Em formação

2.1: Amplificar DNA codificador de aptâmero - Biologia


Introdução

Quando ele era um pós-doutorando, o professor Niles examinou uma biblioteca aleatória de aptâmeros de RNA para encontrar um que se ligasse ao heme - o local que contém ferro na hemoglobina. Sabe-se que o heme pode se ligar a certos fatores de transcrição e modular a expressão gênica (ver referências Zhang e Hach, 1999 e Ogawa, et al., 2001), e aptâmeros de RNA são uma ferramenta potencial para aprender mais sobre redes de sinalização envolvendo heme. Um aptâmero chamado "6-5" sobreviveu à 6ª rodada de triagem, mas acabou não se ligando ao heme. Um aptâmero chamado "8-12" sobreviveu a todas as 8 rodadas de triagem e tem uma afinidade de ligação ao heme de 220 nM. Ambos foram descritos no Niles, et al., 2006 papel referenciado abaixo.

Hoje você receberá dois plasmídeos de arquivo contendo as sequências 6-5 e 8-12, respectivamente. O RNA não é muito estável em comparação com o DNA; assim, aptâmeros de RNA são copiados em suas sequências de DNA associadas para armazenamento de longo prazo. Ligar o fragmento de DNA em um plasmídeo que pode ser transportado em bactérias fornece mais amplificação e capacidades de armazenamento. Faremos uso desses recursos de forma mais ampla no Módulo 2.

Para selecionar e amplificar apenas o pequeno fragmento de DNA que codifica para o aptâmero, você usará a reação em cadeia da polimerase, PCR. O PCR compreende três etapas principais: 1) DNA molde contendo uma sequência desejada é fundido, 2) primers anelam em locais específicos no DNA agora fundido (isto é, fita simples), e 3) os primers são estendidos por uma polimerase para selecionar e crie o produto desejado. A extensão ocorre a ~ 70 ° C, derretendo a ~ 95 ° C e o recozimento a uma temperatura ~ 5 ° C abaixo da temperatura de fusão do primer; assim, a repetição dessas etapas é chamada de ciclagem térmica. Após cada ciclo, os próprios produtos recém-formados tornam-se modelos, causando amplificação exponencial da sequência selecionada. (Observe que as primeiras rodadas de PCR não produzirão o produto desejado - veremos o porquê na aula pré-laboratorial de hoje.)

Assim que o PCR estiver em execução, você começará a explorar algumas ferramentas computacionais para análise de RNA. Durante este módulo, você usará três programas diferentes para explorar as semelhanças de sequência entre aptâmeros candidatos de RNA e estruturas de ordem superior que surgem das sequências primárias. Por hoje, você examinará os graus de similaridade de sequência entre uma lista de aptâmeros, alguns dos quais se ligam ao heme e outros não.

Com base nas inúmeras aplicações do PCR, pode parecer que a técnica existe desde sempre. Na verdade, tem apenas 25 anos. Em 1984, Kary Mullis descreveu essa técnica para amplificar DNA de sequência conhecida ou desconhecida, percebendo imediatamente a importância de seu insight.

"Querido Thor!", Exclamei. Resolvi os problemas mais irritantes da química do DNA com um único raio. Abundância e distinção. Com dois oligonucleotídeos, DNA polimerase e os quatro nucleosidetrifosfatos, eu poderia fazer a sequência de DNA que quisesse e poderia fazê-la em um fragmento de tamanho específico que pudesse distinguir facilmente. De alguma forma, pensei, tinha que ser uma ilusão. Caso contrário, mudaria a química do DNA para sempre. Caso contrário, isso me tornaria famoso. Foi muito fácil. Outra pessoa teria feito isso e eu certamente teria ouvido falar. Estaríamos fazendo isso o tempo todo. O que eu estava falhando em ver? "Jennifer, acorde. Eu pensei em algo incrível." -Kary Mullis de sua Palestra Nobel, 8 de dezembro de 1983.

(Copyright © The Nobel Foundation 1993. Todos os direitos reservados. Este conteúdo está excluído de nossa licença Creative Commons. Para obter mais informações, consulte http://ocw.mit.edu/fairuse.)

Referências

Zhang, L. e A. Hach. "Mecanismo molecular de sinalização heme em leveduras: o ativador transcricional Hap1 serve como o mediador principal." Cell Mol Life Sci 56, não. 5-6 (30 de outubro de 1999): 415-26.

Ogawa, K., et al. "Heme medeia a desrepressão do elemento de reconhecimento Maf por meio de ligação direta ao repressor de transcrição Bach1." EMBO J 20, não. 11 (1 de janeiro de 2001): 2835-43.

Niles, J. C. "Utilizando aptâmeros de RNA para sondar uma rede celular regulada por heme fisiologicamente importante." ACS Chem Biol 1, não. 8 (19 de setembro de 2006): 515-24.

Protocolos

Parte 1: Prática de Laboratório

Você e seu parceiro podem trabalhar juntos na prática de laboratório. (Nota: este não será o caso para questionários futuros.) Você pode dar respostas diferentes, caso discorde.

Parte 2: Amplificar Aptâmero de Codificação de Fragmento de DNA

Antes de começar o trabalho de laboratório úmido de hoje, você pode limpar suas pipetas e sua bancada com etanol 70%.

  1. Você receberá plasmídeos que codificam o DNA para dois aptâmeros: "6-5" e "8-12", ambos a ~ 250 μg / mL. Faça um plano para adicionar 2,5 ng de DNA a cada reação de PCR, em um volume final não superior a 20 μL de plasmídeo e água.
    • Observe que pode ser necessário diluir o DNA em série. Por exemplo, se você precisa diluir o DNA 10.000 vezes para atingir uma concentração de 2,5 ng / 20 μL, você deve fazer uma diluição de 1: 100 do estoque original e, em seguida, uma diluição de 1: 100 da solução resultante. É melhor pipetar pelo menos 5 μL de solução por vez, para evitar as imprecisões associadas à pipetagem de volumes muito pequenos. Sinta-se à vontade para executar seu plano com o corpo docente.
  2. Por reação, adicione 20 μL de mistura principal de PCR, 5 μL de cada primer, o molde de DNA e água de modo que o volume total da reação seja de 50 μL. Além das duas reações contendo DNA, você deve preparar um controle sem modelo que contenha água pura sem qualquer plasmídeo.
    • O que significaria se o seu controle sem template resultasse na amplificação do DNA do mesmo tamanho que seus aptâmeros?
  3. O PCR será executado por cerca de 1 hora, no seguinte ciclo:
SEGMENTOSCICLOSTEMPERATURA (° C)TEMPO
11944 min
2-4259430 s
5730 s
7230 s
517210 min
614indeterminado

Parte 3: Introdução à Análise Computacional

A sua compreensão deste módulo será em parte avaliada pelo Atribuição de análise computacional de RNA. Embora você não esteja preparado para entender toda a tarefa hoje - até que tenha uma melhor compreensão do que o SELEX envolve - você deve ser capaz de obter um bom começo na primeira seção.

  1. Comece lendo a visão geral da tarefa e as informações básicas. (Tudo bem se o último ainda não fizer sentido.)
  2. Baixe o arquivo de dados associado e leia o plano de fundo. Novamente, o texto introdutório pode fazer mais sentido em uma ou duas semanas.

Análise de Primer

Observe que todas as sequências no arquivo de dados são mostradas de 5 'a 3'.

