Em formação

Neurônio VC06 de c.elegans


Meu entendimento foi que todos os neurônios e suas sinapses do worm c.elegans já estão listados.

Como fonte deste mapa, estou usando os seguintes bancos de dados (ambos devem conter as mesmas informações):

Dados de conectividade

Banco de dados de conectividade sináptica de C. elegans para computação

Em ambos os bancos de dados, o neurônio neuro-motor VC6 (também conhecido como VC06) não tem sinapses com nenhum outro neurônio. Isso é surpreendente para mim.

O conectoma deste animal terminou? Em caso afirmativo, esses dois bancos de dados estão atualizados? Finalmente, se a resposta às perguntas anteriores for "sim", alguma explicação sobre esse neurônio "isolado"?


Introdução

A identificação da célula é um processo essencial nos amplos campos da biologia, incluindo a neurociência e a biologia do desenvolvimento. Por exemplo, a identificação de células onde um gene é expresso pode muitas vezes ser a primeira etapa na análise de funções e interações do gene. Além disso, as informações de identidade são necessárias para comparar as atividades celulares em diferentes animais. Para anotar identidades celulares em imagens microscópicas, características das células, como posições e morfologias, são frequentemente comparadas entre as amostras e um atlas de referência.

O nematóide Caenorhabditis elegans tem uma propriedade única de que todas as células e suas linhagens foram identificadas neste animal [1, 2]. Além disso, a morfologia e as conexões entre todos os 302 neurônios em hermafroditas adultos também foram identificadas por reconstrução por microscopia eletrônica [3]. Esse conhecimento detalhado abre oportunidades únicas em neurociência, tanto em nível de célula única quanto de rede. Avanços recentes em técnicas de microscopia também permitem imagens da atividade do cérebro inteiro do verme [4,5,6,7,8,9,10,11], mesmo para os vermes que se movem livremente [12,13,14]. As atividades neurais foram obtidas na resolução de uma única célula, e as identidades de um número limitado de neurônios foram anotadas manualmente em alguns dos estudos [4,5,6,7,8, 10, 14]. No entanto, não há uma abordagem sistemática e abrangente para anotar os neurônios nos dados de atividade do cérebro inteiro [12].

Anotação de identidades neuronais em C. elegans é frequentemente realizado com base nas posições dos neurônios, especialmente para animais larvais em que os neurônios estão localizados em posições estereotipadas [15, 16]. No entanto, para animais adultos, as posições dos corpos celulares neuronais são altamente variáveis ​​entre os animais [12]. Várias informações adicionais podem ser usadas, como marcadores de identidade celular sobrepostos e informações morfológicas dos neurônios. Atualmente, a sobreposição de marcadores de identidade celular, como proteínas fluorescentes expressas por promotores específicos de células bem caracterizados, é o método mais popular e confiável para identificação neural. Por exemplo, Serrano-Saiz et al. mostraram que tais métodos são eficazes quando o número de neurônios-alvo é limitado [17]. No entanto, a integração dessa abordagem com a imagem da atividade do cérebro inteiro parece difícil porque requer, em princípio, diferentes marcadores e diferentes canais fluorescentes para cada neurônio. A informação morfológica também é útil quando o número de neurônios-alvo é muito limitado, mas não é prontamente utilizada para imagens de todo o cérebro porque os neurônios estão distribuídos densamente na região da cabeça dos vermes e a informação morfológica não pode ser obtida com precisão.

Vários esforços para desenvolver métodos de anotação automática foram relatados. Para anotar os neurônios com base em suas posições, serão necessárias as informações das posições e suas variações. Long et al. [18, 19] produziram atlas digital 3D para 357 das 558 células de várias dezenas de animais L1, e trabalhos relacionados também usaram o atlas [20, 21]. O atlas consiste em posições e seus desvios dos núcleos celulares dos músculos da parede corporal, intestino, neurônios da faringe e neurônios posteriores ao gânglio retrovesicular, bem como alguns outros tipos de células. No entanto, os neurônios anteriores ao gânglio retrovesicular são omitidos por causa de sua distribuição densa [19], e o atlas não é aplicável aos neurônios na região da cabeça importante para o processamento da informação neural. Aerni et al. [22] relataram posições de 154 de 959 células de 25 hermafroditas adultos, incluindo células intestinais, musculares e hipodérmicas, e introduziram um método que integra características úteis, incluindo pontos de referência fluorescentes e informações morfológicas com as posições das células. No entanto, as posições dos neurônios não foram relatadas. Pelo que sabemos, as informações das posições dos neurônios em vermes adultos podem ser obtidas apenas no atlas produzido pelo trabalho de reconstrução do EM [3]. Infelizmente, o atlas branco não contém informações sobre a variedade de posições entre os animais individuais. Além disso, o atlas pode ser deformado por causa das características inerentes aos métodos de preparação de amostras para microscopia eletrônica. Assim, os dados experimentais das posições dos neurônios em animais adultos eram muito limitados.

Aqui, medimos as posições dos neurônios em animais adultos usando promotores específicos de células e criamos um conjunto de dados. Avaliamos as variações das posições e obtemos uma combinação ideal dos promotores específicos da célula para tarefas de anotação com base nas informações acumuladas das posições das células. Nossas cepas ideais permitem a anotação manual racional da maioria dos neurônios na região da cabeça de um animal. Também desenvolvemos e validamos uma ferramenta de anotação eficiente que inclui funcionalidades de anotação automatizada e interação humana.


