DNA polimerase μ (Pol μ) é uma enzima da família X com especificidade de substrato única que contribui para seu papel especializado na união de extremidades de DNA não homólogo (NHEJ). Para investigar a especificidade incomum do substrato de Pol μ, descrevemos a estrutura cristalina de 2,4 Å do domínio da polimerase de Pol μ de murino ligado ao DNA com lacuna com um dNTP correto no sítio ativo. Esta estrutura revela interações de substrato com cadeias laterais em Pol μ que diferem de outros membros da família X. Por exemplo, uma única substituição de aminoácido, H329A, tem pouco efeito na síntese dependente do modelo por Pol μ a partir de um terminal de iniciador emparelhado, mas reduz a síntese independente do modelo e dependente do modelo durante NHEJ de intermediários cujas extremidades 3 'carecem de complementar nucleotídeos da fita modelo. Estes resultados fornecem informações sobre a especificidade do substrato e funções diferentes de quatro polimerases de DNA da família X de mamíferos intimamente relacionadas.


Discussão

Mostramos que a avaliação baseada em eDNA oferece uma resolução mais precisa da dinâmica da biodiversidade espacial e temporal, em comparação com a amostragem tradicional. Além disso, os padrões de biodiversidade derivados de eDNA e amostragem tradicional mostraram tendências temporais gerais semelhantes em riqueza e diversidade funcional. A riqueza da biodiversidade localizada não mostrou filtragem ambiental entre os tipos de uso da terra, enquanto a partição da diversidade beta mostrou diferenças claras na dinâmica espaço-temporal da biodiversidade. Especificamente, as condições ambientais regionais foram o principal impulsionador da mudança da biodiversidade e os efeitos do uso da terra foram menos pronunciados. É importante ressaltar que mostramos que avaliações de biodiversidade baseadas em eDNA fornecem relações espaciais e temporais significativas. Nossa avaliação da biodiversidade ambiental também inclui o aumento da capacidade de detectar táxons indicadores importantes, particularmente Chironomidae e táxons EPT, que são difíceis de amostrar diretamente para muitos dos locais, ou em diferentes momentos do ano. Também mostramos que a dinâmica temporal-espacial funcional derivada do eDNA pode fornecer informações claras sobre como os ecossistemas podem ser gerenciados com eficácia.

Como esperado, a biodiversidade foi maior durante os meses de primavera e verão para ambos os métodos de amostragem. A dinâmica da riqueza de gêneros diferiu entre o eDNA e os métodos tradicionais entre os tipos de uso da terra, mas não entre as estações onde a diversidade derivada do eDNA era consistentemente maior do que a diversidade tradicional. É importante ressaltar que encontramos uma maior diversidade derivada de eDNA em comparação com os métodos tradicionais para todos os sites. Embora vários estudos tenham mostrado aumento da biodiversidade observável usando eDNA em relação aos métodos tradicionais 17,29, eles se concentraram predominantemente em peixes, enquanto os estudos focados em macroinvertebrados variam ligeiramente, com a maioria mostrando maior biodiversidade de eDNA 16,45, mas também alguns com menor biodiversidade de eDNA 46, em comparação à amostragem tradicional. A disparidade na diversidade de macroinvertebrados pode resultar da maior dificuldade em projetar um primer adequado para capturar toda a gama de diversidade associada a macroinvertebrados, no entanto primers de eDNA mais eficientes estão sendo desenvolvidos ativamente 47. Além disso, em todos os tipos de uso da terra, pastagens ácidas e locais de charnecas tinham maior diversidade de eDNA em comparação com locais agrícolas, urbanos ou florestais. Os resultados do monitoramento de eDNA estavam mais de acordo com a expectativa de que o uso da terra não modificado deveria conter uma maior diversidade biológica, particularmente no que diz respeito à maior diversidade encontrada em charnecas e locais de pastagens ácidas, que eram as áreas menos modificadas na bacia hidrográfica. A amostragem tradicional, no entanto, sugeriu maior biodiversidade em locais agrícolas e urbanos, em comparação com charnecas ou pastagens ácidas. A menor biodiversidade observada com a amostragem tradicional nos locais menos perturbados é provavelmente devido, em parte, aos tipos de substrato. As charnecas e locais de pastagens ácidas são dominadas por grandes rochas ou sedimentos soltos, que não são substratos ideais ao realizar métodos de amostragem de rede de chute tradicionais, que funcionam melhor com substrato de cascalho (riqueza positiva significativa com cobertura de cascalho aumentada p = 0,007), e pode levar à subamostragem dos táxons locais 41. Estudos anteriores sugeriram que o transporte de eDNA de comunidades a montante pode aumentar a biodiversidade amostrada 42,48. Não há, no entanto, nenhuma indicação clara de que a paisagem ou bacia hidrográfica ao redor desses locais seja mais diversa, já que os locais de charnecas em particular estão em altitudes mais elevadas e mais isolados em comparação com os outros locais de uso do solo. Com o transporte a montante limitado ao longo do sistema de estudo, o aumento da detecção da biodiversidade é mais provavelmente um efeito do eDNA em relação à metodologia tradicional do que a ecologia proposta do eDNA. Como recomendação, a amostragem de eDNA é provavelmente mais benéfica em geral em comparação com a amostragem tradicional para detectar maior diversidade biológica, o que tem implicações diretas na detecção de grupos de biomonitoramento tradicionalmente mais difíceis de identificar, como Chironomidae ou Diptera. Além disso, o uso de eDNA é altamente benéfico para amostragem em locais tradicionalmente difíceis de amostrar, incluindo tipos de substrato não tradicionais que podem introduzir distorção quando metodologias de amostragem tradicionais ou em massa são usadas.

