Em formação

A neurogênese é essencial para o aprendizado?


Portanto, li que nosso cérebro produz 700 novos neurônios no hipocampo todos os dias e que, se realizarmos tarefas cognitivas exigentes, comer ômega-3 ou fazer exercícios (outras coisas?), Ele pode produzir ainda mais neurônios.

O que acontece com esses novos neurônios? Digamos que eu esteja aprendendo algumas novas habilidades, que papel esses novos neurônios desempenham no processo? É possível aprender sem neurogênese?

Editar: Estou interessado neste tópico (por exemplo: cérebro, hipocampo, aprendizagem). Onde posso aprender sobre isso com o básico? Que classes ensinam isso na faculdade?


Não, a neurogênese não é necessária para a aprendizagem (supondo que você esteja falando sobre neurogênese adulta: é claro que você precisa gerar neurônios em algum momento do desenvolvimento para ter até mesmo um sistema nervoso).

Facilmente, a teoria mais aceita para aprendizagem e memória é que a aprendizagem acontece por mudanças na força das sinapses, as conexões entre as células. Os pontos fortes dessas conexões também são freqüentemente chamados de "pesos sinápticos". Os mecanismos primários para esse aprendizado são a potenciação de longo prazo e a plasticidade dependente do tempo de pico relacionada, bem como o princípio orientador do aprendizado Hebbian freqüentemente declarado como "células que disparam juntas, se conectam".

Resumidamente, a potenciação de longo prazo ou LTP descreve o aumento nos receptores pós-sinápticos que ocorre sob certas condições: isso é o que aumenta a eficácia ou força de certas sinapses. Uma das principais condições é que o LTP tende a ocorrer nas sinapses que contribuem causalmente para fazer o disparo da célula pós-sináptica.

Neurogênese adulta ocorre principalmente em algumas áreas localizadas do cérebro (Zhao et al., 2008). Embora seja possível que haja neurogênese fora dessas áreas, ela não foi demonstrada de forma conclusiva e certamente não é suficiente para ser necessária para o aprendizado em um cérebro adulto normal sem lesões.

Os neurônios nascidos na zona subventricular substituem continuamente os receptores olfativos, que têm uma vida útil relativamente curta, provavelmente evoluídos devido à sua exposição constante a todos os tipos de compostos externos potencialmente prejudiciais que entram no nariz. Essas células precisam passar por alguns processos de "aprendizado" para se integrarem às redes existentes, mas não é isso que você pensaria coloquialmente como aprendizado em geral.

Os melhores candidatos para células que realmente impactam o aprendizado em algum grau são os novos neurônios nascidos na zona subgranular do giro denteado no hipocampo. O hipocampo é de fato uma estrutura importante para certos tipos de aprendizado, mas novos neurônios não são necessários para esse aprendizado. Embora ainda não esteja claro quais são os papéis dos novos neurônios no giro dentado, acredita-se que eles contribuam para os papéis primários do giro dentado, que ajudam a distinguir entre padrões semelhantes de atividade (Deng et al., 2010), também chamado de "separação de padrões".

Duas outras hipóteses são de que a neurogênese adulta ajuda a codificar informações de temporização nas memórias porque os novos neurônios apenas participam de novas memórias, ou que permitem a incorporação de novos estímulos, uma vez que os neurônios mais antigos foram condicionados e sintonizados apenas para estímulos que foram experimentados antes (Aimone, et al., 2013). Existem evidências para todas essas hipóteses, mas nenhuma delas é conclusiva, e todas podem ser verdadeiras em algum grau.

Existem muitos tipos diferentes de aprendizagem e esses diferentes tipos de aprendizagem podem ocorrer em diferentes regiões do cérebro, a maioria das quais não demonstra nenhuma neurogênese adulta substancial. Freqüentemente, as pessoas pensam em aprendizagem associativa com condicionamento operante ou clássico. Também há aprendizagem episódica: lembrar eventos que aconteceram (este é o tipo mais intimamente associado ao hipocampo, onde talvez a neurogênese desempenhe algum papel). Também existe o aprendizado motor e vários tipos de aprendizado em sistemas sensoriais, como habituação ou sensibilização. Portanto, é importante entender que aprender não é uma coisa e, embora os mecanismos possam estar relacionados, nem sempre são os mesmos.

Como aprender mais: Posso falar sobre os cursos em instituições às quais me afiliei, mas é claro que podem variar entre as escolas. Aprendizagem e memória geralmente fazem parte de um curso de graduação em neurociência em nível de sistema, que geralmente é o segundo de dois cursos de visão geral em neurociência. O momento mais comum para os alunos fazerem esse tipo de curso seria como um aluno do segundo semestre do segundo semestre ou do segundo semestre do primeiro ano de graduação, porque há conhecimentos pré-requisitos em física, química, biologia molecular e fisiologia. Existem também cursos de pós-graduação nos mecanismos moleculares de aprendizagem e memória, e cursos teóricos de neurociência que cobrem as considerações computacionais de aprendizagem e memória, em vez de apenas os mecanismos biológicos. Esses tipos de cursos também podem estar disponíveis para alunos de graduação de nível sênior.

Claro que você também pode ler alguns dos artigos de revisão que incluí aqui e seguir as referências que eles citam para pesquisas originais. A revisão Aimone é particularmente legível e tem algumas ilustrações excelentes para um novato, e também cobre extensivamente a regulação da neurogênese pelo comportamento e ambiente.

Referências

Aimone, J. B., Li, Y., Lee, S. W., Clemenson, G. D., Deng, W., & Gage, F. H. (2014). Regulação e função da neurogênese adulta: dos genes à cognição. Physiological reviews, 94 (4), 991-1026.

Deng, W., Aimone, J. B., & Gage, F. H. (2010). Novos neurônios e novas memórias: como a neurogênese hipocampal adulta afeta o aprendizado e a memória ?. Nature Reviews Neuroscience, 11 (5), 339-350.

Zhao, C., Deng, W., & Gage, F. H. (2008). Mecanismos e implicações funcionais da neurogênese adulta. Cell, 132 (4), 645-660.


Muitas estruturas de IA e aprendizado de máquina podem aprender incrivelmente rápido, mas não têm neurônios e alguns deles não tentam imitar redes neurais.

Se a memorização mecânica (a forma mais simples e grosseira de aprendizado) for considerada aprendizado, você pode até argumentar que um computador "aprende" quando você instala um novo programa nele.

Portanto, a resposta à sua pergunta é não.

Mesmo que você não esteja aceitando o aprendizado por computador como exemplo, qualquer sistema imunológico decente pode "lembrar" os patógenos encontrados anteriormente e isso não parece depender dos neurônios.


A propagação de células-tronco e a neurogênese agora podem ser estudadas em cultura de células

Os pesquisadores agora são capazes de estudar células-tronco do cérebro de camundongos adultos e sua neurogênese em culturas de células de longo prazo. Harish Babu e Dr. Gerd Kempermann (ambos do Max Delbr & uumlck Center for Molecular Medicine, MDC, Berlin-Buch, o Volkswagenstiftung Research Group no Charit & eacute & ndash Universit & aumltsmedizin Berlin, Alemanha) desenvolveram um novo método que lhes permite gerar exatamente esses neurônios de células-tronco em cultura de células como aquelas que se desenvolveriam no cérebro vivo.

Eles isolaram as células-tronco de uma região do hipocampo, o giro denteado, que é uma ilha para a neurogênese no cérebro adulto. Primeiro, eles demonstraram que o hipocampo de camundongos adultos realmente possui células com propriedades de células-tronco & ndash que haviam sido previamente debatidas & ndash e, além disso, que essas células-tronco se desenvolvem em neurônios do hipocampo sob certas condições.

Essas culturas de células-tronco a partir das quais os neurônios podem ser gerados são uma ferramenta poderosa para estudar células-tronco e seus mecanismos regulatórios no hipocampo, a região de aprendizagem e memória,

Vários anos antes, o Dr. Kempermann e outros pesquisadores conseguiram mostrar que mesmo os cérebros adultos podem construir novos neurônios. Os pesquisadores presumem que os novos neurônios no hipocampo ajudam o cérebro a se ajustar aos novos desafios da vida. Resta saber se e como essas novas células ou suas células precursoras, as células-tronco, podem ser usadas para desenvolver terapias contra a demência.


Neurogênese humana adulta revelada

Dan Cossins
7 de junho de 2013

CÉLULA/ SPALDING ET AL Testes de bombas nucleares acima do solo realizados há mais de 50 anos resultaram em níveis atmosféricos elevados do isótopo radioativo de carbono-14 (14 C), que diminuiu constantemente com o tempo. Em um estudo publicado ontem (7 de junho) em Célula, os pesquisadores usaram medições da concentração de 14 C no DNA de células cerebrais de pacientes falecidos para determinar os neurônios e demonstraram que há neurogênese adulta substancial no hipocampo humano.

"Fornecemos informações completas sobre a extensão da neurogênese e mostramos que há uma quantidade surpreendentemente grande", disse o autor do estudo Jonas Fris & eacuten, do Instituto Karolinksa em Estocolmo, Suécia.

"É uma conquista muito impressionante", disse Gerd Kempermann, do Centro Alemão de Doenças Neurodegenerativas em Dresden, que não participou do estudo. & ldquoIt & rsquos bem-vindo ao campo como uma confirmação há muito procurada, mas & rsquos também mais, porque eles modelam a dinâmica & rdquo do adulto.

A primeira evidência direta de neurogênese adulta em humanos veio em 1998, mas o método usado - injetar um rótulo químico que se integra permanentemente ao DNA das células cerebrais em divisão - não está mais disponível para os pesquisadores devido a questões de segurança, então os resultados nunca foram replicados . Além disso, a técnica não poderia fornecer informações sobre o número de novos neurônios gerados, por isso era impossível ver se a neurogênese ocorre em humanos na mesma extensão que em roedores, nos quais novos neurônios são conhecidos por influenciar o funcionamento do cérebro.

Para estudar a renovação neuronal em humanos, Frisén e colegas desenvolveram uma estratégia para datar células retrospectivamente em cérebros post mortem medindo os níveis de 14 C. Como o 14 C é absorvido pelas plantas e pelos animais que comem plantas, os humanos também absorvem 14 C em níveis atmosféricos - que vêm declinando a uma taxa conhecida desde o Tratado de Proibição de Testes Limitados de 1963, que pôs fim aos testes de bombas nucleares acima da superfície.

