Em formação

PBS ou TBS, onde não pode usar cada buffer?


Como você sabe, a solução salina tamponada com Tris e a solução salina tamponada com fosfato são polivalentes. Para encontrar o uso de cada buffer, há muitos experimentos de uso para PBS e TBS. TBS usa para western blotting e PBS usa para cultura de células.

mas alguns experimentos nunca usam PBS e alguns nunca usam TBS, quero perguntar a esta situação que quando você usa TBE, mas nunca usa PBS, e a situação oposta (use TBS, mas nunca use PBS), por exemplo, quando você usa western-blotting com fosfatase alcalina nunca use PBS e PBS-T. neste caso, o fosfato inibe AP, e o acoplamento da amina com NHS-EDC, nunca use o tampão Tris porque tem amina primária.


Acho que você respondeu sua própria pergunta.

O buffer usado em um determinado experimento depende dos requisitos e limitações do próprio experimento. Você só precisa olhar as propriedades do buffer e se ele é relevante para o seu experimento.

Você acabou de dar dois ótimos exemplos ... você está apenas procurando mais exemplos de experimentos em que não se usaria tampão de fosfato em vez de tampão Tris?

Supõe-se que o PBS imite / represente de perto a osmolaridade de uma célula e o tampão de pH = 7,0 a 9,0. Tris também protege em torno de pH neutro. É muito barato, mas como você afirmou, tem grupos de aminas primárias que são nucleofílicos e, portanto, interferem em certos experimentos, como reticulação de suberato de dissuccinimidila, etc.


Capítulo 5: Buffers de Western Blot

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Preparação

Existem muitas maneiras diferentes de preparar o PBS. Algumas formulações não contêm potássio, enquanto outras contêm cálcio ou magnésio [1]. Uma das preparações mais comuns é descrita a seguir.

Um estoque de 10 litros de 10x PBS pode ser preparado dissolvendo

  • 800 g de NaCl,
  • 20 g KCl,
  • 144 g Na2HPO4 · 2H2O
  • 24 g KH2PO4
  • 8 litros de água destilada.

Após a mistura completa, complete a solução final para 10 L. O pH do estoque 10X será de aproximadamente 6,8, mas quando diluído para 1x PBS deve mudar para 7,4. Ao fazer soluções tampão, é uma boa prática sempre medir o pH diretamente usando um medidor de pH. Se necessário, o pH pode ser ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Na diluição, o PBS 1x resultante deve ter uma concentração final de NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM e um pH de 7,4.
Outra preparação é descrita em Molecular Cloning por Sambrook, Fritsch and Maniatis, Apendix B.12 [2] da seguinte forma:

Para 1 litro de 1X PBS, prepare da seguinte forma:

  1. Comece com 800 ml de água destilada:
  2. Adicione 8 g de NaCl.
  3. Adicionar 0,2 g de KCl.
  4. Adicionar 1,44 g de Na2HPO4.
  5. Adicionar 0,24 g de KH2PO4.
  6. Ajuste o pH para 7,4 com HCl.
  7. Adicione água destilada até um volume total de 1 litro.

Dispense a solução em alíquotas e esterilize em autoclave (20 min, 121 ° C, ciclo de líquido). Armazenar em temperatura ambiente.


Objetivo e função das etapas de bloqueio

Os suportes de membrana usados ​​no western blotting têm alta afinidade por proteínas. Portanto, após a transferência das proteínas do gel, é importante bloquear a superfície remanescente da membrana para evitar a ligação não específica dos anticorpos de detecção durante as etapas subsequentes. Uma variedade de tampões de bloqueio variando de leite ou soro normal a proteínas altamente purificadas têm sido usados ​​para bloquear locais livres em uma membrana. O tampão de bloqueio deve melhorar a sensibilidade do ensaio, reduzindo a interferência de fundo e melhorando a relação sinal-ruído. O tampão de bloqueio ideal se ligará a todos os locais potenciais de interação não específica, eliminando o fundo completamente sem alterar ou obscurecer o epítopo para a ligação do anticorpo.

