Em formação

Que implicações tem o 2'-OH ausente na capacidade do DNA de formar estruturas 3D?


A diferença química entre o RNA e o DNA é a falta do grupo 2'-hidroxila nos nucleotídeos que constroem o DNA. O principal efeito dessa mudança que conheço é a maior estabilidade do DNA em comparação com o RNA. Mas estou me perguntando se essa diferença tem implicações significativas para a capacidade do DNA de formar estruturas tridimensionais complexas.

O RNA é conhecido por ser capaz de partir de estruturas terciárias complexas e funcionar como ribozimas. Ele claramente tem a capacidade de formar uma ampla gama de estruturas e pode catalisar uma variedade de reações químicas.

Até onde eu sei, não há nenhum DNA catalítico de ocorrência natural conhecido. Mas uma série de enzimas de DNA sintéticas foram criadas em laboratório, então geralmente é possível que o DNA forme estruturas catalíticas (veja Breaker e Joyce 1994 para a primeira enzima de DNA criada).

Estou me perguntando se a falta de 2'-OH significa que o DNA tem menos potencial para formar estruturas complexas em comparação com o RNA. Imagino que isso mude a capacidade de criar ligações de hidrogênio, mas não sei se diminuiria significativamente as estruturas potenciais que o DNA poderia adotar.


Breaker RR, Joyce GF; (Dezembro de 1994). "Uma enzima de DNA que cliva o RNA". Chem Biol. 1 (4): 223-9


Para ter certeza de que não estou comparando maçãs e peras, minha (tentativa de) responder à pergunta será dividida em duas partes: comparação de ácidos nucléicos de fita simples e de fita dupla.

DNA e RNA de fita simples

Tanto o DNA quanto o RNA podem formar estruturas terciárias complexas de fita simples nas quais os elementos da estrutura secundária são associados por meio de contatos de van der Waals e ligações de hidrogênio. A presença de um grupo 2'-hidroxila faz com que o anel da ribose prefira conformações diferentes do que a desoxirribose no DNA. Além disso, uma vez que a porção 2'-OH é um doador e aceitador de hidrogênio, ele fornece RNA com maior flexibilidade para formar estruturas complexas 3D e estabilidade permanecer em uma dessas conformações. Como Aleadam observa, este artigo mostra que o tRNA e seu análogo de DNA formam estruturas terciárias semelhantes, embora o tDNA não seja tão estável quanto o tRNA:

Portanto, sugerimos que a conformação global dos ácidos nucléicos é ditada principalmente pela interação das bases purina e pirimidina com átomos e grupos funcionais comuns ao RNA e ao DNA. Nessa visão, o grupo 2-hidroxila, pelo menos no tRNA, é uma característica estrutural auxiliar cujo papel se limita a promover interações locais, que aumentam a estabilidade de uma determinada conformação.

Esses autores também mostram que pelo menos uma alça no análogo de tDNA é mais suscetível à clivagem por uma endonuclease de restrição. Nesta região, o tRNA tem uma molécula de água ligada por hidrogênio ao grupo 2'hidroxila.

Não consegui encontrar mais dessas comparações interessantes na literatura.

DNA e RNA de fita dupla

Tanto o DNA quanto o RNA podem formar estruturas de fita dupla. Mais uma vez, a conformação do açúcar determina a forma da hélice: para a hélice de DNA é geralmente a forma B, enquanto o RNA helicoidal forma a geometria A em quase todas as condições. Na hélice de RNA encontramos a ribose predominantemente na conformação C3'-endo, como 2'-OH estericamente desfavorece a conformação C2'-endo, necessária para a geometria da forma B.

Significado fisiológico

dsRNA e ssDNA geralmente fornecem um sinal para a célula de que algo está errado. O dsRNA é evidentemente visto em processos normais como a interferência de RNA, mas também pode interromper a síntese de proteínas e sinalizar infecções virais (cf. vírus de RNA de fita dupla). Da mesma forma, o ssDNA é muito mais sujeito à degradação do que o dsDNA, frequentemente sinaliza danos ao DNA ou infecções por vírus de DNA de fita simples e induz a morte celular. Portanto, devido às suas funções, em condições normais, a estrutura 3D do DNA é principalmente uma hélice de fita dupla, enquanto o RNA tem uma estrutura 3D complexa "semelhante a uma proteína" de fita simples.


