Em formação

Por que minha qualidade básica no alinhamento não é perfeita?


Tenho um arquivo fasta com algumas sequências de DNA. Eu gostaria de simular leituras de sequenciamento de próxima geração a partir dele. Estou fazendo isso sem nenhum erro de base e erro de mutação.

wgsim -e 0 -r 0 sequência.fa seq_0_1.fq seq_0_2.fq

Pelo que sei, esta é uma simulação perfeita. Em seguida, eu dou os alinhamentos emparelhados para bwa para alinhamento.

bwa mem -M sequence.fa seq_0_1.fq seq_0_2.fq> P0.sam

Agora, eu verifico o ASCII de qualidade base (coluna 11 no formato SAM, a especificação está aqui).

head -n 3 P0.sam | corte -f11 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

De acordo com esta página, o ASCII (em ordem de qualidade) é:

! "# $% & '() * +, -. / 0123456789:; <=>? @ ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ [] ^ _' abcdefghijklmnopqrstuvwxyz {|} ~

Pergunta: Meu experimento deve ser perfeito, portanto, espera-se que minhas métricas de qualidade básica apareçam perto da extremidade direita da lista (como x, y, z). No entanto, minha métrica I não está nem perto do topo da lista. Em particular, não consigo alcançar nada de J a ~. Porque?


Quando as leituras fasta estão alinhadas, são atribuídas por padrão a pontuação phred de 40, que na codificação phred + 33 é representada poreu. Phred + 33 usa caracteres ASCII de!paraeu:

! "# $% & '() * +, -. / 0123456789:; <=>? @ ABCDEFGHI

Phred + 33 foi originalmente usado por máquinas sanger, mas agora é usado por todas as plataformas populares, como Illumina, Ion-torrent (também Ion-proton) e Roche 454. Como a maioria das plataformas agora usa phred + 33, a maioria dos alinhadores também o assume por predefinição. Você pode especificar outros formatos de codificação de qualidade se desejar (como phred + 64 ou Solexa).

Dê uma olhada na página da Wikipedia sobre o formato FASTQ para os diferentes formatos de codificação de qualidade.


Alinhamento não é postura.

“Acredita-se, pelo menos desde a época de Galileo Galilei (1564-1642), que fatores mecânicos influenciam fortemente a forma e a função biológicas. Na verdade, o conceito geral de que a mecânica influencia a biologia foi articulado claramente há mais de um ano por J. Wolff (1835-1902), que sugeriu que a arquitetura trabecular do osso é ditada principalmente por direções de tensão máxima que surgem em resposta à carga externa. No entanto, foi muito mais recente que aprendemos que a mecânica influencia a biologia até o nível de expressão do gene alterado que, em muitos casos, parece contribuir para uma homeostase mecânica em várias escalas de comprimento e tempo [1]. ”

Ocorre-me que devo a você uma explicação mais robusta do alinhamento, visto que ela é usada regularmente de forma intercambiada com a palavra postura. Deixe-me começar retirando algumas definições do Merriam-Webster.com.

Postura: a maneira como seu corpo está posicionado quando você está sentado ou em pé.

Explicando um pouco mais a postura, a postura é a orientação das partes. Você quantifica a postura medindo como as peças estão posicionadas em relação umas às outras, bem como como elas estão posicionadas em relação ao solo. Ou talvez seja mais fácil pensar no corpo em uma grade onde você pode plotar as partes neste gráfico.

Agora, para a definição de alinhamento:

Alinhamento: o posicionamento adequado ou estado de ajuste das peças (como de um dispositivo mecânico ou eletrônico) em relação umas às outras.

Tanto a postura quanto o alinhamento têm a ver com o posicionamento, mas diferem porque a definição de alinhamento inclui a palavra adequada. É essa ideia de “adequado” que diferencia os dois. Agora, antes de assumirmos que apropriado significa “melhor” ou “superior”, ou atribuir a ele um termo com condescendência implícita, vamos examinar a definição.

Apropriado é definido como "do tipo necessário adequado ou apropriado."

Se você dirige um carro, provavelmente teve que ajustar o alinhamento das rodas (não a postura das rodas) em algum ponto. Nesse caso, seu mecânico não está encontrando a posição mais atraente para uma roda. Na verdade, o alinhamento das rodas não tem nada a ver com o posicionamento estático, mas como, uma vez em movimento, a interação de um sistema - a estrada, as rodas, o pneu, os componentes da suspensão e outras coisas sobre as quais nada sei - não infligir danos excessivos em qualquer parte que compõe o sistema.

Para encontrar o alinhamento ideal das rodas, o mecânico deve considerar os pontos de fadiga do material, as forças criadas pela velocidade, o terreno (seu veículo sai da estrada?), A pressão dos pneus, etc. Em suma, o alinhamento inclui a consideração das FORÇAS. Ou dito de outra forma, a postura é a orientação visível das peças e o alinhamento engloba as forças invisíveis criadas por movimentos específicos.

Muitos de vocês estão trabalhando em seu alinhamento, o que não quer dizer que não estejam trabalhando em sua postura. Você está, por definição, trabalhando em ajustes posturais. Mas você está trabalhando nesses ajustes posturais para um melhor alinhamento - para mudar a maneira como você cria forças que se transformam em cargas experimentadas por seus tecidos.

O termo "adequado" levanta a questão "existem requisitos quando se trata da máquina em questão (leia-se: o corpo humano)." E a resposta é, claro que existem. Assim como existe uma homeostase fisiológica para o corpo, também existe uma homeostase mecânica.