A escolha adequada do bloqueador para um determinado blot depende do próprio antígeno e do tipo de marcador de detecção usado. Por exemplo, em aplicações onde são usados ​​conjugados de AP, um tampão de bloqueio em TBS deve ser selecionado porque o PBS interfere com a fosfatase alcalina. Para a verdadeira otimização da etapa de bloqueio para um imunoensaio específico, o teste empírico é essencial. Muitos fatores, incluindo várias interações proteína-proteína exclusivas para um determinado conjunto de reagentes de imunoensaio, podem influenciar a ligação não específica. O parâmetro mais importante ao selecionar um bloqueador é a razão sinal-ruído, medida como o sinal obtido com uma amostra contendo o analito alvo, em comparação com aquele obtido com uma amostra sem o analito alvo. O uso de quantidades inadequadas de bloqueador resultará em manchas de fundo excessivas e uma relação sinal-ruído reduzida. O uso de concentrações excessivas de bloqueador pode mascarar as interações anticorpo-antígeno ou inibir a enzima marcadora, novamente causando uma redução da razão sinal-ruído. Ao desenvolver qualquer novo imunoensaio, é importante testar vários bloqueadores diferentes para obter a relação sinal-ruído mais alta do ensaio. Nenhum agente de bloqueio é ideal para todas as ocasiões, uma vez que cada par de antígeno-anticorpo tem características únicas.

Manual Técnico de Detecção de Proteína

Este manual de 84 páginas fornece um mergulho profundo na última etapa do fluxo de trabalho do western blot - detecção de proteínas. Com uma variedade de técnicas de detecção para escolher (quimioluminescência, fluorescência ou cromogênica), você pode selecionar uma tecnologia que corresponda aos seus requisitos experimentais e aos instrumentos que você tem disponíveis. Seja para visualização rápida ou quantificação precisa, detecção de sonda única ou multiplexação - a Thermo Fisher Scientific oferece uma variedade de reagentes e kits para detecção de western blot e análise subsequente.


PBS ou TBS, onde não pode usar cada buffer? - Biologia

ACETATO DE SÓDIO PH 3.6 & # 1505.6, PKUMA = 4.76

ácido acético acetato de sódio pH
185 15 3.6
176 24 3.8
164 36 4.0
147 53 4.2
126 74 4.4
102 98 4.6
80 120 4.8
59 141 5.0
42 158 5.2
29 171 5.4
19 181 5.6

SALINO BUFFER (PBS, TBS, TNT, PBT)

PBS 20x estoque TBS
Cloreto de Potássio 4 g 53,6 mM Cloreto de potássio 4 g
NaCl 160 g 274 mM NaCl 160 g
Fosfato de potássio monobásico 4 g 29,4 mM Tampão Tris (10 mM, pH 7,5) a 1 litro
Fosfato de sódio dibásico (7 & bullH2O) DI 43,2 g 17,5 mM para 1 litro Use TBS ao realizar imunocitoquímicos
experimentos em tecidos sensíveis ao fosfato
(tecidos fotossintéticos normalmente)
TNT PBT
NaCl 150 mM PBS para vol
Tampão Tris (100 mM, pH 7,5) para 1 litro Tween 20 1% (v / v)

CACODYLATE BUFFER PH 5.0 & # 1507.4, PKUMA = 6.27

0,2 M HCl pH
94.0 5.0
90.0 5.2
86.0 5.4
78.4 5.6
69.6 5.8
59.2 6.0
47.6 6.2
36.6 6.4
26.6 6.6
18.6 6.8
12.6 7.0
8.4 7.2
5.4 7.4

CITRATE BUFFER PH 3.0 & # 1506.2, PKUMA = 6.40 Soluções estoque de tampão citrato (Gomori, 1955): UMA: Ácido cítrico 0,1 M B: Citrato de sódio 0,1 M. Usar x ml A + y ml B e diluir para 100 ml com 50 ml DI.