  1. Comece copiando a fita sense do DNA que codifica a biblioteca SELEX para um novo documento do Word.
    • Certifique-se de usar a fonte Courier para que cada base tenha o mesmo tamanho.
  2. Determine e escreva a fita complementar antisense (de 3 'a 5') diretamente abaixo da fita sense.
  3. Para qual fita o primer 5 'se anulará? Copie e cole para alinhar o primer com a referida fita - mostre-o acima ou abaixo das duas fitas do DNA modelo, não entre elas. Destaque o primer em negrito.
  4. Para qual fita o primer 3 'será anelado? Alinhe este primer com o dito fio e destaque em negrito. Certifique-se de que os pares de bases complementares estejam alinhados. O que você teve que fazer com a cartilha para que isso acontecesse?
  5. Entregue seu diagrama de primer (e as respostas às perguntas acima) com seu caderno hoje.

Alinhamento de Sequência

  1. Hoje você trabalhará na primeira parte da atribuição computacional, ou seja, alinhamento de sequência usando o programa CLUSTAL. Você pode não ser capaz de responder a todas as questões interpretativas ainda, mas você pode começar a responder as mais simples e analíticas, como as partes 2, 3 e 4.
  2. Para capturar a captura de tela da figura necessária, você pode usar o Pegar utilitário em um Mac.
    • Pesquise "Agarrar" usando o holofote (o ícone que parece uma lupa no canto superior direito) ou vá para FormuláriosServiços de utilidade pública Pegar.
  3. Você não é obrigado a registrar seu trabalho nesta parte em seu caderno.

Para a próxima vez

  1. Continue a se familiarizar com o funcionamento do OpenWetWare. Especificamente, você deve:
    • Adicione sua página de usuário à página Pessoas da classe.
    • Preencha o questionário / registro do aluno para entregar na próxima vez.
  2. A principal avaliação para este módulo será a Relatório de Engenharia RNA. Comece a se familiarizar com a estrutura e o conteúdo esperados.
  3. Daqui a uma semana, na sessão do Módulo 1, Dia 3, teremos uma discussão em sala de aula sobre um artigo da literatura científica primária. Você pode começar a ler e pensar sobre o artigo agora, em vez de tentar fazer isso apenas nos dois dias entre o Dia 2 e o Dia 3.

Lista de Reagentes

  • PCR Master Mix (2,5X)
    • 62,5 U / ml Taq DNA Polimerase
    • 125 mM KCl
    • Tris-HCl 75 mM, pH 8,3
    • 3,75 mM Mg (OAc) 2
    • 500 μM cada dNTP
  • Primer Forward: estoque 20μM
  • Primer reversor: estoque 20μM
  • Modelos: 8-12 e 6-5

Anormalidade no DNA do faraó egípcio: ele era um híbrido alienígena?

Os antigos egípcios tentaram apagar seu legado da história, então muito pouco se sabe sobre ele. Mas o que sabemos sobre esse governante nos faz pensar quem ou o que ele realmente era. Ao contrário de todos os faraós anteriores que foram retratados em excelente forma física, a aparência de Akhenaton é surpreendentemente estranha: olhos amendoados, abdômen pequeno, membros finos, um crânio alongado.

Monoteísmo de Akhenaton e # 8217

Um antigo faraó egípcio Akhenaton

Akhenaton virou o Egito inteiro de cabeça para baixo, criando o maior ato de heresia que os egípcios jamais conheceram. Ele afirmou que os egípcios não deveriam mais acreditar em um panteão de vários deuses, mas adorar um deus. A este respeito, existe uma suposição de que Akhenaton e o personagem bíblico Abraão podem ter sido a mesma pessoa. Os pesquisadores descobriram os corpos de muitos faraós e seus familiares em uma forma mumificada, mas nenhuma múmia de Akhenaton foi encontrada. & # 8220Mas estátuas e esculturas da época mostram Akhenaton sozinho, bem como em ambientes familiares afetuosos que incluíam sua consorte principal, Nefertiti, e seus filhos. Tais configurações nunca foram empregadas em obras de arte de faraós antes ou depois de Akhenaton. & # 8221

No entanto, Akhenaton não acreditava realmente no monoteísmo, ele estava absolutamente convencido da existência de outros deuses, mas decidiu que toda adoração e orações seriam dadas a um Deus, Aton (o Deus Sol na tradição do Egito antigo). Seu período de governo é conhecido como Período de Amarna. Ele também mudou a capital do Egito de Tebas para a cidade que ele fundou, conhecida como Tell el-Amarna (ou Amarna). Este é o período mais debatido e estudado da história egípcia.

Akhenaton e a família real, abençoados por Aton. Crédito da imagem: por Troels Myrup

Estudo de DNA do Faraó

Tudo sobre Akhenaton era incomum, até mesmo seu DNA.

Em 2015, Stuart Fleischmann, professor assistente de genômica comparativa na Universidade do Cairo e sua equipe publicaram o resultado de um estudo de 7 anos. Eles mapearam os genomas de nove antigos faraós egípcios. Oito amostras eram completamente normais, e a nona que pertencia a Akhenaton era bastante incomum.

& # 8220Fleischmann e sua equipe submeteram as preciosas amostras de DNA antigo a um processo chamado Polymerse Chain Reaction (PCR). No campo da biologia molecular, esta técnica é frequentemente usada para replicar e amplificar uma única cópia de um pedaço de DNA, dando aos pesquisadores uma imagem clara da impressão digital genética de alguém.

Oito em nove amostras apresentaram resultados interessantes, mas típicos. A nona amostra pertenceu a Akhenaton, o enigmático faraó do século 14 aC e pai de Tutancâmon. Um pequeno fragmento de tecido cerebral desidratado foi a fonte da amostra de DNA e o teste foi repetido usando tecido ósseo, mas os mesmos resultados foram obtidos.

Um dos culpados foi um gene chamado CXPAC-5, responsável pelo crescimento do córtex. A anomalia é visível na imagem abaixo. & # 8221

Crédito da imagem: Abovetopsecret

& # 8220Outra evidência interessante fornece suporte para essa hipótese. A imagem abaixo mostra duas fotografias microscópicas de tecido ósseo retirado do crânio de Akhenaton e de uma múmia diferente da mesma idade. & # 8221

Crédito da imagem: Abovetopsecret

O crânio é aumentado apenas por dois processos: envelhecimento extremo e mutação genética extrema, portanto Akhenaton não poderia ter mais de 45 anos. A evidência arqueológica refuta isso. Além disso, os microscópios eletrônicos encontraram sinais de uma cicatriz do nucléon, que é uma manifestação certa da cura da hélice do DNA após a exposição a fortes agentes mutagênicos.

Irwin M. Braverman na 14ª Conferência Clinicopatológica Histórica Anual

De acordo com o professor de Yale, Irwin M. Braverman, a anormalidade na aparência de Akhenaton pode ser ginecomastia familiar e craniossinostose. Ginecomastia é a condição encontrada principalmente em homens cujo peito incha devido ao desequilíbrio hormonal. Braveman disse que o pai, avô e bisavô de Akhenaton tiveram ginecomastia familiar. A cabeça aumentada de Akhenaton foi devido à doença chamada craniossinostose.