O 14 C chega ao DNA das células em proliferação, onde é integrado aos cromossomos à medida que são duplicados antes da divisão. A proporção de 14 C em comparação com o isótopo de carbono-12 estável e muito mais abundante (12 C), cujos níveis permanecem constantes ao longo do tempo, fornece uma data de nascimento para células individuais. “Basicamente, o 14 C fornece um carimbo de data / hora em cada célula do cérebro recém-nascido”, disse Frisén, “e medimos a idade das células cerebrais lendo esse carimbo de data / hora”.

Os pesquisadores investigaram os cérebros de 55 indivíduos de várias idades, de 19 a 92. Com base na proporção de 14 C a 12 C no DNA de neurônios no giro denteado - uma parte do hipocampo conhecida por ser importante para o aprendizado e a memória, onde acredita-se que a neurogênese ocorra - a equipe criou um modelo matemático para estimar a taxa de renovação dos neurônios. Eles calcularam que um terço dos neurônios no hipocampo são regularmente renovados ao longo da vida, totalizando a adição de cerca de 1.400 novos neurônios por dia, com a taxa diminuindo modestamente com a idade.

No modelo proposto, uma subpopulação de neurônios se renova continuamente, enquanto outra população não se renova de forma alguma. As células em renovação vivem por um período de tempo muito mais curto do que outras, mas são continuamente giradas.

Em ratos, os neurônios do hipocampo aumentaram a plasticidade sináptica por um tempo limitado após a diferenciação - o que significa que eles adaptam mais prontamente a força das conexões em resposta a novos estímulos. “Essas [células jovens] são necessárias para separar experiências semelhantes como memórias distintas”, disse Frisén. “Para nós, isso significa diferenciar os Beatles e os Rolling Stones, em vez de juntar os dois como música rock and roll.”

Se os novos neurônios também são mais plásticos em humanos, sugere ele, a neurogênese pode desempenhar um papel fundamental na função cerebral, mantendo um suprimento constante de células mais jovens - embora haja uma perda geral de neurônios do hipocampo à medida que envelhecemos.

“Ao permanecer‘ para sempre jovem ’, o giro dentado poderia comandar soluções únicas para problemas computacionais encontrados apenas na região do cérebro central para a aprendizagem, memória e muitas funções cognitivas superiores consideradas essenciais para os humanos”, escreveu Kempermann em uma perspectiva sobre o artigo em Ciência.

Além disso, há evidências de modelos animais de que a neurogênese reduzida está implicada em doenças psiquiátricas, levando Frisén e colegas a sugerir que neurônios jovens no giro denteado também podem desempenhar um papel fundamental na regulação do humor. “O que queremos fazer a seguir é olhar para o histórico médico desses [e de outros] assuntos. . . para ver se a depressão ou outras condições psiquiátricas parecem estar relacionadas à neurogênese ”, disse ele.

K.L Spalding et al., "Dinâmica da neurogênese hipocampal em humanos adultos", Célula, 153:1219-27, 2013.


Neurogênese adulta essencial para a consolidação da memória induzida pelo sono em camundongos

A neurogênese adulta, na qual novos neurônios são gerados dentro do hipocampo no cérebro adulto totalmente desenvolvido, ocorre em camundongos - mas como os novos neurônios são funcionalmente integrados aos circuitos cerebrais existentes permanece amplamente desconhecido. Um estudo publicado em 4 de junho na revista Neurônio mostra um novo papel importante para os neurônios gerados durante a idade adulta na consolidação de memórias durante o sono em ratos.

Estudos anteriores vincularam a presença de neurônios nascidos em adultos (ABNs) às memórias e à plasticidade sináptica, tornando-os candidatos lógicos a participar da consolidação da memória durante o sono, quando os neurônios do hipocampo costumam repetir os padrões de atividade presentes quando o animal aprende uma nova tarefa. Mas a função dos ABNs durante o sono era desconhecida.

Agora, o autor principal Masanori Sakaguchi, professor associado do Instituto Internacional de Medicina Integrativa do Sono da Universidade de Tsukuba, no Japão, descobriu que os ABNs são essenciais para a remodelação estrutural sináptica e consolidação da memória durante o sono REM em camundongos.

"Nosso estudo é o primeiro a mostrar qualquer atividade e função do ABN durante o sono em animais", diz ele. "Nossos resultados abrem caminho para a revelação de percepções mecanicistas sobre como os ABNs se relacionam com funções de memória conhecidas durante o sono."

Os pesquisadores foram capazes de detectar a atividade ABN usando novas técnicas para visualizar a atividade neuronal ao longo de quatro horas em ratos que dormiam naturalmente. Como um único episódio de REM geralmente dura menos de um minuto em ratos, os pesquisadores manipularam com precisão a atividade do ABN durante esses episódios por meio da optogenética - neurônios geneticamente modificados para permitir que os cientistas os estimulem com luz.

Sakaguchi e seus colegas ficaram inicialmente surpresos ao ver que os jovens ABNs mostravam pouca atividade durante o sono. Eles então viram que uma pequena população de ABNs foi ativada enquanto os ratos estavam aprendendo uma memória de medo - recebendo um leve choque nas patas - e foi reativada no sono REM subsequente.

"Embora os níveis de atividade do ABN realmente diminuam durante o sono REM, uma vez que os animais aprenderam a memória com sucesso, um processo de consolidação da memória durante o sono REM reativou os ABNs que foram ativados quando os ratos estavam aprendendo", diz Sakaguchi. Portanto, quando a atividade ABN foi silenciada, a consolidação geral da memória dos animais foi prejudicada. A manipulação optogenética que aumentou e diminuiu a atividade ABN durante o sono REM resultou em prejuízo da memória, sugerindo que há atividades ABN altamente coordenadas desempenhando papéis críticos para a consolidação da memória durante o sono REM.

As próximas etapas envolvem explorar como a reativação de ABNs durante o sono REM consolida a memória. A reativação representa a reprodução da memória? O que coordena a atividade ABN durante o sono REM? Como os ABNs reforçam a consolidação de memória downstream?

"Acreditamos que esses mecanismos são essenciais para que novos neurônios se integrem funcionalmente aos circuitos neuronais existentes", diz Sakaguchi. Ele espera que "coletivamente, esses estudos contribuam para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para regenerar o cérebro danificado".


Regenerando seus sentidos: múltiplas funções para a neurogênese no cérebro adulto

O cérebro do camundongo adulto fornece continuamente novos neurônios ao bulbo olfatório e ao hipocampo. Um novo estudo nesta edição mostra que a neurogênese contínua é essencial para a manutenção do bulbo olfatório e para a memória espacial.

Imayoshi et al. 3 tiraram essas conclusões com base em uma estratégia transgênica elegante que eles usaram para marcar permanentemente e, em seguida, esgotar a progênie gerada por células-tronco no cérebro adulto. Especificamente, os autores geraram camundongos nos quais uma recombinase Cre induzível por tamoxifeno (CreER T2) foi expressa sob o promotor para o marcador precursor neural nestina. Usando esses ratos, eles primeiro perguntaram quantos novos neurônios derivados de células-tronco foram adicionados ao cérebro adulto. Para fazer isso, eles cruzaram seus camundongos com várias linhagens repórter e induziram a atividade da recombinase em adultos com tamoxifeno, assim, expressando de forma eficiente (até 87%) os repórteres em células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie. Inicialmente, os autores acompanharam a diferenciação, migração e maturação de novos neurônios no bulbo olfatório. Trabalhos anteriores mostraram que os neurônios são gerados a partir de NSCs na zona subventricular dos ventrículos laterais e que esses neurônios migram para o bulbo olfatório, onde amadurecem e adquirem características de neurônios granulares maduros após cerca de 1 mês 4,5. A nova abordagem transgênica induzível dos autores confirmou esse trabalho anterior e levou à conclusão de que quase toda a população de células granulares foi substituída por novos neurônios ao longo de um período de 12 meses. A taxa de substituição neuronal foi quase linear durante os primeiros 6 meses, com uma diminuição no ritmo de adição de 6 a 12 meses, refletindo potencialmente um declínio na neurogênese olfatória na meia-idade e além. A exceção a essa substituição quase completa foi nas camadas superficiais, onde apenas metade dos neurônios foram marcados, sugerindo que há pelo menos uma subpopulação de células granulares persistentes no bulbo olfatório.


Poluição do ar ligada a crimes violentos em Chicago

Conforme aumenta a poluição do ar, aumenta o crime violento.

  • Um novo relatório sugere que a poluição do ar pelas rodovias aumentou os crimes violentos em Chicago em 2%.
  • O efeito foi consistente em diferentes partes da cidade e independente de outros fatores.
  • A pesquisa sugere que um imposto simultaneamente pode reduzir a poluição do ar e o crime.

A poluição do ar não prejudica apenas os pulmões. Um número crescente de estudos sugere que ele também está associado a menores produtividade, reduzido curto prazo conhecimento, e um aumento no psicológico sofrimento e até mesmo suicídio.

Agora, um novo estude em breve será publicado no American Economic Journal acrescenta outro efeito colateral potencial ao ar poluído: o aumento das taxas de crimes violentos.


Discussão

Relógios circadianos em neuroesferas de giro dentado

Imagem de bioluminescência revelada circadiana mPer1 atividade em neuroesferas mantidas em meio de soro. Em contraste, as esferas no SCM eram arrítmicas. Além disso, o meio sérico e o B27M produziram a sequência temporal de marcadores de células-tronco, proteínas específicas de neurônios e alterações morfológicas previstas em estudos anteriores de neuroesferas DG em diferenciação e desenvolvimento in vitro. Esses resultados apontam para uma forte dependência do tempo circadiano na liberação de células-tronco DG de processos moleculares que mantêm o estado das células-tronco.

A falta de ritmos da neuroesfera no estado indiferenciado se assemelha à falha das células-tronco embrionárias em mostrar ritmos circadianos na expressão gênica até que sejam induzidas a se diferenciar [31]. Embora seja possível que um pequeno número de células dentro das neuroesferas SCM fossem rítmicas, mas não detectadas, o funcionamento do relógio circadiano foi suprimido em geral, talvez por genes que mantêm a haste celular, como sugerido para as neuroesferas SVZ [35]. Alternativamente, os fatores de crescimento em SCM podem inibir o mecanismo do relógio, estimulando excessivamente as vias de transdução de sinal que são usadas para arrastar o relógio circadiano para ciclos externos de 24 horas, conforme proposto em um estudo de células-tronco tumorais cancerosas [40]. Essas tumoresferas de glioma, no entanto, permaneceram rítmicas no SCM, enquanto os ritmos circadianos estavam ausentes nas neuroesferas DG, indicando uma maior supressão dos processos de temporização.