A biodiversidade do DNA ambiental foi maior para a biodiversidade geral e todos os outros subconjuntos da biodiversidade, incluindo EPT, quironomídeos e diversidade funcional (Figs. 3 e 4). O maior aumento na resolução da biodiversidade de eDNA foi em grupos tradicionalmente difíceis de identificar, que de outra forma não seriam observáveis ​​usando métodos derivados taxonômicos. O mais revelador é que os dados de eDNA retratam com mais precisão os padrões do ciclo de vida de Chironomidae em comparação com a amostragem tradicional. Especificamente, a variação sazonal na riqueza derivada de eDNA segue os padrões de emergência larval esperados, que aumentam durante a primavera e o verão, e diminuem continuamente durante o outono e inverno 28, em contraste com a amostragem tradicional que foi incapaz de detectar esta mudança sazonal, possivelmente devido à dificuldade na observação tradicional de Chironomidae. Da mesma forma, a emergência de EPT foi detectável tanto por eDNA quanto por amostragem tradicional, já que Ephemeroptera geralmente emerge durante a primavera, enquanto Trichoptera emerge em épocas mais variáveis ​​ao longo do ano.

A dinâmica espaço-temporal mostrou que a biodiversidade foi impulsionada pela dinâmica de rotação regional e menos afetada pela especialização ambiental localizada ou aninhamento (Figs. 5 e 6). O aninhamento entre os locais não foi significativo com nenhum dos métodos, sugerindo que as diferenças na biodiversidade entre os locais não eram devidas à classificação ambiental localizada, conforme nossas expectativas iniciais. O principal impulsionador da heterogeneidade observada na biodiversidade entre locais foi em grande parte devido à rotação sazonal, provavelmente impulsionada pelos eventos de alta perturbação que ocorrem historicamente na região do estudo 49, ou devido a efeitos muito fortes de interações bióticas 8. Houve maior renovação de eDNA observada em locais urbanos e florestais, o que foi atribuído a um pH mais alto e menor cobertura de musgo e rocha em comparação com outros locais. A rotatividade em EPT e Chironomidae mostrou tendências semelhantes em comparação com a rotatividade geral, em que as diferenças na biodiversidade entre os locais foram significativamente atribuídas à substituição sazonal de gêneros ao longo do gradiente ambiental, que foi predominantemente ligada ao pH e tipo de substrato (Fig. Suplementar 1). Por outro lado, a rotatividade foi maior em locais de charnecas, devido ao aumento da cobertura de rochas e musgos. A disparidade na relação observada entre os métodos é provavelmente impulsionada em grande parte pelos próprios métodos e os valores de riqueza subjacentes para cada método, conforme mencionado acima. No geral, tanto a rotatividade tradicional quanto a baseada em eDNA sugerem diferenças sazonais dominadas pela rotatividade na biodiversidade, que podem ser atribuídas à adaptação (histórica) das comunidades às condições regionais 50. A biodiversidade em todo o sistema é mais provavelmente um produto de efeitos fundadores e colonizadores frequentes, resultantes de padrões de perturbação frequentes e da incapacidade dos locais de estabelecer comunidades de interação de longo prazo 51,52.

A diversidade funcional foi amplamente dominada por coletores alimentadores, indicando que o conjunto de biodiversidade regional é impulsionado por matéria orgânica particulada fina (FPOM), também conhecida como seston 53,54. Dois fatores principais contribuem para o alto driver FPOM em toda a área de estudo. Primeiro, a ampla entrada de fezes da pecuária que cobre toda a bacia hidrográfica. Além disso, para locais de terras altas onde a agricultura é menos prevalente, as charnecas produzem uma grande quantidade de FPOM 55. As entradas combinadas de FPOM de pântanos e ambientes agrícolas / urbanizados criam um sistema FPOM regional, homogeneizando o habitat funcional da região como um todo. Considerando que o efeito charneca é provavelmente limitado a certos locais de cabeceira neste estudo, a diferença de qualidade em FPOM gerado a partir de fontes agrícolas vs charnecas provavelmente desempenha um papel nas diferenças de diversidade vistas entre locais onde os coletores dominam em geral 39,53. Mudanças sazonais em características funcionais foram observadas com eDNA, mas não com métodos tradicionais. Isso se reflete na capacidade do eDNA de detectar mais grupos funcionais em comparação com os métodos tradicionais, particularmente no que diz respeito a Diptera, incluindo Chironomidae e Simuliidae (ou seja, moscas pretas), que são grupos coletores importantes que são fortemente afetados por mudanças na temperatura 55. Da mesma forma, a avaliação funcional do eDNA indica uma mudança na funcionalidade da pastora com a estação, seguindo de perto as expectativas de disponibilidade do perifíton, que é um fator chave para a atividade da pastora 56. A homogeneidade na diversidade funcional entre os locais de uso da terra, tanto para o eDNA quanto para os métodos tradicionais, indicou ainda que a filtragem ambiental não era o principal fator para a diferença de biodiversidade entre os locais. Uma mensagem importante da avaliação da diversidade funcional neste estudo, em vez de simplesmente depender da variação na riqueza, é que essas descobertas apontam para uma estratégia de gerenciamento clara para aumentar a diversidade em todo o sistema. Especificamente, a biodiversidade regional se beneficiaria com o aumento do habitat para grupos funcionais de coletores por meio de uma gestão melhorada da floresta de folha larga local e práticas agrícolas para aumentar o material de alimentação grossa em locais de cabeceira chave, o que aumentaria a estabilidade geral do ecossistema da região, aumentando a heterogeneidade ambiental.