2. Linhagens celulares neuronais e classificação de neurônios

O diagrama de linhagem de Sulston revela algumas características-chave do desenvolvimento do sistema nervoso (Figura 2). Como uma rápida olhada no diagrama mostra, C. elegans os neurônios são em grande parte derivados de forma não clonal de muitas linhagens diferentes (linhas vermelhas na Figura 2). Alguns sub-ramos da linhagem dão origem exclusivamente aos neurônios, mas em alguns casos as escolhas neuronais versus não neuronais são feitas apenas muito tarde na linhagem (alguns exemplos estão sombreados em cinza na Figura 2). Por exemplo, algumas células musculares são produzidas dentro de linhagens que produzem principalmente neurônios e vice-versa (Sulston et al., 1983) (Figura 2). Isso indica que as células precursoras em tais linhagens permanecem não comprometidas com um destino específico até a divisão celular terminal. Alternativamente, as células podem ser comprometidas, mas o comprometimento pode não ser um processo irreversível. Consistente com a última visão, uma célula em C. elegans sofre um processo de transferência pós-mitótica & # 8220 & # 8221 de um tipo de célula não neuronal para neuronal (Jarriault et al., 2008).

A natureza não clonal & # 8220piece-meal & # 8221 das linhagens neuronais é acompanhada por uma falta de correlação da história da linhagem com características terminais específicas dos tipos de neurônios. Por exemplo, neurônios motores do cordão nervoso ventral gerados embrionariamente que se enquadram em classes anatômicas específicas (por exemplo, os nove neurônios DA1-DA9) mostram pouca relação de linhagem entre si, da mesma forma, neurônios sensoriais anfídicos envolvidos na detecção de pistas ambientais derivam de ramos de linhagem distintos ( Sulston et al., 1983). Outra classificação amplamente aplicada de neurônios é baseada no tipo de neurotransmissor que um neurônio produz (& # 8220 fenótipo do neurotransmissor & # 8221). Contudo, C. elegans neurônios com o mesmo fenótipo de neurotransmissor mostram pouca ou nenhuma relação de linhagem (Sulston, 1983) (a Figura 2 mostra como exemplo a posição linear dos 8 neurônios dopaminérgicos de um C. elegans hermafrodita). Outra classificação de neurônios segue as linhas de unidades funcionais. No sistema nervoso da mosca, os neurônios e as células de suporte que formam um sensor sensorial derivam de uma sub-linhagem comum (Modolell, 1997). Mas, novamente, as células que formam tipos específicos de sensilas sensoriais em C. elegans (neurônio, bainha, alvéolo) raramente têm uma história de linhagem comum (Sulston, 1983). Neurônios ligados sinapticamente também não mostram nenhuma relação especial de linhagem. Devido às extensas migrações de células no embrião em desenvolvimento, os neurônios em proximidade direta uns com os outros também não estão necessariamente relacionados linearmente.

Outro esquema de classificação potencial de neurônios é o perfil molecular intrínseco de um neurônio. Aqui, novamente, relacionamentos complexos com a linhagem de neurônios são evidentes. Centenas de perfis de expressão gênica baseados em gene repórter foram acumulados com resolução de neurônio único desde que a tecnologia do gene repórter foi estabelecida em C. elegans (Chalfie et al., 1994). Esses repórteres geraram um painel extremamente útil de & # 8220 descritores moleculares & # 8221 de tipos de neurônios pós-mitóticos, diferenciados terminalmente e estão arquivados no WormBase (ver, por exemplo, o perfil molecular do interneurônio AIYL). O tema comum desses perfis de expressão é muito óbvio: em vez de serem definidos por um painel de genes específicos de um único neurônio, os neurônios são geralmente definidos pela coexpressão combinatória de um conjunto de genes de diferenciação terminal que individualmente são expressos em mais neurônios tipos (Figura 1C) (Hobert et al., 2010). Curiosamente, a maioria dos padrões de expressão gênica neuronal publicados novamente não se correlacionam bem com a história da linhagem, ou seja, os perfis de expressão gênica obviamente não se agrupam em grupos de neurônios linearmente relacionados. A Figura 1C mostra um exemplo de alguns genes expressos em AIY e outros tipos de neurônios, a maioria dos outros tipos de neurônios não mostram nenhuma relação de linhagem óbvia com AIY.

Resta-se, portanto, classificar os neurônios por características anatômicas específicas. Com base em seu trabalho de microscopia eletrônica, White et al. (1986) definiu 118 classes de neurônios, com membros de classes de neurônios individuais principalmente distinguidos por sua posição e projeção axodendrítica comum e padrões de conexão (ver WormAtlas). Neurônios classificados juntos por morfologia novamente muitas vezes não compartilham histórias de linhagem comum, por exemplo, neurônios simétricos esquerdo / direito que definem classes de neurônios individuais (por exemplo, os neurônios AWB esquerdo e direito que definem a classe de neurônios & # 8220AWB & # 8221) muitas vezes não compartilham um histórico de linhagem comum (consulte a inserção na Figura 2). O mesmo se aplica a membros individuais de classes específicas de neurônios motores (por exemplo, os sete neurônios motores DB). A relação frequentemente limitada de neurônios semelhantes com a linhagem significa essencialmente que praticamente todos os neurônios nascem por meio de divisões celulares assimétricas. Em outras palavras, apenas alguns pares de células irmãs no sistema nervoso são semelhantes entre si (por exemplo, consulte a Figura 5 mostrando o interneurônio AIY e sua irmã muito distinta, o neurônio motor SMDD).