Ritmos circadianos eram evidentes enquanto as neuroesferas DG se diferenciavam em SM, como mostrado por imunocitoquímica identificando os marcadores de células-tronco SOX2, Msi1, Nestina e GFAP. Por exemplo, 42 ± 6,40% das células da neurosfera foram positivas para SOX2 após o Dia 4 em SM. No entanto, nenhuma célula neuronal madura estava presente enquanto os ritmos circadianos foram detectados, sugerindo que os ritmos surgiram nos NSPCs. Este resultado foi apoiado por imunomarcação mPER1 indicando que a bioluminescência se originou no núcleo rico em células-tronco das neuroesferas. Esses resultados suportam uma visão de que as subpopulações de NSPC em neuroesferas são células de relógio circadiano, em contraste com estudos anteriores que afirmam que os relógios circadianos começam primeiro em células maduras e não são operacionais em células imaturas em diferenciação [41, 42]. No entanto, o suporte adicional de que as células-tronco diferenciadoras são circadianas é encontrado em estudos de células-tronco hematopoéticas, células embrionárias do núcleo supraquiasmático hipotalâmico (SCN) e células-tronco embrionárias iniciais que expressam ritmos circadianos [43-45].

Oscilações de alta frequência em mPer1::luc expressão foram relatadas em neuroesferas SVZ mantidas em SCM [35], mas foram observadas apenas uma vez no presente estudo. Juntos, esses dois estudos sugerem que pelo menos um dos principais genes do relógio circadiano pode ser modulado em frequências mais altas, muito parecido com a expressão rítmica de genes que regulam os eventos iniciais do desenvolvimento [46, 47]. Uma possibilidade alternativa é que as oscilações ultradianas sejam formadas a partir da saída de duas populações de células circadianas que permanecem fixas em uma relação de fase com cerca de 12 horas de intervalo, semelhante às descrições de outras oscilações ultradianas [48, 49].

Ritmos circadianos estavam presentes já no segundo dia após a transferência para SM, permitindo tempo adequado para avaliação de suas propriedades. O período médio de neuroesferas DG em SM foi menor do que 24 horas, semelhante ao do ritmo locomotor circadiano de corrida livre da linha de camundongos consanguíneos C57BL / 6 usada neste estudo (23,84 horas) [50]. Por outro lado, culturas de explante de hipocampo de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de fusão de mPER2 e luciferase de vagalume exibem um ritmo circadiano em bioluminescência de 25,08 horas [14]. A fase do ritmo circadiano da neurosfera foi determinada a partir do momento do pico mPer1 expressão. No SM, esta fase ocorreu conforme previsto após o tratamento com forscolina que foi usado para sincronizar os NSPCs [51]. O pico médio de bioluminescência ocorreu em intervalos de cerca de 24 horas após o término do pulso de forscolina, indicando um ritmo de conjunto de múltiplas células oscilantes [40].

Um modelo apoiado pelos resultados de DG aqui e trabalhos anteriores em neuroesferas SVZ [35] surge da heterogeneidade NSPC e poderia explicar a presença de ritmos durante eventos de diferenciação inicial: pelo menos duas populações de células são consideradas, uma que é não circadiana, mas substancial, e uma segunda população muito menor que é circadiana e entra no pulso de forscolina. Durante a diferenciação, a população menor prolifera, produzindo um ritmo circadiano de conjunto detectável, enquanto as células não circadianas são diminuídas ou esgotadas por divisão celular assimétrica. Uma possibilidade é que as células não circadianas originais sejam células gliais radiais ativadas que são perdidas à medida que se diferenciam em NSPCs que entram na população de células circadianas conforme a proliferação prossegue. Este modelo de pool de duas células descreve a emergência de ritmos circadianos em mPer1 expressão durante a diferenciação neural e merece mais testes. Prevê que os NSPCs circadianos podem entrar em sintonia uns com os outros por meio de contatos celulares ou fatores parácrinos, uma premissa apoiada por interações celulares relatadas em tumorspheres [40].

Embora poucos estudos tenham examinado os ritmos circadianos no hipocampo mantidos in vitro, as evidências indicam que ele contém um oscilador circadiano periférico distinto daquele do SCN [14]. No entanto, um estudo in vitro diferente de genes do relógio em culturas isoladas do hipocampo não detectou ritmos circadianos [15, 52]. A maioria dos estudos de ritmos circadianos do hipocampo analisou ritmos em tecido DG colhido em intervalos de animais alojados em ciclos padrão de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão (LD) [15, 23, 53]. Em um caso, os camundongos ficaram em DD por pelo menos 2 dias antes da dissecção, evitando assim os efeitos imediatos dos sinais de luz na expressão gênica [1]. No entanto, os efeitos indiretos da atividade locomotora circadiana ou osciladores circadianos em outras partes do cérebro podem ter sido responsáveis ​​por grande parte da atividade hipocampal rítmica observada em estudos anteriores. Ritmos circadianos em entradas neurais para o hipocampo ou ritmos em substratos metabólicos e cortisol no cérebro são algumas maneiras pelas quais os ritmos circadianos podem ser dirigidos [54]. Ao evitar essas influências externas, os ritmos da neuroesfera DG mostram que as células do hipocampo são de fato capazes de sincronismo circadiano endógeno. Além disso, os fenótipos celulares presentes em neuroesferas rítmicas são identificáveis ​​por imunofluorescência, sugerindo assim quais células geram o ritmo BLI, como as células mPER1-positivas localizadas no núcleo.

Imagens de fluorescência de seções fixas do hipocampo de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de fusão DsRED e PER2 são relatadas para mostrar ritmos circadianos em células DG que parecem ser NSPCs quiescentes (células Tipo 1, Sox2 + / GFAP +) [1]. A evidência de que as células rítmicas eram células do Tipo 1 foi indireta: a fluorescência DsRED-PER2 alta foi inversamente correlacionada com a intensidade da coloração para Ki-67, um marcador de atividade mitótica, sugerindo que o ritmo circadiano se originou em células quiescentes. No entanto, as células DCX + também foram identificadas como Ki-67-negativas, fornecendo uma possível fonte adicional do ritmo [1]. Os neuroblastos são células DCX + e sofrem divisão celular assimétrica para se tornarem neurônios, mas são distintos das células do Tipo 1, que são multipotentes e menos diferenciadas [55]. Uma preocupação adicional é que os ritmos DsRED-PER2 que foram registrados podem ter resultado de um ritmo na abundância de células no GD, como suposto, ou de uma modulação circadiana de mPer2 atividade do promotor.

Proteínas do relógio circadiano e crescimento e formação da neurosfera

Usando Bmal1 -/- e Choro 1 -/- , 2 -/- ratos arrítmicos, descobrimos que o relógio circadiano é necessário para o crescimento e diferenciação normais da neurosfera. Taxas de crescimento mais lentas foram observadas em culturas de neurosfera secundária derivadas de DG de Choro 1 -/- , 2 -/- camundongos quando comparados com os de mesma idade Cry1 -/- camundongos ou irmãos de ninhada WT. o Cry1 -/- ratos de controle são rítmicos, mas o período de seu ritmo locomotor circadiano é 1 hora mais curto do que WT [34]. Neuroesferas geradas a partir de Choro 1 -/- , 2 -/- os camundongos eram significativamente menores e menos em relação aos controles, indicando que a falta de produção de tempo circadiano ou a ausência de outras funções para as proteínas criptocromo podem suprimir as taxas de crescimento ou induzir o aumento da apoptose.

Déficits também foram observados em Bmal1 -/- Neuroesferas DG após cultura em SCM por 15-20 dias: as lacunas eram abundantes em Bmal1 -/- Neuroesferas DG, mas não estavam presentes nas neuroesferas DG de irmãos WT. De forma similar, Bmal1 -/- As neuroesferas de SVZ não tinham lacunas, sugerindo que DG NSPCs podem ser mais sensíveis do que as esferas de SVZ ao estresse metabólico ou outros desafios à sobrevivência em cultura impostos por uma perda de tempo circadiano. Quando comparado com os controles WT, Bmal1 -/- As neuroesferas DG tiveram um número aumentado de células PI-positivas, indicativo de células danificadas, particularmente perto das lacunas.

Níveis aumentados de ROS foram relatados em Bmal1 -/- ratos [56]. É possível que Bmal1 -/- Neuroesferas DG também geram mais ROS do que esferas WT ou são mais sensíveis ao estresse de ROS, levando à apoptose. Essas possibilidades são apoiadas pela maior intensidade geral de imunofluorescência para o marcador apoptótico caspase – 3 que observamos em Bmal1 -/- Esferas KO. A porcentagem de células positivas para caspase – 3 também foi significativamente elevada em relação ao controle no nível da lamela de seções de imagem confocal, abaixo das neuroesferas anexadas. O acesso ao meio de cultura seria baixo neste local, sugerindo novamente que a perda de Bmal1 leva a uma maior sensibilidade a estressores e aumento da morte celular quando a sobrevivência celular é desafiada [39, 57].

Um estudo anterior do oscilador circadiano em fibroblastos embrionários de camundongo descobriu que a perda de Cry1, 2 causou aumento da proliferação celular, mas apenas em condições de hipóxia [58]. Por outro lado, não houve mudanças na proliferação celular de células nocaute do criptocromo em condições normais de cultura [59]. Surpreendentemente, observamos redução da expansão da neurosfera, um possível indicador de proliferação celular, em Choro 1 -/- , 2 -/- neuroesferas, que podem refletir diferenças entre culturas de células e condições de cultura de neuroesferas ou entre fibroblastos e NSPCs. No entanto, os estudos devem examinar a proliferação celular especificamente no núcleo da Choro 1 -/- , 2 -/- neuroesferas porque esta área é tipicamente mais hipóxica.

Existe uma escassez de informações sobre Bmal1 -/- células em cultura. Estudos recentes usando Bmal1- células modificadas sugerem que o relógio circadiano altera a taxa mitótica de diferentes maneiras, dependendo do tipo de célula: Hepatócitos cultivados a partir de Bmal1 -/- os animais exibem um atraso na fase G1-S do ciclo celular [4], enquanto a superexpressão dessa proteína em células NIH3T3 aumenta a taxa de proliferação celular [29]. Um estudo mostrou um aumento na proliferação na zona subgranular de Bmal1 -/- animais [1], enquanto outro relatou proliferação normal e aumento da sobrevivência celular no SGZ in vivo [2]. Não observamos um aumento da taxa de proliferação em Bmal1 -/- Neuroesferas DG ou SVZ. Os tamanhos das esferas não foram significativamente diferentes daqueles dos animais WT.