Ácido cítrico 0,1 M Citrato de sódio 0,1 M pH
46.5 3.5 3.0
43.7 6.3 3.2
40.0 10.0 3.4
37.0 13.0 3.6
35.0 15.0 3.8
33.0 17.0 4.0
31.5 18.5 4.2
28.0 22.0 4.4
25.5 24.5 4.6
23.0 27.0 4.8
20.5 29.5 5.0
18.0 32.0 5.2
16.0 34.0 5.4
13.7 36.3 5.6
11.8 38.2 5.8
9.5 41.5 6.0
7.2 42.8 6.2

S & OslashRENSEN & rsquoS PHOSPHATE BUFFER PH 5.8 & # 1508.0, PKUMA = 7.20

A (ml) B (ml) pH
92.0 8.0 5.8
87.7 12.3 6.0
81.5 18.5 6.2
68.5 31.5 6.5
62.5 37.5 6.6
56.5 43.5 6.7
51.0 49.0 6.8
45.0 55.0 6.9
39.0 61.0 7.0
33.0 67.0 7.1
28.0 72.0 7.2
23.0 77.0 7.3
19.0 81.0 7.4
16.0 84.0 7.5
8.5 91.5 7.8
5.3 94.7 8.0

PHOSPHATE & # 150CITRATE BUFFER PH 2.2 & # 1508.0, PKUMA = 7.20/6.40

0,2 M Na2HPO4 (ml) Citrato 0,1 M (ml) pH
5.4 44.6 2.6
7.8 42.2 2.8
10.2 39.8 3.0
12.3 37.7 3.2
14.1 35.9 3.4
16.1 33.9 3.6
17.7 32.3 3.8
19.3 30.7 4.0
20.6 29.4 4.2
22.2 27.8 4.4
23.3 26.7 4.6
24.8 25.2 4.8
25.7 24.3 5.0
26.7 23.3 5.2
27.8 22.2 5.4
29.0 21.0 5.6
30.3 19.7 5.8
32.1 17.9 6.0
33.1 16.9 6.2
34.6 15.4 6.4
36.4 13.6 6.6
40.9 9.1 6.8
43.6 6.5 7.0

BARBITAL BUFFER PH 6.8 & # 1509.2, PKUMA = 7.98

0,2 M HCl (ml) pH
1.5 9.2
2.5 9.0
4.0 8.8
6.0 8.6
9.0 8.4
12.7 8.2
17.5 8.0
22.5 7.8
27.5 7.6
32.5 7.4
39.0 7.2
43.0 7.0
45.0 6.8
Solução Preparação
Tris, estoque 1 M Tris base DI Dissolver e ajustar o pH com a seguinte quantidade aproximada de HCl: pH 7,4 pH 7,6 pH 8,0 121,1 g 800 ml 70 ml 60 ml 42 ml
EDTA, 0,5 M Tetraacetato dissódico de etilenodiamina Ajustar o pH a aprox. 8.0 e mexa até dissolver 186,1 g
SSC, 20x NaCl NaCitrato DI Ajuste o pH para 7,0 com NaOH e, em seguida, adicione DI para 1 litro 175,3 g 88,2 g 800 ml
SSPE, 20x NaCl NaH2PO4 & bull H2O EDTA DI Ajuste o pH para 7,4 com NaOH, em seguida, adicione DI para 1 litro 174 g 27,6 g 7,4 g 800 ml
TE Tris EDTA Ajustar pH usando solução estoque Tris 10 mM 1 mM
STE (TNE) Tris NaCl EDTA Ajustar o pH para 8,0 usando solução estoque Tris 10 mM 100 mM 1 mM

GLYCINE & # 150 NAOH BUFFER PH 8.6 & # 15010.6, PKUMA = 9.78


Formulários

  • PBS: tampão de lavagem, preparação de reagentes, diluição da amostra
  • PBS-T: tampão de lavagem de diluição de anticorpo para Western blots e ELISAs

Informações adicionais do produto

Consulte o Certificado de Análise do produto para obter informações sobre as condições de armazenamento, componentes do produto e especificações técnicas. Consulte a Lista de componentes do kit para determinar os componentes do kit. Certificados de análise e listas de componentes do kit estão localizados na guia Documentos.