A pesquisa sobre as nuances de cada doença induzida por carga começará a surgir agora que as cargas mecânicas e as respostas celulares (mecanotransdução) são entendidas um pouco mais. Quanto às questões musculoesqueléticas, muito do nosso raciocínio atual para vários exercícios e ajustes posturais deriva de pesquisas de carga. (Embora seja interessante notar que o pesquisador de mecanoterapia KM Khan descobriu que a mecanotransdução não é apresentada atualmente nos curículos de fisioterapia. "Nossos '' resultados '' informais (dados não publicados) sugeriram que a mecanotransdução não estava sendo ensinada como um princípio biológico importante na fisioterapia. programas [2]. ")

Eu não acho que chegará um momento em que esgotaremos a descoberta do que um corpo precisa (não estamos nem perto de avaliar o movimento de uma forma diferenciada e depois de 50 anos ainda estamos trabalhando com 30 eixos de articulação em 300 ), mas até então, saiba que não é uma "posição perfeita" que você está procurando, mas uma conjunto de forças que permite que seu sistema funcione melhor como um todo.

1. Adaptação vascular e homeostase mecânica nos níveis tecidual, celular e subcelular. Cell Biochemistry and Biophysics Fevereiro de 2008, Volume 50, Edição 2, pp 53-78


Qualidade de construção

Construído com materiais de qualidade e montado manualmente, nosso processo de construção de gabinete resulta em gabinetes semipersonalizados que parecem personalizados. Artesãos habilidosos constroem gabinetes duradouros e de qualidade que resistirão ao passar do tempo em sua casa.

Recursos de gabinete de parede padrão

Os armários de parede apresentam prateleiras ajustáveis ​​para máxima capacidade de armazenamento. Dobradiças ocultas Whisper Touch & trade fornecem portas de fechamento suave e são ajustáveis ​​de seis maneiras para o alinhamento perfeito. Clique na imagem à direita para saber mais.

Veja todos os recursos em um relance

Whisper Touch e trocar dobradiças

As dobradiças Whisper Touch ocultas fecham as portas suave e silenciosamente todas as vezes e são ajustáveis ​​de seis maneiras para o alinhamento perfeito.

Prateleiras de armário de parede

Prateleiras de 3/4 "de espessura total têm um laminado de grão de madeira de bétula natural. Prateleiras de madeira compensada de 3/4" fornecidas quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Armações de rosto

As armações de rosto arredondadas mantêm as mãos livres de arranhões e duplicam a aparência de móveis finos, dando aos seus armários um toque extra de luxo.

Interiores

A construção padrão tem um laminado de grão de madeira de bétula natural. As opções de atualização incluem o interior laminado correspondente ou o interior folheado a condizer. Interior de folheado de bétula natural fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Whisper Touch e trocar dobradiças

As dobradiças Whisper Touch ocultas fecham as portas suave e silenciosamente todas as vezes e são ajustáveis ​​de seis maneiras para o alinhamento perfeito.

Prateleiras de armário de parede

Prateleiras de 3/4 "de espessura total têm um laminado de grão de madeira de bétula natural. Prateleiras de madeira compensada de 3/4" fornecidas quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Armações de rosto

As armações de rosto arredondadas mantêm as mãos livres de arranhões e duplicam a aparência de móveis finos, dando aos seus armários um toque extra de luxo.

Interiores

A construção padrão tem um laminado de grão de madeira de bétula natural. As opções de atualização incluem o interior laminado correspondente ou o interior folheado a condizer. Interior de folheado de bétula natural fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Recursos do Gabinete Base Padrão

Os gabinetes básicos apresentam painéis traseiros e inferiores mais grossos e construção em forma de I. Caixas de gaveta de madeira sólida de profundidade total apresentam construção em cauda de andorinha. Os corredores de gaveta com extensão total Whisper Touch & trade criam gavetas de fechamento suave com fácil acesso ao conteúdo. Clique na imagem à esquerda para saber mais.

Veja todos os recursos em um relance

Suspensórios

As vigas I de profundidade total, feitas de madeira projetada de 1/2 ", fornecem estabilidade e fortes pontos de ancoragem para a bancada. As vigas I de compensado de 1/2" são fornecidas quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Painel Traseiro

Laminado de grão de madeira de bétula natural de 3/8 "de espessura. Compensado de 3/8" fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Painéis Finais

Painéis laterais de 1/2 "de construção padrão com laminado de grão de madeira que combina com a espécie do seu estilo de porta. As atualizações disponíveis incluem: Extremidades de compensado, Extremidades de compensado para móveis e Extremidades de compensado para móveis e Construção totalmente de compensado com painéis de extremidade de móveis.

Armações de rosto

As armações de rosto arredondadas mantêm as mãos livres de arranhões e duplicam a aparência de móveis finos, dando ao seu armário um toque extra de luxo.

Whisper Touch e troca de corrediças de gaveta

Nossos corredores de gaveta Whisper Touch de extensão total criam gavetas de fechamento suave com fácil acesso ao conteúdo.

Construção de gaveta

Gaveta de profundidade total de madeira maciça de 3/4 "com construção em cauda de andorinha de quatro lados e fundo de madeira compensada de 3/16".

Frente da gaveta

3/4 "de madeira maciça ou frentes de gaveta laminadas.

Portas

Molduras de madeira maciça de 3/4 "com painéis centrais sólidos ou folheados ou portas laminadas. Os pára-choques PermaSet flexíveis e transparentes amortecem o ruído de fechamento.

Prateleiras de armário baixo

Prateleiras de profundidade total de 3/4 "de espessura têm um laminado de grão de madeira de bétula natural. Prateleiras de profundidade total fornecem 25% mais espaço de armazenamento utilizável por gabinete do que prateleiras de meia profundidade. Compensado de 3/4" fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Painel Inferior

Laminado de grão de madeira de bétula com 1/2 "de espessura fixado com juntas de laminado. Contraplacado de 1/2" de espessura fornecido quando Todas as construções de madeira compensada são selecionadas.

Whisper Touch e trocar dobradiças

As dobradiças Whisper Touch ocultas fecham as portas silenciosamente todas as vezes e são ajustáveis ​​de seis maneiras para o alinhamento perfeito.