Embora tipos de neurônios semelhantes possam ser gerados por padrões de linhagem distintos, alguns tipos de neurônios semelhantes são gerados por padrões de linhagem muito semelhantes. Isso é evidenciado pelas chamadas & # 8220 sublineagens repetidas & # 8221, ou seja, padrões de divisão celular que são encontrados em vários pontos da linhagem e que dão origem à mesma matriz de tipos de neurônios, na maioria das vezes neurônios motores do cordão ventral (Figura 2) (Sulston, 1983 Sulston et al., 1980 Sulston e Horvitz, 1977 Sulston et al., 1983). Sub-linhagens repetidas se originam de células blásticas que podem ser diversas em sua história de linhagem, mas então, por meio do padrão de sub-linhagem, executam um programa de desenvolvimento comum. Portanto, padrões de linhagem semelhantes podem, mas não necessariamente, produzir tipos de neurônios semelhantes.

À luz dessas complexidades, como funcionam os programas de especificação genética no sistema nervoso? Qual é a base genética do impacto que a linhagem tem ou não na especificação de neurônios? Desde a introdução de C. elegans como um sistema de modelo por Sydney Brenner na década de 1970, essas questões foram abordadas usando uma das principais vantagens do sistema de modelo de worm & # 8212forward análise genética (Brenner, 1974 Horvitz et al., 1983 Jorgensen e Mango, 2002). A beleza dessa abordagem reside em sua natureza amplamente imparcial. Simplesmente isola-se mutantes nos quais aspectos da morfologia e função do sistema nervoso (rastreáveis ​​por uma variedade de meios) são interrompidos (Horvitz et al., 1983). Esses estudos genéticos, bem como uma série de estudos de genética reversa, forneceram informações importantes sobre como o sistema nervoso se desenvolve (a Tabela 1 fornece uma visão geral dos mutantes de desenvolvimento neuronal). Abaixo, destaco alguns desses mutantes selecionados, agrupando-os pelos tipos de defeitos observados. Outras revisões se aventuraram mais nos detalhes do desenvolvimento de componentes específicos do sistema nervoso, como o sistema nervoso masculino, os sistemas sensoriais ou motores (ver Desenvolvimento masculino, Lanjuin e Sengupta, 2004 Von Stetina et al., 2006). As células gliais são um componente importante do C. elegans sistema nervoso (Shaham, 2006), mas uma compreensão de seu desenvolvimento é limitada a partir de agora (Yoshimura et al., 2008) e, portanto, eles não são discutidos aqui.


Discussão

A sinalização Wnt desempenha um papel em vários processos durante o desenvolvimento do circuito neural, incluindo orientação do axônio, estabelecimento da polaridade, regeneração do axônio e especificidade sináptica (Park e Shen, 2012). No Drosófila, a expressão de Wnt4 na célula muscular M13 é necessária para evitar que os motoneurônios que inervam a célula muscular M12 formem sinapses ectópicas em M13, sugerindo que Wnt4 inibe a formação de sinapses e ajuda a escolha sináptica seletiva (Inaki et al., 2007). No C. elegans, A sinalização Wnt está envolvida em muitos aspectos do desenvolvimento envolvendo a polaridade anterior-posterior, como divisão celular assimétrica, migração celular, polaridade axônio / dendrito e crescimento de neurito (Goldstein et al., 2006 Hilliard e Bargmann, 2006 Kirszenblat et al., 2011 Pan et al., 2006 Sawa, 2012 Silhankova e Korswagen, 2007). Nosso estudo revelou que dois neurônios de uma única classe de neurônios formam seus domínios sinápticos em regiões distintas, respondendo diferencialmente a dois gradientes Wnt.

Alterações na sinalização Wnt afetaram dramaticamente os padrões sinápticos DA8 e DA9 no plx-1 fundo mutante. O fenótipo aditivo de má localização de sinapses entre os wnt mutantes e o plx-1 mutant argumenta fortemente que essas duas vias atuam em paralelo às sinapses padrão. Curiosamente, tanto a sinalização PLX-1 quanto os dois Wnts restringem a formação de sinapses, estabelecendo limites para domínios sinápticos. Esses resultados destacam a importância das pistas inibitórias na regulação dos padrões sinápticos na Vivo. Embora a ação de EGL-20 e LIN-44, combinada com a via de tiling sináptica, possa explicar amplamente a posição das sinapses DA8 e DA9, raramente observamos padrões sinápticos invertidos ou randomizados entre os neurônios DA8 e DA9 em wnt ou crespo mutantes, sugerindo que existem mecanismos adicionais que determinam a posição das sinapses DA8 e DA9. Um mecanismo possível pode ser o tempo de desenvolvimento desses dois neurônios: DA8 ou DA9 podem formar sinapses primeiro, obrigando o domínio sináptico do neurônio & # x02019s restante a se formar no espaço livre de sinapses restante ao longo do cordão nervoso. Essa possibilidade ainda precisa ser testada.