Takara Bio USA, Inc.
Estados Unidos / Canadá: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
SOMENTE PARA USO EM PESQUISA. NÃO SE DEVE USAR EM PROCEDIMENTOS DE DIAGNÓSTICO. & cópia 2021 Takara Bio Inc. Todos os direitos reservados. Todas as marcas registradas são propriedade da Takara Bio Inc. ou de suas afiliadas nos EUA e / ou outros países ou seus respectivos proprietários. Certas marcas comerciais podem não estar registradas em todas as jurisdições. Informações adicionais sobre produtos, propriedade intelectual e uso restrito estão disponíveis em takarabio.com.

A Takara Bio Europe é membro do Takara Bio Group, uma empresa líder em ciências da vida que está comprometida em melhorar a condição humana por meio da biotecnologia. Por meio de nossas marcas Takara, Clontech e Cellartis, nossa missão é desenvolver ferramentas e serviços inovadores de alta qualidade para acelerar a descoberta.


Armazene o pó em temperatura ambiente. Após a reconstituição, armazene o tampão de bloqueio de caseína a 2-8 ° C para evitar contaminação bacteriana. As soluções podem ser guardadas até uma semana a 2-8 ° C após a reconstituição.

Procedimento de bloqueio, sondagem e detecção de Southern blot

  1. Após a transferência e a reticulação do ácido nucleico marcado para uma nitrocelulose, náilon ou membrana de náilon carregada positivamente, incube a membrana com tampão de bloqueio de caseína por 60 minutos (0,6 mL / cm 2) à temperatura ambiente ou por 30 minutos a 37 ° C com agitação suave. Além disso, observe que o bloqueio pode ser realizado durante a noite a 2-8 ° C.
    Nota: O tampão de bloqueio de caseína não é adequado para bloquear membranas de PVDF.

O conjugado de proteína ou anticorpo deve ser diluído com solução salina tamponada com fosfato com 0,05% (v / v) de Tween-20 (PBS-T). Uma concentração inicial de 1-10 ng / mL é sugerida ao usar estreptavidina-fosfatase alcalina (S2890) ou estreptavidina-peroxidase (S5512) como o conjugado de proteína.

Bloqueio de Western blot, sondagem e procedimento de detecção

  1. Após a transferência da proteína para uma membrana de nitrocelulose, incubar a membrana com tampão de bloqueio de caseína por 10 minutos (0,6 mL / cm 2) à temperatura ambiente ou por 30 minutos a 37 ° C com agitação suave. Além disso, observe que o bloqueio pode ser realizado durante a noite a 2-8 ° C.

Sugestões para detecção colorimétrica:

    A membrana deve ser exposta ao substrato colorimétrico até que surja um sinal positivo, mas quando o fundo começa a se desenvolver, a reação deve ser interrompida. A membrana não deve ser exposta ao substrato por mais de 60 minutos.

Sugestões para detecção quimioluminescente:

    Após a exposição ao substrato, o excesso de substrato deve ser removido e a membrana transferida para um suporte sólido. Recomenda-se a transferência da membrana para um "protetor de página", ligeiramente maior do que a própria membrana. A membrana suportada deve então ser colocada dentro de um saco selável por calor. Usando uma leve pressão, alise as bolhas de ar entre a membrana e o saco plástico rolando um tubo de ensaio de vidro ou pipeta sobre a membrana contida. Sele o saco e limpe qualquer excesso de substrato da parte externa do saco. Coloque a membrana contida em um cassete de filme e exponha ao filme.

Sugestões para detecção de Western blot:

    As diluições do conjugado enzima-anticorpo dependem do substrato utilizado para a detecção subsequente e devem ser otimizadas pelo pesquisador. As diretrizes gerais para diluições são 1: 5.000 para substratos cromogênicos e 1: 50.000 para substratos quimioluminescentes. As razões de diluição são baseadas em uma concentração inicial de


Formulários

  • TBS: tampão de lavagem para ELISA, Western blotting e tampão de diluição de amostra de coloração imunohistoquímica
  • TBS-T: diluição de anticorpo, tampão de lavagem para Western blots e ELISAs

Informações adicionais do produto

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Procedimento

Os procedimentos de Western blotting incluem as seguintes etapas:

Preparação de tecido (preparação de lisado de amostra):

Pegue a amostra, adicione PBS gelado e tampão de lise, como tampão RIPA, que é um tampão comumente usado para rendimento máximo de proteína. (A escolha do tampão de lise depende amplamente da localização da proteína de interesse, a solubilização das proteínas ligadas à membrana requer detergentes de extração mais fortes em comparação com as proteínas citoplasmáticas isoladas).