Interiores

A construção padrão tem um laminado de madeira de bétula natural. As opções de atualização incluem o interior laminado correspondente ou o interior folheado a condizer. Interior de folheado de bétula natural fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Quadro

Suspensórios

As vigas I de profundidade total, feitas de madeira projetada de 1/2 ", fornecem estabilidade e fortes pontos de ancoragem para a bancada. As vigas I de compensado de 1/2" são fornecidas quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Painel Traseiro

Laminado de grão de madeira de bétula natural de 3/8 "de espessura. Compensado de 3/8" fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Painéis Finais

Painéis laterais de 1/2 "de construção padrão com laminado de grão de madeira que combina com a espécie do seu estilo de porta. As atualizações disponíveis incluem: Extremidades de compensado, Extremidades de compensado para móveis e Extremidades de compensado para móveis e Construção totalmente de compensado com painéis de extremidade de móveis.

Armações de rosto

As armações de rosto arredondadas mantêm as mãos livres de arranhões e duplicam a aparência de móveis finos, dando ao seu armário um toque extra de luxo.

Painel Inferior

Laminado de grão de madeira de bétula com 1/2 "de espessura fixado com juntas de laminado. Contraplacado de 1/2" de espessura fornecido quando Todas as construções de madeira compensada são selecionadas.

Gavetas e portas de amplificação

Whisper Touch e troca de corrediças de gaveta

Nossos corredores de gaveta Whisper Touch de extensão total criam gavetas de fechamento suave com fácil acesso ao conteúdo.

Construção de gaveta

Gaveta de profundidade total de madeira maciça de 3/4 "com construção em cauda de andorinha de quatro lados e fundo de madeira compensada de 3/16".

Frente da gaveta

3/4 "de madeira maciça ou frentes de gaveta laminado.

Portas

Molduras de madeira maciça de 3/4 "com painéis centrais sólidos ou folheados ou portas laminadas. Amortecedores PermaSet flexíveis e transparentes amortecem o ruído de fechamento.

Prateleiras de armário baixo

Prateleiras de profundidade total de 3/4 "de espessura têm um laminado de grão de madeira de bétula natural. Prateleiras de profundidade total fornecem 25% mais espaço de armazenamento utilizável por gabinete do que prateleiras de meia profundidade. Compensado de 3/4" fornecido quando a atualização de todas as construções de madeira compensada é selecionada.

Whisper Touch e trocar dobradiças

As dobradiças Whisper Touch ocultas fecham as portas silenciosamente todas as vezes e são ajustáveis ​​de seis maneiras para o alinhamento perfeito.


Resultados

Nós projetamos Varlociraptor, como um método para implementar as melhorias na etapa de análise diferencial delineada na introdução. Até onde sabemos, o Varlociraptor é o primeiro método que permite um controle preciso e estatisticamente sólido da taxa de descoberta falsa na descoberta de indels somáticos. Como consequência, a aplicação de Varlociraptor leva a aumentos substanciais na recuperação na descoberta indel somática. O Varlociraptor dobra ou mesmo triplica o número de descobertas verdadeiras em comparação com as ferramentas de última geração, enquanto muitas vezes também melhora a precisão ou, de qualquer forma, não incorre em qualquer tipo de perda de precisão. O varlociraptor também estima com precisão a frequência do alelo variante (VAF) para todos os indels somáticos.

A seguir, fornecemos uma descrição de alto nível do fluxo de trabalho do Varlociraptor. Fornecemos uma breve explicação de como podemos quantificar todas as incertezas relevantes no tempo de execução linear, como a principal descoberta metódica e o bloco de construção fundamental que está por trás de tudo o que se segue. Ilustramos brevemente como o modelo de variável latente bayesiana, que permite a quantificação rápida de incertezas, imediatamente dá origem ao cálculo de todas as probabilidades que são cruciais na chamada de variantes somáticas. Além disso, abordamos brevemente como o Varlociraptor estima as frequências de alelos variantes (VAFs). Finalmente, explicamos como o FDR preciso pode ser estabelecido. Para obter detalhes, consulte a seção “Métodos”.

Posteriormente, analisamos o desempenho do Varlociraptor em comparação com as ferramentas de última geração em dados simulados e reais. Como apontado acima, mostramos que o Varlociraptor de fato atinge aumentos (às vezes drásticos) no recall, frequentemente acompanhados por novos aumentos na precisão. Notamos que as probabilidades usadas para classificar chamadas de variantes putativas permitem uma distinção clara entre verdadeiros e falsos positivos, o que é de valor considerável na prática de classificação. Em seguida, demonstramos que o Varlociraptor de fato controla o FDR de maneira confiável, fornecendo, assim, a explicação teórica de por que o Varlociraptor atinge taxas de desempenho superiores em termos de recall e precisão. O Varlociraptor estima com mais precisão todos os VAFs. Voltando nossa atenção para os dados reais, concluímos que o Varlociraptor atinge uma concordância superior para variantes de VAF de pelo menos 20%. Para variantes de VAF de menos de 20%, o Varlociraptor é a única ferramenta que descobre quantidades consideráveis ​​de variantes. A baixa cobertura de leituras que suportam essas chamadas fornece explicações estatísticas rigorosas sobre o motivo pelo qual a concordância não pode ser alcançada em tarifas que se aplicam a chamadas acima de 20%. Para corroborar que a maioria das chamadas de Varlociraptor estão corretas - assim como experimentamos em dados simulados - demonstramos que as estatísticas de contagem de Varlociraptor concordam com a expectativa teórica sob evolução neutra.

Fluxo de Trabalho

Primeiro, discutimos como o Varlociraptor incorpora um fluxo de trabalho para chamadas de variantes somáticas e destacamos a diferença central para as abordagens clássicas.