Os resultados da análise do tecido ósseo retirado do crânio de Akhenaton & # 8217s mostraram que os ossos do crânio são muito mais densos e fundamentalmente diferentes de outras múmias da mesma idade e período. Além disso, o crânio e o esqueleto de Akhenaton são duas vezes mais densos e duráveis ​​do que os dos humanos modernos.

Então, quem ou o que era realmente Akhenaton: um híbrido de um alienígena, um mutante ou uma criatura de outro planeta? Se alguma dessas coisas for verdade, então existe a possibilidade de que antigos alienígenas chegaram à Terra em um passado distante, residiram perto do rio Nilo e viveram entre os habitantes locais.


PALEOBOTANY | DNA de planta antiga

Problemas associados à degradação do DNA

A degradação do DNA apresenta vários problemas para o campo do aDNA (cf. Gilbert et al., 2005). Em primeiro lugar, os pesquisadores estão limitados às quantidades de DNA amplificável que podem recuperar. Em segundo lugar, devido à fragmentação do DNA e ligações cruzadas, os pesquisadores muitas vezes são limitados em sua capacidade de amplificar modelos de menos de algumas centenas de bp de tamanho (cf. Willerslev e Cooper, 2005). Quando isso é combinado com os insights sobre as implicações da abundância relativa de diferentes alvos genéticos, torna-se aparente que há limitações sobre o que pode ser alcançado neste campo de estudo. Um outro problema, e o mais sério para a credibilidade da disciplina, é o da contaminação da amostra. A baixa abundância de DNA extraído de uma amostra degradada pode ser facilmente mascarada pelo DNA moderno de contaminantes externos da mesma sequência de DNA ou similar. Sem o tratamento adequado para remover o DNA ambiental, é muito simples (e, infelizmente, comum) coamplificar as duas fontes de DNA. Dependendo das concentrações relativas do DNA do hospedeiro para o contaminante na PCR, o DNA alvo pode estar completamente inundado ou suficientemente modificado para resultar em dados errôneos.


Resultados

Seguindo um painel diversificado de loci durante a preparação da biblioteca Illumina

O protocolo de preparação da biblioteca Illumina é um processo de várias etapas que consiste em corte do DNA de entrada, reparo final enzimático, 5'-fosforilação e extensão 3'-single-dA dos fragmentos resultantes, ligação de adaptador, fracionamento de tamanho em um gel de agarose e Amplificação por PCR de fragmentos ligados ao adaptador. O viés pode ser introduzido em qualquer etapa, incluindo as etapas de limpeza física que removem proteínas, nucleotídeos e pequenos fragmentos de DNA.

Uma vez que virtualmente todos os genomas têm sua composição de base em uma faixa estreita de% GC, usamos uma amostra de DNA genômico composto com uma faixa de composição de base abrangendo quase todo o espectro como um substrato de teste em toda a nossa investigação de fontes de viés. Começamos com uma mistura equimolar de DNA preparada a partir de Plasmodium falciparum (tamanho do genoma 23 Mb, conteúdo GC 19%), Escherichia coli (4,6 Mb 51% GC) e Rhodobacter sphaeroides (4,6 Mb 69% GC). O genoma composto 'PER' de 32 Mb é cerca de 100 vezes menor do que o genoma de um mamífero típico, tornando-o um tamanho mais tratável para nossas análises. Um histograma da distribuição% GC de janelas de 50 bp nos três genomas é mostrado na Figura S1 no arquivo adicional 1.

Em seguida, desenvolvemos um painel de ensaios qPCR que definem amplicons variando de 6% a 90% GC (Tabela S1 no arquivo adicional 2). Os amplicons eram muito curtos (50 a 69 bp) e, portanto, nos permitiram realizar ensaios de qPCR em DNA 'PER' cisalhado e em alíquotas retiradas em vários pontos ao longo do protocolo (Figura 1). Determinamos a abundância de cada locus em relação a uma curva padrão de entrada de DNA 'PER'. Para ajustar as diferenças na concentração de DNA, normalizamos as quantidades calculadas em relação à quantidade média dos amplicons 48% GC e 52% GC em cada amostra.

Traçando um painel diverso de loci durante a preparação da biblioteca Illumina. (a-e) Em cinco etapas no protocolo padrão, as alíquotas foram removidas e analisadas quanto ao viés de composição de base por qPCR. (f, g) Para isolar e analisar a população competente para ligação de fragmentos de DNA, uma reação de ligação separada com adaptadores biotinilados foi realizada seguida pela captura de fragmentos com estreptavidina contendo pelo menos um adaptador. A quantidade de cada amplicon em uma determinada amostra foi dividida pela quantidade média dos dois amplicons mais próximos de 50% GC. As abundâncias relativas resultantes de amplicons foram plotadas em um log10 escala sobre seus respectivos conteúdos GC.

O DNA genômico de entrada 'PER' é imparcial por definição. Como esperado, um gráfico de dispersão da quantidade normalizada de cada amplicon sobre seu conteúdo de GC foi essencialmente plano de 6% a 90% GC quando plotado em uma escala logarítmica, validando o ensaio de polarização baseado em qPCR (Figura 1a). O cisalhamento do DNA não levou a qualquer distorção óbvia da composição de base (Figura 1b), nem as três etapas de reação enzimática subsequentes até a ligação do adaptador (Figura 1c). Isso não é surpreendente, uma vez que até este ponto nenhuma etapa explícita de fracionamento de DNA havia ocorrido além das etapas de limpeza. Analisar a mistura de ligação de fragmentos ligados por adaptador por qPCR não revelaria viés potencial durante qualquer uma das reações enzimáticas necessárias para ligar o adaptador aos fragmentos de DNA cortados porque a mistura presumivelmente inclui alguns fragmentos sem adaptador.

Para realizar um ensaio de polarização exclusivamente na fração ligada ao adaptador, configuramos uma ligação com adaptadores biotinilados não fosforilados, isolamos os fragmentos de DNA ligados ao adaptador por captura de estreptavidina e liberamos os fragmentos de inserção capturados por desnaturação para análise por qPCR. Vimos muito pouco, ou nenhum, viés sistemático de GC na fração ligada ao adaptador (Figura 1f, g) e, portanto, nenhuma evidência de forte discriminação com base na composição de base durante qualquer uma das reações enzimáticas anteriores e etapas de limpeza.

A excisão de um intervalo de tamanho estreito (correspondendo a fragmentos genômicos de aproximadamente 170 a 190 pb) de um gel de agarose preparativo não distorceu a composição de base (Figura 1d). No entanto, apenas dez ciclos de PCR usando a formulação de enzima (Phusion HF DNA polimerase) e condições de termociclagem prescritas no protocolo padrão Illumina depletados loci com um conteúdo de GC & gt 65% a cerca de um centésimo dos loci de referência mid-GC (Figura 1e ) Amplicons & lt 12% GC foram reduzidos a aproximadamente um décimo de seu nível de pré-amplificação. Entre os flancos íngremes de cada lado, o gráfico de polarização GC era essencialmente plano. Sua fase de platô (definida como o segmento no eixo% GC com não mais do que um ponto de dados abaixo de uma abundância relativa de 0,7) variou de 11% a 56% GC.