Relógios circadianos e diferenciação neural

Estudos recentes identificaram ligações entre os principais genes do relógio circadiano e fatores que regulam a neurogênese adulta. Um relatório mostrou que Rev-erbα regula a neurogênese por meio de Fabp7 modulação [60]. NeuroD1, um fator de transcrição neurogênico, demonstrou ser regulado pelo complexo BMAL1 / Clock. Os autores também relataram um declínio na porcentagem de células positivas para o marcador neuronal MAP2 após a transfecção celular com siRNA BMAL1 [41]. Este resultado interessante está de acordo com o estudo atual em que Bmal1 -/- as células da neuroesfera não conseguiram gerar neurônios enquanto em B27M, um meio de diferenciação neuronal. Confirmamos nossos resultados usando marcadores neuronais imaturos (BetaIII-tubulin + e DCX +) e maduros (NeuN +) e registramos muito poucas células de ambos os fenótipos.

Em contraste, houve aumento do número de células GFAP + quando Bmal1 -/- as neuroesferas foram cultivadas em B27M. Nossos resultados também concordam com um estudo recente no qual o aumento do número de astrócitos foi observado no córtex cerebral e no hipocampo de crianças de 6 meses de idade. Bmal1 -/- camundongos. Perturbação do relógio circadiano no cérebro pela eliminação de Bmal1 também foi mostrado para induzir estresse oxidativo, astrogliose, degeneração dos terminais dos axônios e perda de neurônios [28].

Algumas das características observadas especificamente em Bmal1 -/- neuroesferas, incluindo lacunas, podem ser atribuídas à perda de uma função não circadiana da proteína, em vez de perda do tempo circadiano. Se esses fenômenos foram causados ​​pela perda de processos dependentes do relógio, eles deveriam ter aparecido em Bmal1 -/- e Choro 1 -/- , 2 -/- esferas porque ambos não têm um relógio funcionando, mas eles foram associados apenas com Bmal1 -/- . Alternativamente, conforme descrito abaixo, as diferenças entre os dois tipos de esfera knockout podem ter sido porque seus relógios circadianos foram interrompidos de duas maneiras diferentes, conseqüentemente agindo em fases separadas do ciclo circadiano e fazendo com que os níveis das muitas proteínas controladas por relógio também difiram . Curiosamente, o efeito sobre o crescimento da neurosfera a partir da perda de Cry1 e Cry2 também pode depender de uma função não-relógio de CRY1 porque, como DG e SVZ Choro 1 -/- , 2 -/- esferas, SVZ Choro 1 -/- as esferas eram significativamente menores após 35 dias de diferenciação, embora os ritmos circadianos não devessem ter sido eliminados. Estes resultados sugerem papéis diferentes, mas sobrepostos, para CRY1 em neuroesferas DG e SVZ.

Quer tenha sido causado por perda de tempo ou não, o baixo número de células BetaIII-tubulin +, DCX + e NeuN + juntamente com o aumento do número de células GFAP + em nossas culturas confirmaram que Bmal1 é essencial para a neurogênese normal. Junto com os relatórios mencionados anteriormente que examinam a neurogênese in situ, concluímos que a determinação do destino na diferenciação de neuroesferas depende da BMAL1.

Nossos resultados, conforme mostrado na Tabela 2, não concordam com o estudo de Bouchard-Cannon et al. que relata aumento da proliferação celular em pacientes com 40 dias de idade Bmal1 -/- animais, com base na expressão do marcador mitótico Ki67 e NeuN + [1]. A diferença observada em nosso estudo pode ser devido à idade mais jovem dos animais que usaram. Outro estudo não relatou efeito sobre a proliferação em 60 dias de idade Bmal1 -/- animais [2]. Existem muitas vias possíveis pelas quais o relógio pode regular a neurogênese. O relógio circadiano pode afetar diretamente a diferenciação por meio de seu controle de um elemento E-box na região promotora de fatores de transcrição neurogênicos, como NeruoD1, Pax6, etc. [41]. A região promotora do gene NeuroD1 contém nove E-box [61, 62]. Os relógios circadianos também podem regular o comprometimento do destino modulando miRNAs. Por exemplo, o heterodímero Clock / BMAL1 regula o miRNA 219 [63] que promove a diferenciação de oligodendrócitos [64]. Nossos resultados indicam que a perda de BMAL1 em ​​NSPCs suprime o comprometimento do destino neuronal e pode direcionar os NSPCs em direção a uma linhagem astroglial.

Insights de neuroesferas DG

Os efeitos sobre o crescimento das neuroesferas que observamos em resposta a ambos os nocautes do relógio circadiano indicam que as proteínas que atuam no mecanismo de temporização do oscilador também são importantes na neurogênese. Se, por outro lado, os efeitos fossem encontrados apenas nas esferas de um nocaute, mas não do outro, ficaria claro que o relógio não é necessário para que a neurogênese normal prossiga. No entanto, os diferentes efeitos em NSPCs observados nos dois tipos de neuroesferas nocaute sugerem que eles podem ser causados ​​por déficits exclusivos das proteínas ausentes. Parece igualmente provável que essas diferenças se devam aos diferentes papéis desempenhados pelas proteínas no mecanismo de temporização. As proteínas atuam em diferentes fases do ciclo circadiano com muitas horas de intervalo [65], e os padrões de expressão de proteínas que induzem também são distintos. Os fenótipos que as esferas de nocaute exibem parecem ser devido à falta de tempo circadiano e ao estado único das proteínas de relógio que cada nocaute gera. Por exemplo, mPER2 os níveis de proteína estão elevados e BMAL1 está em níveis baixos em Cry1 -/- , 2 -/- ratos [66]. Quantos genes controlados por relógio a jusante que estão sob Bmal1 controle de tempo [67] responde de forma diferente a suprimida ao invés de ausente Bmal1 pode explicar por que as características da neuroesfera produzidas pelos dois nocautes diferem: alguns desses genes efetores podem ser induzidos sob uma condição, mas não na outra.

As culturas da neuroesfera também são bastante informativas porque exibem capacidades endógenas e comportamentos de NSPCs que podem proceder independentemente da regulação neural que controla a proliferação e diferenciação das células-tronco no cérebro. Semelhante ao cérebro embrionário em desenvolvimento, as culturas da neuroesfera adulta revelam mecanismos pelos quais as células neurais surgem apenas de origens de células semelhantes à glia [68]. A sequência de tipos de células progenitoras em culturas de esfera pode ocorrer em uma taxa diferente do que in situ, mas eventualmente os precursores imediatos de neurônios maduros e glia aparecem. Se neurônios totalmente funcionais são produzidos a partir das neuroesferas usadas aqui, ainda está para ser determinado.No entanto, está claro que a proliferação diminuída, o aumento da apoptose e o destino celular alterado observados nas esferas de nocaute não podem ser atribuídos ao controle ou à falta de controle por meio de sinalização neural. A tendência de produzir células com características semelhantes a astrócitos, em vez de neuronais, é bastante semelhante à gliose excessiva observada no Bmal1 -/- cérebro de camundongo [28]. Este resultado indica que uma decisão crítica das células progenitoras na definição do rendimento neurogênico depende de um evento de tempo circadiano intrínseco aos NSPCs ou meramente da presença desta proteína chave nessas células.

Relógio, neurogênese e formação de memória

O aumento da neurogênese do hipocampo está correlacionado a um maior desempenho cognitivo em animais. Melhorias relacionadas à neurogênese foram relatadas na aquisição e retenção da memória na consolidação da memória espacial (labirinto aquático de Morris, teste do braço radial), memória condicionada pelo medo, memória contextual do medo, memória perceptual olfativa e separação de padrões [69-72]. A ablação seletiva de células-tronco neurais em animais transgênicos ou depleção do pool de células-tronco por tratamentos anti-mitóticos tem mostrado alterar as memórias de reconhecimento de lugar e objeto [73-75]. A neurogênese no bulbo olfatório tem se mostrado crítica para tarefas de discriminação de odores, memória de odores e aprendizagem [76, 77]. No geral, a neurogênese adulta é importante por seu significado adaptativo - por exemplo, na evitação de predadores, comportamento de homing, localização de comida ou identificação de parceiros [77].

Da mesma forma, o sistema de tempo circadiano fornece aos animais a capacidade de antecipar eventos diários previsíveis que afetam sua sobrevivência ou aptidão. As proteínas centrais do relógio circadiano que atuam no mecanismo de temporização são encontradas em todo o hipocampo [23], e prejudicar sua expressão normal causa déficits na habituação, no comportamento exploratório e no aprendizado [24]. Choro 1 -/- , 2 -/- camundongos exibem memória de reconhecimento prejudicada, ansiedade aumentada [78] e falta de associações de tempo-lugar [22], embora nenhum déficit na formação de memória de trabalho ou de longo prazo tenha sido relatado. Em contraste, Bmal1 -/- camundongos mostram uma capacidade de aprendizado diminuída e foi relatado anteriormente que exibem fenótipos associados com envelhecimento acelerado [1, 39]. Per2 -/- camundongos mostraram memória de medo de rastreamento prejudicada, potenciação de longo prazo suprimida (LTP) e fosforilação de CREB diminuída [14]. Efeitos equivalentes foram observados em mPer1 -/- camundongos nos quais a memória espacial, ativação de CREB e LTP diminuíram [23, 79], sugerindo ainda que Por os genes têm efeitos adicionais nas funções do hipocampo, talvez independentemente de seu papel no tempo circadiano.

A habilidade especializada do hipocampo em substituir seus interneurônios aumenta a possibilidade de que vários dos déficits relacionados ao relógio descritos se manifestem por meio de alterações na neurogênese. A presença da atividade do relógio circadiano observada neste estudo durante a diferenciação da neuroesfera encoraja um exame mais aprofundado das influências das proteínas circadianas na determinação e proliferação celular. As propriedades circadianas dos NSPCs podem ser exploradas ao modificar essas células para fornecer tratamentos ao cérebro para corrigir doenças neurodegenerativas ou traumas cerebrais. Por exemplo, se a diferenciação em neurônios e glia for controlada pelo relógio, então o rendimento relativo dos tipos de células pode ser manipulado por meio da expressão da proteína do gene do relógio. Além disso, conhecendo a fase dos ritmos NSPC in situ, pode ser possível determinar quando as células são menos sensíveis aos efeitos deletérios dos medicamentos. Além disso, a entrega de quimioterapias contra o câncer pode ser programada para uma fase específica do ritmo NSPC para minimizar a toxicidade das células-tronco e neurogênese adulta prejudicada.