O fluxo de trabalho clássico para chamar variantes somáticas (Fig. 1a) começa com leituras alinhadas do tumor e amostra saudável correspondente do mesmo paciente em BAM (https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf) ou CRAM ( formato https://samtools.github.io/hts-specs/CRAMv3.pdf). Primeiro, as variantes são descobertas e uma análise diferencial é realizada para chamar as variantes como somáticas ou germinativas. As variantes candidatas são relatadas no formato VCF ou BCF (https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf). A seguir, nos referiremos a VCF como um espaço reservado para VCF / BCF e BAM como um espaço reservado para BAM / CRAM. Em segundo lugar, as variantes candidatas são filtradas, geralmente aplicando limites para várias pontuações (por exemplo, qualidade da variante, polarização da fita, cobertura, qualidade de mapeamento mínima, número mínimo de leituras de suporte em amostra saudável), a fim de obter chamadas de variantes finais. Se não depender apenas de alguns padrões sugeridos, encontrar esses limites costuma ser um esforço tedioso e específico do estudo.

Diferença entre uma a variante somática clássica chamando o fluxo de trabalho e b a abordagem do Varlociraptor

Com o Varlociraptor, fornecemos uma nova abordagem para chamada e filtragem, separando assim a descoberta de variante da chamada (Figura 1b). A entrada para Varlociraptor são variantes candidatas de uma etapa de descoberta externa. Aqui, qualquer ferramenta de chamada de variante pode ser aplicada. No momento em que este artigo foi escrito, a implementação do Varlociraptor oferece suporte a SNVs, variantes de múltiplos nucleotídeos (MNVs), inserções e exclusões. No entanto, o modelo apresentado aqui é agnóstico em relação ao tipo de variante e estamos trabalhando ativamente para adicionar suporte para todos os outros tipos de variantes no Varlociraptor. Portanto, embora estejamos escrevendo sobre indels a seguir, lembre-se de que o modelo apresentado pode ser aplicado diretamente a outros tipos de variantes. Da mesma forma, o Varlociraptor atualmente oferece suporte a leituras curtas de extremidade única ou emparelhada, enquanto o próprio modelo é independente do protocolo e da tecnologia de sequenciamento. A implementação será estendida no futuro. Existem muitas abordagens que lidam completamente com a etapa de descoberta. Em particular, como já é prática comum dentro dos pipelines de chamada de variantes somáticas de última geração (por exemplo, o pipeline de Sarek, [22]), é possível combinar as variantes candidatas de diferentes chamadores, a fim de obter o máximo sensibilidade em todos os tipos de variantes e intervalos de comprimento. No entanto, em vez de ter que realizar uma filtragem ad hoc de chamadas finalizadas (por exemplo, Sarek realiza a votação por maioria), o Varlociraptor fornece um mecanismo unificado para avaliar todas as variantes candidatas. Durante a chamada, o Varlociraptor classifica as variantes em tumor somático, somático saudável, linha germinativa ou variantes ausentes, enquanto fornece probabilidades posteriores para cada evento (consulte a seção "Classificação") junto com estimativas máximas a posteriori da frequência do alelo variante (VAF) (consulte seção “Estimativa de frequências de alelos para variantes de tumor somático”), relatado no formato BCF. Finalmente, usando as probabilidades posteriores, o Varlociraptor pode filtrar variantes simplesmente controlando uma taxa de descoberta falsa desejada (FDR, consulte a seção “Controle de taxa de descoberta falsa”), em vez de exigir o ajuste de vários limites. Isso se torna possível porque o Varlociraptor, como a primeira abordagem, integra todas as fontes conhecidas de incerteza em um único modelo unificado.

Neste trabalho, avaliaremos o desempenho do Varlociraptor em comparação direta com as rotinas de análise diferencial (geralmente ad hoc) fornecidas por outras ferramentas. Usaremos os indels que são produzidos pela respectiva ferramenta para comparar em sua primeira etapa (descoberta) como entrada para o Varlociraptor. Dessa forma, garantimos que todas as ferramentas recebam informações com as quais devem lidar e, portanto, garantimos o máximo de justiça.

Fundação da abordagem

Cálculo eficiente da função de verossimilhança fundamental

Vamos corrigir um locus variante particular, conforme fornecido por uma entrada no arquivo VCF que lista todas as variantes candidatas da Fig. 1b. Por θh e θc, denotamos a frequência alélica verdadeira, mas desconhecida, dessa variante (putativa) entre os saudáveis ​​(θh) e o canceroso (θc) cópias do genoma. Enquanto por linha germinativa variantes, θ ∈ <0,1 / 2,1> refletindo ausência (artefatos ou ruído) e heterozigosidade e homozigotia da variante, e θ ∈ [0,1] para variantes somáticas. Nós modelamos isso somático saudável as variantes geralmente aparecem em taxas subclonais, permitindo apenas θ ∈ (0,1 / 2), ou seja, o intervalo exclusivo entre 0 e 1/2. Uma variante avalia como tumor somático se e apenas se θc& gt0, enquanto θh= 0. Uma vez que estamos mais interessados ​​nessas variantes, um dos objetivos centrais é concluir que θc& gt0,θh= 0 para uma variante putativa particular com probabilidade suficientemente grande.

Por ( boldsymbol ^= left (Z_ <1> ^. Z_^ right) ) e ( boldsymbol ^= left (Z_ <1> ^. Z_^ right) ), denotamos os dados lidos sendo associados ao locus variante na amostra saudável (h) e tumoral (t). Observe que distinguimos entre a amostra do tumor, que é uma mistura de células saudáveis ​​e cancerosas, e as próprias células cancerosas. Quando nos referimos a este último, usamos o subscrito c, e para o primeiro, usamos o subscrito t. Cada um dos (Z_^, Z_^, i = 1. k, j = 1. l ) representa uma leitura (emparelhada) que se tornou alinhada ao longo ou próximo ao locus variante fornecido. Isso significa ainda que k e eu correspondem às coberturas de leitura específicas da amostra nesse locus. Para selecionar leituras por meio de alinhamentos, usamos BWA-Mem [23] a seguir, embora a escolha de um alinhador particular seja opcional, desde que o alinhador produza um valor MAPQ [24], que quantifica a certeza pela qual o fragmento sequenciado ( representado pelo par de leitura) deriva do locus em consideração.

