Em formação

7.5: Lesões de DNA - Biologia


A natureza robusta do DNA devido às suas fitas duplas complementares já foi observada várias vezes. O DNA não é tão robusto quanto a mídia popular faz parecer. Na verdade, para pegar o livro e o filme de grande sucesso, Parque jurassico, por exemplo, embora haja inquestionavelmente algum DNA a ser encontrado embutido em parasitas ligados ao âmbar, ou talvez em tecidos moles preservados (encontrado nas profundezas de um fêmur fossilizado, Schweitzer et al, 2007). É provável que esteja bastante degradado e a reprodução precisa é impossível sem muitas amostras para trabalhar.

O insulto mais comum ao DNA de organismos vivos é a depurinação, na qual a ligação β-N-glicosídica entre uma adenina ou guanina e a desoxirribose é hidrolisada. Em células de mamíferos, é estimado em quase 10.000 purinas por geração de células e, geralmente, a taxa média de perda em pH fisiológico e força iônica, e a 37 ° C, é de aproximadamente 3 x 10-11 / seg. A despirimidinação de resíduos de citosina e timina também pode ocorrer, mas a uma taxa muito mais lenta do que a depurinação. Apesar da alta taxa de perda dessas bases, elas geralmente são facilmente corrigidas por reparo por excisão de base (BER), que é discutido posteriormente nesta seção. Portanto, é raro que a depurinação ou despirimidinação leve à mutação.

Três das quatro bases de DNA, adenina, guanina e citosina, contêm grupos amina que podem ser perdidos em uma variedade de reações dependentes de pH e temperatura que convertem as bases em hipoxantina, xantina e uracila, respectivamente. Isso às vezes pode levar a mutações permanentes, pois durante a replicação, elas servem como um modelo para a síntese de uma fita complementar, e onde uma guanina deve ir, por exemplo (complementar à citosina), uma adenina pode ser inserida (porque complementa a uracila, o produto de desaminação da citosina).

Outra desaminação, da metilcitosina de base modificada, também pode levar a uma mutação após a replicação. Algumas citosinas podem ser metiladas como parte de um processo regulatório para inativar certos genes em eucariotos ou em procariotos como proteção contra endonucleases de restrição. Quando a citosina metilada é desaminada, ela produz uma timina, que muda o nucleotídeo complementar (na replicação) de uma guanina para uma adenina. A desaminação de citosinas ocorre quase na mesma taxa que a depurinação, mas a desaminação de outras bases não é tão generalizada: a desaminação de adeninas, por exemplo, é 50 vezes menos provável do que a desaminação de citosina.

Thymine bom, Uracil ruim. Por que a timina é encontrada no DNA em vez da uracila? Acontece que a frequência da desaminação da citosina pode fornecer uma pista de por que as células deram um passo extra (literalmente, uma vez que o uracil é um precursor na biossíntese da timina) para fazer um novo nucleotídeo "padrão" para o DNA quando o uracil funcionou bem por RNA, provavelmente a molécula genética mais antiga. Considere o seguinte: se o uracil fosse o padrão para DNA, então as conversões de desaminação muito freqüentes de C em U não seriam detectadas pela verificação de erros de bases não DNA, e a taxa de mutação dispararia. Felizmente, uma vez que T evoluiu para ser o parceiro de pareamento de bases padrão da adenina no DNA, o uracil é rapidamente reconhecido e removido por várias glicosilases de DNA de uracila (mais sobre isso neste capítulo), e a integridade de nossas sequências de DNA é muito mais segura .

Todas as bases do DNA podem mudar espontaneamente para um isômero tautomérico (amino para imino, ceto para enol, etc.), embora o equilíbrio se incline fortemente para um do que para o outro. Quando ocorre um tautômero raro, ele forma pares de bases de maneira diferente de sua forma estrutural mais comum: guaninas com tinas e adeninas com citosinas. Aqui, novamente, uma mutação pode ser propagada durante a replicação do DNA.

O DNA dentro de uma célula também deve lutar com espécies oxidativas reativas (ROS) geradas pelos processos metabólicos da célula. Isso inclui o oxigênio singlete, os radicais peróxido e peróxido, bem como os radicais hidroxila. embora se pense que o peróxido de hidrogênio e os radicais peróxido não atacam diretamente o DNA, mas sim geram radicais hidroxila que o fazem. A maioria dessas ROS é gerada na mitocôndria durante a fosforilação oxidativa e vazamento, embora algumas possam ser geradas em peroxissomos ou em algumas reações citosólicas. Dependendo de qual parte do DNA é o alvo, ROS pode causar uma variedade de lesões, incluindo quebras de fita e remoção de bases.

A radiação ionizante (por exemplo, raios-X) e a radiação ultravioleta podem causar lesões no DNA. A radiação ionizante é freqüentemente uma causa de quebras de fita dupla do DNA. Conforme descrito posteriormente neste capítulo, o processo de reparo para quebras de fita dupla necessariamente leva a alguma perda de informações e pode potencialmente nocautear um gene. A radiação ultravioleta que atinge as timinas adjacentes pode fazer com que elas reajam e formem um dímero de timina ciclobutil (quatro carbonos ligados em circuito fechado). O dímero puxa cada timina em direção à outra, fora do alinhamento normal. Dependendo da forma estrutural do dímero, isso é suficiente para bloquear a máquina de replicação e interromper a replicação. No entanto, alguns dados sugerem que o emparelhamento de base normal com a adenina pode ser possível sob algumas condições, embora, seja provável que apenas um par de base resultaria, e a base ausente poderia levar a uma substituição aleatória ou uma deleção na fita recém-sintetizada .

Finalmente, consideramos a formação de adutos químicos (grupos ligados covalentemente) no DNA. Eles podem vir de uma variedade de fontes, incluindo oxidação de lipídios, fumaça de cigarro e toxinas fúngicas. Esses adutos se ligam ao DNA de maneiras diferentes, portanto, também há uma variedade de efeitos diferentes dos adutos. Alguns podem ser adutos muito pequenos - muitos carcinógenos ambientais são agentes alquilantes, que transferem grupos metil ou outros pequenos grupos alquil para o DNA. Outros adutos são maiores, mas também se ligam covalentemente a uma base nitrogenada de DNA. Exemplos comuns são o benzo (a) pireno, um importante componente mutagênico da fumaça do cigarro, e a aflatoxina B1, produzida por uma variedade de fungos da família Aspergillus. Benzo (a) pireno é convertido em epóxido de benzo (a) pireno diol, que pode então atacar o DNA. Quando isso acontece, o anel do pireno se intercala entre as bases, causando mudanças estéricas que levam à deformação local do DNA e à interrupção da replicação normal do DNA.

A aflatoxina B1 é a aflatoxina primária produzida por algumas espécies (esp. flavus, parasiticus) de Aspergillus, um fungo muito comum que cresce em grãos armazenados (bem como detritos e outras substâncias vegetais mortas ou moribundas). Além de infectar os grãos, é um problema comum com amendoins armazenados. Em níveis elevados, a aflatoxina é agudamente tóxica, mas em níveis mais baixos, tem a propriedade insidiosa de ser imperceptivelmente tóxica, mas mutagênica. Como o benzo (a) pireno, ele é metabolizado em um epóxido e então reage com o DNA para formar um aduto que pode interromper a replicação.

Alguns agentes alquilantes, particularmente compostos N-nitroso, são formados nas condições ácidas do estômago a partir da nitrosação de nitritos naturais produzidos a partir dos alimentos (redução de nitratos) ou nitritos ambientais na água potável. Ironicamente, embora alguns agentes alquilantes possam causar câncer, outros são usados ​​terapeuticamente como tratamentos anticâncer, e. mitomicina, melfalan. A ideia, como acontece com muitos tratamentos de câncer, é que, embora tais drogas causem danos ao DNA de células não cancerosas, bem como células cancerosas, a alta taxa de proliferação de células cancerosas lhes dá menos chances de reparar o DNA danificado e, portanto, maior probabilidade de que o dano pode interromper a replicação e levar à morte celular.

De forma semelhante, os agentes quimioterápicos de reticulação, como a cisplatina (um átomo de platina ligado a dois grupos cloreto e dois grupos amino), também se ligam ao DNA. Os grupos cloreto são deslocados primeiro pela água e depois por outros grupos, incluindo locais no DNA. Embora às vezes classificado como um agente alquilante, obviamente não o é, mas age de forma semelhante. No entanto, a cisplatina vai um passo além de um simples agente alquilante, porque tem outro sítio reativo e pode, assim, reticular (ligar covalentemente) outro nucleotídeo, possivelmente em outra fita de DNA, criando uma forte obstrução à replicação do DNA. A cisplatina também pode reticular proteínas ao DNA.

Benzo (a) pireno e aflatoxina B1 não são mutagênicos. Uma vez na célula, o metabolismo normal desses compostos leva à formação de diol epóxido, que pode então atacar o DNA. Embora o 7-nitrogênio (N7) da guanina seja mais nucleofílico e seja um alvo para a aflatoxina, a maioria dos adutos de epóxido de benzo (a) pireno-diol se ligam ao 2-nitrogênio dos resíduos de guanina.

Existem padrões federais (20-300 partes por bilhão, dependendo do uso) para aflatoxina em várias formas de ração animal à base de grãos, especialmente alimentos à base de milho, porque a toxina pode passar do animal para o leite, bem como permanecer no eu no. Além da ração, existem máximos federais para amendoim e produtos derivados, castanha-do-brasil, pistache e outros alimentos (acionáveis ​​a 20 ppb).

Bem, então, o que uma célula pobre pode fazer quando seu DNA está sendo constantemente destruído? Acontece que existem alguns processos de reparo muito bons que estão constantemente trabalhando no DNA, examinando-o em busca de defeitos e, quando possível, fazendo reparos. Muitas vezes os reparos são perfeitos, se a fita complementar estiver intacta, às vezes devem ser introduzidas mutações e, finalmente, há ocasiões em que o reparo é impossível e a apoptose é disparada para matar a célula e evitar a propagação do DNA danificado.


Engenharia de uma resposta de dano ao DNA sem dano ao DNA

Trabalhos recentes conseguiram a façanha de ativar o checkpoint de dano ao DNA na ausência de dano ao DNA, revelando a importância das associações proteína-cromatina para a ativação, amplificação e manutenção da resposta ao dano ao DNA.

Detectar e reparar danos no DNA é fundamental para a transmissão fiel de informações genéticas. Em resposta a lesões de DNA, as células ativam uma resposta celular complexa, que em seu núcleo consiste em uma cascata de transdução de sinal controlada por membros da família PI (3) quinase-like quinase (PIKK) [1, 2]. Essa cascata de sinalização, muitas vezes referida como ponto de verificação de danos ao DNA, tem como objetivo principal coordenar o reparo do DNA com a interrupção ou desaceleração do ciclo celular (o ponto de verificação). A falha em detectar e reparar danos ao DNA pode levar à morte celular ou a aberrações do genoma que podem promover o desenvolvimento de câncer.

Como outros sistemas de sinalização, como aqueles que operam na superfície da célula, a sinalização de danos ao DNA está sob rígido controle espacial e temporal. O componente espacial dessa via é particularmente evidente durante a resposta a quebras de fita dupla de DNA (DSBs), o tipo mais prejudicial de lesão de DNA. Os DSBs provocam o rápido acúmulo de proteínas de sinalização e reparo de danos ao DNA na cromatina que envolve as lesões, formando focos subnucleares distintos [1, 2] que são facilmente detectáveis ​​por microscopia de fluorescência. O que é extraordinário nesta resposta não é que haja recrutamento de proteínas per se em vez disso, é a escala do fenômeno que impressiona. Na verdade, o recrutamento de proteínas após a indução de DSBs pode se estender por dezenas de quilobases em ambos os lados da lesão [3, 4]. Por inferência, os DSBs promovem o recrutamento de dezenas, senão centenas, de moléculas para a cromatina circundante. Conforme descrito abaixo, o recrutamento de proteínas em lesões de DNA geralmente ocorre de maneira hierárquica e envolve várias modificações pós-tradução. Por que a sinalização de danos ao DNA é organizada dessa forma? Trabalho recente publicado por Evi Soutoglou e Tom Misteli em Ciência [5] e por David Toczyski e colegas em Molecular Cell (Bonilla et al. [6]) abordam essa questão crítica por meio da engenharia reversa da resposta ao dano ao DNA, com um efeito espetacular.