Introdução

Estudos recentes sugerem que os relógios circadianos celulares podem regular a neurogênese adulta e a sobrevivência de neurônios recém-formados [1, 2], embora faltem estudos circadianos de neurogênese in vitro. Durante a neurogênese adulta, as células-tronco neurais multipotentes se auto-renovam e se diferenciam para gerar neurônios. O giro denteado (DG) e a zona subventricular (SVZ) são duas áreas bem conhecidas do cérebro de mamíferos contendo células-tronco neurais (NSCs), que são mantidas em um ambiente celular único. Este nicho para NSCs é emulado in vitro dentro de neuroesferas que são culturas derivadas de DG e SVZ.

Ritmos circadianos são endógenos, oscilações de quase 24 horas na expressão gênica, fisiologia ou comportamento que são gerados em células animais por dois loops de feedback transcricional-translacional em interação nos quais genes do relógio central (por exemplo, Período, Criptocromo, e Bmal1) são ativados ritmicamente [3]. O relógio circadiano pode acoplar-se ao ciclo celular [4] e modular a proliferação celular [5]. O oscilador circadiano bloqueia o ponto de verificação G2 / M do ciclo celular via gene relógio wee1 [6] e a transição G1 / S via genes controlados por relógio p20 e p21 [4, 7]. O controle do ciclo celular sobre o relógio circadiano também foi mostrado, mas é menos bem compreendido do que a regulação do ciclo celular pelo relógio [8, 9].

A modulação da neurogênese e da proliferação de NSC por um relógio endógeno no GD permanece amplamente inexplorada. Cortisol, melatonina e vários neurotransmissores sob controle do relógio circadiano parecem regular a neurogênese diária no sistema nervoso central [10 & # x0201313]. Ritmos circadianos em mPer2 expressão foi relatada em culturas de explante hipocampal [14], embora um estudo separado não detectou ritmos na DG in vivo [15]. As células progenitoras neurais do hipocampo de camundongos se dividem com mais frequência à noite [1, 16]. Sono perturbado ou alterações da fase do relógio circadiano também demonstraram suprimir a neurogênese, conforme indicado pela expressão reduzida de duplecortina (DCX), um marcador de neurônios imaturos [17].

Os ritmos circadianos influenciam a aprendizagem, o desempenho cognitivo e a formação da memória em diferentes espécies [18 & # x0201320]. Estudos descrevem a interrupção dos ritmos circadianos alterando o desempenho da aprendizagem e da memória, aprendizagem espacial, habituação intra e interseção, aprendizagem do local, potencialização de longo prazo e memória do medo de rastreamento [14, 21 & # x0201324]. Os genes do criptocromo também são necessários para a aprendizagem no local do tempo [22]. Esses estudos fornecem muitas evidências de que um relógio circadiano funcional é necessário para a formação e persistência ideais da memória [25].

Durante a neurogênese adulta, as células granulares recém-fabricadas produzidas dentro do DG formam sinapses hipocampais funcionais que parecem fornecer desempenho aprimorado de tarefas de memória espacial, humor aprimorado e reparo neural [26, 27]. Como o aumento da neurogênese está associado a habilidades cognitivas aprimoradas em roedores, o controle circadiano ideal da divisão celular que introduz novos neurônios no circuito do hipocampo também pode aumentar o desempenho. Por exemplo, níveis mais elevados de proliferação celular na DG de camundongos knockout sem BMAL1 foram mostrados em um estudo [1], enquanto outro estudo descreveu a proliferação normal na DG de Bmal1 -/- camundongos knockout [2]. Knockout de BMAL1 usando shRNA de lentivírus em culturas de neurônios primários de camundongos causou aumento da morte celular e knockdown mediado por siRNA de Bmal1 mostrou efeitos semelhantes [28]. Superexpressão de Bmal1 em NIH3T3, as células produziram um aumento na proliferação celular [29]. Em contraste, a perda de funcionamento do mPER2 aumentou a proliferação de DG NSPC [15]

Ritmos circadianos na expressão do gene clock estão tipicamente ausentes em células-tronco embrionárias ou multi-potentes, mas aparecem em células progenitoras e tecidos mais diferenciados [30, 31]. Uma questão importante é se as células progenitoras-tronco neurais adultas (NSPCs) são células do relógio circadiano que são capazes de ritmos circadianos endógenos sustentados. Nosso estudo identifica os ritmos circadianos nas culturas da neurosfera DG, independentemente das influências rítmicas e das pistas de tempo do animal ou de seu ambiente. Também descrevemos propriedades de culturas de neurosfera do DG de Bmal1 -/- e Choro 1 -/- , 2 -/- camundongos double knockout sem ritmos circadianos. Nossos resultados indicam que esses genes do relógio circadiano não são necessários para a formação da neuroesfera in vitro, mas sua ausência retarda o crescimento da neuroesfera, suprime o comprometimento do destino neuronal e aumenta a apoptose.


Resultados

Mll1 é expresso em todas as camadas neuronais da retina do rato

Para determinar os padrões espaciais e temporais de Mll1 expressão na retina do rato, nós analisamos Mll1 níveis de transcrição e distribuição durante o desenvolvimento. Ensaios PCR quantitativos em tempo real (qRT-PCR) com Mll1específico do "Conjunto de primer 1" (Fig. 1A, Tabela Suplementar S1) mostrou que Mll1 a expressão foi constante do dia 0 pós-natal (P0) a P5, mas aumentou significativamente na segunda semana pós-natal (Fig. 1B), o período crucial para a diferenciação terminal dos neurônios da retina. No local hibridização (ISH) com um Mll1 sonda (Fig. 1A) mostrou Mll1 transcrições detectáveis ​​já no Dia Embrionário 12 (E12), distribuídas uniformemente por toda a camada de neuroblastos (NBL, Fig. 1C) onde ocorre a neurogênese. Em E16, Mll1 foi expresso tanto no NBL quanto na camada de células ganglionares (GCL, Fig. 1D). Mll1 a expressão foi continuamente detectada em todas as camadas de desenvolvimento pós-natal e retinas de camundongos maduros de P0 a P21 (Fig. 1E-I). Consistente com os resultados de qRT-PCR (Fig. 1B), a intensidade do sinal ISH foi muito maior em P14 em comparação com P7 e anteriores, particularmente na camada nuclear interna (INL) e GCL (Fig. 1H, G). Em P14, Mll1 a expressão também foi observada na camada nuclear externa (ONL), onde residem núcleos fotorreceptores diferenciados, embora o sinal fosse esparso e muito mais fraco do que INL e GCL (Fig. 1H). Este padrão de Mll1 a expressão permaneceu em P21 (Fig. 1I) e durante a idade adulta. Geral, Mll1 é amplamente expresso em progenitores neurais, neurônios em desenvolvimento e diferenciados, particularmente na retina interna.

Mll1 expressão na retina do mouse e seu nocaute condicional. (UMA) Diagrama do mouse Mll1 sequência de codificação mostrando as posições do domínio SET catalítico e o LoxP locais que flanqueiam os sinais de localização nuclear codificados nos exons 3-4 29. Os locais de ligação para o no local sonda (linha sólida vermelha) e dois pares de iniciadores de RT-PCR (sequências de setas fornecidas na Tabela Suplementar S1) são indicados. (B) Análises quantitativas de RT-PCR de Mll1 mRNA das idades pós-natais indicadas usando o conjunto de iniciadores 1, apresentado como expressão de dobra em relação às amostras P0, com barras de erro representando o erro padrão da média (SEM, n ≥ 3). *p & lt 0,05 com base em ANOVA unilateral com comparações múltiplas de Tukey. (C – I) no local hibridização de Mll1 (vermelho) com coloração nuclear DAPI (azul) em seções transversais da retina de tipo selvagem (C57BL / 6 J) camundongos nos pontos de tempo de desenvolvimento indicados. Observe que a intensidade do sinal aumenta em duas camadas retinianas internas em P14 em comparação com idades anteriores. NBL-camada de neuroblasto GCL-camada de células ganglionares ONL-camada nuclear externa INL-camada nuclear interna. Barra de escala = 25um para os painéis C, D e E-I. (J) Análises quantitativas de RT-PCR de Mll1 Expressão de mRNA usando o conjunto de iniciadores 2. Os resultados são apresentados como expressão dobrada em relação a CreNeg amostras de ninhada, com barras de erro representando SEM (n ≥ 3). *p & lt 0,05 em comparação com CreNeg por ANOVA unilateral com comparações múltiplas de Tukey. (K,eu) No local hibridização com Mll1 sonda em seções transversais da retina de 1 mês de idade CreNeg e Mll1KO camundongos.

Geração de Mll1 nocaute condicional no desenvolvimento de retinas

Para investigar o papel do MLL1 no desenvolvimento da retina, nós eliminamos condicionalmente Mll1 no desenvolvimento de retinas de camundongos usando Cre-LoxP recombinação mediada. Cruzamos ratos carregando Mll1 flox alelos 29 (Fig. 1A) com um Chx10-Cre linha que expressa a recombinase Cre em células progenitoras ao longo do desenvolvimento retinal 37. Para confirmar a recombinação bem-sucedida do Mll1 região floxed, realizamos qRT-PCR para unrecombined Mll1 RNA usando “Primer Set 2” localizado na região excisada por CRE (Fig. 1A). Em P14, as retinas de heterozigotos (Mll1Het) e homozigoto (Mll1KO) camundongos knockout expressaram 55% e 26% das quantidades normais de Mll1 mRNA, respectivamente (Fig. 1J). Para revelar a extensão de Mll1 nocaute (KO) no nível celular, realizamos no local hibridização (Fig. 1K, L) com uma sonda específica para não combinados Mll1 RNA (Fig. 1A). Comparado com CreNeg irmãos da mesma ninhada (Fig. 1K), a maioria das células da retina em Mll1KO retinas não se ligam mais à sonda, embora algumas células tenham permanecido positivas para Mll1 transcrição (Fig. 1L). Assim, nos referimos ao homozigoto Mll1 f / f Chx10-Cre ratos como Mll1KO (ou KO).

Mll1 deficiência causa déficits na função retiniana

Para determinar a consequência de Mll1 deficiência na função retiniana global, realizamos eletrorretinografia (ERG) com 1 mês de idade (1MO). Ambas as formas de onda de resposta adaptadas ao escuro e à luz de Mll1KO ratos mostraram ondas A, ondas B e potenciais oscilatórios, com latências comparáveis ​​a CreNeg controles do companheiro de ninhada (Fig. 2A, D). Contudo, Mll1KO as amplitudes diminuíram acentuadamente (Fig. 2A-E) na maior parte da faixa de intensidades de luz testadas em ambas as condições. Notavelmente, as reduções de amplitude adaptadas ao escuro foram desproporcionalmente maiores para as ondas B do que A (Fig. 2F), sugerindo que Mll1KO as retinas não têm apenas disfunção de bastonetes / cones, mas também déficits na transmissão do sinal visual dos fotorreceptores para os neurônios internos. Esses defeitos não pioraram com a idade até 6 meses (dados não mostrados), argumentando contra a degeneração progressiva neste modelo. Finalmente, ambos os irmãos heterozigotos da mesma ninhada (Mll1Het) e Cre-expressando camundongos sem floxed Mll1 alelos mostraram apenas pequenas reduções não significativas em suas amplitudes de ondas A e B em relação a CreNeg controles (Fig. 2B, C, E), indicando que Mll1 deficiência, não Cre expressão em si, é responsável por Mll1KO déficits funcionais.