Além disso, deixe ( beta in <0, frac 12,1 > ) denotar o viés de vertente afetando o locus variante particular. Deste modo, β= 0 e β= 1 denota que a evidência sobre a variante putativa ocorre apenas no reverso (β= 0) ou para a frente (β= 1) fita. Ambos os casos são indicadores de artefatos de sequenciamento ou mapeamento. Portanto, nenhum viés de fita, ou seja, β= 1/2 será subsequentemente usado para selecionar variantes sem artefato.

Apresentamos um Modelo de variável latente bayesiana que permite computar eficientemente:

a probabilidade de frequências de alelos θh,θc e viés de fita β dados lidos dados Z h ,Z t (consulte a seção “O modelo”). Abordagens diretas para calcular (1) via quantificação de incerteza inversa totalmente bayesiana [25], que é a forma canônica aprovada para calcular (1) falha devido à necessidade de tempo de execução exponencial (consulte também a seção S1 (arquivo adicional 1)). A estrutura de dependência condicional do modelo estatístico que levantamos (consulte as seções "Métodos" e "O modelo"), aponta uma maneira de calcular (1) em tempo de execução linear em k+eu, conforme resumido pelo seguinte teorema.

Teorema 1

eu(θh,θc,βZ h ,Z t ) pode ser calculado em O(k+eu) operaçoes aritimeticas.

Observe que este é o melhor que se pode esperar, pois o insight é crucial na prática da chamada de variantes somáticas, além de estabelecer também uma novidade teórica, pois o Teorema 1 estabelece que eu(θh,θc,βZ h ,Z t ) pode ser avaliado rapidamente em qualquer (θh,θc,β) Isso, por sua vez, torna a integração eu(θh,θc,βZ h ,Z t ) computacionalmente viável, o que facilita a resolução dos três problemas essenciais a seguir.

Classificação

A classificação estatisticamente correta na chamada de variantes somáticas requer, quando fornecida Z h ,Z t , para calcular as probabilidades posteriores para os quatro casos a seguir, que se referem a diferentes combinações de θc,θh (veja também a Fig. 8a na seção “Métodos”).

Tumor somático (st) θc& gt0,θh= 0: a variante é somática no tumor e não aparece no genoma saudável.

Linha germinativa (ge) θh ∈ <1 / 2,1>: uma variante da linha germinativa, onde θh= 1/2 reflete um heterozigoto e θh= 1 uma variante homozigótica.

Somático saudável (sh) θh ∈ (0,1 / 2): uma variante que é somática, mas aparece no genoma saudável, refletida por frequências de alelos subclonais, variantes não germinativas.

Ausente (ab) β ∈ <0,1> ou θc=0,θh= 0: a variante reflete artefatos ou ruído (tendência da fita).


A energia do dinheiro

O dinheiro é uma expressão de energia e nós o usamos para sustentar nossa vida. Consciência é a percepção e o conhecimento interno de pensamentos, sentimentos e experiências. Quando o dinheiro é ganho, gasto, economizado e doado conscientemente, ele reflete o que mais valorizamos. Torna-se um indicador intuitivo de quem somos, o que defendemos e para onde vamos. Ao interagir com o dinheiro de forma consciente, nos sentimos bem conosco e com nosso mundo.

Porém, quando não estamos conscientes em nossas experiências com o dinheiro, ocorre o efeito oposto e acabamos fazendo coisas, muitas vezes repetidas, que não têm muito sentido lógico.

"A função da mente é criar coerência entre nossas crenças e a realidade que experimentamos." Lipton continua: "Geralmente percebemos que estamos conduzindo nossas vidas com nossos desejos e vontades. Mas a neurociência revela um fato surpreendente. Nós apenas conduzimos nossas vidas com nossa mente criativa e consciente cerca de 5 por cento do tempo. Noventa e cinco por cento dos Com o tempo, nossa vida é controlada pelas crenças e hábitos que são programados na mente subconsciente. "

Se usarmos nossa mente consciente apenas cerca de 5% do tempo, isso pode explicar por que geralmente fazemos coisas com dinheiro que não fazem sentido, como comprar coisas de que não precisamos, não podemos pagar ou não queremos de fato. E se a mente subconsciente está no controle 95 por cento do tempo, isso significa que somos altamente suscetíveis a quaisquer mensagens com as quais entramos em contato. Os profissionais de marketing, é claro, sabem disso muito bem e construíram todo o seu sistema aproveitando as vantagens de como a mente subconsciente funciona. Vemos como isso funciona no ataque diário de informações de vendas recebidas e também observando todas as nossas coisas.

Essa mesma inconsciência sobre o dinheiro também pode explicar por que nos encontramos trabalhando em empregos de que não gostamos.

À medida que aumenta a consciência em torno do dinheiro, inevitavelmente começamos a questionar nossas percepções e expectativas morais e psicológicas. É neste momento que podemos nos fazer perguntas como:

1. Faço coisas com dinheiro que, em retrospecto, não parecem fazer muito sentido? Se sim, por que isso acontece?

2. Meus valores essenciais estão alinhados com meu trabalho e como ganho dinheiro?

3. Tenho minhas prioridades bem definidas e, em caso afirmativo, a maneira como gasto o dinheiro apóia essas prioridades?

4. Sei a diferença entre meus desejos e necessidades e, em caso afirmativo, cuido de minhas necessidades primeiro e meus desejos em segundo lugar ou vice-versa?

5. Sei como meu dinheiro é investido e esses investimentos apóiam meus valores essenciais?

6. Estou dedicando meu tempo e dinheiro o suficiente às causas que pretendo apoiar?

Para entender como chegamos onde estamos, é útil entender que construímos um sistema complexo de crenças sobre dinheiro em nosso subconsciente. Usamos essas crenças como um painel de vidro através do qual vemos tudo. Às vezes, nossas crenças são úteis, mas outras vezes nos impedem de ver a dura realidade de nossas interações financeiras e, portanto, nunca acabamos fazendo mudanças úteis e saudáveis.