Comparando três termocicladores em suas velocidades de rampa padrão

Os protocolos de PCR publicados por fabricantes de kits ou na literatura científica geralmente especificam a temperatura e o tempo de duração de cada etapa de termociclagem (por exemplo, 10 s a 98 ° C para a etapa de desnaturação durante cada ciclo para o enriquecimento de PCR de bibliotecas Illumina), mas raramente o velocidade de rampa de temperatura ou a marca e modelo do termociclador. Para o experimento mostrado na Figura 1 (e para um experimento replicado mostrado na Figura 2, linha vermelha brilhante), usamos as taxas de aquecimento e resfriamento padrão (6 ° C / se 4,5 ° C / s, respectivamente) no termociclador 1 ( consulte Materiais e métodos para fazer e modelo).

Efeito das taxas de aumento de temperatura. O protocolo de PCR padrão com Phusion HF DNA polimerase e tempos curtos de desnaturação inicial (30 s) e dentro do ciclo (10 s) foi realizado em três termocicladores diferentes em suas respectivas configurações de rampa de temperatura padrão. As taxas de aquecimento e resfriamento foram de 6 ° C / se 4,5 ° C / s no termociclador 1 (linha vermelha brilhante), 4 ° C / se 3 ° C / s no termociclador 2 (linha roxa) e 2,2 ° C / s e 2,2 ° C / s no termociclador 3 (linha vermelha escura).

A execução do protocolo de PCR no termociclador 2 (em suas taxas padrão de aquecimento e resfriamento de 4 ° C / se 3 ° C / s, respectivamente) estendeu o platô para 76% GC (Figura 2, roxo). O Thermocyler 3 teve a velocidade de rampa padrão mais lenta (2,2 ° C / s). Seu gráfico de polarização era plano de 13% a 84% GC antes de cair para um décimo do nível para os dois loci mais ricos em GC (Figura 2, vermelho escuro). Esses resultados são consistentes com a noção de que um termoprofile excessivamente íngreme não deixa tempo suficiente acima de uma temperatura limite crítica, causando desnaturação incompleta e amplificação pobre da fração rica em GC.

Otimizando as condições de PCR

Para desenvolver um protocolo robusto que produza resultados consistentes em uma ampla gama de velocidades de rampa e termocicladores, optamos por otimizar as condições de reação no termociclador 1, o pior desempenho, em sua velocidade de rampa padrão rápida. Raciocinamos que um protocolo que funciona bem nesta máquina também funcionaria em um termociclador de aceleração mais lenta.

Simplesmente estender a etapa de desnaturação inicial (de 30 s para 3 minutos) e a etapa de desnaturação durante cada ciclo (de 10 s para 80 s) superou os efeitos prejudiciais da taxa de rampa excessivamente rápida, embora sem restaurar totalmente a fração de GC extremamente alta (Figura 3a, quadrados vermelhos escuros). A desnaturação longa produziu uma biblioteca de qualidade semelhante à da desnaturação mais curta no termocilador 3 de aceleração lenta (Figura 2, vermelho escuro).

Otimizando as condições de PCR. (uma) Nem prolongar os tempos de desnaturação (quadrados vermelhos escuros) nem adicionar betaína 2M (triângulos pretos) é suficiente para recuperar fragmentos de DNA extremamente ricos em GC por PCR com Phusion HF. (b) A combinação de desnaturação longa e betaína 2M é eficaz para a fração de alto GC (triângulos pretos), mas o perfil não é tão uniforme em todo o espectro de GC quanto após PCR com AccuPrime Taq HiFi (diamantes azuis) usando tempos de desnaturação estendidos e uma temperatura mais baixa ( 65 ° C) para recozimento e extensão do primer.

A adição de betaína 2M sem alterar o termoprofile teve um efeito equivalente em fragmentos de GC moderadamente alto, mas levou a uma leve depressão de loci na faixa de 10% a 40% GC (Figura 3a, triângulos pretos). A adição de 2M de betaína e a extensão dos tempos de desnaturação resgatados - na verdade, ligeiramente super-representados - loci na extremidade superior extrema do espectro de GC à custa de fragmentos de baixo GC (Figura 3b, triângulos pretos), deslocando o platô para a direita ( 23 a 90% GC).

Substituindo Phusion HF pela mistura AccuPrime Taq HiFi de DNA polimerases e fazendo o ajuste fino do termoprofile, especificamente prolongando a etapa de desnaturação e diminuindo a temperatura para o recozimento e extensão do primer de 72 ° C a 65 ° C, obtivemos o viés GC perfil mostrado na Figura 3b (diamantes azuis). Essas condições restauraram loci de GC extremamente alto quase totalmente, evitando a supressão de amplicons de GC moderadamente baixo vistos com Phusion HF e betaína 2M (triângulos pretos). O platô variou de 11% a 84% GC com apenas uma leve queda acima. Abaixar a temperatura para a extensão ainda mais (para 60 ° C) mudou o equilíbrio ligeiramente em favor de loci ricos em AT em detrimento dos ricos em GC (veja abaixo).

Realizamos uma comparação lado a lado do protocolo AccuPrime Taq HiFi PCR no termociclador 1 de rampa mais rápida e no termociclador 3 de rampa mais lenta e encontramos poucas, se houver, diferenças nas curvas de polarização de GC (Figura S2a em Adicional arquivo 1). Também testamos em bibliotecas de fragmentos ligados a adaptadores que foram cortados e selecionados por tamanho para aproximadamente 360 ​​pb em vez de inserções de 180 pb. Os perfis de GC de bibliotecas de inserções maiores amplificadas por PCR eram quase tão planos quanto os de uma biblioteca de controle de inserções pequenas amplificada em paralelo, com um ombro ligeiramente mais arredondado, atingindo a fase plana em 17% em vez de 13% de GC (Figura S2b em Arquivo adicional 1).

Comparação direta da biblioteca de fragmentos e leituras de sequenciamento

O ensaio qPCR mede a composição da biblioteca amplificada por PCR. É provável que etapas posteriores, como amplificação de cluster, sequenciamento por síntese, análise de imagem e processamento de dados fora do instrumento também introduzam viés. Para comparar diretamente as bibliotecas de entrada e os dados de saída final, ou seja, as leituras Illumina alinhadas e filtradas por qualidade, sequenciamos quatro bibliotecas de fragmentos de 400 bp para as quais também tínhamos dados qPCR e contamos as leituras de sequenciamento cobrindo os mesmos locais.

Conforme mostrado na Figura 4, para uma biblioteca amplificada com AccuPrime Taq HiFi usando 60 ° C para a etapa de extensão do primer, os perfis de sequenciamento e qPCR GC acompanham um ao outro, incluindo alguns dos altos e baixos pronunciados que podem refletir características de amplificação de loci individuais , como contexto de sequência ou potencial para formação de grampo de cabelo, não capturado em seu conteúdo GC médio indicado no eixo x. Uma sobreposição de qPCR e dados de sequenciamento para três bibliotecas amplificadas de forma diferente está disponível na Figura S3 no arquivo adicional 1.

Comparando a biblioteca de entrada e os dados de sequenciamento de saída. É mostrada a abundância relativa de loci na biblioteca, conforme determinado por qPCR (roxo) e a abundância relativa de leituras de sequenciamento Illumina cobrindo esses loci em uma faixa de dados Hi-Seq (preto). Ambos os conjuntos de dados foram normalizados para a média dos dois loci mais próximos de 50% GC.