No neurônio DA8, descobrimos que o deslocamento posterior das sinapses DA8 no lin-17 plx-1 duplo mutante era tão forte quanto aquele no lin-44 egl-20 plx-1 mutante triplo, sugerindo que, além de MIG-1 / Frizzled, LIN-17 / Frizzled também é necessário para detectar EGL-20. Nós relatamos que egl-20 melhora significativamente lin-44 deslocamento de sinapse no neurônio DA9, embora não detectemos a expressão de mig-1 / frizzled em DA9 (Klassen e Shen, 2007). Existem também vários relatos de que LIN-17 atua como um receptor para EGL-20 (Eisenmann, 2005). Receptores frizzled são relatados para formar homo ou hetero-oligômeros (Kaykas et al., 2004). Portanto, é possível que o neurônio DA8 utilize um heteromultímero MIG-1 / LIN-17 para obter maior sensibilidade ao EGL-20 do que os homo-multímeros LIN-17 no neurônio DA9. A localização pontuada do MIG-1 é completamente dependente do EGL-20, mas não do LIN-44. Por outro lado, a localização do LIN-17 é mais afetada pelo LIN-44 do que pelo EGL-20, sugerindo que há especificidade para o receptor Wnt.

Embora os ladrilhos sinápticos e os mapas topográficos de sinapses não tenham sido amplamente descritos fora de C. elegans, isso provavelmente se deve à resolução insuficiente das ferramentas de rotulagem atuais. Pelo menos em um caso de um mapa topográfico sináptico foi observado no sistema vertebrado: No hipocampo de camundongo, cada neurônio granular forma alguns grandes, en passant especializações pré-sinápticas (arborizações terminais, TAs) na região CA3. As posições dos TAs exibem uma relação topográfica colinear marcante com as posições de seus corpos celulares (Galimberti et al., 2010). Esta especificação topográfica de TAs parece envolver EphA4, que exibe um gradiente ao longo do giro denteado. Quando a sinalização do EphA4 é interrompida, TAs excessivos se formam em posições anormais, sugerindo que o EphA4 graduado suprime a formação de TAs para estabelecer esse mapa de sinapse (Galimberti et al., 2010). Portanto, tanto no hipocampo do camundongo quanto no C. elegans sistemas, pistas inibitórias graduadas para formação e manutenção de sinapses são usados ​​para restringir a distribuição de sinapses e criar mapas topográficos de sinapses.


Discussão

Todos os animais são dotados de capacidade altamente conservada de detectar estimulação mecânica na forma de toque, nocicepção e propriocepção [1]. C. elegans foi o primeiro organismo modelo no qual a triagem genética imparcial direta foi usada para identificar os genes que contribuem para a mecanosensação [46, 47]. Ao longo dos anos, vários neurônios sensoriais polimodais foram identificados no nematóide. Os neurônios sensoriais polimodais são uma classe específica de neurônios sensoriais que podem detectar estímulos sensoriais distintos. Em contraste, os neurônios que reconhecem apenas um único estímulo são neurônios sensoriais unimodais [48]. Os neurônios sensoriais nociceptivos são tipicamente polimodais com notável capacidade de sentir uma ampla variedade de estímulos aversivos, incluindo estímulos físicos e químicos, e de transduzi-los em diversos graus e modalidades de sinais de dor [49]. O par bilateral de neurônios ASH (neurônios anfídeos com terminações ciliadas únicas) detecta estímulos químicos, mecânicos e osmóticos para mediar a locomoção para trás para autodefesa [10, 48, 50, 51]. Os neurônios PVD detectam temperaturas frias nocivas, toque severo e estão envolvidos na propriocepção [21, 22]. Os neurônios PHA / PHB respondem a vários estímulos aversivos, incluindo estímulos químicos, mecânicos e osmóticos [10]. Outros neurônios sensoriais estão sob escrutínio para decifrar a base molecular dos processos sensoriais e da multimodalidade.

Os neurônios OLL são novos neurônios sensoriais polimodais

Estudos anteriores usando a reconstrução por microscopia eletrônica descobriram que os neurônios OLL têm um único dendrito. Os cílios dos neurônios OLL atravessam um canal criado por células alveolares e a extremidade é finalmente inserida na subcutícula anfídea [8]. Chang et al. relataram defeitos de toque do nariz em animais nos quais os neurônios OLL foram geneticamente ablacionados, sugerindo que eles estão envolvidos na mecanosensação [11]. No entanto, o mecanismo molecular desta mecanosensação permaneceu indefinido. No presente estudo, usando imagens de Ca 2+ e registro de patch-clamp, revelamos aumentos de Ca 2+ evocados pelo toque do nariz e correntes em neurônios OLL de maneira autônoma em relação às células. Coletivamente, os neurônios OLL estão envolvidos na mecanosensação. Curiosamente, os neurônios OLL também estão envolvidos na detecção da estimulação pelo frio, o que não foi relatado antes. Os comportamentos de percepção da temperatura fria, incluindo sensação inócua de frio, sensação nociva de frio, comportamentos termotáticos positivos e negativos e memória relacionada à temperatura e envelhecimento, são bastante complicados [1, 16, 45]. Devido à complexidade desse esquema de codificação de temperatura, muitas vezes é difícil identificar a saída comportamental da temperatura para um neurônio específico. Neste estágio, não observamos qualquer saída comportamental óbvia de neurônios OLL em resposta à estimulação fria. Estudos futuros são necessários para revelar esses detalhes. No entanto, nossos experimentos de imagem de Ca 2+ conduziram ambos na Vivo e em vitro mostrou claramente que os neurônios OLL responderam à estimulação do frio de uma maneira autônoma da célula, apoiando a conclusão de que eles são células sensíveis ao frio. É assim claro que os neurônios OLL atuam como neurônios sensoriais polimodais funcionando na mecanotransdução e na transdução a frio.