O custo de ignorar a consciência do dinheiro é alto. Isso prejudica nosso bem-estar, causando problemas em nossos relacionamentos e em nosso trabalho, causando doenças e problemas de saúde e, por fim, conhecendo nosso verdadeiro eu. Essa mesma inconsciência levou a objetivos sociais que são insustentáveis. Vemos seus efeitos na degradação de nosso meio ambiente, em nosso governo local, estadual e nacional, em atividades culturais como esportes e religião, em áreas sociais como a educação e o atendimento aos necessitados, e vemos isso nos negócios, onde o fim é freqüentemente visto como uma justificativa dos meios.

É difícil admitir, mas valorizamos nossa inconsciência mais do que valorizamos o potencial de uma vida melhor.

Felizmente, não precisamos permanecer nesse estado mental inconsciente para sempre. Existem maneiras de mudar e isso começa com cada um de nós, em nosso próprio caminho para a autocompreensão e autodescoberta. Não podemos esperar que o mundo mude se nós mesmos não mudamos. Nós somos eles, eles somos nós. Ele começa tomando uma posição para se tornar mais consciente do dinheiro. Olhando para nossas próprias vidas, de onde viemos, o que defendemos e para onde queremos ir, conscientemente. Só então podemos criar o mundo harmonioso e sustentável em que desejamos viver.


Métodos

Conjuntos de dados e processamento de dados de sequência

A fim de comparar o mapeamento de leitura entre vg e bwa aln, compilamos um conjunto de dados de leituras de sequenciamento de indivíduos antigos publicados anteriormente (Tabela 1). O corte do adaptador foi feito com AdapterRemoval [39] para leituras emparelhadas (mesclando leituras sobrepostas) e cutadapt [40] para leituras de terminação única. Os dados FASTQ não alinhados dos outros dois conjuntos de dados [25, 27] já foram fornecidos com adaptadores aparados. Alinhamos as leituras aparadas para o genoma de referência linear humano (hs37d5) usando bwa aln [29] com os parâmetros -l1024 (para desativar a propagação) e -n 0,02 [13] ou -n 0,01 -o 2, com qualidade de base mínima -q 15 Construímos o arquivo de índice para vg [17] com hs37d5 e variantes do conjunto de dados da fase 3 do Projeto 1000 Genomes [16] acima de 0,1% MAF. No total, o gráfico continha 27.485.419 SNPs, 2.662.263 indels e 4.753 outras variantes de pequenos complexos. As leituras cortadas foram alinhadas ao gráfico de variação usando o mapa vg (v1.16.0-137-ge544284) com os parâmetros “–surject-to bam -k 15 -w 1024.” Leituras duplicadas foram removidas com sambamba markdup [41] usando o parâmetro “–remove-duplicates”. Os arquivos BAM foram subsequentemente filtrados com visualização samtools [29], selecionando leituras com diferentes limiares de qualidades de mapeamento (bwa aln e vg: mapQ & gt 0 ≥ 25, ≥ 30 vg apenas: ≥ 50 ≥ 60). A razão para usar diferentes limites de qualidade de mapeamento é que bwa usa um processo de estimativa de qualidade de mapeamento diferente com máximo em torno de 37 do que vg com máximo de 60. A cobertura foi estimada com o utilitário qualimap [42] bamqc. Apresentamos o número de leitura, conteúdo de DNA endógeno e cobertura para amostras alinhadas com vg e bwa aln no arquivo adicional 1: Tabela S5 e Tabela S6.

Simulações

Simulamos todas as leituras possíveis sobrepondo-se aos SNPs do cromossomo 11 no conjunto de dados Human Origins [20, 21]. Em metade das leituras simuladas, o alelo alternativo foi introduzido. Em seguida, adicionamos diferentes níveis de desaminação em leituras simuladas usando gargammel [23], com base em danos post-mortem estimados empiricamente em um conjunto de dados de 102 genomas antigos [22]. Alinhamos essas leituras simuladas ao gráfico 1000GP com o mapeador vg ou ao genoma de referência humano linear (GRCh37) com bwa aln, com os parâmetros -n 0,02 ou -n 0,01 -o 2 [14], bwa mem e vg (aqui referido como “vg linear”). O mapeamento de leitura com vg para o gráfico 1000GP levou aproximadamente quatro (2,12–7,57) vezes mais do que com bwa aln -n 0,02. Os alinhamentos resultantes foram classificados com classificação sambamba, convertidos para bam com visualização samtools e filtrados com diferentes limiares de qualidades de mapeamento. Estimamos a precisão do alinhamento de leitura comparando a coordenada do genoma de onde cada leitura se origina e a coordenada obtida após o mapeamento, levando em consideração os deslocamentos entre eles causados ​​por softclips, exclusões e inserções. Erros de mapeamento de leitura foram visualizados usando o pacote R [43] circlize [44]. Para investigar o impacto de diferentes comprimentos de leitura e desaminação nas taxas de falso alinhamento dos três mapeadores de leitura (vg, bwa aln e bwa mem), simulamos 100.000 leituras de tamanhos diferentes (35-100 bp) de um conjunto de genomas de referência microbiana identificados nos dados da sequência de Clovis [45] usando gargammel [23]. Além disso, introduzimos alterações post-mortem em um subconjunto desses dados (30, 50, 70 e 90 bp) com base em [22]. We processed all simulated microbial read data as described above.

Authenticity and contamination estimates

Post-mortem deamination plots were generated with mapDamage v2 [28], sampling one million reads per sample. We estimated X-chromosome contamination in all male samples with ANGSD [46], with the parameters “-r X:5000000-154900000 -doCounts 1 -iCounts 1 -minQ 20” and using polymorphic sites identified in the HapMap Project.