Análises de eletrorretinograma (ERG) de Mll1KO ratos e controles da ninhada. Animal inteiro adaptado ao escuro (A – C) e adaptado à luz (D,E) ERGs flash foram realizados em camundongos 1MO. (UMA,D) Exemplos de formas de onda em resposta à intensidade do flash de luz mais brilhante testada. (B,C,E) As amplitudes médias das ondas A e B adaptadas ao escuro e B adaptadas à luz foram representadas graficamente em relação à intensidade da luz de estímulo. Barras de erro representam SEM *p & lt 0,05 em relação a CreNeg controles por ANOVA de medidas repetidas bidirecionais e comparações múltiplas de Tukey (n ≥ 4). (F) Adaptado ao escuro Mll1KO As amplitudes das ondas A e B para as cinco intensidades de flash mais brilhantes testadas foram normalizadas para a respectiva média CreNeg amplitudes e representadas graficamente.

Mll1 deficiência produz retinas mais finas, afetando particularmente as camadas internas

Para determinar se Mll1KO os déficits funcionais visuais decorrem da arquitetura retiniana anormal, examinamos cortes retinais P24 corados com hematoxilina e eosina (H & ampE) (Fig. 3). Mll1KO retinas de adultos jovens pareciam grosseiramente normais com camadas neuronais bem separadas, mas pareciam mais finas do que CreNeg controles (Fig. 3B, A). Medimos a espessura de toda a retina e das camadas nucleares individuais a várias distâncias da cabeça do nervo óptico (Fig. 3C-E). A espessura total da retina foi significativamente reduzida em ambos os lados superior e inferior em comparação com CreNeg companheiros de ninhada (Fig. 3C). Embora ONL (Fig. 3D) e INL (Fig. 3E) fossem mais finos em Mll1KO retinas, apenas as mudanças INL alcançaram significância estatística, sugerindo que a redução da espessura de Mll1KO retinas é amplamente atribuível a diminuições nas células INL e seus processos / sinapses.

Coloração H & ampE de CreNeg (UMA) e Mll1KO (B) seções transversais da retina em P24. (C – E) Quantificação morfométrica da espessura da camada retinal nas posições indicadas da cabeça do nervo óptico (ONH). SUP e INF indicam medidas tomadas 100um da borda superior ou inferior da retina. *p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001 ****p & lt 0,0001, com base em ANOVA de duas vias com medidas repetidas e teste de comparações múltiplas de Sidak (n = 4). Os resultados histológicos em outras idades são mostrados na Fig. S1 suplementar. A morte celular no desenvolvimento de retinas avaliada por imunocoloração para Caspase 3 clivada é mostrada na Fig. S2 suplementar.

Também examinamos seções retinianas coradas com H & ampE em várias idades pós-natais (Fig. Suplementar S1). Em P0, Mll1KO retinas já eram ligeiramente mais finas do que CreNeg controles (Suplementar Fig. S1A-D). No P7, Mll1KO retinas mostraram separação ONL e INL normais (Fig. Suplementar S1F vs S1E), mas eram significativamente mais finas do que CreNeg controles, particularmente o INL (Suplementar Fig. S1G-I). Mll1KO retina e reduções de espessura INL persistiram em P14 (Fig. Suplementar S1J-N) e na idade adulta jovem (Fig. 3). As análises morfométricas realizadas aos 7 meses mostraram um padrão semelhante (Fig. Suplementar S1O-S), consistente com as reduções de amplitude ERG relativamente constantes. Juntos, esses resultados sugerem que as anormalidades funcionais e morfológicas que se desenvolvem em Mll1KO retinas durante a neurogênese e diferenciação terminal não desencadeiam degeneração retiniana.

Para investigar a causa do afinamento da retina em Mll1KO camundongos, nós imunocoramos para Caspase-3 ativada em cinco diferentes idades de desenvolvimento, E16, P0, P3, P7 e P14. O número de células apoptóticas foi comparável ou diminuiu em comparação com os controles em todas as idades (Fig. S2 suplementar). Assim, o desbaste de Mll1KO retinas é improvável devido ao aumento da morte celular.

Mll1 deficiência reduz a proliferação de células progenitoras e a progressão do ciclo celular

Para determinar se a diminuição da proliferação celular contribuiu para Mll1KO afinamento da camada retinal, realizamos imunomarcação Ki67 para células em proliferação em seções transversais da retina de Mll1KO e CreNeg ratos de controle. A Figura 4A-C mostra imagens representativas tiradas em P0, quando a espessura alterada da retina foi detectada inicialmente em Mll1KO retinas. O número de células proliferativas Ki67 + diminuiu moderadamente em Mll1KO mas não heterozigoto (Mll1Het) retinas, em comparação com CreNeg companheiros de ninhada (Fig. 4D). Células Ki67 + diminuídas também foram observadas em Mll1KO retinas em P3 e P5 (dados não mostrados) e confirmados por experimentos de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) (Fig. Suplementar S3A). Assim, Mll1-células progenitoras deficientes perdem prematuramente seu potencial de proliferação.

Perda de Mll1 nas células progenitoras da retina resulta em proliferação e defeitos do ciclo celular. (A-C) Imunocoloração Ki67 (verde) para células proliferativas com coloração nuclear DAPI (azul) de seções transversais da retina em CreNeg (UMA), Mll1Het (B) e Mll1KO (C) camundongos em P0. (D) Quantificação de células Ki67 + em três regiões de 100 μm 2 por seção transversal, três seções transversais por amostra e três amostras por genótipo. Os resultados são exibidos como média + SEM (n = 3). (POR EXEMPLO) Imunocoloração da fosfo-histona H3 (PH3) (verde) com DAPI (azul) das mesmas amostras para células na fase mitótica (M-) do ciclo celular. (H) Quantificação do número de células Ki67 + positivas para PH3 por seção transversal, normalizado para o número em CreNeg Seções. Os resultados são exibidos como média + SEM. (eu) Para determinar as células da fase S em retinas P0, EdU foi injetado IP em filhotes de camundongos P0 e as retinas colhidas 4 horas depois. (J – L) Células marcadas com EdU (verde) com DAPI (azul) em cortes retinais de retinas colhidas. (M) Quantificação do número de células Ki67 + reativas para EdU em três regiões de 100 μm 2 por seção transversal, em relação ao número em CreNeg Seções. Os resultados são exibidos como média + SEM. *p & lt 0,05, n.s. = não significativo por ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Tukey (n = 3). As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela Suplementar S2. Reduções nas células em proliferação também foram detectadas em Mll1KO retinas em P3 e P5 usando marcação de pulso EdU (Fig. Suplementar S3A).

Para determinar qual fase do ciclo celular foi afetada, primeiro nós imunocoramos seções retinais de P0 para fosfo-histona H3 (PH3) para marcar células em mitose (fase M). Células PH3 + foram detectadas na camada externa de neuroblastos da retina (NBL) de todos os genótipos (Fig. 4E-G). Quando contadas e ajustadas para o número de células em proliferação marcadas com Ki67, as células na fase M foram ligeiramente, mas significativamente aumentadas em Mll1KO retinas em relação a CreNeg controles, enquanto Mll1Het As células da fase M não mostraram alterações significativas (Fig. 4H). Em seguida, avaliamos os números de células da fase S por marcação de pulso EdU (Fig. 4I): Após um pulso de 4 horas, as células marcadas foram distribuídas principalmente na parte interna do NBL, e Mll1KO retinas tinham menos células de fase S do que CreNeg e Mll1Het retinas (Fig. 4J-L). Devido às diferenças nos números de células Ki67 + entre os genótipos, contamos o número de células positivas para Ki67 e EdU para determinar se as proporções de células em proliferação na fase S diferiam. Ambos Mll1KO e Mll1Het populações de células progenitoras em proliferação tinham porcentagens comparáveis ​​de células em fase S a CreNeg controles (Fig. 4M). Este aumento desproporcional de células da fase M sugere que o MLL1 regula a progressão da fase M nos progenitores da retina.

O MLL1 é conhecido por ser necessário para a progressão normal do ciclo celular em células em cultura por meio da regulação de ciclinas, quinases dependentes de ciclina (CDKs) ou inibidores 38. Para testar se os genes relacionados à ciclina são expressos normalmente em retinas neonatais de Mll1KO camundongos, nós imunocoramos retinas P0 para ciclina D1 (CCND1) 39,40 e o inibidor de CDK P27 Kip1 41,42, ambos regulando o ciclo de RPC apropriado no desenvolvimento de retinas. O número de células positivas para CCND1 era comparável em P0 Mll1KO vs. CreNeg controlar retinas (Suplementar Fig. S3B, C), sugerindo que Mll1KO retinas mantêm a capacidade de expressar CCND1 durante o ciclo celular, pelo menos nas retinas P0. No entanto, o número de células P27 Kip1 positivas foi significativamente menor em Mll1KO do que em CreNeg controles (Suplementar Fig. S3D, E). Uma vez que P27 Kip1 é expresso tanto em células cíclicas quanto transitoriamente em todas as linhagens retinais pós-mitóticas 42, essa redução provavelmente reflete a diminuição do número de células em proliferação e sua progênie em Mll1- retinas deficientes (Fig. 4D). Esses resultados apóiam o raciocínio de que o início do período pós-natal Mll1KO as retinas apresentam um defeito na proliferação de RPC e na progressão do ciclo celular que não prejudica diretamente a expressão da Ciclina D1.

Mll1 a deficiência altera a composição das células retinais e a razão neurônio-glia

Para determinar se a perda de células progenitoras da retina afeta a composição do tipo de célula em Mll1KO retinas, quantificamos os tipos de células de origem precoce e tardia em cortes transversais de retina P24 após a diferenciação celular estar completa. Nós nos concentramos nas células da retina interna, uma vez que esta camada é significativamente afetada em Mll1KO retinas (Fig. 3). A Figura 5A mostra seções retinais coradas com marcadores para gânglio (GC), horizontal (HC), neurônios starburst amacrina (AC) e bastonete ON-bipolar (BC) e glia de Muller (MG). Cada tipo de célula neuronal estava presente, mas diminuiu em Mll1KO comparado com CreNeg retinas, com as populações HC e AC as mais afetadas (Fig. 5A, B). Em contraste, MGs estavam presentes em números comparáveis.