Um novo canal sensível ao sódio na mecanotransdução

É geralmente conhecido que os canais de transdução mecanoelétrica (MeT) detectam sinais mecânicos e os convertem em sinais elétricos [1]. Os canais MeT abrem muito rapidamente e as latências do canal são normalmente menores que 20 ms [31, 41, 52]. Até o momento, membros de quatro classes de proteínas de membrana relacionadas à mecanotransdução são considerados subunidades formadoras de poros dos canais MeT: TRP, DEG / ENaC, Piezo e TMC [31, 32, 34, 38, 53, 54] . Vários membros da família DEG / ENaC, como DEG-1, MEC-4 / MEC-10, DEGT-1 e UNC-8, mostraram formar canais de mecanotransdução [21, 38, 40, 52]. No entanto, os papéis dos canais MeT putativos na transdução sensorial são complicados e desconcertantes. TRP-4 / TRPN forma o canal MeT nos neurônios dopaminérgicos [31, 55], enquanto o canal OSM-9 TRP é dispensável para a mecanotransdução por neurônios ASH, embora seja essencial para comportamentos de evitação mediados por ASH em resposta ao nariz estímulos tácteis, osmóticos e químicos [52, 56]. Em neurônios de raios masculinos, o OSM-9 modula a cinética das variações do Ca 2+ em resposta à estimulação mecânica [18]. Esses resultados apóiam a ideia de que o OSM-9 funciona como um modulador, mas não como o canal MeT primário na mecanosensação.

Neste estudo, registramos MRCs insensíveis à amilorida robustos e de adaptação rápida em neurônios OLL ativados por força mecânica. Os canais MeT nesses neurônios permearam seletivamente os íons Na +, de acordo com o potencial reverso dos MRCs, que é semelhante ao da condutância do canal Na +. Os canais TRP-4, TMC e Piezo são todos canais catiônicos não seletivos envolvidos na mecanosensação, enquanto DEG / ENaC são conhecidos por serem sensíveis à amilorida. Como tal, descartamos os canais TRP-4, TMC, Piezo e ENaC como canais MeT primários em neurônios OLL [1]. Portanto, o canal MeT dos neurônios OLL é um canal de mecanotransdução não relatado que é seletivo para Na +, mas não insensível à amilorida. Os mecanismos moleculares pelos quais os neurônios OLL funcionam na mecanotransdução permanecem indefinidos. Assim, mais estudos são necessários para descobrir esse novo canal de mecanotransdução.

Existe um receptor de detecção de frio ainda desconhecido em neurônios OLL

A capacidade de sentir a temperatura ambiente é uma característica indispensável para a sobrevivência animal [1]. As temperaturas frias, especialmente as extremamente baixas, ameaçam a sobrevivência, causando graves danos aos tecidos e provocando a sensação de dor fria como sinais de alerta [57]. Uma cadeia de mecanismos de detecção de temperatura foi relatada para detectar temperaturas frias para alterar o comportamento e a fisiologia de forma adequada para a sobrevivência [58]. Vários receptores de frio estão presentes em neurônios ou tecidos sensíveis ao frio [58]. O nematóide C. elegans, que sobrevive em uma faixa de temperatura relativamente ampla de 12 ° C a 26 ° C, fornece uma plataforma útil para estudar a base neuro-molecular da sensação de temperatura, particularmente o frio [59]. Até o momento, apenas três receptores de frio foram identificados: TRPM8, TRPA1 e GLR-3. TRPM8 participa da sensação de resfriamento com um limite de ativação em

26 ° C. O receptor frio TRPM8 foi confirmado tanto na Vivo e em vitro em mamíferos [43, 60, 61]. TRPA1 é onipresente e relativamente conservador em sua função [62]. No C .elegans, TRPA1 é responsável pela sensação de frio nos neurônios PVD e no intestino [22, 45]. No entanto, os neurônios OLL exibiram transientes de Ca 2+ robustos evocados por estímulos de frio com trpa-1 mutação, portanto, TRPA1 não contribuiu para a transdução de frio em neurônios OLL.

Um estudo recente identificou o GLR-3 como um receptor metabotrópico do frio, cujo limiar de ativação é de cerca de 20 ° C [16]. O GLR-3 é relatado como estando em ASER (o neurônio anfídeo, terminação ciliada única (AsE), lado direito) para funcionar na sensação de frio e mediar o comportamento de evitação do frio. o glr-3 gene é expresso no neurônio sensorial ASER, interneurônios RIA e no intestino, bem como alguns outros neurônios, mas não em neurônios OLL (https://cengen.shinyapps.io/SCeNGEA/) [16]. Dado que TRPM8 não tem expressão evolutivamente conservada em C. elegans, ainda não está claro qual receptor de frio existe nos neurônios OLL. Estudos prospectivos são necessários para identificar o receptor do frio, bem como os mecanismos de transdução detalhados.