Um mecanismo de vigilância garante o reparo de lesões de DNA durante a reprogramação zigótica

A reprodução sexual culmina em um zigoto totipotente com potencial para produzir um organismo inteiro. A reorganização da cromatina espermática e a reprogramação epigenética que alteram o DNA e as modificações das histonas geram um embrião totipotente. A desmetilação ativa do DNA do genoma paterno foi proposta para envolver a excisão de bases e mecanismos baseados em reparo de DNA. A natureza e a consequência das lesões de DNA geradas durante a reprogramação não são conhecidas. Usando genética de camundongos e biologia química, descobrimos que a reprogramação zigótica dependente de Tet3 gera lesões de DNA paternas que são monitoradas por um mecanismo de vigilância. Ensaios de resgate de função de estrutura in vivo revelaram que o reparo dependente de coesina de lesões de DNA paterno evita a ativação de um ponto de verificação dependente de Chk1 que retarda a entrada mitótica. As condições de cultivo afetam o rigor do ponto de verificação, o que tem implicações para a fertilização in vitro humana. Propomos que o ponto de verificação zigótico detecta lesões de DNA geradas durante a desmetilação do DNA paterno e garante que os loci reprogramados sejam reparados antes da mitose para prevenir a fragmentação cromossômica, a perda de embriões e a infertilidade.

Palavras-chave: Zigoto de reprogramação de coesina de ponto de verificação de reparo de danos no DNA.

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Conteúdo

Danos ao DNA, devido a fatores ambientais e processos metabólicos normais dentro da célula, ocorrem a uma taxa de 10.000 a 1.000.000 de lesões moleculares por célula por dia. [2] Embora isso constitua apenas 0,000165% do genoma humano de aproximadamente 6 bilhões de bases, lesões não reparadas em genes críticos (como genes supressores de tumor) podem impedir a capacidade de uma célula de realizar sua função e aumentar consideravelmente a probabilidade de formação de tumor e contribuir à heterogeneidade do tumor.

A grande maioria dos danos ao DNA afeta a estrutura primária da dupla hélice, ou seja, as próprias bases são quimicamente modificadas. Essas modificações podem, por sua vez, interromper a estrutura helicoidal regular das moléculas, introduzindo ligações químicas não nativas ou adutos volumosos que não se encaixam na dupla hélice padrão. Ao contrário das proteínas e do RNA, o DNA geralmente carece de estrutura terciária e, portanto, danos ou distúrbios não ocorrem nesse nível. O DNA é, no entanto, superenrolado e enrolado em torno de proteínas de "empacotamento" chamadas histonas (em eucariotos), e ambas as superestruturas são vulneráveis ​​aos efeitos do dano ao DNA.

Editar fontes

O dano ao DNA pode ser subdividido em dois tipos principais:

    danos como ataque por espécies reativas de oxigênio produzidas a partir de subprodutos metabólicos normais (mutação espontânea), especialmente o processo de desaminação oxidativa
    1. também inclui erros de replicação
    1. radiação ultravioleta [UV 200-400 nm] do sol ou outras fontes de luz artificiais
    2. outras frequências de radiação, incluindo raios-x e raios gama ou interrupção térmica
    3. certas toxinas vegetais
    4. produtos químicos mutagênicos de fabricação humana, especialmente compostos aromáticos que atuam como agentes intercalantes de DNA [8]

    A replicação do DNA danificado antes da divisão celular pode levar à incorporação de bases erradas opostas às danificadas. As células-filhas que herdam essas bases erradas carregam mutações das quais a sequência original do DNA é irrecuperável (exceto no caso raro de uma mutação reversa, por exemplo, por meio da conversão gênica).

    Edição de Tipos

    Existem vários tipos de danos ao DNA devido a processos celulares endógenos:

    1. oxidação de bases [por exemplo 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoG)] e geração de interrupções na fita de DNA de espécies reativas de oxigênio,
    2. alquilação de bases (geralmente metilação), como a formação de 7-metilguanosina, 1-metiladenina, 6-O-metilguanina
    3. hidrólise de bases, tais como desaminação, depurinação e despirimidinação. (por exemplo, aduto de epóxido-dG de benzo [a] pireno diol, aduto de aristolactama I-dA)
    4. incompatibilidade de bases, devido a erros na replicação do DNA, em que a base de DNA errada é costurada em uma fita de DNA recém-formada, ou uma base de DNA é ignorada ou inserida por engano.
    5. Dano de monoaduto causado pela mudança na base única de nitrogênio do DNA
    6. Dano de diaduto

    Danos causados ​​por agentes exógenos vêm em muitas formas. Alguns exemplos são:

    1. Luz UV-B causa a reticulação entre as bases de citosina e timina adjacentes, criando dímeros de pirimidina. Isso é chamado de dano direto ao DNA.
    2. Luz UV-A cria principalmente radicais livres. O dano causado pelos radicais livres é chamado de dano indireto ao DNA.
    3. Radiação ionizante como aquele criado por decaimento radioativo ou em raios cósmicos causa quebras nas fitas de DNA. A radiação ionizante de nível intermediário pode induzir danos irreparáveis ​​ao DNA (levando a erros de replicação e transcrição necessários para neoplasia ou pode desencadear interações virais) levando ao envelhecimento prematuro e câncer.
    4. Perturbação térmica em temperatura elevada aumenta a taxa de depurinação (perda de bases purinas do esqueleto do DNA) e quebras de fita simples. Por exemplo, a despurinação hidrolítica é observada nas bactérias termofílicas, que crescem em fontes termais a 40–80 ° C.[9] [10] A taxa de depurinação (300 resíduos de purina por genoma por geração) é muito alta nessas espécies para ser reparada por máquinas normais de reparo, portanto, a possibilidade de uma resposta adaptativa não pode ser descartada.
    5. Químicos Industriais como cloreto de vinila e peróxido de hidrogênio, e produtos químicos ambientais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos encontrados na fumaça, fuligem e alcatrão criam uma enorme diversidade de adutos de DNA-etenobases, bases oxidadas, fosfotriésteres alquilados e reticulação de DNA, apenas para citar alguns.

    Danos por UV, alquilação / metilação, danos por raios X e danos oxidativos são exemplos de danos induzidos. Danos espontâneos podem incluir a perda de uma base, desaminação, enrugamento do anel de açúcar e deslocamento tautomérico. Danos constitutivos (espontâneos) ao DNA causados ​​por oxidantes endógenos podem ser detectados como um baixo nível de fosforilação de histona H2AX em células não tratadas. [11]

    Edição Nuclear versus Mitocondrial

    Em células humanas, e em células eucarióticas em geral, o DNA é encontrado em duas localizações celulares - dentro do núcleo e dentro da mitocôndria. O DNA nuclear (nDNA) existe como cromatina durante os estágios não replicativos do ciclo celular e é condensado em estruturas agregadas conhecidas como cromossomos durante a divisão celular. Em ambos os estados, o DNA é altamente compactado e envolve proteínas semelhantes a contas chamadas histonas. Sempre que uma célula precisa expressar a informação genética codificada em seu nDNA, a região cromossômica necessária é desvendada, os genes nela localizados são expressos e, em seguida, a região é condensada de volta à sua conformação de repouso. O DNA mitocondrial (mtDNA) está localizado dentro de organelas mitocondriais, existe em várias cópias e também está estreitamente associado a várias proteínas para formar um complexo conhecido como nucleóide. Dentro das mitocôndrias, espécies reativas de oxigênio (ROS), ou radicais livres, subprodutos da produção constante de trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa, criam um ambiente altamente oxidativo que é conhecido por danificar o mtDNA. Uma enzima crítica para neutralizar a toxicidade dessas espécies é a superóxido dismutase, que está presente tanto na mitocôndria quanto no citoplasma das células eucarióticas.

    Senescência e apoptose Editar

    A senescência, um processo irreversível no qual a célula não mais se divide, é uma resposta protetora ao encurtamento das extremidades do cromossomo. Os telômeros são longas regiões de DNA não codificador repetitivo que encapsulam os cromossomos e sofrem degradação parcial cada vez que uma célula sofre divisão (ver limite de Hayflick). [12] Em contraste, a quiescência é um estado reversível de dormência celular que não está relacionado a danos ao genoma (consulte o ciclo celular). A senescência nas células pode servir como uma alternativa funcional à apoptose nos casos em que a presença física de uma célula por razões espaciais é exigida pelo organismo, [13] que serve como um mecanismo de "último recurso" para evitar que uma célula com DNA danificado se replique inadequadamente na ausência de sinalização celular pró-crescimento. A divisão celular desregulada pode levar à formação de um tumor (veja câncer), que é potencialmente letal para um organismo. Portanto, a indução da senescência e apoptose é considerada parte de uma estratégia de proteção contra o câncer. [14]

    Edição de mutação

    É importante distinguir entre dano ao DNA e mutação, os dois principais tipos de erro no DNA. Danos e mutações no DNA são fundamentalmente diferentes. O dano resulta em anormalidades físicas no DNA, como quebras de fita simples e dupla, resíduos de 8-hidroxidesoxiguanosina e adutos de hidrocarboneto aromático policíclico. Danos no DNA podem ser reconhecidos por enzimas e, portanto, podem ser corrigidos corretamente se informações redundantes, como a sequência não danificada na fita complementar de DNA ou em um cromossomo homólogo, estiverem disponíveis para cópia. Se uma célula retém danos ao DNA, a transcrição de um gene pode ser evitada e, portanto, a tradução em uma proteína também será bloqueada. A replicação também pode ser bloqueada ou a célula pode morrer.

    Em contraste com o dano ao DNA, uma mutação é uma mudança na sequência de bases do DNA. Uma mutação não pode ser reconhecida por enzimas uma vez que a mudança de base está presente em ambas as fitas de DNA e, portanto, uma mutação não pode ser reparada. No nível celular, as mutações podem causar alterações na função e regulação das proteínas. As mutações são replicadas quando a célula se replica. Em uma população de células, as células mutantes aumentarão ou diminuirão em frequência de acordo com os efeitos da mutação na capacidade da célula de sobreviver e se reproduzir.

    Embora distintamente diferentes um do outro, o dano ao DNA e a mutação estão relacionados porque o dano ao DNA freqüentemente causa erros de síntese de DNA durante a replicação ou o reparo desses erros é a principal fonte de mutação.