Sempre use inibidores de protease recém-preparados, mantenha as amostras no gelo e trabalhe rapidamente.

O tampão de lise deve conter inibidores da protease para prevenir a degradação da proteína de interesse. As células são lisadas por incubação em gelo e, posteriormente, aplicação de pressão de cisalhamento com pipeta. A mistura de células é centrifugada e o pellet é descartado. O sobrenadante é o lisado que usaremos para processamento posterior.

  • beta-mercaptoetanol, ou DTT, para reduzir as cristas dissulfeto entre as cisteínas,
  • SDS para ajudar na desnaturação e fornecer uma carga negativa líquida para a proteína,
  • glicerol para permitir que as amostras afundem em cada poço,
  • azul de bromofenol para visualizar o lisado e um tampão iônico.

Agite cada amostra no vórtice e incube a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar completamente as proteínas. Agora a amostra está pronta para carregar em um gel de página SDS.

Eletroforese em Gel:

Nesta etapa, vamos separar as proteínas individuais em nosso lisado de amostra com base em seu peso molecular usando um eletrodo positivo para atrair uma proteína carregada negativamente. Para fazer isso, carregamos nossas amostras de proteínas previamente preparadas em um gel de poliacrilamida disponível no mercado.

  1. Prepare o gel inserindo-o no aparelho de eletroforese e enchendo-o com tampão de corrida apropriado para a química do gel. Lave os poços do gel com tampão de corrida e adicione tampão às câmaras.
  2. Carregue suas amostras nos poços e carregar uma escada de peso molecular pré-manchada em um poço. A escada permitirá que você monitore a separação de proteínas durante a eletroforese e, subsequentemente, verifique o peso da proteína em sua amostra durante a análise posterior.
  3. Feche a unidade de eletroforese e conecte-a a uma fonte de alimentação. A maioria das unidades normalmente funciona 45-60 minutos a 200 volts ou até que o tampão de carregamento alcance o fundo do gel. Durante este tempo, as proteínas carregadas negativamente em cada amostra irão migrar em direção ao eletrodo carregado positivamente, fazendo o seu caminho através da matriz de gel de poliacrilamida.

Transferir

Nesta próxima etapa, iremos transferir proteínas separadas do gel para uma membrana sólida ou blot. Isso se baseia no mesmo princípio da etapa anterior, em que um campo elétrico é carregado para mover as proteínas negativas em direção a um eletrodo positivo. A transferência pode ocorrer em condições úmidas ou semi-secas.

  • Comece removendo o gel de seu cassete cortando a parte superior que contém os poços.
  • Faça um entalhe no canto superior esquerdo para indicar a orientação do gel.
  • Flutue o gel no tampão de transferência enquanto prepara o sanduíche de transferência. Para fazer o sanduíche de transferência, é necessário um cassete, esponjas, papel filtro, o gel e PVDF ou papel de membrana de nitrocelulose.
  • Faça um entalhe no canto superior esquerdo do papel absorvente para indicar a orientação do borrão e incube as membranas em tampão de transferência por 10 minutos.
  • Crie uma pilha colocando os seguintes componentes do cátodo negativo preto para o ânodo positivo vermelho:esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro e esponja (Tenha cuidado para não tocar no gel ou membrana com as mãos desprotegidas e, em vez disso, use uma pinça ou espátula limpa. Tocar na membrana durante qualquer fase pode contaminar a mancha e levar a um sinal de fundo excessivo).
  • Use um rolo limpo com cada camada para desenrolar suavemente quaisquer bolhas que possam estar presentes, uma vez que as bolhas inibem a transferência eficiente de proteínas.
  • Trave a cassete e coloque-a no aparelho de transferência que contém o tampão de transferência a frio, garantindo que a cassete está devidamente posicionada de negativo para positivo.A fim de evitar o aumento de calor, é benéfico transferir com uma bolsa de frio no aparelho ou em uma sala fria com a barra giratória colocada no fundo da câmara.
  • Feche a câmara e conecte a uma fonte de alimentação.
  • Realize a transferência de acordo com as instruções do fabricante, que normalmente é de 100 volts para terceiros a 120 minutos.