Em resumo, demonstramos que os neurônios OLL polimodais medeiam tanto a mecanotransdução quanto a transdução fria de forma autônoma. Excluímos as proteínas da família DEG / ENaC, TRP-4, TMC e proteínas Piezo / Pezo-1 na mecanotransdução de neurônios OLL, no entanto, fornecemos insights fundamentais sobre um novo canal de Na + mecanossensível. Outra observação interessante foi que os neurônios OLL detectaram baixas temperaturas por meio de um receptor de frio desconhecido. Embora três receptores de frio tenham sido identificados, este receptor de frio inesperado instiga novos caminhos para os mecanismos de detecção de frio. Com mais investigações, esperamos que nosso estudo contribua para o avanço da compreensão molecular dos neurônios sensoriais polimodais.


Materiais e métodos

Aquisição de dados

Esta seção descreve os métodos usados ​​para determinar a conectividade neuronal, consulte [78] para obter mais detalhes.

Começamos a montar o diagrama de fiação consolidando os dados existentes de fontes publicadas e não publicadas. Usando J. G. White et al.de The Mind of a Worm (MOW) [7] como ponto de partida, extraímos dados de fiação de diagramas, figuras, tabelas e texto (por exemplo, consulte [7, Apêndice A, pp. 118-122] no neurônio AVAL / R). A conectividade de cada neurônio, seu parceiro sináptico e tipo sináptico (químico, junção gap, neuromuscular) foi inserida manualmente em um banco de dados eletrônico. No cordão ventral, a determinação desse nível de especificação sináptica era complicada pelo fato de as conexões serem registradas por classe de neurônios. Por exemplo, os neurônios bilaterais PVCL e PVCR foram simplesmente listados como PVC. Atribuímos conexões adequadas ao neurônio esquerdo / direito apropriado, referindo-nos aos cadernos de laboratório originais de White e aos colegas de trabalho e às micrografias eletrônicas originais. Em alguns casos, o número de sinapses para uma determinada classe de neurônios em MOW diferia da soma das conexões para os pares bilaterais nos cadernos e / ou micrografias eletrônicas. O valor sináptico desses neurônios foi determinado tomando o valor em MOW e dividindo-o entre os neurônios esquerdo / direito proporcionalmente aos valores nos cadernos e / ou micrografias eletrônicas.

Em seguida, incorporamos os dados de R. M. Durbin para a porção anterior do verme, reconstruída a partir de animais N2U [8]. Para neurônios que se projetam além do anel nervoso, apenas as conexões anteriores precisam ser atualizadas. Como os dados do MOW não especificavam a localização das sinapses, a integração se mostrou difícil. Para esses neurônios, obtivemos informações posicionais cruzando os dados de Durbin com as micrografias eletrônicas originais e suas anotações manuscritas nos cadernos de laboratório de White. Apenas sinapses localizadas em regiões abordadas por Durbin foram incluídas. As conexões nas regiões do meio e da cauda do worm não foram afetadas por essas atualizações.

Os estudos baseados em repórteres de proteína fluorescente verde (GFP) confirmam principalmente as reconstruções de micrografia eletrônica descritas em MOW. Algumas diferenças entre os neurônios corados com GFP e o trabalho de White foram observadas [Hobert O e Hall DH, não publicado]. Notavelmente, os processos anteriores de DVB e PVT podem ter sido trocados por engano em MOW [7]. Com base nessas descobertas, invertemos as conexões dos neurônios DVB e PVT anteriores à vulva.

A maioria dos trabalhos publicados enfocou as regiões do pescoço e cauda de C. elegans onde reside a maioria dos corpos celulares dos neurônios. As reconstruções de neurônios no meio do corpo do verme, por outro lado, são escassas e incompletas. A partir de uma combinação de trabalhos publicados [7], [8], [10], [79], descobrimos que os dados de fiação dos neurônios tinham grandes lacunas ou estavam ausentes por completo. Sessenta e um deles eram neurônios motores na medula ventral. Dois eram neurônios excretores (CANL / R) que não parecem fazer sinapses. O neurônio restante, RID, é o único processo na medula dorsal que se estende ao longo do animal.

No C. elegans arquivo (Albert Einstein College of Medicine), descobrimos um grande número de registros de reconstrução em White et al.cadernos de laboratório de. Esses cadernos identificavam os neurônios por rótulos de códigos de cores diferentes, dependendo do animal, da localização da neurita (ventral ou dorsal) e da ampliação da micrografia eletrônica. Para verificar a identidade dos neurônios, contamos com uma combinação de tabelas de códigos de cores e comparações de estruturas anatômicas comuns entre impressões de micrografias eletrônicas. Ao final, identificamos notas para reconstruções completas dos neurônios citados. Dados de conectividade parcial para o restante também estavam disponíveis, onde os neurônios têm conexões laterais dorsais parciais / ausentes e os neurônios têm conexões laterais ventrais parciais. Verificamos as conexões de todos os neurônios (publicados e não publicados) no cordão ventral contra micrografias eletrônicas usadas por White e colegas de trabalho. Mais de atualizações foram feitas nas notas originais e reconstruções publicadas. Muitas dessas atualizações foram acréscimos de junções neuromusculares perdidas anteriormente entre os neurônios motores do cordão ventral e os músculos da parede corporal.