    Dadas essas propriedades de dano ao DNA e mutação, pode-se ver que o dano ao DNA é um problema especial nas células que não se dividem ou se dividem lentamente, onde o dano não reparado tende a se acumular com o tempo. Por outro lado, em células que se dividem rapidamente, o dano não reparado ao DNA que não mata a célula ao bloquear a replicação tenderá a causar erros de replicação e, portanto, mutação. A grande maioria das mutações que não são neutras em seu efeito são prejudiciais à sobrevivência de uma célula. Assim, em uma população de células compondo um tecido com células em replicação, as células mutantes tenderão a se perder. No entanto, mutações infrequentes que fornecem uma vantagem de sobrevivência tendem a se expandir clonalmente às custas de células vizinhas no tecido. Esta vantagem para a célula é desvantajosa para todo o organismo, porque tais células mutantes podem originar cancro. Assim, o dano ao DNA em células que se dividem com frequência, porque dá origem a mutações, é uma causa importante de câncer. Em contraste, o dano ao DNA em células que se dividem com pouca frequência é provavelmente uma causa importante do envelhecimento. [15]

    As células não podem funcionar se o dano ao DNA corromper a integridade e acessibilidade de informações essenciais no genoma (mas as células permanecem superficialmente funcionais quando genes não essenciais estão ausentes ou danificados). Dependendo do tipo de dano infligido à estrutura em dupla hélice do DNA, uma variedade de estratégias de reparo foram desenvolvidas para restaurar as informações perdidas. Se possível, as células usam a fita complementar não modificada do DNA ou a cromátide irmã como molde para recuperar a informação original. Sem acesso a um modelo, as células usam um mecanismo de recuperação sujeito a erros conhecido como síntese de translesão como último recurso.

    Danos ao DNA alteram a configuração espacial da hélice, e tais alterações podem ser detectadas pela célula. Uma vez que o dano é localizado, moléculas de reparo de DNA específicas se ligam no local do dano ou próximo a ele, induzindo outras moléculas a se ligarem e formarem um complexo que permite que o reparo real ocorra.

    Edição de reversão direta

    As células são conhecidas por eliminar três tipos de danos ao seu DNA, revertendo-o quimicamente. Esses mecanismos não requerem gabarito, pois os tipos de danos que eles neutralizam podem ocorrer em apenas uma das quatro bases. Esses mecanismos de reversão direta são específicos para o tipo de dano incorrido e não envolvem a quebra da estrutura fosfodiéster. A formação de dímeros de pirimidina após irradiação com luz ultravioleta resulta em uma ligação covalente anormal entre bases de pirimidina adjacentes. O processo de fotoreativação reverte diretamente esse dano pela ação da enzima fotoliase, cuja ativação é obrigatoriamente dependente da energia absorvida da luz azul / UV (comprimento de onda de 300–500 nm) para promover a catálise. [16] A fotoliase, uma enzima antiga presente em bactérias, fungos e na maioria dos animais, não funciona mais em humanos, [17] que, em vez disso, usam o reparo por excisão de nucleotídeos para reparar os danos da irradiação UV. Outro tipo de dano, a metilação de bases de guanina, é revertido diretamente pela proteína metil guanina metil transferase (MGMT), cujo equivalente bacteriano é denominado ogt. Este é um processo caro porque cada molécula de MGMT pode ser usada apenas uma vez, ou seja, a reação é estequiométrica em vez de catalítica. [18] Uma resposta generalizada a agentes de metilação em bactérias é conhecida como a resposta adaptativa e confere um nível de resistência aos agentes de alquilação após exposição sustentada por suprarregulação de enzimas de reparo de alquilação. [19] O terceiro tipo de dano ao DNA revertido pelas células é certa metilação das bases citosina e adenina.

    Danos de fio único Editar

    Quando apenas um dos dois fios de uma dupla hélice tem um defeito, o outro fio pode ser usado como um gabarito para orientar a correção do fio danificado. Para reparar o dano a uma das duas moléculas emparelhadas de DNA, existem vários mecanismos de reparo por excisão que removem o nucleotídeo danificado e o substituem por um nucleotídeo não danificado complementar ao encontrado na fita de DNA não danificada. [18]

      (BER): bases únicas ou nucleotídeos danificados são mais comumente reparados removendo a base ou o nucleotídeo envolvido e, em seguida, inserindo a base ou nucleotídeo correto. No reparo por excisão de base, uma enzima glicosilase [20] remove a base danificada do DNA por meio da clivagem da ligação entre a base e a desoxirribose. Essas enzimas removem uma única base para criar um sítio apurínico ou apirimidínico (sítio AP). [20] Enzimas chamadas endonucleases AP cortam a estrutura do DNA danificada no local AP. A DNA polimerase remove então a região danificada usando sua atividade de exonuclease 5 'a 3' e sintetiza corretamente a nova fita usando a fita complementar como modelo. [20] A lacuna é então selada pela enzima DNA ligase. [21] (NER): danos volumosos que distorcem a hélice, como a dimerização da pirimidina causada pela luz ultravioleta, geralmente são reparados por um processo de três etapas. Primeiro, o dano é reconhecido, então fitas de DNA com 12-24 nucleotídeos de comprimento são removidas tanto a montante quanto a jusante do local do dano por endonucleases, e a região de DNA removida é então ressintetizada. [22] NER é um mecanismo de reparo altamente conservado evolutivamente e é usado em quase todas as células eucarióticas e procarióticas. [22] Em procariotos, NER é mediado por proteínas Uvr. [22] Em eucariotos, muito mais proteínas estão envolvidas, embora a estratégia geral seja a mesma. [22] sistemas estão presentes em essencialmente todas as células para corrigir erros que não são corrigidos por revisão. Esses sistemas consistem em pelo menos duas proteínas. Um detecta a incompatibilidade e o outro recruta uma endonuclease que cliva a fita de DNA recém-sintetizada perto da região de dano. No E. coli , as proteínas envolvidas são as proteínas da classe Mut: MutS, MutL e MutH. Na maioria dos eucariotos, o análogo de MutS é MSH e o análogo de MutL é MLH. MutH está presente apenas em bactérias. Isso é seguido pela remoção da região danificada por uma exonuclease, ressíntese pela DNA polimerase e selagem por corte pela DNA ligase. [23]

    Editar quebras de fita dupla

    Quebras de fita dupla, em que ambas as fitas da dupla hélice são cortadas, são particularmente perigosas para a célula porque podem levar a rearranjos do genoma. Na verdade, quando uma quebra de fita dupla é acompanhada por uma ligação cruzada que une as duas fitas no mesmo ponto, nenhuma fita pode ser usada como um modelo para os mecanismos de reparo, de modo que a célula não será capaz de completar a mitose quando em seguida, ele se divide e morrerá ou, em casos raros, sofrerá uma mutação. [3] [4] Existem três mecanismos para reparar quebras de fita dupla (DSBs): união de extremidade não homóloga (NHEJ), união de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ) e recombinação homóloga (HR). [18] [24] Em um em vitro sistema, MMEJ ocorreu em células de mamíferos nos níveis de 10-20% de HR quando os mecanismos de HR e NHEJ também estavam disponíveis. [25]

    No NHEJ, a DNA Ligase IV, uma DNA ligase especializada que forma um complexo com o cofator XRCC4, une diretamente as duas extremidades. [26] Para orientar o reparo preciso, NHEJ se baseia em sequências homólogas curtas chamadas microhomologias presentes nas caudas de fita simples das extremidades do DNA a serem unidas. Se essas saliências forem compatíveis, o reparo geralmente é preciso. [27] [28] [29] [30] NHEJ também pode introduzir mutações durante o reparo. A perda de nucleotídeos danificados no local da quebra pode levar a deleções, e a união de terminações não correspondentes forma inserções ou translocações. O NHEJ é especialmente importante antes que a célula tenha replicado seu DNA, uma vez que não há molde disponível para reparo por recombinação homóloga. Existem vias NHEJ de "backup" em eucariotos superiores. [31] Além de seu papel como um zelador do genoma, NHEJ é necessário para unir quebras de fita dupla capadas em grampo induzidas durante a recombinação V (D) J, o processo que gera diversidade em receptores de células B e T no sistema imunológico de vertebrados sistema. [32]

    A recombinação homóloga requer a presença de uma sequência idêntica ou quase idêntica para ser usada como um modelo para o reparo da quebra. A maquinaria enzimática responsável por este processo de reparo é quase idêntica à maquinaria responsável pelo cruzamento cromossômico durante a meiose. Esta via permite que um cromossomo danificado seja reparado usando uma cromátide irmã (disponível em G2 após a replicação do DNA) ou um cromossomo homólogo como molde. Os DSBs causados ​​pela máquina de replicação que tenta sintetizar através de uma quebra de fita única ou lesão não reparada causam o colapso da bifurcação de replicação e são normalmente reparados por recombinação.

    MMEJ começa com ressecção final de curto alcance por nuclease MRE11 em ambos os lados de uma quebra de fita dupla para revelar regiões de microhomologia. [25] Em etapas posteriores, a [33] Polimerase 1 (PARP1) da Poli (ADP-ribose) é necessária e pode ser uma etapa inicial no MMEJ. Há emparelhamento de regiões de microhomologia seguido pelo recrutamento de endonuclease 1 específica da estrutura do retalho (FEN1) para remover os retalhos pendentes. Isso é seguido pelo recrutamento de XRCC1 – LIG3 para o local de ligação das extremidades do DNA, levando a um DNA intacto. O MMEJ é sempre acompanhado por uma deleção, de modo que o MMEJ é uma via mutagênica para o reparo do DNA. [34]

    O extremófilo Deinococcus radiodurans tem uma capacidade notável de sobreviver a danos ao DNA de radiação ionizante e outras fontes. Pelo menos duas cópias do genoma, com quebras aleatórias de DNA, podem formar fragmentos de DNA por meio de anelamento. Fragmentos parcialmente sobrepostos são então usados ​​para a síntese de regiões homólogas por meio de um loop D móvel que pode continuar a extensão até encontrar fitas parceiras complementares. Na etapa final, ocorre o cruzamento por meio de recombinação homóloga dependente de RecA. [35]

    As topoisomerases introduzem quebras de fita simples e dupla no curso da mudança do estado de superenrolamento do DNA, que é especialmente comum em regiões próximas a uma bifurcação de replicação aberta. Essas quebras não são consideradas danos ao DNA porque são um intermediário natural no mecanismo bioquímico da topoisomerase e são imediatamente reparadas pelas enzimas que as criaram.

    Edição de síntese de transição

    A síntese de translesão (TLS) é um processo de tolerância a danos no DNA que permite que a maquinaria de replicação do DNA replique lesões de DNA passadas, como dímeros de timina ou sítios AP. [36] Envolve a troca de DNA polimerases regulares por polimerases de transgressão especializadas (ou seja, DNA polimerase IV ou V, da família da polimerase Y), frequentemente com sítios ativos maiores que podem facilitar a inserção de bases opostas aos nucleotídeos danificados. Acredita-se que a troca de polimerase seja mediada, entre outros fatores, pela modificação pós-tradução do fator de processabilidade de replicação PCNA. As polimerases de síntese de translesão frequentemente têm baixa fidelidade (alta propensão para inserir bases erradas) em modelos não danificados em relação às polimerases regulares. No entanto, muitos são extremamente eficientes na inserção de bases corretas em tipos específicos de danos. Por exemplo, Pol η medeia o desvio livre de erros de lesões induzidas por irradiação UV, enquanto Pol ι introduz mutações nesses locais. Pol η é conhecido por adicionar a primeira adenina através do fotodímero T ^ T usando o emparelhamento de bases Watson-Crick e a segunda adenina será adicionada em sua conformação syn usando o emparelhamento de bases Hoogsteen. De uma perspectiva celular, arriscar a introdução de mutações pontuais durante a síntese de translesão pode ser preferível a recorrer a mecanismos mais drásticos de reparo de DNA, que podem causar aberrações cromossômicas graves ou morte celular. Resumindo, o processo envolve polimerases especializadas para contornar ou reparar lesões em locais de replicação de DNA paralisada. Por exemplo, a DNA polimerase humana eta pode contornar lesões complexas de DNA, como a reticulação intra-fita guanina-timina, G [8,5-Me] T, embora possa causar mutações direcionadas e semi-direcionadas. [37] Paromita Raychaudhury e Ashis Basu [38] estudaram a toxicidade e mutagênese da mesma lesão em Escherichia coli replicando um plasmídeo modificado com G [8,5-Me] T em E. coli com nocautes específicos da DNA polimerase. A viabilidade era muito baixa em uma cepa sem pol II, pol IV e pol V, as três DNA polimerases induzíveis por SOS, indicando que a síntese de translesão é conduzida principalmente por essas DNA polimerases especializadas. Uma plataforma de desvio é fornecida a essas polimerases pelo antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA). Em circunstâncias normais, o PCNA ligado às polimerases replica o DNA. No local da lesão, o PCNA é ubiquitinado, ou modificado, pelas proteínas RAD6 / RAD18 para fornecer uma plataforma para as polimerases especializadas contornar a lesão e retomar a replicação do DNA. [39] [40] Após a síntese de translesão, a extensão é necessária. Esta extensão pode ser realizada por uma polimerase replicativa se o TLS estiver livre de erros, como no caso de Pol η, mas se o TLS resultar em uma incompatibilidade, uma polimerase especializada é necessária para estendê-lo. Pol ζ. Pol ζ é o único que pode estender incompatibilidades terminais, enquanto polimerases mais processivas não podem. Assim, quando uma lesão é encontrada, a bifurcação de replicação pára, o PCNA muda de uma polimerase processiva para uma polimerase TLS, como Pol ι para consertar a lesão, então o PCNA pode mudar para Pol ζ para estender a incompatibilidade, e o último PCNA mudará à polimerase processiva para continuar a replicação.