Mll1 a deficiência altera a composição do tipo de célula retinal em P24, mas não em P0. (UMA) Imunocoloração de seções transversais da retina de P24 CreNeg e Mll1KO camundongos com anticorpos para marcadores específicos para tipos de células retinais internas (verde): Brn3a para células ganglionares (GC) Calbindina para células horizontais (HC) Calretinina para células amácrinas estelares (AC) Proteína quinase C-alfa (PKC- A) para On- Células Bipolares (BC) Glutamina Sintetase (GS) para Muller Glia (MG). As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela Suplementar S2. (B) Mudanças na contagem de células de cada tipo de célula retinal interna em Mll1KO retinas, apresentadas como número médio de células em relação a CreNeg, com barras de erro representando o erro padrão da média (SEM, n = 4). *p & lt 0,01, n.s. = não significativo por ANOVA de dois fatores. (C) Diagrama esquemático mostrando quando os progenitores de cada tipo de célula retinal saem do ciclo celular. Os tipos de células primitivas incluem GC, HC e Cone (setas cinza claro). Os tipos de células tardias incluem Rod, BC e MG (barras pretas). Diferentes subtipos de células amácrinas (ACs) nascem tanto no início quanto no final (indicado pela barra cinza escuro). (D) Imunocoloração de seções transversais retinais P0 para marcadores de tipos de células nascidas precoces: Brn3a para GC, Onecut1 (OC1) para HC, AP-2 alfa (AP-2a) para AC nascida precoce e RXRγ para Cone. (E) O número de células reativas para cada marcador por seção transversal da retina foi contado. Os resultados são apresentados como número médio de células em relação a CreNeg com barras de erro representando SEM. n.s. = não significativo por ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Tukey (n = 3).

Para determinar a fonte dessas mudanças na composição celular, primeiro investigamos se as células progenitoras da retina (RPCs) produziram os números esperados de precursores neuronais comprometidos. Durante o desenvolvimento do camundongo, os RPCs geram cada um dos sete principais tipos de células da retina dentro de um período definido (Fig. 5C) 2,3. Começamos pela coloração de retinas P0 para fatores de transcrição específicos em diferentes tipos de células nascidas precoces, GC (Brn3a), HC (OC1), AC nascida precocemente (AP2α) e Cone (RXRγ) (Fig. 5D). As contagens de células mostraram que, em P0, os números de cada tipo de célula nascida são comparáveis ​​em Mll1KO vs. CreNeg retinas de controle (Fig. 5E), sugerindo que a neurogênese mediada por RPC precoce não é amplamente afetada em Mll1-retinas deficientes. Assim, mecanismos pós-neurogênicos desconhecidos devem ser responsáveis ​​pela perda de células nascidas precocemente em idades posteriores.

Em seguida, examinamos os tipos de células gerados a partir de RPCs tardios, usando EdU pulse-chase. Os progenitores retinais P3 marcados com EdU foram avaliados quanto às suas escolhas de destino em P14, quando a especificação do tipo de célula retinal está completa 5 (Fig. 6A). Os progenitores P3 dão origem a Rod, BC e alguns neurônios AC e à glia de Muller 5. Como esperado, seções transversais de P14 CreNeg retinas mostraram muitas células EdU + em ONL e INL com um gradiente periférico a central (Fig. 6B, B ’, B"). Em contraste, Mll1KO retinas tinham menos células EdU +, principalmente vistas nas regiões periféricas distantes (Fig. 6C, C ', C "). A quantificação revelou aproximadamente um terço das células EdU + em Mll1KO Como CreNeg retinas (Fig. 6D), consistente com a proliferação diminuída descrita acima.

Mll1 a deficiência altera a capacidade neurogênica vs gliogênica das células progenitoras tardias. (UMA) Diagrama esquemático que mostra a estratégia experimental para rotular células de nascimento tardio: filhotes de camundongos P3 foram injetados IP com EdU. Em P14, as retinas foram coletadas para contar o número de quatro tipos de células nascidas tardias. (B,C) Distribuição de células positivas para EdU (vermelho) em marcadas com DAPI CreNeg (B) e Mll1KO (C) Seções transversais da retina P14. Inserções (B ’, B", C ’, C") mostram detalhes em maior ampliação das áreas indicadas. (D) Quantificação de células positivas para EdU em seções transversais inteiras da retina, três seções por amostra e três amostras por genótipo. Os resultados são representados como média + SEM. ANOVA de duas vias, **p & lt 0,0001. (E) Seções de retina marcadas para EdU (vermelho) foram co-coradas com anticorpos para marcadores de destino celular (verde), conforme indicado. (F) Contagens de células para os diferentes tipos de células derivadas de células progenitoras marcadas com P3 EdU em Mll1KO retinas (barras vermelhas), normalizadas para contagens de CreNeg ninhada. As barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas (n = 3). *p & lt 0,05, n.s. = não significativo por ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Sidak.

Em seguida, co-imunocoramos cortes retinais para quatro tipos de células nascidas tardias esperadas das células marcadas com EdU (Fig. 6E): MG (p27 Kip1), Rod (RHO), AC (PAX6) e Rod ON-BC ( PKC-A). A quantificação de células duplamente positivas (Fig. 6F) revelou que o número de MG marcadas com EdU por Mll1KO seção da retina foi quase o dobro do número médio em CreNeg seções, enquanto o número de ACs foi reduzido em 20%. A proporção de bastonetes e BCs também foi ligeiramente, mas não significativamente reduzida nas retinas mutantes. Assim, as células progenitoras P3 em Mll1- retinas deficientes em células gliais superproduzidas às custas dos neurônios, especialmente AC, sugerindo um papel do MLL1 no estabelecimento da composição celular apropriada e da razão neurônio para glia durante a retinogênese.

A análise de RNAseq suporta mudanças complexas na composição das células da retina

Para determinar se a composição celular alterada está correlacionada com mudanças de expressão gênica em tipos específicos de células retinais (subtipos), a análise de RNAseq foi realizada em amostras retinais em triplicado de Mll1KO (KO) e tipo selvagem (WT) ratos de controle em P14. Os coeficientes de correlação de Spearman de conjuntos de dados RNAseq (Suplementar Fig. S4) mostraram que as réplicas dentro de cada grupo de genótipos se agruparam, e o KO as amostras eram claramente distintas do WT amostras, indicando expressão gênica alterada em KO retinas. Os genes que representam diferentes tipos de células foram agrupados de acordo com conjuntos de dados publicados anteriormente definidos por retinal single-cell drop-seq 43, e plotados de acordo com as diferenças de expressão entre KO vs. WT. A Figura 7A mostra as tendências do nível de expressão de genes expressos em seis tipos de células neuronais e de Muller da glia. No geral, quatro grupos de genes representando neurônios horizontais, ganglionares, amácrinos e bipolares foram diminuídos em Mll1KO, enquanto os genes transcritos por fotorreceptores de bastonetes / cones e células da glia de Muller foram expressos mais alto em Mll1KO que WT. Análises adicionais para os subtipos AC e BC (Fig. Suplementar S5A) mostraram diminuição da expressão gênica em todos os subtipos BC em Mll1KO, enquanto os níveis de expressão gênica variaram em diferentes subtipos de AC, com os subtipos de AC nascidos tardios mostrando maiores reduções do que os subtipos de nascidos anteriores (Fig. Suplementar S5B) 43. No geral, os resultados de RNAseq suportam mudanças na composição celular e na proporção neurônio-glia alterada dos RPCs tardios em Mll1KO retina (Figs 5 e 6).

O MLL1 é necessário para a expressão do gene específico do tipo de célula apropriado. (UMA) Análise de RNAseq em P14 (plotado como a proporção de transcritos em Mll1KO vs C57Bl / 6J amostras) mostra a super-representação dos genes Rod (R), Cone (C) e glial (MG) e redução dos genes do neurônio da retina interna em Mll1-retinas deficientes. (B) Verificação quantitativa (q) por RT-PCR da expressão gênica horizontal selecionada em P14 em Mll1Het e Mll1KO retinas em relação a CreNeg ninhada. As sequências de iniciadores são fornecidas na Tabela Suplementar S3. (C) verificação por qRT-PCR da expressão do gene do cone e da haste selecionada em P14. Os resultados são apresentados como expressão dobrada em relação a CreNeg amostras + SEM (n ≥ 3). *p & lt 0,05, **p & lt 0,0001 em comparação com CreNeg por ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Tukey.

Para validar os resultados de RNAseq, realizamos qRT-PCR em genes selecionados para o conjunto de HC severamente reduzido (Fig. 7B) e conjuntos de bastonetes / cones moderadamente aumentados (Fig. 7C). Consistente com os resultados de RNAseq, três genes específicos de HC, Cx57, Oc1 e Prox1, foram todos expressos em níveis mais baixos em P14 Mll1KO retinas do que CreNeg controles (Fig. 7B). Oc1 e Prox1, que codificam dois TFs essenciais para a especificação de destino de HC 14,15,44, foram reduzidos em 80% e 50%, respectivamente, em P14 Mll1KO. Em contraste, os genes do bastão / cone foram geralmente expressos em níveis semelhantes ou relativamente mais elevados em ambos Mll1Het e Mll1KO em comparação com os controles (Fig. 7C). Uma vez que a espessura ONL de Mll1KO retinas foi relativamente não afetado (Suplementar Fig. S1M), aumento da expressão do gene bastão / cone provavelmente reflete a diminuição em outros tipos de células que contribuem para o RNA retinal total, como resultado de reduções preferenciais de neurônios internos (Suplementar Fig. S1N).

Modificações de histonas consistentes com análise de RNAseq

Na análise de RNAseq e exames histológicos, ficamos surpresos ao ver que os fotorreceptores de bastonetes, que constituem a maioria das células da retina, parecem relativamente normais. Como o MLL1 é conhecido por ativar a expressão do gene específico do tipo de célula por metilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4), nos perguntamos como os níveis dessas marcas de histona são afetados nos mutantes. Extratos retinais inteiros não exibiram diferenças nos níveis de H3K4me3 ou na marca repressiva H3K27me3 em Mll1KO vs. CreNeg camundongos de controle (Suplementar Fig. S6A, B). Além disso, a imunocoloração para várias histonas modificadas, incluindo as marcas ativas H3K4me2, H3K4me3 e H3 Pan-Ac e a marca repressiva H3K27me3, não mostraram diferenças grosseiras entre os tipos de células dentro Mll1KO retinas ou quando comparado com CreNeg amostras de controle (Suplementar Fig. S6C). Juntos, esses resultados sugerem que deve haver outros mecanismos para compensar a perda de MLL1 na orientação do desenvolvimento e manutenção de fotorreceptores e alguns outros tipos de células da retina.