Variant calling and population genetics analyses

For population genetics analyses, we used the Human Origins dataset distributed with Lazaridis et al. [47]. In order to estimate D-statistics and Principal Component Analyses, we generated pileups for each individual [48] at 1233553 SNPs from the Human Origins dataset using samtools mpileup, disabling base quality score recalibration and imposing a minimum base quality filter of q20. We note that pileups were generated from bam files filtered with a minimum mapping quality threshold of 30 for bwa aln or 50 for vg . We generated pseudo-haploid genotypes by randomly sampling one allele at each SNP site and converted resulting pseudo-haploid genotypes to PLINK format using PLINK 1.9 [49]. These were subsequently merged with the Chimp and Href (the human reference genome) samples from the Human Origins dataset and converted to eigenstrat format using convertf. We estimated D-statistics with qpDstat [20], passing the parameter “printsd: YES” to obtain standard deviation estimates.

For the Principal Component Analysis estimated with SNP sites, we first filtered the Human Origins dataset, removing variants with minor allele frequency below 0.02 and genotyping missingness of 0.05, and selecting West Eurasian individuals. We merged this dataset with the pseudo-haploid genotypes belonging to the ancient samples as described above and ran smartpca [50, 51], restricting the analysis to transversion SNPs, using the parameters “lsqproject: YES” to project ancient samples into the PCA coordinates estimated with present-day populations, “killr2: YES” to exclude SNPs in high linkage disequilibrium (r2thresh: 0.2) and performing two iterations for outlier removal (numoutlieriter: 2).

We used PLINK to estimate PCAs with indels. We prepared our datasets by first calling indels in the Yamnaya sample processed with vg and bwa , as described below, keeping variants with quality equal or greater than 30 and keeping biallelic indels only. We used vt [52] for variant normalization, taking the human reference genome as input, and duplicate removal. Then, we generated two datasets, based on the 1000 Genomes chromosome 21 indels, restricting by variants with alternate alleles identified in the vg - or in the bwa -aligned Yamnaya sample.

Downsampling experiment

We downsampled bwa aln and vg alignments belonging to the high-coverage Yamnaya individual from 1 to 10x using samtools. We then called 1,054,447 biallelic SNPs present in the 1000 Genomes chr21 VCF from all alignments using bcftools v. 1.8, requiring a base quality of at least 20. From the resulting variant calls, we kept only biallelic SNPs and selected heterozygous genotypes. We removed potential deamination SNPs and excluded variant calls with quality score below 30. Finally, we estimated the proportion of variants correctly recovered by comparing the genotypes obtained from the downsampled alignments with those obtained at full coverage. Comparison with the read modification method was done by modifying the downsampled and full coverage bwa -aligned reads with the 1000 Genomes SNP alleles and calling variants as described above.

Alternate allele support and allele balance

In order to compare alternate allele support between vg and bwa aln alignments, we called chromosome 1 SNPs from the Yamnaya alignments with bcftools. We then filtered these by variant quality greater or equal than 30, with depth of coverage above 8, and selected heterozygous variants. From these genotype calls, we obtained reference and alternate allelic depth and compared alternate allele support between the vg and bwa aligned sample. To investigate reference bias at the level of indels, we called variants with FreeBayes [53] from the Yamnaya sample processed with both vg and bwa aln with default parameters, which we subsequently filtered for the sites present in the 1000 Genomes variation graph used for alignment.

Comparison with additional methods for reducing reference bias

We compared vg with the workflow proposed by [10] to reduce reference bias. The following method was applied to both real and simulated data. First, for each bwa -aligned sample, we selected reads overlapping with the Human Origins SNPs or with the 1000 Genomes dataset. We then modified the allele in these reads using the “modify_read_alternative.py” script, distributed with [10], and remapped them with bwa aln to GRCh37 as described above. We then kept the original reads which mapped to the same location of the modified reads with “filter_sam_startpos_dict.py.” We estimated D-statistics from the resulting filtered alignments as described above.

We also compared vg with a second workflow for removing reference bias [15]. Simulated sequence reads were aligned with bwa aln to two versions of the reference genome, one containing reference alleles and the other alternate alleles. We used “bam-mergeRef” (https://github.com/StephanePeyregne/bam-mergeRef) to merge the resulting alignments, keeping one version of a read if it maps to the same region in both alignments, and also keeping reads mapped in one alignment but not in the other.


Conclusões

In general, for the prokaryotic data we observe, like others before us [15],[19], a tree of tips, where the terminal branches seem well supported but the deeper branches are not recovered by any of the individual genes studied. Unexpectedly for us, this was observed recurrently for three data sets spanning very different phylogenetic depths among prokaryotes, almost in a fractal-like manner. The lack of congruence among individual genes for deeper branches, which show high BPs in the concatenated analyses, we call the "disappearing tree" effect. Its cause remains obscure, but it provides a source of many caveats when it comes to attempting to infer evolutionary events from branches with high BPs in prokaryotic genome phylogenies. If an ancient evolutionary signal is real, for example the bacteria-archaea split [49], then it should be supported by individual genes, which we observe in the present study. Concatenation is an important aspect of modern phylogenomics and is not likely to go away any time soon, it is therefore all the more important to understand the properties of concatenation and its relationship to the individual underlying trees.


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Implementation

To try to make more sense of this we’ve gone through the documentation of a bunch of the most popular aligners to see how they make use of the MAPQ value.

Bowtie1

Bowtie1 sets the MAPQ value to 255 for uniquely mapped reads and 0 for multiply mapped reads, unless the --mapq flag was added when the program was launched, in which case the value specified will be used instead.

Bowtie2

Reference – this page has a great explanation for how alignments in bowtie2 are scored and MAPQ values are assigned.

Bowtie 2 uses a system of flag values for its mapped alignments based on the number of mismatches of various qualities, and the number of multi-mapping reads.

In the case of bowtie2 therefore you could use a MAPQ filter of >=40 to get reads which had only 1 convincing alignment, or a lower filter to allow multi-mapped reads where there was a secondary alignment with varying degrees of difference to the primary.

Bismark

The MAPQ values reported in Bowtie1 mode are always 255 (multiply aligning hits are not reported). In Bowtie 2 mode the MAPQ scores are re-calculated using the Bowtie2 scoring scheme.