Observamos alguns outliers. Por exemplo, amplicons com aproximadamente 70% ou 80% GC receberam menos cobertura de sequência do que seus vizinhos no espaço% GC, apesar da abundância relativamente alta na biblioteca. Um exame atento de amplicons & gt 50% GC sugeriu um efeito do contexto de sequência. Descobrimos que a% GC de uma janela de 250 bp centrada nos amplicons é um melhor preditor de subcobertura do que a% GC dos amplicons propriamente ditos (Figura S4 no arquivo adicional 1). A queda sistemática na cobertura da sequência com o aumento do conteúdo de GC não foi causada por uma sub-representação proporcional de loci de alto GC na biblioteca, indicando que há viés a jusante da preparação da biblioteca.

Cobertura de sequência de todo o genoma

Nossos loci de teste, que foram selecionados em parte com base em sua capacidade de serem amplificados por PCR, podem ou não ser verdadeiros representantes de suas respectivas composições de base em geral. Para medir o viés de sequenciamento em todo o genoma, calculamos a proporção média entre a cobertura observada e a cobertura esperada (imparcial) para janelas deslizantes de 50 pb. A sobreposição de dados de enviesamento de todo o genoma e específicos de loci, cada um normalizado em relação à fração de GC médio (48 a 52%), mostrou que os loci selecionados eram, em geral, bons proxies para suas respectivas categorias de% GC - apesar das distintas comportamento de amplificação de loci individuais (Figura S5 no arquivo adicional 1).

O padrão Phusion HF PCR (desnaturação curta e rampa rápida) esgotou as sequências & gt 70% GC para menos de um centésimo das janelas de referência mid-GC (Figura 5, quadrados vermelhos). Adicionar betaína e prolongar a etapa de desnaturação resgatou a fração de alto GC de forma eficiente e completa (Figura 5, triângulos pretos): janelas de 50 bp com até 94% de GC ainda receberam mais da metade da cobertura média daqueles com aproximadamente 50% de GC, demonstrando que trechos de 50 bases consistindo quase inteiramente de Gs e Cs podem ser sequenciados, desde que estejam presentes na biblioteca. No entanto, esse ganho de sequências de alto GC ocorreu às custas de sequências de alto AT, que sofreram uma perda significativa em comparação com a biblioteca padrão de Phusion HF.

Curvas de polarização de composição de base em todo o genoma 'PER'. (a, b) É mostrado o viés de GC em leituras Illumina de uma biblioteca de fragmentos de 400 bp amplificada usando o protocolo de PCR padrão (Phusion HF, desnaturação curta) em um termociclador de aceleração (quadrados vermelhos), Phusion HF com desnaturação longa e betaína 2M (triângulos pretos ), AccuPrime Taq HiFi com desnaturação longa e extensão do primer a 65 ° C (diamantes azuis) ou 60 ° C (diamantes roxos). Para calcular a cobertura de leitura observada para esperada (imparcial), o número de leituras alinhadas a janelas de 50 bp em uma determinada% GC foi dividido pelo número de janelas de 50 bp que se enquadram nesta categoria de% GC. Este valor foi então normalizado em relação ao valor médio de 48% a 52% GC e plotado em um log10 escala (a) ou escala linear (b).

Consistente com os dados qPCR, as bibliotecas amplificadas com AccuPrime Taq HiFi foram menos distorcidas do que as bibliotecas amplificadas com Phusion. A extensão do primer recozido com AccuPrime Taq HiFi a 65 ° C (Figura 5, diamantes azuis) superou ambas as reações de Phusion na extremidade de baixo GC, mantendo a fração de alto GC quase tão bem quanto Phusion com betaína (Figura 5, triângulos pretos) . A redução da temperatura de extensão para 60 ° C (Figura 5, diamantes roxos) retornou ainda mais sequências de baixo GC, enquanto diminuiu um pouco o rendimento de leituras ricas em GC. A extensão a 60 ° C produziu uma biblioteca amplificada em que todos os bins de janelas de 50 pb entre 2% e 96% GC receberam pelo menos um décimo da cobertura média da referência mid-GC.

Nenhum protocolo de PCR único era ideal. O melhor protocolo para alto GC, Phusion HF com betaína, levou a uma representação pobre de loci alto-AT. O protocolo que funcionou melhor para alto AT, AccuPrime Taq HiFi com extensão de primer a 60 ° C, comprometeu a fração de alto GC. Um conjunto de duas bibliotecas amplificadas de maneira diferente seria mais complexo do que qualquer uma das bibliotecas sozinha, mas também aumentaria os custos, dobrando a quantidade de construção de biblioteca necessária. Ele ainda seria polarizado e, quando sequenciado, produziria um perfil de polarização GC intermediário semelhante aos mostrados na Figura S6 no arquivo adicional 1 que foram gerados por leituras de sequenciamento de pool.

Também calculamos a fração do genoma que recebeu menos de um décimo da cobertura média de todo o genoma (Tabela 1). Por esta medida, AccuPrime Taq HiFi PCR com extensão de primer a 60 ° C foi claramente a melhor condição de amplificação para os ricos em AT P. falciparum genoma, e no geral, para o genoma composto 'PER', 71% do qual consiste em P. falciparum DNA. This method was slightly worse than the 65°C extension protocol for the GC-rich R. sphaeroides genome, for which long-denaturation PCR with Phusion in the presence of betaine came out on top. o E. coli genome was very evenly covered by three conditions. Only the standard PCR protocol with Phusion HF and short denaturation, when performed with an overly fast temperature ramp, left more than 0.5% of the E. coli genome under-covered.

Rescuing GC-rich loci in the human genome

To test if our optimized conditions improve the representation of biologically relevant loci in the human genome, we developed qPCR assays for eight GC-rich loci near gene promoters and four size-matched control loci. All eight test loci had been under-represented in previous sequencing runs with standard PCR-amplified libraries. We amplified a fragment library of human DNA on the fast-ramping thermocycler 1 using the standard Phusion and the AccuPrime Taq HiFi (extension at 65°C) protocols. The first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1 was below the detection limit in the standard library (Figure 6a) and near unity (109% of the average of the four control loci) in the improved library (Figure 6b). The mean relative abundance of all eight test loci rose from 3% (range 0 to 11%) to 116% (range 60 to 153%).

Optimized PCR conditions rescue GC-rich promoter regions in the human genome. (a,b) A 180-bp fragment library of human DNA was amplified using (a) standard conditions (Phusion HF, short denaturation) or (b) optimized conditions (AccuPrime HiFi, long denaturation, extension at 65°C) on the fast-ramping thermocycler 1. The amplified libraries were analyzed by qPCR. Orange bars indicate the quantity of eight GC-rich loci near gene promoters relative to the mean quantity of four size-matched control loci (blue bars mean set to 100% in each graph). Error bars represent the range of two measurements averaged to calculate the quantity of each locus. Locus 7 is the first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1.

Comparison of PCR-amplified and PCR-free Illumina libraries

Kozarewa et al. [21] developed a protocol for Illumina sequencing without PCR to amplify and enrich adapter-ligated DNA fragments. We sequenced a PCR-amplified and a PCR-free human 180-bp fragment library side-by-side on an Illumina Hi-Seq flowcell and calculated the mean coverage (relative to the mean genome-wide coverage) of a larger set of GC-rich loci (Table S3 in Additional file 2). The 100 test loci were 200 bp in length, located on or near annotated transcription start sites, had a mean GC content of 80% (standard deviation 5%) and were known to be poorly covered in previous whole-genome sequencing runs. By this measure, the PCR-amplified library (AccuPrime Taq HiFi with extension at 65°C) and the PCR-free library performed equally: the mean coverage of the test loci was 28% in both data sets, a 3.6-fold under-representation.