Uma implicação mais ampla decorrente deste estudo é a sugestão de que o eDNA pode revelar uma resolução de diversidade muito maior em comparação com as abordagens tradicionais e pode permitir vários níveis de análises a partir de um único conjunto de dados. O benefício de comparar descobertas tradicionais com análises baseadas em eDNA, que podem ser analisadas usando abordagens padronizadas, é imensamente valioso e ajudará a evitar vieses não intencionais introduzidos de protocolos tradicionais de estudo cruzado. No geral, nossos resultados mostram que o eDNA é um método de pesquisa mais eficaz para amostrar macroinvertebrados e fornece indicações mais claras dos efeitos sazonais e ambientais em vários níveis de diversidade em comparação com os métodos tradicionais. Além disso, fornecemos uma avaliação chave da dinâmica da biodiversidade regional, que atualmente está sub-representada na literatura. Especificamente, mostramos que o aumento da resolução da avaliação da biodiversidade baseada em eDNA separa efetivamente a dinâmica espaço-temporal e a dinâmica da biodiversidade localizada, o que aqui mostra a importância das estratégias de manejo regionais sobre as localizadas. A determinação de tais fatores regionais permite uma gestão biológica eficaz, em que o controle de enchentes, em vez de alterar as práticas atuais de uso da terra, tem maior probabilidade de ter um impacto maior sobre a biodiversidade em locais impulsionados por perturbações. Finalmente, ao utilizar a avaliação da diversidade funcional, mostramos uma razão clara para o surgimento da composição da comunidade. Capacitado por eDNA metabarcoding e síntese ecológica apropriada, nós fornecemos um meio mais valioso para descrever a biodiversidade do que simplesmente contar unidades individuais únicas sem ligação com o que os números significam em escalas ecológicas e ecossistêmicas.


5.E: Replicação de DNA I: Enzimas e Mecanismo (Exercícios)

Imagine que você está investigando a replicação de uma espécie bacteriana chamada B. mulligan. A bactéria é cultivada por várias gerações em meio contendo um rótulo de alta densidade, [15 N] NH4Cl. As bactérias são então transferidas para meio contendo densidade normal [14 N] NH4Cl. O DNA é extraído após cada geração e analisado em um gradiente de CsCl. A partir dos resultados mostrados abaixo, qual é o modo de replicação em B. mulligan? Explique sua conclusão.

Questão 5.9

Quantas voltas devem ser desenroladas durante a replicação do E. coli cromossoma? O cromossomo contém 4,64 x 106 pares de bases.

Questão 5.10

Quais dos comentários a seguir sobre fragmentos de Okazaki são verdadeiros ou falsos? Fragmentos de Okazaki:

  1. são segmentos curtos de DNA recém-sintetizado.
  2. são formados por síntese na fita principal de DNA.
  3. têm um pequeno trecho de RNA, ou uma mistura de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, em sua extremidade 5 '.
  4. são responsáveis ​​pela síntese geral de uma fita de DNA na direção 3 'para 5'.

Questão 5.11.

Os seguintes resultados experimentais são de A. Sugino e R. Okazaki (1972) @Mechanisms of DNA Chain Growth VII. Direção e taxa de crescimento de cadeias curtas de DNA nascentes de T4 & quot J. Mol. Biol. 64: 61-85.

uma. E. colias células foram infectadas com o bacteriófago T4 e depois resfriadas a 4 o C para diminuir a taxa de replicação. A replicação do DNA nas células infectadas foi marcada por pulso com [3H] -timidina (a) ou [3H] -timina (b) por 5 seg (círculos pretos), 30 seg (círculos abertos com linha vertical), 60 seg (círculos abertos com ponto) ou 300 seg (círculos abertos). A marcação de pulso foi interrompida com cianeto de potássio e gelo, e o DNA foi extraído, desnaturado em NaOH e separado em um gradiente de sacarose alcalino. As frações do gradiente foram coletadas e testadas quanto à quantidade de 3 H no DNA (como material que se ligou a um filtro após a lavagem em (a) e como material insolúvel em ácido em (b)). O valor de sedimentação em Svedbergs (S) é dado ao longo do eixo x, o material de sedimentação mais rápido está à direita. O que esses dados dizem sobre os tamanhos do DNA nascente (recém-sintetizado) nos vários tempos de marcação de pulso?