Descobrimos que uma grande seção no lado dorsal do verme, da parte anterior da vulva ao gânglio pré-anal, nunca foi eletromicrografada em grande aumento. Essa escassez de imagens era a razão de tantos neurônios estarem sem reconstruções do lado dorsal. Usando seções finas originais para o N2U verme preparado por White et al., produzimos novas micrografias eletrônicas de alta potência desta região dorsal. Devido ao estado das seções, apenas uma de cada seção foi fotografada. Essas novas micrografias eletrônicas se estendiam quase no lado dorsal. Novos dados do lado dorsal para 3 neurônios (DA5, DB4, DD3) foram obtidos a partir dessas micrografias eletrônicas. As restrições de recursos nos impediram de cobrir toda a fenda dorsal.

De nossa compilação de dados de fiação, incluindo novas reconstruções de neurônios motores do cordão ventral, aplicamos critérios de autoconsistência para isolar neurônios com registros recíprocos incompatíveis. As discrepâncias foram reconciliadas comparando-se com micrografias eletrônicas e cadernos de laboratório de White et al. Conexões na região posterior do animal também foram cruzadas com reconstruções publicadas em [10]. A reconciliação envolveu sinapses para neurônios (química “envia”, química “recebe” e junções elétricas).

Componente gigante para redes aleatórias

Para uma rede aleatória com neurônios e probabilidade de uma conexão estar presente, se for constante, então o tamanho do componente gigante é assintoticamente normal com média e variância [80, p. 120]. Essas quantidades são dadas por (14) onde (15) e é a função de Lambert. Se aceitarmos ser e ser, então. Usando a aproximação assintótica, o tamanho do componente gigante é distribuído aproximadamente normalmente com média e variância. Assim, a probabilidade de haver um componente de tamanho gigante, que está acima dos desvios padrão da média, é de cerca de. If a precise evaluation of this infinitesimal value is desired, large deviations techniques, rather than the asymptotic approximation may be more valid [81].

To apply this method to the weakly connected component of a directed network, we are interested in the undirected network formed by adding a connection between two neurons if there is a connection in either direction. For a random directed network with probability of presence of a directed connection, the probability of a connection existing in either direction is . Taking to be , is . Then for an undirected random network with and the specified , is . Then the size of the giant component is distributed approximately normally with mean and variance . Thus the probability of the giant weakly connected component containing all the neurons in such a random network is overwhelming. Again, large deviations techniques should be used to get a precise evaluation of the probability of being on the order of standard deviations away from the mean.

Giant Component for Random Networks with Given Degree Distribution

Consider the ensemble of random networks with a given degree distribution [82]. For the gap junction network, the generating function corresponding to the measured degree distribution is with derivative Therefore . The generating function is then As shown in [82], the expected fraction of the network taken up by the giant component, , is , where is the smallest non-negative solution to . In our case, we find , and so . That is to say, one would expect the giant component to consist of neurons.

Using the computed and , we can find the average component size excluding the giant component, which turns out to be .

For the symmetrized chemical network, the generating function corresponding to the measured degree distribution is with derivative Therefore . The generating function is then

The expected fraction of the network taken up by the giant component, , is , where is the smallest non-negative solution to . Here is found to be , and so . That is to say, one would expect the giant component to consist of neurons.

Path Length for Random Networks with Given Degree Distribution

Continuing from the previous subsection, we find the derivative of the generating function for the gap junction network to be Thus . Letting and , it is shown in [82, (53)], that the expected path length is (16)

Fitting Tails of Distributions

To find functional forms of the tails of various distributions, we follow the procedure outlined in [42]. For the candidate functional forms—say, the power law and the exponential decay —we perform the following steps. First, we find the optimal parameter of the fit by maximizing the log-likelihood and the optimal starting point of the fit by minimizing the Kolmogorov-Smirnov statistic. Second, we evaluate the goodness of fit by calculating the -value that the observed data was generated by the optimized distribution using as a criterion for plausibility. Finally, if several distributions pass the -value test we compare their log-likelihoods to find the most probable one.

Circuits in Eigenmodes

Let us bound the probability of finding an eigenmode that comprises a random set of neurons. Let be the number of neurons in the network being analyzed. Let be the number of neurons that appear strongly in the th eigenmode and let . Furthermore let be the number of neurons in the random set, which one might endeavor to investigate as a putative functional circuit derived from an eigenmode.

Now go through each eigenmode and add to a list all possible unordered -tuples of strong neurons. Even if all of these are unique, the size of the list is upper-bounded by which itself is upper-bounded by .

Additionally, we can compute the number of all unordered -tuples of neurons. This number is .

Thus, if a random set of neurons was selected from all possible sets of neurons, the probability that there would be an eigenmode containing all of them is upper-bounded as

Suppose we are interested in putative functional circuits of size in the giant component of the gap junction network, which has and from Figure 2 in Text S4 take . Then even the loosest upper-bound yields and so finding a random set of neurons in an eigenmode is unlikely.

Suppose we know functional circuits of size through molecular biology and want to know the probability of at least one of them appearing in the eigenmodes by chance. By the union bound (Boole's inequality), this probability is less than . If we take and , the probability of a known functional circuit appearing in the eigenmodes by chance is less than for the giant component of the gap junction network.

Gap Junction–Chemical Synapse Likelihoods

The likelihood ratios shown in Figure 9 are the following quantities, empirically estimated from either all neuron pairs or pairs with a GABAergic presynaptic neuron. The first is The second is and the third is

Degree Correlation Coefficients

Table 1 shows the Pearson correlation coefficients between neuron degree sequences. The average Pearson correlation coefficients of randomly permuted degree sequences from trials are also shown for comparison. The standard deviation is also shown since the distributions of the three randomized correlation coefficients were all nearly symmetric about zero.