By sequencing the PCR-amplified library, 50-bp windows from 12% to 92% received at least half the mean coverage of those with 50% GC (Figure 7a,b). Only about 0.2% of 50-bp windows in the human reference genome - and less than 0.02% of 50-bp windows that overlap with the human exome - fall outside this range. With the PCR-free library, the mean relative coverage of GC-rich loci stayed near or above unity all the way to 100% GC. The PCR-free library was also slightly better for AT-rich loci, with up to 1.4-fold better coverage of 50-bp stretches containing only one G or C. From 8% to 88% GC, the fold increase by sequencing an unamplified fragment was less than 1.25 (Figure 7c). More than 99.9% of all 50-bp windows in the human genome fall in this category.

Sequencing bias with PCR-amplified and PCR-free libraries. (a,b) Shown is the mean normalized coverage of 50-bp windows in the human genome having the GC-content indicated on the x-axis for a PCR-free (orange dots) and a PCR-amplified (blue diamonds) Illumina sequencing library. Both fragment libraries had approximately 180-bp inserts. The PCR amplification was performed with AccuPrime Taq HiFi (long denat., primer extension at 65°C). The coverage was plotted on a log10 (a) and a linear scale (b). The data points at extremely high GC, where the reads from the PCR-free library had a mean base quality of less than Q20 (open symbols), were omitted in the middle panel (b). (c) The ratios of the two curves in (a,b), that is, the fold-increase in mean coverage by sequencing a PCR-free library instead of a PCR-amplified library. The shaded histogram is the %GC distribution of 50-bp windows in the human genome. More than 99.9% of all 50-bp windows in the genome contain 8% to 88% GC and received a less than 1.25-fold increase in coverage. Less than 0.01% of all 50-bp windows contain 90% or more GC. The open circles at 96% and 98% GC denote data for which the mean base quality of the reads from the PCR-free library was below Q20.

We note that skipping the PCR step during library preparation does not necessarily yield unbiased Illumina sequencing reads, presumably due to bias introduced further downstream in the sequencing process.


Biologics Medicine

6.11.11.3 Oligonucleotide Chromatography Equipment

Unlike ON synthesis that requires highly specialized equipment, which may not be readily available especially at large scales, chromatography systems are more accessible since these systems have wider applications ranging from biopharmaceuticals to small molecules. The key to efficient therapeutic-grade ON purifications therefore lies mostly on the stationary phase, eluent, and conditions used. Equally important is the purification column and column packing strategy employed. Nonetheless, for purification equipment designed for ONs, GE is among the industry leaders with the ÄKTA purification platforms, which complement their synthesizers. Just like in synthesis, GE provides skids from the research-scale (ÄKTA purifier/pure) to large-volume manufacturing (BioProcess/ÄKTAprocess). The ÄKTApurifier and BioProcess have been discontinued and replaced with AKTApure and ÄKTAprocess, respectively. The ÄKTAprocess can deliver flow rates up to 2000 L/h, whereas the UNICORN software makes processes developed on GE’s purification platforms easy to scale up and transfer the systems suffer from their both pressure and low temperature ratings and are not amenable for processes, which require high pressure and sufficient denaturing temperature conditions. Similarly to the equipment, GE’s purification columns are generally designed for low-pressure applications at temperatures below 40°C.

For high pressure and temperature purification equipment, ASAHI KASEI, LEWA, and Novasep are among the major players. For purification columns, Load & Lock stainless columns (Agilent and Agar Machining) have high-pressure dynamic axial compression (DAC) packing, which provides improved bed stability and higher loading. They can also be jacketed for use at higher temperatures.


Métodos

Yeast strain, growth conditions and extraction of total RNA

Total yeast RNA was isolated by a modification of the procedure described previously [11]. Strain W303-1A (Mata, ade2-1, trp1-1, leu2,3-112, his3-11,15, ura3, can1-100) was grown in YPD-supplemented medium (1% yeast extract, 2% bacto peptone, 2% glucose and 0,01% of adenine, uracil, tryptophan, leucine and histidine) in a rotatory shaker (160 rpm and 28°C). Cell growth was monitored by reading OD at 570 nm. Cells (10 mg of dry weight) were harvested by centrifugation and washed with DEPC (diethylpyrocarbonate) treated water at 2200 × g for 5 min before they were resuspended in 0.6 ml RNA extraction buffer (10 mM EDTA (ethylenediaminetetracetic acid), 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 5% SDS) and 0.6 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (50:50:1) mixture. After 6 min at room temperature, 2 g of glass beads (0.45 mm diameter) were added and the cells were broken by vigorous agitation for 2 min on a vortex mix set at maximum speed. The extract was transferred to a microfuge tube (1.5 ml) and cell debris and organic phase were separated from upper aqueous phase by centrifugation at 2200 × g for 5 min (24°C). The upper phase was collected, extracted twice with 1 volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (50:50:1) and once with 1 volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1). The RNA was precipitated from the last upper aqueous phase by the addition of 0.1 volume of 3M NaOAc, pH 5.2, plus 3 volumes of ice-cold absolute ethanol followed by incubation at -20°C for 1 h. The RNA was pelleted by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C), washed once with ice-cold 70% ethanol and again pelleted at 15000 × g for 15 min. After the remaining alcohol was allowed to evaporate, the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Concentration of RNA in the sample was measured by reading OD at 260 nm in a Beckman DU-6 spectrophotometer (1 OD = 42 μg RNA/ml). All materials and solutions were previously treated with DEPC [12].

Removal of contaminating genomic DNA from unfractionated RNA

RNA samples were treated with RNase-free bovine pancreatic DNase I (E.C. 3.1.21.1) to eliminate DNA contamination using two different protocols. Protocol I was a modification of the procedure previously described for C. Botulinum [13]. Six micrograms of RNA, 6.25 mM MgCl2 and 10U of RNase-free DNase I (Sigma) in a 10 μl reaction mixture in water were incubated at 37°C for 30 min. The reaction was stopped by the addition of 2 mM EDTA, pH 8.0, followed by incubation at 37°C for 1 min before inactivation at 65°C for 10 min. RNA was extracted with 1 volume of phenol: chloroform (5:1) and after centrifugation at 2200 × g for 5 min, the RNA present in the upper aqueous phase was precipitated with ice-cold absolute ethanol and collected by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C). The remaining alcohol was allowed to evaporate and the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Protocol II was performed using the DNase I amplification grade kit (Life Technologies, Inc.) following the recommended procedure. In brief, 1 μg of RNA was resuspended in 20 mM Tris-HCl pH 8.4 2.0 mM MgCl2 50 mM KCl and 1U of DNase I into a final volume of 10 μl. After incubation for 15 min at room temperature, DNase was inactivated by the addition of 2,2 mM EDTA, pH 8.0, and subsequent incubation at 65°C for 10 min. The product of this reaction was used directly for RT-PCR without further treatment.