    As células expostas à radiação ionizante, luz ultravioleta ou produtos químicos são propensas a adquirir vários locais de lesões volumosas de DNA e quebras de fita dupla. Além disso, os agentes que danificam o DNA podem danificar outras biomoléculas, como proteínas, carboidratos, lipídios e RNA. O acúmulo de danos, para ser específico, quebras de fita dupla ou adutos paralisando as forquilhas de replicação, estão entre os sinais de estimulação conhecidos para uma resposta global a danos no DNA. [41] A resposta global ao dano é um ato direcionado à preservação das próprias células e desencadeia várias vias de reparo macromolecular, desvio de lesão, tolerância ou apoptose. As características comuns da resposta global são a indução de múltiplos genes, interrupção do ciclo celular e inibição da divisão celular.

    Etapas iniciais Editar

    O empacotamento do DNA eucariótico na cromatina apresenta uma barreira para todos os processos baseados no DNA que requerem o recrutamento de enzimas para seus locais de ação. Para permitir o reparo do DNA, a cromatina deve ser remodelada.Em eucariotos, complexos de remodelação da cromatina dependente de ATP e enzimas modificadoras de histonas são dois fatores predominantes empregados para realizar este processo de remodelação. [42]

    O relaxamento da cromatina ocorre rapidamente no local de um dano ao DNA. [43] [44] Em uma das primeiras etapas, a proteína quinase ativada por estresse, c-Jun N-terminal quinase (JNK), fosforila SIRT6 na serina 10 em resposta a quebras de fita dupla ou outros danos ao DNA. [45] Esta modificação pós-tradução facilita a mobilização de SIRT6 para sítios de dano de DNA e é necessária para o recrutamento eficiente de poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) para sítios de quebra de DNA e para o reparo eficiente de DSBs. [45] A proteína PARP1 começa a aparecer nos locais de dano ao DNA em menos de um segundo, com metade do acúmulo máximo em 1,6 segundos após a ocorrência do dano. [46] PARP1 sintetiza cadeias poliméricas de adenosina difosfato ribose (poli (ADP-ribose) ou PAR) em si mesmo. Em seguida, o remodelador de cromatina ALC1 rapidamente se liga ao produto da ação PARP1, uma cadeia de ribose poli-ADP, e ALC1 completa a chegada ao dano no DNA dentro de 10 segundos da ocorrência do dano. [44] Cerca de metade do relaxamento máximo da cromatina, provavelmente devido à ação de ALC1, ocorre por 10 segundos. [44] Isso permite o recrutamento da enzima de reparo do DNA MRE11, para iniciar o reparo do DNA, em 13 segundos. [46]

    γH2AX, a forma fosforilada de H2AX, também está envolvida nas etapas iniciais que levam à descondensação da cromatina após a quebra da fita dupla de DNA. A variante de histona H2AX constitui cerca de 10% das histonas H2A na cromatina humana. [47] γH2AX (H2AX fosforilado na serina 139) pode ser detectado assim que 20 segundos após a irradiação das células (com formação de quebra de fita dupla de DNA), e metade do acúmulo máximo de γH2AX ocorre em um minuto. [47] A extensão da cromatina com γH2AX fosforilado é de cerca de dois milhões de pares de bases no local de uma quebra de fita dupla de DNA. [47] γH2AX não causa, por si só, a descondensação da cromatina, mas dentro de 30 segundos da irradiação, a proteína RNF8 pode ser detectada em associação com γH2AX. [48] ​​O RNF8 medeia a descondensação da cromatina extensa, por meio de sua interação subsequente com CHD4, [49] um componente da remodelação do nucleossomo e do complexo de desacetilase NuRD.

    DDB2 ocorre em um complexo heterodimérico com DDB1. Este complexo complexifica-se ainda mais com a proteína ubiquitina ligase CUL4A [50] e com PARP1. [51] Este complexo maior se associa rapidamente a danos induzidos por UV na cromatina, com associação pela metade do máximo concluída em 40 segundos. [50] A proteína PARP1, anexada a DDB1 e DDB2, então PARila (cria uma cadeia de ribose poli-ADP) em DDB2 que atrai a proteína remodeladora de DNA ALC1. [51] A ação de ALC1 relaxa a cromatina no local do dano UV ao DNA. Este relaxamento permite que outras proteínas na via de reparo por excisão de nucleotídeos entrem na cromatina e reparem os danos do dímero de pirimidina de ciclobutano induzidos por UV.

    Após a rápida remodelação da cromatina, os pontos de verificação do ciclo celular são ativados para permitir que o reparo do DNA ocorra antes que o ciclo celular progrida. Primeiro, duas quinases, ATM e ATR, são ativadas 5 ou 6 minutos após o DNA ser danificado. Isso é seguido pela fosforilação da proteína Chk1 do ponto de verificação do ciclo celular, iniciando sua função, cerca de 10 minutos após o DNA ser danificado. [52]

    Pontos de verificação de dano de DNA Editar

    Após o dano ao DNA, os pontos de verificação do ciclo celular são ativados. A ativação do ponto de verificação pausa o ciclo celular e dá à célula tempo para reparar o dano antes de continuar a se dividir. Os pontos de verificação de danos ao DNA ocorrem nos limites G1 / S e G2 / M. Também existe um ponto de verificação intra-S. A ativação do ponto de verificação é controlada por duas quinases principais, ATM e ATR. ATM responde a quebras de fita dupla de DNA e interrupções na estrutura da cromatina, [53] enquanto o ATR responde principalmente a bifurcações de replicação paralisadas. Essas quinases fosforilam alvos a jusante em uma cascata de transdução de sinal, levando à interrupção do ciclo celular. Uma classe de proteínas mediadoras de checkpoint incluindo BRCA1, MDC1 e 53BP1 também foi identificada. [54] Essas proteínas parecem ser necessárias para transmitir o sinal de ativação do checkpoint para as proteínas a jusante.

    Ponto de verificação de dano de DNA é uma via de transdução de sinal que bloqueia a progressão do ciclo celular em G1, G2 e metáfase e diminui a taxa de progressão da fase S quando o DNA é danificado. Isso leva a uma pausa no ciclo celular, permitindo que a célula tenha tempo para reparar o dano antes de continuar a se dividir.

    As proteínas checkpoint podem ser separadas em quatro grupos: fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), proteína quinase semelhante, grupo semelhante a antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), duas serina / treonina (S / T) quinases e seus adaptadores. No centro de todas as respostas de pontos de verificação induzidas por danos no DNA está um par de grandes proteínas quinases pertencentes ao primeiro grupo de proteínas quinases semelhantes a PI3K - a ATM (Ataxia telangiectasia mutada) e ATR (relacionada à Ataxia e Rad) quinases, cuja sequência e funções foram bem conservados na evolução. Toda resposta a danos no DNA requer ATM ou ATR porque eles têm a capacidade de se ligar aos cromossomos no local do dano ao DNA, junto com proteínas acessórias que são plataformas nas quais os componentes da resposta a danos no DNA e os complexos de reparo de DNA podem ser montados.

    Um importante alvo a jusante de ATM e ATR é o p53, pois é necessário para induzir a apoptose após dano ao DNA. [55] O inibidor de quinase dependente de ciclina p21 é induzido por mecanismos dependentes de p53 e independentes de p53 e pode interromper o ciclo celular nos pontos de verificação G1 / S e G2 / M desativando complexos de ciclina / quinase dependente de ciclina. [56]

    A resposta SOS procariótica Editar

    A resposta SOS são as mudanças na expressão gênica em Escherichia coli e outras bactérias em resposta a extensos danos ao DNA. O sistema SOS procariótico é regulado por duas proteínas principais: LexA e RecA. O homodímero LexA é um repressor transcricional que se liga a sequências de operadores comumente chamadas de caixas SOS. No Escherichia coli sabe-se que LexA regula a transcrição de aproximadamente 48 genes, incluindo os genes lexA e recA. [57] A resposta SOS é conhecida por ser disseminada no domínio Bacteria, mas está ausente em alguns filos bacterianos, como os espiroquetas. [58] Os sinais celulares mais comuns que ativam a resposta SOS são regiões de DNA de fita simples (ssDNA), decorrentes de bifurcações de replicação paralisadas ou quebras de fita dupla, que são processadas por DNA helicase para separar as duas fitas de DNA. [41] Na etapa de iniciação, a proteína RecA se liga ao ssDNA em uma reação de hidrólise de ATP, criando filamentos de RecA – ssDNA. Os filamentos RecA – ssDNA ativam a atividade autoprotease de LexA, que em última análise leva à clivagem do dímero de LexA e subsequente degradação de LexA. A perda do repressor LexA induz a transcrição dos genes SOS e permite uma maior indução de sinal, inibição da divisão celular e um aumento nos níveis de proteínas responsáveis ​​pelo processamento de danos.

    No Escherichia coli, As caixas SOS são sequências longas de 20 nucleotídeos próximas a promotores com estrutura palindrômica e um alto grau de conservação de sequência. Em outras classes e filos, a sequência de caixas SOS varia consideravelmente, com diferentes comprimentos e composições, mas é sempre altamente conservada e um dos sinais curtos mais fortes do genoma. [58] O alto conteúdo de informação das caixas SOS permite a ligação diferencial de LexA a diferentes promotores e permite o tempo da resposta SOS. Os genes de reparo da lesão são induzidos no início da resposta SOS. As polimerases de transgressão sujeitas a erros, por exemplo, UmuCD'2 (também chamada de DNA polimerase V), são induzidas posteriormente como último recurso. [59] Uma vez que o dano ao DNA é reparado ou contornado usando polimerases ou através de recombinação, a quantidade de DNA de fita simples nas células é diminuída, reduzindo as quantidades de filamentos RecA diminui a atividade de clivagem do homodímero LexA, que então se liga às caixas SOS próximas promotores e restaura a expressão normal do gene.