-Pseudospectrum Computation

We used the MATLAB package EigTool [83] to compute pseudospectra.

MATLAB Code and Data

Note that MATLAB code for computing several network properties is available at http://mit.edu/lrv/www/elegans/. This collection of software may be used not only to reproduce most of the figures in this paper, but also for future connectomics analyses.

The collected data is available from the WormAtlas [22] as well as from the same website as the MATLAB code.


O C. elegans cérebro

Figura 2: C. elegans head region, ventral view: various classes of neurons labeled in different colors.

The majority of the neurons is located in the head, where they are organised in a number of ganglia surrounding the pharynx, forming the brain of the animal (Figure 2, pharynx not visible). 68 neurons are sensory neurons detecting various soluable and volatile chemicals, tactile stimuli and temperature. These sensory neurons, especially chemosensory neurons (all the white and most of the blue neurons in Figure 2), make up a large fraction of the neurons in the head ganglia. They send their dendrites to the tip of the nose (to the left, but outside the actual picture in Figure 2), which is richly innervated with several sensory structures. Sensory axons join a large axon bundle, the nerve ring (see Figure 3), where they make synaptic connections with interneurons. Some of these interneurons (red neurons in Figure 2) in turn send long axons into the ventral cord, which runs the entire length of the animal. The command interneurons of the motorcircuit connect to motoneurons located in the ventral cord, which in turn connect to muscle cells allowing the animal to respond to sensory input by changing its movement pattern.

Figure 3: ASH sensory neurons in the head. Surface rendering of confocal images.


Developmental genetics of the C. elegans pharyngeal neurons NSML and NSMR

Fundo: We are interested in understanding how the twenty neurons of the C. elegans pharynx develop in an intricate yet reproducible way within the narrow confines of the embryonic pharyngeal primordium. To complement an earlier study of the pharyngeal M2 motorneurons, we have now examined the effect of almost forty mutations on the morphology of a bilateral pair of pharyngeal neurosecretory-motor neurons, the NSMs.

Resultados: A careful description of the NSM morphology led to the discovery of a third, hitherto unreported process originating from the NSM cell body and that is likely to play a proprioceptive function. We found that the three NSM processes are differently sensitive to mutations. The major dorsal branch was most sensitive to mutations that affect growth cone guidance and function (e.g. unc-6, unc-34, unc-73), while the major sub-ventral branch was more sensitive to mutations that affect components of the extracellular matrix (e.g. sdn-1). Of the tested mutations, only unc-101, which affects an adaptin, caused the loss of the newly described thin minor process. The major processes developed synaptic branches post-embryonically, and these exhibited activity-dependent plasticity.

Conclusão: By studying the effects of nearly forty different mutations we have learned that the different NSM processes require different genes for their proper guidance and use both growth cone dependent and growth cone independent mechanisms for establishing their proper trajectories. The two major NSM processes develop in a growth cone dependent manner, although the sub-ventral process relies more on substrate adhesion. The minor process also uses growth cones but uniquely develops using a mechanism that depends on the clathrin adaptor molecule UNC-101. Together with the guidance of the M2 neuron, this is the second case of a pharyngeal neuron establishing one of its processes using an unexpected mechanism.


Long-term activity drives dendritic branch elaboration of a C. elegans sensory neuron

Neuronal activity often leads to alterations in gene expression and cellular architecture. The nematode Caenorhabditis elegans, owing to its compact translucent nervous system, is a powerful system in which to study conserved aspects of the development and plasticity of neuronal morphology. Here we focus on one pair of sensory neurons, termed URX, which the worm uses to sense and avoid high levels of environmental oxygen. Previous studies have reported that the URX neuron pair has variable branched endings at its dendritic sensory tip. By controlling oxygen levels and analyzing mutants, we found that these microtubule-rich branched endings grow over time as a consequence of neuronal activity in adulthood. We also find that the growth of these branches correlates with an increase in cellular sensitivity to particular ranges of oxygen that is observable in the behavior of older worms. Given the strengths of C. elegans as a model organism, URX may serve as a potent system for uncovering genes and mechanisms involved in activity-dependent morphological changes in neurons and possible adaptive changes in the aging nervous system.


UMA C. elegans neuron both promotes and suppresses motor behavior to fine tune motor output

How neural circuits drive behavior is a central question in neuroscience. Proper execution of motor behavior requires the precise coordination of many neurons. Within a motor circuit, individual neurons tend to play discrete roles by promoting or suppressing motor output. How exactly neurons function in specific roles to fine tune motor output is not well understood. No C. elegans, the interneuron RIM plays important yet complex roles in locomotion behavior. Here, we show that RIM both promotes and suppresses distinct features of locomotion behavior to fine tune motor output. This dual function is achieved via the excitation and inhibition of the same motor circuit by electrical and chemical neurotransmission, respectively. Additionally, this bi-directional regulation contributes to motor adaptation in animals placed in novel environments. Our findings reveal that individual neurons within a neural circuit may act in opposing ways to regulate circuit dynamics to fine tune behavioral output.


Assista o vídeo: Transferring L4 Hermaphrodite C. elegans Using a Toothpick (Dezembro 2021).