Mll1 deficiência perturba a integridade das células horizontais

Embora as células horizontais (HC) sejam um tipo de célula de origem precoce, seu perfil de expressão gênica foi um dos mais gravemente afetados em Mll1KO retinas. Para determinar se esta mudança resultou de especificação de destino de célula alterada ou manutenção de célula defeituosa, realizamos imunocoloração em três idades pós-natais para OC1 (Fig. 8A-I), um fator de transcrição essencial para especificação de destino de HC e sobrevivência 14,44. No P0, ambos Mll1KO e CreNeg as retinas de controle mostraram números e localizações comparáveis ​​de OC1 + HCs (Fig. 8A-C). Assim, a especificação inicial de HC e a migração pareceram normais em Mll1KO retinas. Em P7, OC1 + HCs foram amplamente mantidos em Mll1KO retinas (Fig. 8D-F). No entanto, por P14, o número de OC1 + HCs em Mll1KO as retinas caíram significativamente para menos de 40% dos controles (Fig. 8G-I). A intensidade de coloração de OC1 também foi drasticamente reduzida nas HCs restantes em comparação com aquelas nas retinas de controle (Fig. 8H vs G), sugerindo que Mll1KO HCs perdem sua integridade e / ou morrem entre P7 e P14.

O MLL1 é necessário para a integridade da célula horizontal. Cortes retinais de CreNeg e Mll1KO camundongos em P0 (UMA,B), P7 (D,E) e P14 (G,H), imunomarcado para OC1 (verde) para marcar células horizontais (pontas de seta). Quantificação de células OC1 + por seção transversal da retina em P0 (C), P7 (F) e P14 (eu), apresentado como células OC1 + médias por seção transversal + SEM. *p & lt 0,05, n.s. = não significativo por ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Tukey (n = 3). Para avaliar ainda mais a distribuição horizontal de células e conectividade em retinas 1MO, a imunocoloração foi realizada em seções transversais da retina (J,K) para Calbindin (vermelho), que rotula corpos celulares de HC e AC, e cadeia média de neurofilamento (verde), que rotula seus axônios. (J,K) As seções transversais da retina mostram a distribuição espacial clara de HC (pontas de seta) e AC (setas brancas). Suportes planos de 1MO CreNeg (eu) e Mll1KO retinas (M), imagens com microscopia confocal no nível do OPL e INL externo revelaram defeitos no mosaico de HC e na rede de distribuição de axônios, bem como neurofilamentos interrompidos (setas) e varicosidades axonais (pontas de setas) em Mll1KO retinas. As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela Suplementar S2.

Para confirmar as reduções em HCs e revelar mudanças no mosaico de HC e distribuição de neurites, realizamos co-imunomarcação para Calbindin e Neurofilament (NF) em seções de retina 1MO e montagens planas. Enquanto os anticorpos para NF marcam axônios HC, Calbindin marca HC e AC somata e dendritos em seções transversais da retina 45. No CreNeg retinas, somata de HC intensamente corado positivo para Calbindina são posicionados na fronteira entre INL e OPL, enquanto somata de AC levemente corado para Calbindina positiva estão localizados no interior de INL e GCL (Fig. 8J). Comparado com os controles, Mll1KO retinas tinham menos e menos HCs positivos para Calbindina (Fig. 8K, pontas de setas brancas) e ACs (Fig. 8K, setas brancas). Além disso, o OPL mutante parecia mais fino e as lâminas de IPL mais desorganizadas em Mll1KO seções retinais em 1MO. Em seguida, realizamos microcopia confocal para visualizar o plano de HC em retinas planas co-coradas para Calbindin (vermelho) e NF (verde). No Mll1KO retinas, Calbindin + HC somata e dendritos eram mais esparsos e mais fracos do que em CreNeg controles (Fig. 8M vs L). Muitos axônios HC em Mll1KO a retina era curta e de aparência anormal, algumas retraídas para o corpo celular ou inchaços axonais (Fig. 8M, pontas de setas brancas). Esses defeitos podem levar a déficits no campo receptivo e função visual anormal. Coletivamente, esses resultados sugerem que o MLL1 não é necessário para a especificação inicial do destino do HC, mas é indispensável para manter a integridade do HC, incluindo identidade, expressão gênica e rede de axônios.

Mll1KO retinas não conseguem desenvolver sinapses OPL normais

Para determinar se os defeitos de transmissão de sinal visual detectados pela análise de ERG podem ser explicados por mudanças na integridade estrutural de OPL, realizamos imunocoloração para duas proteínas pré-sinápticas expressas em fotorreceptores: VGLUT1 é um transportador de glutamato necessário para carregar glutamato em vesículas sinápticas e para transmissão sináptica de fotorreceptores 46,47. CtBP2 (Ribeye) é um componente estrutural essencial das fitas pré-sinápticas 48. Ambos os marcadores eram claramente visíveis no OPL de 1MO CreNeg camundongos, mas diminuiu acentuadamente na mesma idade Mll1KO camundongos (Fig. 9A-D), indicando anormalidades nos terminais pré-sinápticos dos fotorreceptores. Em seguida, examinamos as mudanças ultraestruturais nas sinapses OPL usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Micrografias TEM randomizadas de ambas as amostras de controle e mutantes (Fig. 9E, F) foram analisadas para esférulas de bastonete e pedículos de cone. Mll1KO retinas tinham menos esférulas de bastonetes do que CreNeg controles de ninhada (Fig. 9G), e menos daqueles mostraram fitas de formato normal em Mll1KO do que nos controles (Fig. 9H). Nenhuma diferença significativa no número de pedículos de cone foi detectada entre mutantes e controles (Fig. 9I). Essas descobertas sugerem que o MLL1 é necessário para o estabelecimento de sinapses fotorreceptoras normais para transmissão de sinal visual.

Mll1KO retinas têm defeitos sinápticos. A imunocoloração de seções transversais de retina de 1 mês para o marcador sináptico VGLUT1 (verde) e o marcador bipolar PKC-A (vermelho) (UMA,B), ou para CtBP2 (Ribeye, verde) e aglutinina de amendoim (PNA, vermelho) para cones (C,D) revelam terminais pré-sinápticos de fotorreceptores marcadamente reduzidos no Mll1KO camada plexiforme externa (OPL). As informações sobre anticorpos são fornecidas na Tabela Suplementar S2. Em imagens de microscopia eletrônica do OPL (E,F), as esférulas de bastonete representativas são marcadas com linhas pontilhadas e fitas sinápticas indicadas por pontas de seta. Quantificação do número total de esférulas de bastonete (G) e o número de esférulas com fitas normais (H), exibido como média de esférulas de bastonete por região de 10 μm + SEM. Quantificação do número de pedículos cônicos (eu), exibido como pedículos cônicos médios por 10μm + SEM. *p & lt 0,05, n.s. = não significativo por ANOVA de dois fatores (n ≥ 4).


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Palavras-chave: neurogênese, células-tronco neurais, PATZ1, camundongos knockout, ensaio de neurosfera, zona subventricular

Citação: Mancinelli S, Vitiello M, Donnini M, Mantile F, Palma G, Luciano A, Arra C, Cerchia L, Liguori GL e Fedele M (2021) O regulador de transcrição Patz1 é essencial para a manutenção e proliferação de células-tronco neurais. Frente. Cell Dev. Biol. 9: 657149. doi: 10.3389 / fcell.2021.657149

Recebido: 22 de janeiro de 2021 Aceito: 15 de março de 2021
Publicado: 07 de abril de 2021.

Elena Parmigiani, Universidade de Basel, Suíça
Angela Fontan-Lozano, Universidade de Sevilha, Espanha

Copyright & # x00A9 2021 Mancinelli, Vitiello, Donnini, Mantile, Palma, Luciano, Arra, Cerchia, Liguori e Fedele. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). É permitida a utilização, distribuição ou reprodução em outros fóruns, desde que o (s) autor (es) original (is) e o (s) titular (es) dos direitos autorais sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitida a utilização, distribuição ou reprodução em desacordo com estes termos.


Materiais e métodos

Animals and Drug Administration.

Todos os camundongos foram alojados no Animal and Plant Care Facility da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST), e o Comitê de Ética Animal da HKUST aprovou todos os experimentos com animais. Para obter detalhes sobre a geração de camundongos e administração de drogas, consulte Apêndice SI, Métodos.

Immunohistochemistry and FISH.

Usamos anticorpos de α2-quimerina, Tbr2, DCX, Nestina, BrdU, GFAP, Ki67, NeuN, caspase-3 ativa, GFP, Ttr, Klotho e MCM2 para imunocoloração. Para detalhes, veja Apêndice SI, Métodos.

Os modelos para a síntese de ribossondas para Ttr e Kl eram de corpo inteiro Ttr cDNA e os 810 pb do terminal N de Kl cDNA, respectivamente (46). Para detalhes, veja Apêndice SI, Métodos.

The 10 × Genomics scRNA-Seq and Pathway Analysis.

Realizamos scRNA-seq de acordo com o protocolo do fabricante (10 × Chromium Single Cell 3 ′ Reagent Kit, versão 2 10 × Genomics). Detalhes para a análise de pseudotempo, análise GO, análise STRING e análise GSEA são fornecidos em Apêndice SI, Métodos.

Injeção de vírus, eletrofisiologia e testes comportamentais.

Retrovírus que expressam GFP foram injetados bilateralmente no DG de camundongos WT e α2-KO, e as seções do cérebro foram analisadas em 30 dpi. Para detalhes, veja Apêndice SI, Métodos.

A LTP foi induzida nas aferências das vias perfurantes mediais, e a medição foi estabelecida na camada molecular do DG usando estimulação de explosão teta (TBS). Medimos a magnitude de LTP por 60 min após TBS (Apêndice SI, Métodos).

Todos os testes comportamentais foram realizados em camundongos 3-4 semanas após a injeção de TAM, começando dos 2 aos 3 meses de idade (Fig. 6D) Para obter detalhes de cada experimento comportamental, consulte Apêndice SI, Métodos.

Quantificação e análises estatísticas.

Detalhes para quantificação e análises estatísticas podem ser encontrados em Apêndice SI, Métodos.