    Respostas transcricionais eucarióticas a danos no DNA Editar

    As células eucarióticas expostas a agentes que danificam o DNA também ativam importantes vias de defesa, induzindo várias proteínas envolvidas no reparo do DNA, controle do ponto de verificação do ciclo celular, tráfego e degradação de proteínas. Essa resposta transcricional ampla do genoma é muito complexa e rigidamente regulada, permitindo assim uma resposta global coordenada aos danos. Exposição de fermento Saccharomyces cerevisiae aos agentes que danificam o DNA resulta em perfis de transcrição sobrepostos, mas distintos. Semelhanças com a resposta ao choque ambiental indicam que existe uma via geral de resposta ao estresse global no nível da ativação transcricional. Em contraste, diferentes tipos de células humanas respondem aos danos de maneira diferente, indicando a ausência de uma resposta global comum. A provável explicação para essa diferença entre células de levedura e células humanas pode estar na heterogeneidade das células de mamíferos. Em um animal, diferentes tipos de células são distribuídos entre diferentes órgãos que desenvolveram diferentes sensibilidades a danos no DNA. [60]

    Em geral, a resposta global ao dano ao DNA envolve a expressão de múltiplos genes responsáveis ​​pelo reparo pós-replicação, recombinação homóloga, reparo por excisão de nucleotídeos, ponto de verificação de dano ao DNA, ativação transcricional global, genes que controlam o decaimento do mRNA e muitos outros. Uma grande quantidade de dano a uma célula deixa-a com uma decisão importante: sofrer apoptose e morrer, ou sobreviver ao custo de vida com um genoma modificado. Um aumento na tolerância a danos pode levar a um aumento da taxa de sobrevivência que permitirá um maior acúmulo de mutações. A levedura Rev1 e a polimerase humana η são membros da [família Y translesion DNA polimerases presentes durante a resposta global a danos no DNA e são responsáveis ​​pela mutagênese intensificada durante uma resposta global a danos no DNA em eucariotos. [41]

    Efeitos patológicos do reparo deficiente do DNA Editar

    Animais experimentais com deficiências genéticas no reparo do DNA freqüentemente apresentam diminuição da expectativa de vida e aumento da incidência de câncer. [15] Por exemplo, camundongos deficientes na via dominante do NHEJ e nos mecanismos de manutenção dos telômeros adquirem linfoma e infecções com mais frequência e, como consequência, têm expectativa de vida mais curta do que os camundongos do tipo selvagem. [61] De maneira semelhante, camundongos deficientes em uma proteína chave de reparo e transcrição que desenrola as hélices de DNA têm início prematuro de doenças relacionadas ao envelhecimento e consequente redução da expectativa de vida. [62] No entanto, nem toda deficiência de reparo de DNA cria exatamente os efeitos previstos que os camundongos deficientes na via NER exibiram vida útil reduzida sem taxas correspondentemente mais altas de mutação. [63]

    Se a taxa de danos ao DNA exceder a capacidade da célula de repará-lo, o acúmulo de erros pode sobrecarregar a célula e resultar em senescência precoce, apoptose ou câncer. Doenças hereditárias associadas ao funcionamento defeituoso do reparo do DNA resultam em envelhecimento prematuro, [15] aumento da sensibilidade a carcinógenos e, correspondentemente, aumento do risco de câncer (ver abaixo). Por outro lado, organismos com sistemas aprimorados de reparo de DNA, como Deinococcus radiodurans, o organismo conhecido mais resistente à radiação, exibe notável resistência aos efeitos indutores de quebra de fita dupla da radioatividade, provavelmente devido à maior eficiência de reparo de DNA e especialmente NHEJ. [64]

    Longevidade e restrição calórica Editar

    Vários genes individuais foram identificados como influenciando variações na expectativa de vida de uma população de organismos. Os efeitos desses genes são fortemente dependentes do meio ambiente, em particular, da dieta alimentar do organismo. A restrição calórica resulta de forma reproduzível em uma vida útil prolongada em uma variedade de organismos, provavelmente por meio de vias de detecção de nutrientes e diminuição da taxa metabólica. Os mecanismos moleculares pelos quais tal restrição resulta em longevidade ainda não são claros (veja [65] para alguma discussão), entretanto, o comportamento de muitos genes conhecidos por estarem envolvidos no reparo do DNA é alterado sob condições de restrição calórica. Vários agentes relatados como tendo propriedades anti-envelhecimento demonstraram atenuar o nível constitutivo de sinalização mTOR, uma evidência de redução da atividade metabólica e, ao mesmo tempo, reduzir o nível constitutivo de dano ao DNA induzido por espécies reativas de oxigênio geradas endogenamente. [66]

    Por exemplo, aumentar a dosagem do gene SIR-2, que regula o empacotamento de DNA no verme nematóide Caenorhabditis elegans, pode estender significativamente a vida útil. [67] O homólogo de mamífero de SIR-2 é conhecido por induzir fatores de reparo de DNA a jusante envolvidos em NHEJ, uma atividade que é especialmente promovida sob condições de restrição calórica. [68] A restrição calórica foi intimamente ligada à taxa de reparo por excisão de base no DNA nuclear de roedores, [69] embora efeitos semelhantes não tenham sido observados no DNA mitocondrial. [70]

    o C. elegans O gene AGE-1, um efetor a montante das vias de reparo do DNA, confere uma longevidade dramaticamente estendida em condições de alimentação livre, mas leva a uma diminuição na aptidão reprodutiva sob condições de restrição calórica. [71] Essa observação apóia a teoria da pleiotropia das origens biológicas do envelhecimento, que sugere que os genes que conferem uma grande vantagem de sobrevivência no início da vida serão selecionados, mesmo que carreguem uma desvantagem correspondente no final da vida.

    Distúrbios hereditários de reparo de DNA Editar

    Defeitos no mecanismo NER são responsáveis ​​por vários distúrbios genéticos, incluindo:

      : hipersensibilidade à luz solar / UV, resultando em aumento da incidência de câncer de pele e envelhecimento prematuro: hipersensibilidade a UV e agentes químicos: pele sensível, cabelos e unhas quebradiças

    O retardo mental geralmente acompanha os dois últimos distúrbios, sugerindo maior vulnerabilidade dos neurônios do desenvolvimento.

    Outros distúrbios de reparo de DNA incluem:

      : envelhecimento prematuro e crescimento retardado: hipersensibilidade à luz solar, alta incidência de doenças malignas (especialmente leucemias). : sensibilidade à radiação ionizante e alguns agentes químicos

    Todas as doenças acima são freqüentemente chamadas de "progerias segmentares" ("doenças do envelhecimento acelerado") porque suas vítimas parecem idosas e sofrem de doenças relacionadas ao envelhecimento em uma idade anormalmente jovem, embora não manifestem todos os sintomas da velhice.

    Outras doenças associadas à redução da função de reparo do DNA incluem anemia de Fanconi, câncer de mama hereditário e câncer de cólon hereditário.

    Devido às limitações inerentes aos mecanismos de reparo do DNA, se os humanos vivessem o suficiente, todos desenvolveriam câncer. [72] [73] Existem pelo menos 34 mutações hereditárias no gene de reparo do DNA humano que aumentam o risco de câncer. Muitas dessas mutações fazem com que o reparo do DNA seja menos eficaz do que o normal. Em particular, o câncer colorretal hereditário não polipose (HNPCC) está fortemente associado a mutações específicas na via de reparo de incompatibilidade de DNA. BRCA1 e BRCA2, dois genes importantes cujas mutações conferem um risco extremamente elevado de câncer de mama em portadores, [74] estão ambos associados a um grande número de vias de reparo de DNA, especialmente NHEJ e recombinação homóloga.

    Os procedimentos de terapia do câncer, como a quimioterapia e a radioterapia, funcionam sobrecarregando a capacidade da célula de reparar danos ao DNA, resultando em morte celular. As células que se dividem mais rapidamente - geralmente as células cancerosas - são preferencialmente afetadas. O efeito colateral é que outras células não cancerosas, mas que se dividem rapidamente, como as células progenitoras do intestino, da pele e do sistema hematopoiético, também são afetadas. Os tratamentos modernos de câncer tentam localizar o dano do DNA às células e tecidos apenas associados ao câncer, seja por meios físicos (concentrando o agente terapêutico na região do tumor) ou por meios bioquímicos (explorando uma característica única das células cancerosas no corpo) . No contexto de terapias que visam genes de resposta a danos no DNA, a última abordagem foi denominada 'letalidade sintética'. [75]

    Talvez o mais conhecido desses medicamentos de "letalidade sintética" seja o inibidor da poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) olaparibe, que foi aprovado pela Food and Drug Administration em 2015 para o tratamento de mulheres com deficiência de BRCA no ovário Câncer. As células tumorais com perda parcial da resposta ao dano ao DNA (especificamente, reparo de recombinação homóloga) são dependentes de outro mecanismo - reparo de quebra de fita simples - que é um mecanismo que consiste, em parte, no produto do gene PARP1. [76] O olaparibe é combinado com quimioterápicos para inibir o reparo de quebra de fita simples induzido por dano ao DNA causado pela quimioterapia coadministrada. As células tumorais que dependem desse mecanismo de reparo de DNA residual são incapazes de reparar o dano e, portanto, não são capazes de sobreviver e proliferar, enquanto as células normais podem reparar o dano com o mecanismo de recombinação homóloga em funcionamento.

    Muitos outros medicamentos para uso contra outros mecanismos de reparo de DNA residual comumente encontrados no câncer estão atualmente sob investigação. No entanto, as abordagens terapêuticas de letalidade sintética têm sido questionadas devido à evidência emergente de resistência adquirida, obtida por meio da reconfiguração das vias de resposta a danos no DNA e reversão de defeitos previamente inibidos. [77]

    Defeitos de reparo de DNA em câncer Editar

    Tornou-se aparente nos últimos anos que a resposta ao dano ao DNA atua como uma barreira à transformação maligna de células pré-neoplásicas. [78] Estudos anteriores mostraram uma elevada resposta ao dano ao DNA em modelos de cultura de células com ativação de oncogene [79] e adenomas de cólon pré-neoplásico. [80] Os mecanismos de resposta a danos no DNA desencadeiam a parada do ciclo celular e tentam reparar lesões de DNA ou promover a morte / senescência celular se o reparo não for possível. O estresse de replicação é observado em células pré-neoplásicas devido ao aumento dos sinais de proliferação de mutações oncogênicas. O estresse de replicação é caracterizado por: aumento da iniciação / origem da replicação, aumento da transcrição e colisões de complexos de transcrição-replicação, aumento da deficiência de nucleotídeos em espécies reativas de oxigênio (ROS). [81]

    O estresse de replicação, junto com a seleção de mutações inativadoras em genes de resposta a danos de DNA na evolução do tumor, [82] leva à regulação negativa e / ou perda de alguns mecanismos de resposta a danos de DNA e, portanto, perda de reparo de DNA e / ou senescência / morte celular programada. Em modelos experimentais de camundongos, a perda de senescência celular mediada por resposta a danos de DNA foi observada após o uso de um RNA em gancho curto (shRNA) para inibir a resposta de quebra de fita dupla ataxia telangiectasia (ATM), levando ao aumento do tamanho do tumor e invasividade. [80] Humanos nascidos com defeitos hereditários nos mecanismos de reparo do DNA (por exemplo, síndrome de Li-Fraumeni) têm um risco maior de câncer. [83]

    A prevalência de mutações de resposta a danos no DNA difere entre os tipos de câncer, por exemplo, 30% dos carcinomas invasivos da mama têm mutações em genes envolvidos na recombinação homóloga. [78] No câncer, a regulação negativa é observada em todos os mecanismos de resposta de dano de DNA (reparo de excisão de base (BER), reparo de excisão de nucleotídeo (NER), reparo de incompatibilidade de DNA (MMR), reparo de recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga ( NHEJ) e síntese de DNA translesão (TLS). [84] Assim como mutações em genes de reparo de danos ao DNA, as mutações também surgem nos genes responsáveis ​​por interromper o ciclo celular para permitir tempo suficiente para que o reparo de DNA ocorra, e alguns genes estão envolvidos no reparo de danos ao DNA e no controle de checkpoint do ciclo celular, por exemplo ATM e checkpoint quinase 2 (CHEK2) - um supressor de tumor que geralmente está ausente ou regulado para baixo no câncer de pulmão de células não pequenas. [85]

    RH NHEJ SSA FA BER NER MMR
    ATM x x x
    ATR x x x
    PAXIP x x
    RPA x x x
    BRCA1 x x
    BRCA2 x x
    RAD51 x x
    RFC x x x
    XRCC1 x x
    PCNA x x x
    PARP1 x x
    ERCC1 x x x x
    MSH3 x x x

    Tabela: Genes envolvidos nas vias de resposta ao dano ao DNA e frequentemente mutados no câncer (HR = recombinação homóloga NHEJ = união final não homóloga SSA = anelamento de fita simples FA = via de anemia fanconi BER = reparo por excisão de base NER = reparo por excisão de nucleotídeo MMR = incompatibilidade reparar)

    Defeitos epigenéticos no reparo do DNA no câncer.