(b) Sugino e Okazaki usaram um método para quebrar as cadeias nascentes curtas isoladas (fragmentos de Okazaki completos) aleatoriamente e recuperar apenas os oligonucleotídeos das extremidades 5 & Atilde & tímidas. Eles descobriram que em tempos de marcação muito curtos (por exemplo, 5 segundos) a [3H] timidina não estava nas extremidades 5 'do DNA (portanto, era interna e nas extremidades 3'). Após tempos de marcação mais longos, a [3H] timidina foi encontrada nos oligonucleotídeos na extremidade 5 '. O que você conclui é a direção do crescimento da cadeia das cadeias nascentes? Explique sua lógica.

Questão 5.12

Cobrimos dois experimentos do laboratório de Okazaki usando marcação de pulso para aumentar o tempo para seguir a síntese de novo DNA. Como você projetaria um experimento de perseguição de pulso para monitorar não apenas a produção inicial de fragmentos de Okazaki, mas também sua incorporação em moléculas maiores de DNA?

Questão 5.13

Quais enzimas, substratos e cofatores são usados ​​em comum e quais são distintos para a síntese de fitas principais e fitas retardadas de DNA na forquilha de replicação de E. coli?

Questão 5.14

Qual subunidade ou complexo dentro E. coli A holoenzima da DNA polimerase III tem cada uma das seguintes funções?

  1. Catalisa a polimerização 5 'a 3' do novo DNA.
  2. Tem a função de revisão (exonuclease 3 'a 5').
  3. Dimeriza os dois núcleos catalíticos.
  4. Forma a braçadeira que é considerada responsável por sua alta processabilidade.
  5. Carrega e descarrega a braçadeira deslizante.

Questão 5.15

Quais são os componentes do complexo multiproteico conhecido como primosome em E. coli? O que isso faz? Em que direção ele viaja?

Questão 5.16

Qual (is) polimerase (s) de DNA nuclear eucariótica (s) é (são) considerada (s) a responsável pela síntese da fita principal e da fita retardada?