BWA actually follows the SAM spec and reports Phred scores as MAPQ values. The calculation is based on the number of optimal (best) alignments found, as well as the number of sub-optimal alignments combined with the Phred scores of the bases which differ between the optimal and sub-optimal alignments.

Tophat

Tophat uses flag values with specific meanings to populate the MAPQ value field. Older versions of tophat set all values to 255 (not available) but any recent version has used an updated scoring scheme.

  • 50 = Uniquely mapping
  • 3 = Maps to 2 locations in the target
  • 2 = Maps to 3 locations in the target
  • 1 = Maps to 4-9 locations in the target
  • 0 = Maps to 10 or more locations in the target

There are however some caveats which come with these values!

  1. Tophat has the option to restrict reporting of hits using the -g parameter and unfortunately the calculation of MAPQ values appears to happen after this filtering resulting in all hits being given a MAPQ of 50. This means that to see meaningful MAPQ values you have to set -g to at least 2 (you can then later filter on the primary alignment flag to remove the secondary alignments).
  2. Tophat uses a dual mapping strategy where it first tries to align to a transcriptome and only if it doesn’t get a good hit there will it search the entire genome. When you have a read which is uniquely mapped within the transcriptome, but has multiple hits within the genome as a whole the hit will be reported as unique and given a MAPQ of 50, which can result in artefacts in downstream analyses.

Star uses a similar scoring scheme to tophat except that the value for uniquely mapped reads is 255 instead of 50.

The mapping quality MAPQ (column 5) is 255 for uniquely mapping reads, and int(-10*log10(1-1/[number of loci the read maps to])) for multi-mapping reads. This scheme is same as the one used by Tophat…

HiSat2

The HiSat2 manual helpfully has no information at all on the meaning of the MAPQ values it assigns. The code which generates it though at least gives some better clues. It looks like the MAPQ value is based on two factors – whether the aligner finds more than one hit, and whether the best hit it finds is a perfect match. It then generates a set of MAPQ values based on the degree to which an alignment is perfect, and the difference between the best alignment and the second best one. The scoring matrix can be seen here.

In effect it seems that the score for a perfect unique alignment is 44. A perfect alignment with a secondary hit will scale down from 42 to 2. An imperfect unique alignment scales down from 43 to 0. An imperfect primary alignment with a secondary alignment scales between 30 and 0.

A pragmatic level to filter at would therefore seem to be somewhere around 40 to get only very good, unique alignments.

Novoalign

Novoalign creates proper probabilistic MAPQ scores, based on the primary and secondary alignments. It also tries to take into account the likelihood that a read might have come from a region of the genome which was not present in the assembly. The full description can be found in sections 4.3.2 of the manual. The MAPQ values are capped at 70.

GSNAP

Since GSNAP is a popular aligner (albeit one that we don’t personally use) I tried to find the details of how it calculates MAPQ scores, but failed. The documentation has no information on this, and although I can find the source file which reports the MAPQ values it has no useful comments and a fairly complex schema so I gave up. If anyone wants to provide a summary of how this works I’ll be happy to add it.


Universal genetic code may not be so universal

New research is casting doubt on a commonly held belief about how cells use DNA to make proteins, suggesting the genetic code is more diverse than previously thought.

Cells take a number of complicated steps to translate their sequence of basic DNA building blocks into proteins, which then act as workhorses to carry out the vital functions of life. Since many different proteins are encoded on a single DNA strand, the cell uses markers to know when to start and stop making a protein.

Many biology textbooks say that the start marker, called a start codon, always encodes for a compound called methionine. Yet William Duax, a structural biologist at the State University of New York at Buffalo, says new research by his team suggests the textbooks could be wrong. He will present the research at the 66th annual meeting of the American Crystallographic Association, help July 22-26 in Denver, Colorado.

"We have ample evidence that hundreds of the oldest ribosomal proteins still start with a valine or a leucine code and do not have the codon for methionine in the DNA," Duax said, referring to proteins found in basic cell components called ribosomes. "We have found unequivocal evidence that the earliest species on earth are still using a primitive form of the genetic code consisting of only half of the standard 64 codons," he said.

The results are contradictory to a widely held belief among biologists. "There are significant errors in text books. The universal code is not universal and all species now on earth do not use a code "frozen in time" as claimed by Watson and Crick," Duax said. "Some basic assumptions about evolution are incorrect." Duax also noted that the results raise questions about some aspects of a hypothesis on the origins of life, called the RNA world, which posits that RNA, which is similar to DNA and is still used in cells, was the first genetic material.

Duax and his team obtained their results by combing through a database that contains the sequences of more than 90 million genes. The genes encode proteins and the researchers used new techniques to accurately identify all members of each family of proteins and distinguish them from all other families that have remained unchanged for 3 billion years.

The research team developed programs to expedite the complete capture and perfect alignment of families of proteins having 25,000 members and encompassing all species for which genomes are reported. From those perfect alignments researchers could identify the precise location and function of the most conserved residues in the alignment, meaning the proteins that have stayed the same for the longest period of time. From these primordial proteins the researchers found evidence that the oldest proteins do not start in the standard way or use many of the other parts of the standard codes for making proteins.

Perhaps as surprising as the research and its findings is the way that Duax helped fund his research. He developed a three-week summer school in molecular bioinformatics and evolution for highly motivated high school students. In the past six summers he has trained more than 220 students to trace the origin and evolution of the protein composition and folding, of all cellular species and of the genetic code.

In addition to changing the way we look at genetic coding and rewriting textbooks, Duax's work has applications in genetic therapies that exploit structural details of bacteria to develop therapies that are selective and have fewer side effects.

The next step for the research team is to publish the results of their work and receive feedback from other researchers.

"Some of my students have been in the program for three years and are already equipped to prepare manuscripts for submission to journals in molecular evolution and structural science," Duax said. However, the team is just beginning.