    Classicamente, o câncer tem sido visto como um conjunto de doenças que são causadas por anormalidades genéticas progressivas que incluem mutações em genes supressores de tumor e oncogenes e aberrações cromossômicas. No entanto, tornou-se evidente que o câncer também é impulsionado por alterações epigenéticas. [86]

    As alterações epigenéticas referem-se a modificações funcionalmente relevantes no genoma que não envolvem uma mudança na sequência de nucleotídeos. Exemplos de tais modificações são mudanças na metilação do DNA (hipermetilação e hipometilação) e modificação da histona, [87] mudanças na arquitetura cromossômica (causadas pela expressão inadequada de proteínas como HMGA2 ou HMGA1) [88] e mudanças causadas por microRNAs. Cada uma dessas alterações epigenéticas serve para regular a expressão do gene sem alterar a sequência de DNA subjacente. Essas mudanças geralmente permanecem por meio de divisões celulares, duram várias gerações de células e podem ser consideradas epimutações (equivalentes a mutações).

    Enquanto um grande número de alterações epigenéticas são encontradas em cânceres, as alterações epigenéticas em genes de reparo de DNA, causando expressão reduzida de proteínas de reparo de DNA, parecem ser particularmente importantes. Acredita-se que essas alterações ocorram no início da progressão para o câncer e sejam uma causa provável da instabilidade genética característica dos cânceres. [89] [90] [91]

    A expressão reduzida de genes de reparo de DNA causa reparo de DNA deficiente. Quando o reparo do DNA é deficiente, os danos ao DNA permanecem nas células em um nível mais alto do que o normal e esses danos em excesso causam frequências aumentadas de mutação ou epimutação. As taxas de mutação aumentam substancialmente em células defeituosas no reparo de incompatibilidade de DNA [92] [93] ou no reparo de recombinação homóloga (HRR). [94] Os rearranjos cromossômicos e a aneuploidia também aumentam nas células com defeito de HRR. [95]

    Níveis mais altos de dano ao DNA não só causam aumento da mutação, mas também causam aumento da epimutação. Durante o reparo de quebras de fita dupla de DNA, ou reparo de outros danos ao DNA, locais de reparo não completamente limpos podem causar silenciamento de genes epigenéticos. [96] [97]

    A expressão deficiente de proteínas de reparo de DNA devido a uma mutação hereditária pode causar aumento do risco de câncer. Indivíduos com deficiência hereditária em qualquer um dos 34 genes de reparo de DNA (ver artigo transtorno de deficiência de reparo de DNA) têm um risco aumentado de câncer, com alguns defeitos causando até 100% de chance de câncer ao longo da vida (por exemplo, mutações de p53). [98] No entanto, essas mutações germinativas (que causam síndromes de câncer altamente penetrantes) são a causa de apenas cerca de 1 por cento dos cânceres. [99]

    Frequências de epimutações em genes de reparo de DNA Editar

    Deficiências nas enzimas de reparo de DNA são ocasionalmente causadas por uma mutação somática recém-surgida em um gene de reparo de DNA, mas são muito mais frequentemente causadas por alterações epigenéticas que reduzem ou silenciam a expressão de genes de reparo de DNA. Por exemplo, quando 113 cânceres colorretais foram examinados em sequência, apenas quatro tinham uma mutação missense no gene de reparo de DNA MGMT, enquanto a maioria tinha expressão reduzida de MGMT devido à metilação da região do promotor MGMT (uma alteração epigenética). [100] Cinco estudos diferentes descobriram que entre 40% e 90% dos cânceres colorretais reduziram a expressão de MGMT devido à metilação da região do promotor MGMT. [101] [102] [103] [104] [105]

    Da mesma forma, de 119 casos de câncer colorretal deficiente no reparo de incompatibilidade sem expressão do gene de reparo de DNA PMS2, PMS2 era deficiente em 6 devido a mutações no gene PMS2, enquanto em 103 casos a expressão de PMS2 era deficiente porque seu parceiro de emparelhamento MLH1 foi reprimido devido à metilação do promotor (a proteína PMS2 é instável na ausência de MLH1). [106] Nos outros 10 casos, a perda da expressão de PMS2 foi provavelmente devido à superexpressão epigenética do microRNA, miR-155, que desregula MLH1. [107]

    Em outro exemplo, defeitos epigenéticos foram encontrados em vários cânceres (por exemplo, mama, ovário, colorretal e cabeça e pescoço). Duas ou três deficiências na expressão de ERCC1, XPF ou PMS2 ocorrem simultaneamente na maioria dos 49 cânceres de cólon avaliados por Facista et al. [108]

    O gráfico nesta seção mostra alguns agentes de danos ao DNA frequentes, exemplos de lesões de DNA que eles causam e as vias que lidam com esses danos ao DNA. Pelo menos 169 enzimas são diretamente empregadas no reparo do DNA ou influenciam os processos de reparo do DNA. [109] Destes, 83 são diretamente empregados na reparação dos 5 tipos de danos ao DNA ilustrados no gráfico.

    Alguns dos genes centrais mais bem estudados para esses processos de reparo são mostrados no gráfico. As designações de genes mostradas em vermelho, cinza ou ciano indicam genes frequentemente alterados epigeneticamente em vários tipos de câncer. Os artigos da Wikipedia sobre cada um dos genes destacados em vermelho, cinza ou ciano descrevem as alterações epigenéticas e os cânceres em que essas epimutações são encontradas. Artigos de revisão [110] e amplos artigos de pesquisa experimental [111] [112] também documentam a maioria dessas deficiências de reparo de DNA epigenético em cânceres.

    Genes destacados em vermelho são freqüentemente reduzidos ou silenciados por mecanismos epigenéticos em vários tipos de câncer. Quando esses genes têm expressão baixa ou ausente, danos ao DNA podem se acumular. Os erros de replicação além desses danos (ver síntese de translesão) podem levar ao aumento de mutações e, em última instância, ao câncer. Repressão epigenética de genes de reparo de DNA em preciso As vias de reparo do DNA parecem ser centrais para a carcinogênese.

    Os dois genes destacados em cinza RAD51 e BRCA2, são necessários para o reparo de recombinação homóloga. Eles são às vezes superexpressos epigeneticamente e às vezes subexpressos em certos tipos de câncer. Conforme indicado nos artigos da Wikipedia sobre RAD51 e BRCA2, esses tipos de câncer normalmente têm deficiências epigenéticas em outros genes de reparo de DNA. Essas deficiências de reparo provavelmente causariam um aumento nos danos ao DNA não reparado. A superexpressão de RAD51 e BRCA2 visto nesses tipos de câncer pode refletir pressões seletivas para compensações RAD51 ou BRCA2 superexpressão e aumento do reparo de recombinação homóloga para, pelo menos parcialmente, lidar com tais danos em excesso de DNA. Nos casos em que RAD51 ou BRCA2 são subexpressos, isso por si só levaria a um aumento de danos de DNA não reparados. Erros de replicação após esses danos (ver síntese de transesão) podem causar aumento de mutações e câncer, de modo que a subexpressão de RAD51 ou BRCA2 seria cancerígeno por si só.

    Genes destacados em ciano estão na via de junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ) e são regulados positivamente no câncer. MMEJ é um outro sujeito a erros impreciso via de reparo para quebras de fita dupla. No reparo MMEJ de uma quebra de fita dupla, uma homologia de 5-25 pares de bases complementares entre as duas fitas emparelhadas é suficiente para alinhar as fitas, mas as extremidades incompatíveis (abas) geralmente estão presentes. MMEJ remove os nucleotídeos extras (flaps) onde as fitas são unidas e, em seguida, liga as fitas para criar uma dupla hélice de DNA intacta. MMEJ quase sempre envolve pelo menos uma pequena deleção, de modo que é uma via mutagênica. [24] FEN1, a endonuclease de retalho em MMEJ, é epigeneticamente aumentada pela hipometilação do promotor e é superexpressada na maioria dos cânceres de mama, [113] próstata, [114] estômago, [115] [116] neuroblastomas, [ 117] pâncreas, [118] e pulmão. [119] PARP1 também é superexpressado quando seu sítio ETS da região promotora é epigeneticamente hipometilado, e isso contribui para a progressão para câncer endometrial [120] e câncer de ovário seroso com mutação de BRCA. [121] Outros genes na via de MMEJ também são superexpressos em vários tipos de câncer (consulte MMEJ para obter um resumo) e também são mostrados em ciano.

    Distribuição de reparo de DNA em células somáticas humanas em todo o genoma Editar

    A atividade diferencial das vias de reparo do DNA em várias regiões do genoma humano faz com que as mutações sejam distribuídas de maneira muito desigual nos genomas do tumor. [122] [123] Em particular, as regiões de replicação precoce ricas em genes do genoma humano exibem frequências de mutação mais baixas do que a heterocromatina de replicação tardia pobre em genes. Um mecanismo subjacente a isso envolve a modificação da histona H3K36me3, que pode recrutar proteínas de reparo de incompatibilidade, [124] reduzindo assim as taxas de mutação em regiões marcadas com H3K36me3. [125] Outro mecanismo importante diz respeito ao reparo de excisão de nucleotídeos, que pode ser recrutado pela maquinaria de transcrição, reduzindo as taxas de mutação somática em genes ativos [123] e outras regiões abertas da cromatina. [126]

    Os processos básicos de reparo do DNA são altamente conservados entre procariotos e eucariotos e até mesmo entre bacteriófagos (vírus que infectam bactérias), no entanto, organismos mais complexos com genomas mais complexos têm mecanismos de reparo correspondentemente mais complexos. [127] A capacidade de um grande número de motivos estruturais de proteínas para catalisar reações químicas relevantes desempenhou um papel significativo na elaboração de mecanismos de reparo durante a evolução. Para uma revisão extremamente detalhada das hipóteses relacionadas à evolução do reparo do DNA, consulte. [128]

    O registro fóssil indica que a vida unicelular começou a proliferar no planeta em algum ponto durante o período pré-cambriano, embora não seja claro exatamente quando a vida moderna reconhecidamente emergiu. Os ácidos nucléicos se tornaram o meio único e universal de codificar informações genéticas, exigindo mecanismos de reparo de DNA que, em sua forma básica, foram herdados por todas as formas de vida existentes de seu ancestral comum. O surgimento da atmosfera rica em oxigênio da Terra (conhecida como a "catástrofe do oxigênio") devido aos organismos fotossintéticos, bem como a presença de radicais livres potencialmente prejudiciais na célula devido à fosforilação oxidativa, exigiu a evolução de mecanismos de reparo de DNA que atuam especificamente para combater os tipos de danos induzidos pelo estresse oxidativo.