Unidade 2: Química Biológica

  • Módulo 2: átomos, grupos funcionais e água
    • Depois de se aprofundar no agrupamento funcional de moléculas, os alunos serão capazes de identificar diferentes grupos funcionais e caracterizar cada um, por categoria (ou seja, polares, não polares, neutros ou carregados).
    • Defina um buffer e sua utilidade para o sistema biológico.
    • Defina uma ligação de hidrogênio e desenhe possíveis ligações de hidrogênio entre quaisquer duas moléculas apropriadas.
    • Defina e desenhe a estrutura de uma ligação de hidrogênio entre quaisquer duas moléculas apropriadas.
    • Defina e desenhe a estrutura de uma ligação de hidrogênio entre quaisquer duas moléculas apropriadas.
    • Descreva um exemplo de biosseletividade resultante da estrutura e ligação do carbono.
    • Descreva como a água, como solvente, protege a estrutura dos íons em solução.
    • Descreva as propriedades da água que a tornam a mais adequada para sustentar sistemas vivos.
    • Descreva a diferença entre ligações covalentes e não covalentes.
    • Descreva a energia associada à quebra de ligações covalentes e não covalentes.
    • Descreva o efeito hidrofóbico e sua importância nos sistemas biológicos.
    • Descreva as propriedades da água que são críticas para o sustento dos sistemas vivos.
    • Descreva os resultados do efeito hidrofóbico, que é a interação de moléculas hidrofóbicas com a exclusão da água.
    • Determine a carga nos grupos funcionais em um determinado nível de pH.
    • Determine o número total de ligações de hidrogênio possíveis de um dado átomo eletronegativo.
    • Faça a distinção entre um eletrólito forte e um eletrólito fraco.
    • Explique a estrutura básica de uma molécula de água e como ela pode formar uma estrutura tridimensional.
    • Explique a importância de ter átomos eletronegativos em uma molécula.
    • Identifique diferentes grupos funcionais e caracterize cada um por categoria (ou seja, polar / não polar, carregado / descarregado).
    • Identifique os átomos eletronegativos encontrados em sistemas biológicos.
    • Identifique o átomo mais eletronegativo ao comparar dois átomos.
    • Liste pelo menos 4 dos principais oligoelementos encontrados nas células e o estado iônico em que existem naturalmente.
    • Liste os átomos (elementos) encontrados em sistemas biológicos que são mais importantes para a vida, incluindo os átomos e oligoelementos mais comuns.
    • Liste os seis principais átomos encontrados na composição dos sistemas biológicos e descreva as propriedades que os tornam essenciais para a vida.
    • Reconhecer e descrever uma ligação covalente e uma ligação iônica estruturalmente.
    • Reconhecer e descrever uma ligação covalente e forças inter-moleculares (um iônico, uma ligação de hidrogênio e interações de van der Waals) estrutural e energeticamente.
    • Reconhecer e descrever uma ligação covalente, uma iônica e uma ligação de hidrogênio, tanto estrutural quanto energeticamente.
    • Defina um eletrólito fraco e escreva uma expressão para a constante de equilíbrio.
    • Descreva a dinâmica do equilíbrio.
    • Descreva a relação entre o pH e a concentração de prótons.
    • Distinga ácidos de bases e explique sua relação com a dissociação ácida.
    • Explique a relação entre a concentração de ácido e base conjugada no equilíbrio.
    • Ao concluir esta revisão, os alunos serão capazes de descrever o significado de Ka e pKa e explicar a relação entre eles.
    • Depois de examinar as moléculas de carboidratos, os alunos serão capazes de descrever as três funções principais dos carboidratos.
    • Caracterizar os grupos funcionais em carboidratos.
    • Defina uma ligação glicosídica e a relação entre condensação e hidrólise.
    • Defina os critérios para a formação de uma ligação glicosídica.
    • Descreva condensação e hidrólise.
    • Descreva os carbonos anoméricos da forma hemiacetal dos carboidratos.
    • Designe funções para os mono-, di- e polissacarídeos, fornecidos no texto.
    • Distinguir aldose (aldeídos) de cetoses (cetonas).
    • Distinguir e descrever as diferenças entre a parede celular da planta e a parede celular bacteriana.
    • Faça a distinção entre uma aldose e uma cetose.
    • Distinguir diferenças estruturais características entre homopolissacarídeos.
    • Distinguir estruturas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias.
    • Distinguir e caracterizar as diferenças entre celulose, amido e glicogênio.
    • Explique as estruturas alfa-hélice e beta.
    • Explique por que todos os aminoácidos são o isômero L e por que a glicina não é.
    • Explique por que os carboidratos são adequados para funções de sinalização e reconhecimento de células.
    • Identifique uma ligação glicosídica.
    • Identifique e descreva as características das moléculas marcadas.
    • Identifique centros assimétricos (quirais).
    • Identifique os enantiômeros de todos os carboidratos como D.
    • Identifique a estrutura básica de todos os aminoácidos.
    • Identifique as moléculas: gliceraldeído, diidroxiacetona, ribose, glicose, galactose e frutose.
    • Identifique quais estereoisômeros de carboidratos são encontrados na natureza.
    • Ilustre os diferentes tipos de ligação responsáveis ​​por manter a estrutura terciária da proteína unida.
    • Coloque qualquer aminoácido em uma das quatro categorias de propriedades, com base na estrutura de sua cadeia lateral.
    • Reconhecer um peptídeo (ligação amida) e listar suas propriedades estruturais.