Immunobloting

Como uma etapa opcional, podemos verificar se as proteínas foram transferidas com sucesso pela coloração da membrana com vermelho ponceau. Incubar a membrana em ponceau por cinco minutos e lavar com água até que as bandas estejam claras. Após a verificação, a mancha pode ser removida, continuando a lavar com água ou com TBS até que a tinta seja completamente removida.

Uma etapa opcional recomendada é usar também um anticorpo de controle de carga positiva que permite ao usuário verificar que quantidades iguais de proteína total foram carregadas em cada poço e auxilia na solução de problemas, removendo quaisquer incertezas com o procedimento Western Blot.

Detecção

Nesta fase final, vamos demonstrar o desenvolvimento do sinal usando o método de detecção mais comum, mais sensível e mais barato, a eletroquimioluminescência ou reação ECL. Este método utiliza a enzima HRP que foi conjugada com a secundária para catalisar a reação ECL e produzir luz. A luz é então reunida em um filme de raio-x e revelada ou digitalizada com o auxílio de uma câmera especializada e sensível o suficiente para essa aplicação.

Passos:

  • Começamos misturando partes iguais de reagentes ECL em uma proporção de um para um de acordo com as instruções do fabricante.
  • Vamos incubar a membrana por 3-5 minutos sem agitação.
  • Após a incubação, decantar a mistura de ECL e usar um pano de laboratório para limpar o excesso de solução do canto da membrana.
  • Coloque a membrana em um filme plástico transparente, como um protetor de folha, para evitar a secagem.
  • Agora podemos usar um rolo para empurrar quaisquer bolhas ou qualquer excesso de solução.
  • Desenvolva imediatamente a membrana.
  • Os sistemas de filme e câmera nos permitem ajustar manualmente o tempo de exposição para garantir um Western Blot de imagem perfeita. As densidades de banda relativa agora podem ser quantificadas com software disponível comercialmente. O peso molecular adequado também pode ser verificado comparando os tamanhos das bandas com a escala de peso molecular.

Como preparar o tampão Tris

É fácil encontrar uma solução tampão tris disponível no mercado, mas é possível fazer você mesmo com o equipamento adequado.

Calcule a quantidade de cada item de que você precisa com base na concentração molar da solução desejada e na quantidade de tampão necessária.

  1. Comece determinando a concentração (molaridade) e o volume do tampão Tris que você deseja preparar. Por exemplo, a solução tampão Tris usada para solução salina varia de 10 a 100 mM. Depois de decidir o que está fazendo, calcule o número de moles de Tris necessários, multiplicando a concentração molar do tampão pelo volume do tampão que está sendo feito. (moles de Tris = mol / L x L)
  2. Em seguida, determine quantos gramas de Tris são multiplicando o número de moles pelo peso molecular de Tris (121,14 g / mol). gramas de Tris = (moles) x (121,14 g / mol)
  3. Dissolva o Tris na água destilada deionizada, 1/3 a 1/2 do volume final desejado.
  4. Misture HCl (por exemplo, HCl 1M) até que o medidor de pH forneça o pH desejado para sua solução tampão Tris.
  5. Diluir o tampão com água para atingir o volume final de solução desejado.

Depois de preparada, a solução pode ser armazenada por meses em local estéril à temperatura ambiente. A longa vida útil da solução tampão Tris é possível porque a solução não contém proteínas.


Assista o vídeo: Chemical Buffers (Novembro 2021).