    Taxa de mudança evolutiva Editar

    Em algumas ocasiões, o dano ao DNA não é reparado ou é reparado por um mecanismo sujeito a erros que resulta em uma alteração da sequência original. Quando isso ocorre, as mutações podem se propagar nos genomas da progênie da célula. Se tal evento ocorrer em uma célula da linha germinativa que acabará por produzir um gameta, a mutação tem o potencial de ser transmitida à descendência do organismo. A taxa de evolução em uma determinada espécie (ou, em um determinado gene) é uma função da taxa de mutação. Como consequência, a taxa e a precisão dos mecanismos de reparo do DNA têm influência sobre o processo de mudança evolutiva. [129] A proteção e o reparo de danos ao DNA não influenciam a taxa de adaptação por regulação gênica e por recombinação e seleção de alelos. Por outro lado, o reparo e proteção de danos ao DNA influenciam a taxa de acúmulo de mutações hereditárias irreparáveis, vantajosas, de expansão de código e retarda o mecanismo evolutivo de expansão do genoma de organismos com novas funcionalidades. A tensão entre a evolucionabilidade e o reparo e proteção da mutação precisa de uma investigação mais aprofundada.

    Uma tecnologia chamada de repetição palindrômica curta regularmente interespaçada (abreviada para CRISPR-Cas9) foi descoberta em 2012. A nova tecnologia permite que qualquer pessoa com treinamento em biologia molecular altere os genes de qualquer espécie com precisão, induzindo danos ao DNA em um ponto específico e então alterando os mecanismos de reparo do DNA para inserir novos genes. [130] É mais barato, mais eficiente e mais preciso do que outras tecnologias. Com a ajuda do CRISPR – Cas9, partes de um genoma podem ser editadas por cientistas removendo, adicionando ou alterando partes em uma sequência de DNA.


    3. Resultados & # x000a0

    3.1. Estrutura geral & # x000a0

    O sistema hospedeiro & # x02013guest utilizado neste estudo emprega a co-cristalização de um oligonucleotídeo duplex de DNA de 16 pares de bases (hóspede) com a proteína (hospedeiro), o fragmento N-terminal da transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (MMLV RT ), que inclui os domínios dos dedos e da palma (Cot & # x000e9 et al., 2000 e # x025b6). O domínio dos dedos do MMLV RT interage com a extremidade 3 & # x02032 - & # x000adOH de uma fita, bem como a base do sulco menor e os átomos de açúcar dos três pares de bases terminais, resultando em várias ligações de hidrogênio e contatos de van der Waals (Cot & # x000e9 & # x00026 Georgiadis, 2001 & # x025b6 Berço & # x000e9 et al., 2000 & # x025b6, 2003 & # x025b6 Najmudin et al., 2000 e # x025b6). O sistema host & # x02013guest possui vários recursos importantes, dois dos quais são relevantes para este trabalho. Em primeiro lugar, diferentes oligonucleotídeos de DNA são todos analisados ​​dentro da mesma rede cristalina e, portanto, estão sujeitos ao mesmo ambiente cristalino (ver Tabela 1 & # x025b6 para parâmetros de célula unitária). Em segundo lugar, os 10 & # x02005bp centrais do DNA duplex 16 & # x02005bp estão livres de interações com a proteína ou outras moléculas de DNA, permitindo que o ácido nucleico adote uma estrutura ditada por sua sequência. Em trabalho anterior, usamos este sistema host & # x02013guest para analisar as propriedades da etapa de dinucleotídeo 5 & # x02032-CA que é reconhecida e processada por integrase (entradas PDB 2fvp, 2fvq, 2fvr e 2fvs) e descobrimos que independente de sua posição dentro o 10 & # x02005bp central, a etapa de dinucleotídeo CA nessas estruturas tinha propriedades estruturais semelhantes, incluindo um ângulo de rotação positivo e um valor de slide negativo (Monta & # x000f1o et al., 2006 & # x025b6).

    O sistema host & # x02013guest é mais adequado para a análise de sequências de DNA simétricas, uma vez que 8 & # x02005bp do total de 16 & # x02005bp duplex estão contidos na unidade assimétrica, a unidade repetitiva única dentro do cristal (Goodwin et al., 2005 & # x025b6 Sun et al., 1998 & # x025b6). Assim, analisamos as estruturas de dois duplexes simétricos de 16 pares de bases, um com duas lesões SP, uma em cada fita separada por dois pares de bases, e a outra com o DNA normal de mesmo comprimento e sequência (Figs. 1 e # x025b6 uma, 1 e # x025b6 b e 1 & # x025b6 c) Além disso, uma vez que o fragmento de RT MMLV sozinho foi usado como o modelo de pesquisa para obter a fase de substituição molecular, a densidade de elétrons inicial obtida para as moléculas de DNA convidado foi imparcial. Densidade de elétrons bem definida foi observada para a lesão de SP nos mapas de densidade de elétrons iniciais (Fig. 2 & # x025b6 uma) No geral, as estruturas dos duplexes de DNA contendo SP e não contendo SP têm diferenças estruturais claras, como mostrado na Fig. 2 & # x025b6 (b) e descrito em detalhes abaixo.

    Estrutura de cristal do oligonucleotídeo duplex de 16-mer contendo SP em um complexo hospedeiro & # x02013guest. (uma) A estrutura química do fotoproduto de esporo é mostrada. (b) O host & # x02013complexo de hóspede inclui duas moléculas de proteína, mostradas em um desenho animado com uma molécula em verde e a outra em azul, e um duplex de 16 pares de bases, mostrado em uma representação em bastão com uma fita colorida com átomos de C em verde , Átomos de N em azul, átomos de O em vermelho e átomos de P em laranja e o outro com átomos de C em ciano, átomos de N em azul, átomos de O em vermelho e átomos de P em laranja. A unidade assimétrica do cristal inclui uma molécula de proteína e oito pares de bases de DNA duplex. As lesões SP são mostradas em magenta e são indicadas por setas. (c) A sequência do DNA contendo SP usada para este estudo é mostrada com seu esquema de numeração. As timas envolvidas na lesão de SP são indicadas como & # x02018t & # x02019. A mesma sequência sem a lesão de SP também foi cristalizada e analisada.

    A lesão SP induz mudanças estruturais no DNA. (uma) O F o & # x02212 F c mapa de densidade de elétrons (malha verde) é mostrado antes da inclusão do SP e adeninas complementares no modelo estrutural contornado em 2,5 & # x003c3, com o modelo refinado final para a lesão mostrado como um modelo em bastão. A densidade de elétrons para a ligação covalente entre as timas é claramente evidente. (b) As renderizações de nove pares de bases são mostradas em estéreo para o DNA duplex contendo SP em verde, a lesão de SP em azul e o duplex de DNA não contendo SP em magenta. Os primeiros três pares de bases dentro de cada estrutura se superpõem bem. Desvios nas duas estruturas são então aparentes além desses primeiros pares de bases. O posicionamento aproximado de uma spline através do backbone de fosfodiéster é indicado por linhas vermelhas para o duplex contendo SP e por uma linha laranja para o duplex não contendo SP. Nesta visão, o alargamento significativo do sulco menor do DNA contendo SP é aparente. (c) As renderizações de stick são mostradas em estéreo para os pares de bases (verde) entre as duas lesões SP (azul) dentro de nosso oligonucleotídeo 16 & # x02005bp sobreposto na região equivalente da estrutura de uma única lesão SP (laranja) encontrada dentro de um oligonucleotídeo complexado com B. stearothermophilus DNA polimerase I. A segunda lesão de SP em nossa estrutura (não mostrada) estaria na fita complementar àquela incluindo A8 e T9.

    3.2. Parâmetros helicoidais & # x000a0

    Os parâmetros helicoidais e geometrias de pares de bases locais das sequências de DNA contendo SP e não contendo SP de 16 pares de base foram calculados usando 3DNA (Colasanti et al., 2013 & # x025b6 Lu & # x00026 Olson, 2003 & # x025b6, 2008 & # x025b6). Os parâmetros estruturais associados à estrutura SP podem ser influenciados pela proximidade das duas lesões SP, que estão localizadas dentro de dois pares de bases uma da outra.No entanto, os pares de bases imediatamente adjacentes às lesões de SP são muito semelhantes em estrutura àqueles encontrados na estrutura relatada para uma única estrutura contendo lesão de SP em um complexo com B. stearothermophilus DNA polimerase I (Fig. 2 & # x025b6 c) Em particular, o par de bases imediatamente adjacente à lesão, onde ambas as estruturas contêm uma purina na posição equivalente a A8, é quase idêntico nas duas estruturas. No próximo par de bases, a única estrutura de lesão de SP possui uma purina na posição equivalente a T9, mas ainda é estruturalmente bastante semelhante. Assim, a proximidade das duas lesões em nossa estrutura não parece causar alterações estruturais que diferem significativamente daquelas induzidas por uma única lesão.

    Ambas as estruturas mantêm uma conformação de DNA destro com empilhamento de base contínuo e têm torções helicoidais médias de 34,56 & # x000b0 e 33,98 & # x000b0, correspondendo a 10,4 e 10,6 & # x02005bp por volta, respectivamente. No entanto, a torção helicoidal em função dos pares de bases difere nas duas estruturas, como mostrado na Fig. 3 & # x025b6 (uma) Um desenrolamento pronunciado é observado na etapa de dinucleotídeo t6t7 (consulte a Fig. 1 & # x025b6 para o esquema de numeração) na região da lesão do fotoproduto de esporo, onde o DNA se desenrola em um ângulo de & # x022124.4 & # x000b0 em comparação com a estrutura não-SP. No entanto, as três etapas de dinucleotídeo após t6t7 mostram enrolamento do DNA, com valores variando de 0,68 & # x000b0 a 7,6 & # x000b0. Coletivamente, essas mudanças são responsáveis ​​pela acomodação da lesão do fotoproduto de esporo no DNA de dupla hélice, enquanto mantém o par de bases de Watson e # x02013Crick. Os valores de torção helicoidal global para a estrutura não-SP divergem significativamente daqueles da estrutura SP para as etapas de dinucleotídeo C3C4 e C4G5, com valores de 24,63 & # x000b0 e 39,66 & # x000b0 em comparação com 35,10 & # x000b0 e 34,64 & # x000b0, respectivamente . Assim, essas duas etapas são efetivamente underwound e overwound, respectivamente, na estrutura não-SP em comparação com a estrutura SP.

    Análise comparativa de torção helicoidal e largura de sulco menor em estruturas de DNA contendo SP e não contendo SP. (uma) A mudança na torção helicoidal para DNA não contendo SP (triângulos pretos) e contendo SP (quadrados pretos) é representada graficamente em relação aos pares de bases. (b) As larguras de ranhuras menores são mostradas na ausência (triângulos pretos) e na presença (quadrados pretos) da lesão do fotoproduto de esporo plotada para as etapas de dinucleotídeo (bases 5 & # x0201312).