    • Reconhecer a orientação alfa e beta da hidroxila no carbono anomérico.
    • Reconhecer e descrever a estrutura e função da sacarose, lactose, celulose, glicogênio, amilose, amilopectina e amido.
    • Reconheça o carbono anomérico na forma hemiacetal dos carboidratos.
    • Classifique as cadeias laterais de aminoácidos com base na polaridade e na ionização.
    • Defina e descreva a estrutura primária de uma proteína.
    • Defina a força motriz para o dobramento de um polipeptídeo em água e em um solvente apolar.
    • Defina as propriedades estruturais de uma ligação peptídica que restringirá o enovelamento de uma proteína.
    • Descreva como uma estrutura quaternária é dinâmica.
    • Descreva exemplos específicos de estrutura secundária em detalhes.
    • Descreva as restrições estruturais específicas que caracterizam a estrutura secundária.
    • Descreva os domínios estruturais.
    • Descreva a ligação envolvida no dobramento das proteínas.
    • Descreva o tipo de reação responsável pela formação e degradação da ligação peptídica.
    • Descreva o que é necessário para formar uma estrutura quaternária.
    • Explique como a estrutura primária define a estrutura final de uma proteína.
    • Explain the covalent bonds possible in stabilizing a tertiary structure.
    • Explain why most naturally occurring amino acids are the L-isomers and why glycine is not.
    • Give at least one example of a quaternary structure.
    • Identify and draw hydrogen bonding between peptide bonds.
    • Identify the basic structure of amino acids.
    • Identify the functional groups involved in formation of a peptide bond.
    • Define activation energy and the effect an enzyme hasupon it.
    • Define equilibrium binding and describe how it is dynamic.
    • Describe how pH affects enzyme kinetics.
    • Describe how temperature affects enzyme kinetics.
    • Describe the effect of changing ligand concentration on an equilibrium.
    • Describe the general reaction for an enzyme catalyzed reaction.
    • Describe the interactions that stabilize the protein-ligandcomplex.
    • Discern the difference between a ligand and a substrate.
    • Draw a graph of equilibrium binding.
    • Explain the parallels between protein-ligand binding and weak electrolyte dissociation.
    • Explain what happens before and after the formation of the ES complex.
    • Explain, and graphically illustrate, the effect of each inhibitor type on a velocity vs. substrate concentration graph: a) non-competitive and b) competitive.
    • Graphically represent the relationship, between each of the following, for an enzyme catalyzed reaction: 1) velocity and substrate concentration 2) velocity and enzyme concentration 3) velocity and pH and, 4) velocity and temperature.
    • Recognize, and describe, the reversible binding of proteins with their ligands.
    • Upon completion of this topic, students will be able to recognize, and describe, the reversible binding of proteins with their ligands.
    • Module 7: Lipids and Membranes
      • Define the amphipathic character of a phospholipid and glycolipid.
      • Define the functions of each of the classes of lipids.
      • Describe and diagram the characteristic features of the fluid mosaic membrane.
      • Describe and identify the difference between a liposome and a micelle.
      • Explain how the different structural features of fatty acids influence their role in phospholipids and fats.
      • Name and identify the ester bonds between fatty acids and glycerol and the glycerol and phosphate.
      • Characterize the environmental changes necessary to allow recycling of intermediates in receptor mediated endocytosis.
      • Describe a set of criteria for selective transport of a given molecule to pass through a membrane channel.
      • Describe a typical source of energy (general and specific examples).
      • Describe how osmotic pressure is generated and what conditions are necessary to create high osmotic pressure in a cell.
      • Describe the difference between general endocytosis and protein transduction.
      • Describe the factors that affect simple diffusion
      • Describe the fate of a molecule taken into a cell by receptor mediate endocytosis.
      • Describe the fate of the material undergoing endocytosis.
      • Describe the general structural features of a membrane transport protein.
      • Describe the solute differences between isotonic, hypertonic and hypotonic solutions.
      • Describe the spontaneous direction of the movement of molecules
      • Describe the structural and chemical characteristics of a typical ‘facilitator’.
      • Describe why the process requires energy.
      • Disntiguish how receptor mediated endocytosis differs from protein transduction.
      • Distinguish between facilitated diffusion and active transport.
      • Distinguish between simple diffusion and facilitated diffusion.
      • Distinguish the mechanisms of uniports, symports and antiports.
      • Explain how receptor mediated endocytosis differs from phagocytosis.
      • Explain the affect of an isotonic, hypertonic and hypotonic solution on the shape of a cell.
      • Explain the difference between pinocytosis and phagocytosis.
      • Explain why the description of osmosis emphasizes the solvent hanges.
      • Expound on how the inside surface of the endocytic vesicle is the same as the outside surface of the cell and why that is important to the cell.