RT-PCR assay

mRNAs were amplified by using the kit Ready-to-Go RT-PCR Beads (Amershan Pharmacia Biotech Inc.) in a GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Inc.). Each reaction contained

2.0U of TaqDNA polimerase, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM of each dNTP, MMuLV reverse transcriptase, RNA guard ribonuclease inhibitor, stabilizer including RNase/DNase free BSA, 1 μg of total RNA and 20 pmol of the appropriate primers (Del Aguila et al, 2003 Souza, 2001) (Table 1) into a final volume of 50 μl. Synthesis of cDNA was performed at 50°C for 20 min and stopped by inactivation of reverse transcriptase at 95°C for 10 min. Amplification of cDNA by PCR was performed for 30 sec at 95°C 30 sec at 65°C and 1 min at 72° C for 30 cycles, chosen after testing amplification from 20 to 40 cycles. RT minus controls was incubated at 95°C for 10 min to inactivate M-MuLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase before cDNA synthesis and PCR steps. RT-PCR products were run on 1.3% agarose gel in 1x TAE (40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA) buffer, pH.8.0, and stained with aqueous ethidium bromide at a concentration of 0.5 μg/mL [12]. Data represent a typical result obtained from three different experiments.


Métodos

Plasmid construction

The nCas9, APOBEC1, UGI, ecTadA, and ecTadA7.10 portions of PBEcs and PABEcs were amplified from PBE or PABE-7 [19, 25]. The Cas9 variant nCas9-NG (D10A) containing the R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R substitutions was amplified from STEME-NG [41]. Binding proteins, including MCP, PCP, N22p, and Com, were synthesized commercially (GenScript, Nanjing, China). The different components of PBEcs, PABEcs, and SWISSv2/v3 were assembled into the pJIT163 backbone by One Step Cloning (ClonExpress II One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China). The sgRNA constructs pOsU3-sgRNA and pOsU3-esgRNA have been previously described [25] the TaU6 promoter was amplified from pTaU6-sgRNA [25]. All the scRNAs listed in Additional file 2: Sequences S2 were synthesized commercially and used to replace the sgRNA in pOsU3-esgRNA by One Step Cloning. Annealed oligos were inserted into BsaI (New England BioLabs)-digested OsU3-derived vectors. To construct the pH-SWISSv2/v3 binary vector, this cassette was cloned into the pHUE411 backbone under the Ubi-1 promoter of maize [47]. PCR was performed using TransStart FastPfu DNA Polymerase (TransGen Biotech, Beijing, China). All primer sets used in this work were listed in Additional file 1: Table S5 and were synthesized by Beijing Genomics Institute (BGI).

Installing multiple sgRNAs

The templates for assembling multiple sgRNAs listed in Additional file 2: Sequences S4 were synthesized commercially. For dual sgRNAs, the PCR products were amplified from esgRNA-pTaU6 or esgRNA-2×boxB-pTaU6 and installed into pOsU3-esgRNA or pOsU3-esgRNA-2×MS2 by Golden Gate cloning [37]. For triple or quadruple sgRNAs, the PCR products were amplified from single- or dual-sgRNA vectors and assembled by Multi One Step Cloning (ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China).

Protoplast transfection

We used the Japonica rice variety Nipponbare to prepare protoplasts. Protoplast isolation and transformation were performed as described [48]. Ten micrograms of each of nuclease and sgRNA plasmid DNA was introduced into the protoplasts by PEG-mediated transfection, with a mean transformation efficiency of 30–45% as measured by flow cytometry (FCM) or hemocytometer. The transfected protoplasts were incubated at 23 °C. The protoplasts were collected after 60 h incubation, and the genomic DNA were extracted for amplicon deep sequencing.

Agrobacterium-mediated transformation of rice callus cells

The binary vector was transformed into A. tumefaciens AGL1 by electroporation and used to transform about 120 rice calli. Agrobacterium-mediated transformation of callus cells of the Japonica rice variety Zhonghua11 was conducted as reported [48]. Hygromycin (50 μg/ml) was used to select transgenic plants.

Extração de DNA

Genomic DNA of protoplasts was extracted with a DNA-Quick Plant System (Tiangen Biotech, Beijing, China). Genomic DNA of regenerated rice seedlings was extracted with CTAB. Targeted sites were amplified with specific primers, and the amplicons were purified with an EasyPure PCR Purification Kit (TransGen Biotech, Beijing, China) and quantified with a NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Amplicon deep sequencing and data analysis

Genomic DNA extracted from the desired protoplast samples at 60 h post-transfection served as template. Two rounds of PCR were performed for the amplicons of protoplasts. In the first round, the target region was amplified using site-specific primers (Additional file 1: Table S5). In the second, both forward and reverse barcodes were added to the ends of the PCR products for library construction (Additional file 1: Table S5). Equal amounts of the PCR products were pooled and purified by Gel DNA Extraction, and samples were sequenced commercially (Novogene, Tianjin, China) using the Illumina NextSeq 500 platform. The protospacer sequences in the reads were examined to identify base substitutions or indels. Amplicon sequencing was performed three times for each target site, using genomic DNA extracted from three independent protoplast samples. Amplicon reads with a quality score < 30 were filtered out. Analyses of base-editing processivity were performed as previously described [49].

Mutant identification by T7EI and Sanger sequencing

Site-specific primers were used to amplify genomic DNA from regenerated rice seedlings. T7EI enzyme (Vazyme, Nanjing, China) was used to identify rice mutants with C-to-T conversions, A to G conversions, or indels in target regions, with an optimized protocol: 200 ng sample PCR products, 200 ng wild-type PCR products, and reaction buffer added to 8.0 μL 98 °C denaturation for 10 min, 95 °C denaturation for 5 min, and temperature lowered from 90 to 10 °C in next 10 steps followed by denaturation for 1 min 0.2 μL T7EI (10 U/μL) added with water to 10.0 μL and incubate at 37 °C for 20 min and assay immediately. Sanger sequencing was performed to confirm genotypes. The genotypes of indels were analyzed with the online tools DSDecodeM [50] and TIDE [51].

Off-target analysis

Potential off-target sites were predicted using the online tool Cas-OFFinder [52]. Sites containing up to 3-nt mismatches were examined. The whole-genome sequencing assay and genome-wide Cas9-independent off-target analysis were conducted as reported [32].

Análise estatística

GraphPad Prism version 7.0 was used for all data analysis. All numerical values are presented as means ± s.e.m. Statistical comparison adjustments were performed using two-tailed Mann-Whitney você teste.


Resultados

Quality indicators in DNA samples isolated from human 118 frozen tissues in OCT, 68 FFPE tissues, 119 frozen blood samples, and 26 saliva samples were analyzed.

The 260/280 purity ratio was obtained for each DNA sample, with the average value between 1.8 and 2.0 for all the groups (Table 1). For DNA extracted from FFPE tissue samples, only a single sample with a ratio out of range was found, as it is represented by the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0. The 260/230 purity ratio was also determined for each DNA sample and represented versus its corresponding DNA concentration value (Fig. 1). The 260/230 ratio for high-concentration DNA was ∼2.0 for all groups (frozen tissue in OCT [Fig. 1A], FFPE tissue [Fig. 1B], frozen blood [Fig. 1C], and saliva [Fig. 1D]), whereas low-concentration DNA presented a higher 260/230 ratio for frozen tissue and blood samples.

FIGO. 1 DNA purity 260/230 ratio. Absorbance at 260 and 230 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (UMA), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D), and 260/230 ratio obtained was represented versus its corresponding DNA concentration based on spectrophotometric measurement. The trendline for each group of samples is shown. FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Table 1. DNA Purity 260/280 Ratio

Absorbance at 260 and 280 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva, and the purity of the DNA was calculated using 260/280 ratio. The average 260/280 ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. Since an optimum value for 260/280 ratio for pure DNA is 1.8, the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0 was determined (in parentheses). Only for FFPE tissue, we found a single DNA sample with a 260/280 ratio out of range (2.1).

FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Next, we observed the integrity for DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva by electrophoresis on an agarose gel (Fig. 2), and we estimated the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear using densitometry analysis (Table 2). The percentage of DNA samples with presence of the HMW band was also determined. DNA integrity for all the groups of samples was high as the percentage near 100% indicated, except for DNA samples isolated from FFPE tissue, which were observed as a smeared band and the HMW band was not observed. Densitometric measurements supported the integrity results as the HMW band/smear ratio was considerably higher than 1.0 for frozen tissue and blood samples and lower than 1.0 for FFPE tissues. The ratio for saliva samples was 1.31 because of the lower intensity of the HMW band.

FIGO. 2 DNA integrity observation by electrophoresis in agarose gel. DNA samples were analyzed by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel. The Lambda-pUC Mix Marker 4 (MW) was also separated as size reference. Four representative samples of DNA for frozen tissue in OCT (UMA), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) are shown.

Table 2. DNA Integrity Analysis by Agarose Gel Electrophoresis

The extracted DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva were evaluated by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel electrophoresis. Densitometry analysis was performed to gauge the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear. The average ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. The percentage of samples for each group with presence of a HMW band was also determined (in parentheses).

HMW, high molecular weight.

When DNA integrity was estimated using the ratio between both absolute yields by PicoGreen and by spectrophotometry, results corroborated the higher integrity for DNA samples from frozen tissue, blood, and saliva with trend values of 1.0, and the lower integrity for DNA from FFPE tissue. However, the ratio for blood was lower than that we expected from agarose gel results (Fig. 3).

FIGO. 3 PicoGreen ® /A260 yield ratio. PicoGreen DNA quantification and DNA quantification using Lambert–Beer law from 260 nm absorbance were performed for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (UMA), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D). Absolute yields in micrograms of DNA obtained for both methods were calculated. The average ratio and standard deviation of the ratio between absolute yield using PicoGreen and spectrophotometry for each type of source are represented.

To determine the usability of DNA samples for downstream applications, a real-time PCR assay for the GAPDH e RPLP0 genes was performed. Although all DNA samples amplified for both genes, the CT value for FFPE tissue was significantly higher (almost five cycles) (Fig. 4), supporting the higher fragmentation of DNA.

FIGO. 4 DNA performance for real-time PCR assay. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (UMA), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) were amplified by real-time PCR for the GAPDH (deixou) e RPLP0 (direito) genes. The average CT value and standard deviation for each type of source were calculated. PCR, polymerase chain reaction.

In fact, when different sized PCR products were amplified (5049, 1137, and 400 bp corresponding to ACVR2B, ZFX, AF4 genes, respectively), DNA from FFPE tissue failed to amplify the 400 bp product (Fig. 5). Only frozen tissue in OCT and blood were able to amplify all the products.

FIGO. 5 DNA quality for PCR analysis. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (UMA), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) were amplified by PCR for the ACVR2B, ZFX, AF4, e GAPDH genes. PCR products of 5049, 1137, 400, and 87 bp, respectively, were analyzed by agarose gel electrophoresis. Four representative samples for each group are shown.


Affibody-mediated hot-start PCR enzyme with improved speed, yields, and amplicons length

Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase is fused with a dsDNA-binding domain that allows short extension times (10–15 sec/kb) and helps improve yields compared to a standard hot-start Taq DNA polymerase. In addition, its hot-start technology with Affibody molecules allows complete activation of the enzyme in “zero-time” at standard cycling temperatures. This combination of features, along with 2x fidelity of Taq DNA polymerase, makes Phire Hot Start II DNA Polymerase an ideal solution for routine and high-throughput PCR applications.

Features:

  • Fast enzyme with quick hot start (no separate activation step required)
  • Minimal reaction optimization due to high inhibitor tolerance and amplicons length than with traditional hot-start Taq DNA polimerase
  • Direct gel loading of PCR products, with green reaction buffer formats

Complete PCR cycling in less than half the time

Phire Hot Start II DNA Polymerase provides extension time of 10 sec/kb, requires no separate activation step, and allows direct loading of PCR products onto gels. Due to these features, PCR protocols with Phire Hot Start II DNA Polymerase is significantly faster than protocols with Taq DNA polymerases.

Short cycling times with Phire Hot Start II DNA Polymerase. A 600 bp fragment from human genomic DNA was amplified with five different hot-start DNA polymerases. With Phire Hot Start II DNA Polymerase, the PCR protocol was completed up to four times faster than with Taq DNA polymerases utilizing chemical or antibody-based hot-start technologies (suppliers A-D). Green buffer further reduces experimental time by allowing fewer pipetting steps and direct gel loading.


Scientists discover a way to sequence DNA of rare animals

Rare and extinct animals are preserved in jars of alcohol in natural history museum collections around the world, which provide a wealth of information on the changing biodiversity of the planet. These preserved specimens of snakes, lizards, frogs, fish and other animals can last up to 500 years when processed in a chemical called formalin. While formalin helps preserve the specimen making it rigid and durable, it poses a challenge to extracting and sequencing DNA. Furthermore, DNA degrades and splits into small fragments over time. This fragmented DNA is difficult to amplify into long informative stretches of DNA that can be used to examine evolutionary relationships among species when using older DNA sequencing technology. Therefore, scientists have not been able to effectively sequence DNA from these specimens until now.

LSU Museum of Natural Science Curator and Professor Christopher Austin and his collaborator Rutgers-Newark Assistant Professor Sara Ruane developed a protocol and tested a method for DNA sequencing thousands of genes from these intractable snake specimens. Their research was published today in the international scientific journal Molecular Ecology Resources.

"Natural history museums are repositories for extinct species. Unfortunately, naturalists in the 1800s were not collecting specimens for analyses we conduct today such as DNA sequencing. Now with these new methods, we can get the DNA from these very old specimens and sequence extinct species like the Ivory Billed Woodpecker, the Tasmanian Wolf and the Dodo Bird," Austin said.

He and Ruane found and tested an approach that includes taking a small piece of liver tissue from the snake specimen, heating it up over a longer period of time and applying an enzyme that digests the tissue sample and enables the DNA to be extracted. Their minimally invasive protocol preserves the specimen so additional information can be collected from the specimen in the future. It also includes applying the latest technology to chemically sequence the specimens' DNA.

"A genome is a complex jigsaw puzzle broken up in to hundreds of millions of small pieces. We can sequence those pieces and computationally put them back together," Austin said.

They extracted and sequenced the DNA of 13 historic or rare snake specimens from all over the world many of which had never been analyzed using modern genetic methods. Some of the specimens were more than 100 years old. They also integrated these data with modern samples to create a genetic family tree, or phylogeny, that maps the evolutionary relationships of various snake species. This work resulted in thousands of genetic markers for snake specimens collected as far back as the early 1900s.

"The exciting thing about this work is that it makes species that have been essentially lost to science, due to extirpation, rarity or general secretiveness, which applies to many animals and not just snakes, available for scientific research in the modern age of genomics," Ruane said.

"We also believe this research will benefit scientists working with rare animals that are either hard to collect or extinct but are represented in fluid-preserved historical collections. It also underscores the continued importance of museum collections in modern science," Austin said.


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