    A estrutura do DNA não SP é totalmente B - & # x000adform, enquanto a do fotoproduto de esporo mostra três regiões distintas na estrutura do DNA: os terços superior e inferior adotam uma estrutura de forma B, enquanto as etapas centrais de dinucleotídeo incluem os dois fotoprodutos de esporos e pares de bases intermediários formam algum tipo de estrutura intermediária que se desvia significativamente do formato B - & # x000. A região central inclui as etapas de dinucleotídeo tt / AA, tA / TA, AT / AT, TA / tA e AA / tt (B6 & # x02013B11 / G6 & # x02013G11). Os valores de Zp para essas etapas de dinucleotídeo, juntamente com a inclinação helicoidal e x deslocamento, degrau de dímero, roll e slide desviam substancialmente daqueles encontrados em conformações de DNA padrão. Os parâmetros Zp e de par de bases locais do DNA contendo SP e não contendo SP estão listados na Tabela & # x000a02 & # x025b6. Um efeito significativo da lesão do fotoproduto de esporo também é observado na largura do sulco menor do DNA. Ao comparar a largura do sulco menor do DNA contendo SP com a forma não-SP, é claro que há um alargamento significativo do sulco menor (Fig. 3 & # x025b6 b): a largura do sulco menor aumenta de 9,7 & # x02005 & # x000c5 no DNA não SP para 12,5 & # x02005 & # x000c5 no DNA contendo SP. O sulco alargado é o resultado de mudanças nos parâmetros do par de bases locais devido à presença do fotoproduto de esporo, no qual as duas timas estão ligadas covalentemente uma à outra. As larguras da ranhura principal nas estruturas SP e não SP são semelhantes, com diferenças de menos de 1 & # x02005 & # x000c5.

    Mesa 2

    Parâmetros de par de bases locais.

    A característica mais notável da estrutura não-SP é que ela tem uma ranhura menor muito estreita variando de 9,7 a 10,4 & # x02005 & # x000c5 associada à sua sequência central TTATAA. Nesse sentido, ele difere de outras sequências ricas em AT que cristalizamos e analisamos, nas quais os locais AATT foram separados por um par GC central (Glass et al., 2009 e # x025b6 Goodwin et al., 2005 & # x025b6, 2006 & # x025b6). Nessas estruturas, a largura do sulco era muito estreita na extremidade 5 & # x02032 da sequência AATT e se alargava significativamente em direção ao par GC central.

    3.3. Parâmetros do par de base & # x000a0

    As variações nos parâmetros helicoidais e nas larguras de sulco do DNA contendo SP daqueles da forma não-SP são um resultado do efeito das variações nos parâmetros de etapa do par de bases locais, bem como bases individuais em resposta à presença do fotoproduto de esporo. O DNA contendo SP sugere mudanças significativas nos parâmetros locais da etapa do par de bases da etapa do dinucleotídeo t6t7 da lesão do fotoproduto de esporo. A inclinação e a torção para t6t7 reduzem de 1,84 & # x000b0 para & # x022126,96 & # x000b0 e de 35,79 & # x000b0 para 25,49 & # x000b0, respectivamente. Há um aumento significativo no valor de roll de & # x022123.60 & # x000b0 no DNA não contendo SP para 17,52 & # x000b0 no DNA contendo SP (Tabela & # x000a02 & # x025b6). Uma redução significativa também é observada no caso de x deslocamento (& # x022120,58 & # x000b0 a & # x022125,49 & # x000b0) e torção helicoidal global (36,01 & # x000b0 a 31,61 & # x000b0) em t6t7. A diminuição da inclinação e torção e a redução x o deslocamento em comparação com os dois degraus de base adjacentes resulta em um alargamento da ranhura menor. A inclinação reduzida das bases em relação ao eixo da hélice também resulta em uma torção semelhante a uma hélice do par de bases, alterando seu valor de & # x0221214.27 & # x000b0 no DNA não contendo SP para & # x0221224.76 & # x000b0 no DNA contendo SP.

    Mudanças significativas também são observadas nas distâncias das ligações de hidrogênio dos pares de bases envolvidos na formação da lesão SP. t6 e t7 no DNA não SP têm distâncias de ligação de hidrogênio O4 & # x02013N6 de 3,31 e 3,15 & # x02005 & # x000c5, respectivamente, em comparação com 2,76 e 2,84 & # x02005 & # x000c5 no DNA SP (Fig. 4 & # x025b6 uma) Isso sugere que o DNA não SP tem uma longa ligação de hidrogênio dentro do par A & # x02013T, enquanto o par A & # x02013t correspondente tem distâncias de ligação de hidrogênio mais convencionais. Assim, a estrutura sugere que as ligações de hidrogênio entre as bases são previstas para ser um pouco mais fortes na região contendo SP. Isso é ainda suportado pela diminuição da inclinação, resultando em uma torção significativa na região da lesão SP. O normalizado B fatores para a região contendo SP ou a região equivalente da estrutura não-SP estavam dentro de 15% da média B fator e eram semelhantes em padrão um ao outro. Assim, a presença da lesão de SP não parece influenciar diretamente a dinâmica da estrutura avaliada pelo B fatores.

    Comparação de pares de bases TT & # x02013AA em estruturas contendo SP e não contendo SP. (uma) As renderizações de stick de etapas de dinucleotídeo não SP TT & # x02013AA sobrepostas (roxo) e SP tt & # x02013AA são mostradas. As distâncias de ligação de hidrogênio são mostradas para N6 de A11 e O4 de T6 para ambos os pares de bases na etapa de dinucleotídeo. Para a estrutura não contendo SP, esta ligação de hidrogênio é muito longa em 3,31 & # x02005 & # x000c5, enquanto na estrutura contendo SP é 2,76 & # x02005 & # x000c5. As ligações de hidrogênio entre os mesmos átomos em A10 e T7 são muito semelhantes. (b) Representações em bastão da etapa de dinucleotídeo contendo SP neste trabalho (C, N verde, O azul, P vermelho, laranja) e um mímico sem o fosfato de ligação complexado com B. stearothermophilus DNA polimerase I (Heil et al., 2011 e # x025b6 rosa) são mostrados sobrepostos. As estruturas são muito semelhantes, apesar do fato de que o mímico não tem o fosfato de ligação. As distâncias de ligação de hidrogênio são mostradas para ambos os pares de bases da estrutura de SP e indicam uma forte ligação de hidrogênio da lesão de SP às adeninas complementares.

    Para determinar se a perda de aromaticidade influencia a estabilidade do empilhamento de base para t6, analisamos a área de contato entre t6 e G5 ou t7 e comparamos esta área com aquela na estrutura não contendo SP entre T6 e G6 ou T7 usando NACCESS (Hubbard & # x00026 Thornton, 1993 & # x025b6). As áreas de contato entre t6 e G5 ou T6 e G5 foram muito semelhantes nas duas estruturas. No entanto, a área de contato calculada para t6 e t7 foi, na verdade, um pouco maior do que para T6 e T7 (76 contra 67 & # x02005 & # x000c5 2), sugerindo que a perda de aromaticidade não afeta negativamente o empilhamento de base na lesão de SP.

    3.4. Cadeia principal e ângulos de torção & # x003c7 & # x000a0

    O DNA da forma B padrão tem ângulos de torção glicosídicos (& # x003c7) no anti conformação. Tanto o DNA não contendo SP quanto o contendo SP têm ângulos & # x003c7 no anti conformação, exceto para G13 (& # x02212 86.1 & # x000b0, syn) no SP-DNA. A mudança no ângulo & # x003c7 de & # x02212114.9 & # x000b0 para & # x0221296.8 & # x000b0 em t6 e de & # x02212104.9 & # x000b0 para & # x02212121.9 & # x000b0 em t7 no SP-DNA reflete a mudança estrutural necessária para acomodar a lesão do fotoproduto de esporo. O ângulo de torção do backbone & # x003b2 experimenta o maior desvio na região da lesão do fotoproduto de esporo, diminuindo de 173,1 & # x000b0 para & # x02212151.5 & # x000b0 em t6 enquanto aumenta ligeiramente de & # x02212175.6 & # x000b0 para 174,5 & # x000b0 em t7.


    Biologia e associações patológicas dos vírus do papiloma humano: uma revisão

    Os estudos históricos do papilomavírus do coelho coelho levantaram as primeiras indicações de um vírus oncogênico de DNA de mamífero. Hoje, a clonagem molecular reconhece vários papilomavírus humanos e animais (HPVs) e o desenvolvimento de ensaios de transformação in vitro intensificou a pesquisa oncológica em HPVs. Atualmente, a sua detecção e tipagem nos tecidos é geralmente por Southern blotting, hibridização in situ e métodos de reação em cadeia da polimerase. O vírion papilomavírus completo constitui um revestimento de proteína (capsídeo) que envolve um DNA circular de fita dupla organizado em regiões codificantes e não codificantes. Foram identificados 8 quadros de leitura aberta (E1-E8) iniciais (ORFs) e 2 ORFs tardios (L1, L2) na região de codificação de todos os papilomavírus. Os ORFs iniciais codificam proteínas que interagem com o genoma do hospedeiro para produzir novo DNA viral, enquanto os ORFs tardios são ativados somente após a replicação do DNA viral e codificam as proteínas do capsídeo viral. Todos os papilomavírus são organismos intranucleares obrigatórios com tropismo específico para queratinócitos. Três cursos possíveis de eventos podem seguir a entrada do papilomavírus nas células: (1) o DNA viral é mantido como epissomas de DNA circular, extracromossômico e intranuclear, que se replica sincronicamente com a célula hospedeira, estabelecendo uma infecção latente (2) conversão de infecção latente em infecção produtiva com montagem de vírions infecciosos completos (3) integração do DNA viral no genoma celular do hospedeiro, um fenômeno observado em infecções por HPV associadas à transformação maligna. Os papilomavírus humanos (HPVs) induzem essencialmente lesões epiteliais da pele e da mucosa. Sabe-se que várias verrugas cutâneas estão associadas ao HPV (HPVs 1, 2, 3, 7 e 10). Além dos HPVs 3 e 10, os HPVs 5, 8, 17 e 20 foram recuperados de lesões de epidermodisplasia verruciforme. O condiloma acuminado anogenital, fortemente relacionado com os HPVs 6 e 11, é provavelmente transmitido sexualmente. Os mesmos HPVs, demonstráveis ​​em papilomas laríngeos juvenis recorrentes, são provavelmente transmitidos por passagem através de um canal de parto infectado. HPVs descritos em lesões cervicais uterinas são geralmente categorizados em aqueles associados com alto (16, 18), intermediário (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) e baixo (6, 11 , 26, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66) risco de carcinoma escamoso cervical. O adenocarcinoma cervical, o carcinoma de células claras e o carcinoma neuroendócrino de pequenas células também têm sido associados aos HPVs, especialmente o HPV18. Outras lesões relatadas como associadas ao HPV são: papilomas, displasia e carcinomas na cavidade nasal (HPV 6, 11, 57) papiloma escamoso, condiloma acuminado e verruga vulgar da cavidade oral (HPV 6, 11), epitelial focal oral hiperplasia (HPV 13, 32) lesões verrucosas dos lábios (HPV 2): e papilomas conjuntivais (HPV 6, 11).


    A Biologia Química dos Danos ao DNA

    Nicholas E. Geacintov é Professor de Química e ex-Presidente do Departamento de Química da New York University (NYU), EUA. Ele recebeu seu diploma de PhD em físico-química e química de polímeros pela Faculdade Florestal da Universidade Estadual de Nova York na Universidade de Syracuse, e passou a maior parte de sua carreira na NYU. Seus interesses de pesquisa atuais estão focados nos mecanismos de carcinogênese química e danos ao DNA gerados por oxidação, especialmente as relações entre as características estruturais das lesões de DNA e seu impacto no reparo e replicação do DNA. Ele publicou mais de 350 artigos e atualmente atua como membro do Conselho Editorial do Journal of Biological Chemistry.

    Suse Broyde é Professor de Biologia e Professor Afiliado de Química na New York University, EUA. Seus interesses de pesquisa estão focados na modelagem computacional de lesões de DNA, com o objetivo de elucidar as origens moleculares de suas propriedades mutagênicas e tumorigênicas. Ela possui um PhD em físico-química com especialização em física pelo Instituto Politécnico de Nova York e publicou mais de 160 artigos em periódicos revisados ​​por pares. Ela foi membro do Conselho Editorial de Pesquisa Química em Toxicologia.


    Assista o vídeo: Reparo de lesões no DNA (Janeiro 2022).