      Unit 4: Basis of Molecular Biology

      • Module 10: DNA Replication
        • Characterize the direction of DNA synthesis.
        • Describe one method of editing that takes place during DNA synthesis.
        • Describe the formation of the Open Complex at the origin of replication.
        • Describe the process of connecting the Okazaki fragments into a continuous strand of DNA.
        • Describe the results of semiconservative replication.
        • Differentiate the multiple origins of replication that are used to reduce the time of replication of Eukaryotic chromosomes.
        • Discuss how competitive binding is used in DNA sequencing using dideoxy-NTPs.
        • Distinguish the difference between continuous and discontinuous DNA synthesis.
        • Explain how the appropriate substrate for DNA polymerase at the replication fork is established.
        • Explain how the the length of DNA amplified during PCR is defined.
        • Explain the substrate requirements for DNA synthesis by DNA polymerase.
        • Expound on why Okazaki fragments are formed on the lagging strand.
        • Specify how telomerase uses the rules for DNA synthesis to overcome shortening of the chromosome.
        • Describe a post-transcriptional modification that takes place with each of the classes of transcription products.
        • Describe the difference between a eukaryotic and prokaryotic Operon
        • Describe the differences between the substrate requirements for DNA polymerase and RNA polymerase
        • Describe the process of RNA splicing including the splicesome, introns, exons and lariats.
        • Describe the role of the 5′-cap and the 3′-polyA tail in the functioning of mRNA.
        • Describe the similarities between the functioning of DNA plymerase and RNA polymerase
        • Describe the steps in the process of transcription (RNA synthesis) starting with RNA polymerase binding to the promoter and ending with the release of polymerase from the terminator
        • Describe where the information (signal) for splicing is and why it might lead to alternative splicing.
        • Explain the difference between a weak and a strong promoter including the basis for the difference in “strength” of the promoter
        • Name the products of transcription and differentiate each from the others
        • Define the genetic code.
        • Define the role of each RNA molecule used in translation.
        • Describe the process of translation as a step-wiseprocess.
        • Describe what post-transcriptional modification must take place beforetranslation.
        • Distinguish between prokaryotic and eukaryotictranslation.
        • Correctly draw the hydrogen bonding between DNA and RNA bases.
        • Correctly identify and specifically name all of the nucleotides.
        • Define which helix type describes DNA and RNA.
        • Describe 3 common structural characteristics of DNA/RNA polymer backbones.
        • Describe the criteria for determining the most stable structure between two DNA molecules, two RNA molecules, between a DNA and a RNA molecule.
        • Describe the difference and identify the difference between a nucleotide and a nuceloside.
        • Describe the hydrogen bonding that exists between complimentary base pairs in DNA and RNA.
        • Describe the major characteristics of the B-DNA double helix
        • Describe the structural differences between the A-helix and B-helix.
        • Describe why AT and AU base pairs are weaker than GC base pairs.
        • Describe why purines are always paired with pyrimidines to form the helix structures of DNA and RNA.
        • Explain the major difference between the DNA and RNA backbone structures.
        • Give two examples of bioselectivity in the formation of the RNA or DNA backbone.
        • Identify a phosphodiester bond.
        • Identify correct base pairing between DNA and RNA bases.
        • Identify the difference between a purine and pyrimidine.
        • Identify the structure of each of the nitrogenous bases: A, T, G, C,U.
        • Identify which bases are incorporated into DNA and RNA.
        • Module 13: Pathways
          • Describe a linear, branched, and circular pathway.
          • Describe the common features of metabolic pathways.
          • Describe the major differences between a competitive and uncompetitive inhibitor.
          • Distinguish regulation by non-covalent and covalent modification of enzymes.
          • Explain activation of enzymes by allosteric compounds as a method of regulation.
          • State the major differences between catabolic and anabolic pathways.
          • Calculate the Gibbs free energy change, given the state of the system and the standard energy changes.
          • Describe how a pathway with a positive Gibbs free energy can be reversed by coupling to an energy releasing reaction.
          • Describe the direction of electron transfer in oxidation/reduction reactions.
          • Determine the spontaneous direction of a reaction from the Gibbs free energy.
          • Explain how to balance redox reactions.
          • Explain the difference between direct and indirect coupling.
          • Explain the major energy storage methods in metabolism – phosphorylated compounds, redox carriers, and proton gradient.
          • Explain the relationship between the equilibrium point of a system and the difference in standard energies.
          • Identify and describe the source of “high-energy” phosphate bonds in ATP.
          • Specify the difference between standard energy and Gibbs free energy.
          • State the name of two common organic electron carriers and show familiarity with changes in the structure that occurs on oxidation/reduction.
          • Tell how the energy stored in a thioester can be used for ATP synthesis or organic addition reactions.
          • Describe the reactions catalyzed by dehydrogenases, hydratases, isomerases, and synthetases.
          • Explain the difference between a kinase and a phosphatase
          • Define glycolysis and identify its celluar location.
          • Describe anaerobic metabolism and how it effects glycolysis.
          • Describe how energy released by oxidation is stored.
          • Distinguish how direct and indirect coupling are used to make glycolysis spontaneous.
          • Explain what happens when glucose is metabolized through glycolysis.
          • Describe how glycolysis connects to the TCA cycle and where the TCA cycle occurs.
          • Describe how intermediates in the TCA cycle are used to synthesize a wide range of compounds.
          • Explain where CO2 is released.
          • Expound on where, and in what form, the energy released by the TCA cycle is stored.
          • Explain ATP synthase and the effects of allosteric changes during proton translocation.
          • Explain the role of the four complexes, coenzyme Q, and cytochrome C in electron transport.
          • Explain what happens when electrons transport through complexes I, III, and IV.
          • Identify the pathway of the electrons from FADH2 to oxygen resulting in the formation of water.
          • Identify the pathway of the electrons from NADH to oxygen resulting in the formation of water.
          • Predict whether the free energy stored in the non-equilibrium hydrogen ion gradient is sufficient to sythesize ATP from the transport of 3 protons.
          • Describe how glycolysis and gluconeogenesis are coordinately regulated by sensing energy levels in the cell.
          • Describe how select amino acids enter the oxidative pathways.
          • Describe indirect coupling in glycogen synthesis and how glycogen synthase is controlled by protein phosphorylation.
          • Describe receptor mediated signal transduction and explain the role of G-proteins and adenyl cyclase.
          • Explain how glucose can be synthesized from pyruvate.
          • Explain how glycogen degradation by glycogen phosphorylase is controlled by protein phosphorylation.
          • Explain how hormone controlled phosphorylation of enzymes affect fructose 2,6 phosphate (F-26-P) levels.
          • Explain how the disaccharides sucrose and lactose enter glycolysis.
          • Explain the physiological role of the hormones epinephrine, glucagon, and insulin.
          • Explain the role of the protein kinases and phosphatases in regulating the enzyme function.
          • Express how glycogen and glucose metabolism in the liver effects the glucose demand of the organism and the liver cell.
          • Identify the role of phosphofructose kinase and fructose-1,6-bisphosphatase in gluconeogenesis pathways.
          • Indicate the number of steps in glycolysis that are too energetically unfavorable to reverse in gluconeogenesis and describe how the steps are reversed.
          • Recognize the structure of glycogen.
          • Specify how fats (triglycerides) are metabolized by fatty acid oxidation.
          • Specify the number of steps in glycolysis with Gibbs free energies that are close to zero and can be reversed in gluconeogenesis.
          • Summarize how fructose 2,6, phosphate levels regulate glycolysis and gluconeogenesis.
          • Tell how carbons atoms from the excess consumption of any dietary source can be incorporated into fats.

          Examples of Substrate

          Lactose

          Lactose is a sugar produced in milk. Mammals typically produce milk for their offspring. It contains a blend of fats, proteins, and growth hormones to get a young mammal to gain a lot of weight in a short amount of time. Humans, interestingly, are the only animals that drink another species milk in a non-predatory way. While some big predators will surely consume the milk of a mammal they just killed, only humans purposefully drink the milk provided by cows. Not surprisingly, many people have lactose intolerance, or an inability to process the sugar lactose.

          Lactase, the enzyme needed to act on lactose as a substrate, is produced by humans when they are babies to deal with the lactose in breastmilk. Once weaned from breastmilk, the substrate lactose is no longer present for the enzyme to work on. The lactose, besides being a substrate for lactase, also acts on your DNA. It is thought that in the presence of lactose that DNA produces more lactase. Once weaned, the body produces little to no lactase, causing lactose intolerance. However, most people continue to drink cow’s milk almost immediately, or concurrently, with being weaned from breast milk. In this way, you are continuously able to process lactose, which might not be a good thing. Recent studies have shown that the growth hormones, cholesterol, and animal proteins in cow’s milk may not be good for your health, as a health adult mammal. Although, it does make sense that adults shouldn’t drink baby formula.

          ACE Inhibitors as Substrate Blockers

          Luckily, ACE inhibitors were created to be substrate “mimics”. The ACE inhibitors are about the same size and shape as angiotensin I, the substrate for the angiotensin converting enzyme. Instead of binding to the substrate, the enzyme binds to the inhibitor instead. Unlike the substrate, the inhibitor cannot undergo a chemical reaction, and becomes stuck to the enzyme. By regulating the amount of ACE inhibitor given to a person, the effectiveness of all their angiotensin converting enzymes can be effected, and a lower level of angiotensin II will be seen in the blood and tissues. Without this chemical, the muscles around blood vessels relax, and blood pressure is lowered. A lower blood pressure prevents many of the dangerous conditions that can arise from high blood pressure.


          5.E: DNA replication I: Enzymes and Mechanism (Exercises)

          • Contributed by Ross Hardison
          • T. Ming Chu Professor (Biochemistry and Molecular Biology) at The Pennsylvania State University

          Question 5.8

          Imagine you are investigating the replication of a bacterial species called B. mulligan. The bacteria is grown for several generations in medium containing a heavy density label, [ 15 N] NH4Cl. The bacteria are then shifted to medium containing normal density [ 14 N] NH4Cl. DNA is extracted after each generation and analyzed on a CsCl gradient. From the results shown below, what is the mode of replication in B. mulligan? Explain your conclusion.

          Question 5.9

          How many turns must be unwound during replication of the E. coli chromosome? The chromosome contains 4.64 x 106 base pairs.

          Question 5.10

          Which of the following comments about Okazaki fragments are true or false? Okazaki fragments:

          1. are short segments of newly synthesized DNA.
          2. are formed by synthesis on the leading strand of DNA.
          3. have a short stretch of RNA, or a mixture of ribonucleotides and deoxyribonucleotides, at their 5' end.
          4. account for overall synthesis of one DNA strand in a 3' to 5' direction.

          Question 5.11.

          The following experimental results are from A. Sugino and R. Okazaki (1972) "Mechanisms of DNA Chain Growth VII. Direction and rate of growth of T4 nascent short DNA chains" J. Mol. Biol. 64: 61-85.

          uma. E. colicells were infected with bacteriophage T4 and then chilled to 4 o C to slow the rate of replication. Replicating DNA in the infected cells was pulse-labeled with [3H]-thymidine (a) or [ 3 H]-thymine (b) for 5 sec (black-filled circles), 30 sec (open circles with vertical line), 60 sec (open circles with dot) or 300 sec (open circles). The pulse labeling was stopped with potassium cyanide and ice, and the DNA was extracted, denatured in NaOH, and separated on an alkaline sucrose gradient. Fractions from the gradient were collected and assayed for the amount of 3 H in the DNA (as material that bound to a filter after washing in (a) and as acid-insoluble material in (b)). The sedimentation value in Svedbergs (S) is given along the x-axis faster sedimenting material is toward the right. What do these data tell you about the sizes of nascent (newly synthesized) DNA at the various pulse labeling times?

          (b) Sugino and Okazaki used a method to break the isolated short nascent chains (completed Okazaki fragments) randomly and recover only the oligonucleotides from the 5í ends. They found that at very short labeling times (e.g. 5 sec) the [ 3 H] thymidine was not at the 5' ends of the DNA (hence it was internal and at the 3' ends). After longer labeling times, the [ 3 H] thymidine was found in the oligonucleotides at the 5' end. What do you conclude is the direction of chain growth of the nascent chains? Explain your logic.

          Question 5.12

          We have covered two experiments from the Okazaki lab using pulse labeling for increasing times to follow the synthesis of new DNA. How would you design a pulse-chase experiment to monitor not only the initial production of Okazaki fragments, but also their incorporation into larger DNA molecules?

          Question 5.13

          Which enzymes, substrates, and cofactors are used in common and which ones are distinctive for synthesis of leading strands and lagging strands of DNA at the replication fork of E. coli?

          Question 5.14

          Which subunit or complex within E. coli DNA polymerase III holoenzyme has each the following functions?

          1. Catalyzes 5'to 3' polymerization of new DNA.
          2. Has the proofreading function (3' to 5' exonuclease).
          3. Dimerizes the two catalytic cores.
          4. Forms the clamp that is thought to account for its high processivity.
          5. Loads and unloads the sliding clamp.

          Question 5.15

          What are the components of the multiprotein complex known as the primosome in E. coli? O que isso faz? In what direction does it travel?

          Question 5.16

          Which eukaryotic nuclear DNA polymerase(s) is (are) thought to account for leading strand and lagging strand synthesis?


          Produção

          The yield of the synthesis is heavily dependent on the coupling efficiency. Even with 99.5% efficiency, which we readily achieve, you can see in tabela 1 that as the oligonucleotide length increases, the yield rapidly decreases.

          It is important to keep in mind that coupling efficiency is not all that determines the yield. Deprotection, cleavage, and purification (even simple desalting) decrease the yield further. Our guaranteed yields based on manufacturing scale and purification can be found here.