Este não é o meu campo, então estou arriscando uma resposta errada / incompleta aqui, mas eu diria que a diferença crítica é a ocorrência quase completa de DNA de fita dupla que impede a formação de estruturas terciárias em RNA de fita simples, em vez da diferença 2'OH. Na verdade, e seguindo o link que você postou, os autores até comentam na introdução que:

"É bem conhecido que o DNA de fita simples pode assumir estruturas terciárias interessantes. Um tRNA e seu análogo de DNA formam estruturas muito semelhantes [9]".

Não segui a citação 9 [Paquette et al (1990), Eur. J. Biochem. 189,259-265], mas eles parecem responder sua pergunta com essa frase. Em essência, provavelmente não tem uma implicação importante.


A resposta está inteiramente na estabilidade termodinâmica proporcionada por um 2'-OH. Como mencionado por Aleksandra, o RNA adotará apenas a conformação C3'-endo, enquanto o DNA adota tanto C2'-endo quanto C3'-endo. Efetivamente, isso torna a fita de DNA mais flexível, não o RNA. Ao fazer isso, um oligômero de DNA de fita simples será capaz de adotar mais estados.

A formação da hélice de DNA / RNA é predominantemente entalpicamente dirigido. Quando uma hélice se forma, o RNA só adota uma hélice de forma A, enquanto o DNA adota uma forma A e uma forma B. Embora existam mais conformações possíveis para o DNA, a redução no entrópico contribuições tornam-no significativamente mais desfavorável. Curiosamente, é por isso que análogos de RNA como PNA e morfolinos têm boas propriedades de ligação, pois formarão um emparelhamento de bases mais entropicamente estável com sua sequência alvo.

Por essas razões, é muito mais comum ver Ribozimas estruturadas e RNAs não codificantes na natureza, embora seja fisicamente possível produzir DNAzimas. Novamente, uma das muitas razões pelas quais a hipótese do mundo de RNA faz sentido.


o grupo OH na posição dois atua como um catalisador nucleofílico para a clivagem do RNA ou do DNA se ele tivesse tal grupo. Como o DNA precisa permanecer intacto durante toda a vida de uma célula, seria desastroso se fosse clivado por causa do grupo 2'OH. O RNA, por outro lado, é clivado rapidamente conforme necessário pela célula, sem consequências prejudiciais ao código genético das células, de modo que pode ter um grupo OH.


Que implicações tem o 2'-OH ausente na capacidade do DNA de formar estruturas 3D? - Biologia

A nanotecnologia de DNA estrutural consiste na combinação de motivos incomuns de DNA por interações coesivas específicas estruturalmente bem definidas (principalmente extremidades pegajosas) para produzir materiais alvo com estruturas 3D previsíveis. Esse esforço gerou catenanas poliédricas de DNA, dispositivos nanomecânicos robustos e uma variedade de matrizes periódicas em duas dimensões. O sistema tem sido usado para produzir padrões específicos na mesoescala através do desenho e combinação de fitas específicas de DNA, que são então examinadas por microscopia de força atômica. Espera-se que a combinação dessas construções com outros componentes químicos contribua para o desenvolvimento da nanoeletrônica, nanorobótica e materiais inteligentes. As capacidades organizacionais da nanotecnologia de DNA estrutural estão apenas começando a ser exploradas, e espera-se que o campo seja capaz de organizar uma variedade de espécies que levarão a materiais excitantes e possivelmente revolucionários.


MATERIAIS E MÉTODOS

Análise de sequência da subunidade acessória de Drosófila pol & # x003b3.

O banco de dados de sequência de proteínas SwissProt foi pesquisado usando o algoritmo de explosão (11) por meio do servidor da web do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para homólogos da sequência da subunidade acessória de pol & # x003b3 (7). Os alinhamentos de sequência foram obtidos com os programas de gap e bestfit do pacote de software do University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) (12) usando o algoritmo Needleman e Wunsch (com peso de gap = 5 e peso de comprimento = 4). Os resíduos 254 & # x02013361 da subunidade acessória de pol & # x003b3 (pol & # x003b3 - & # x003b2) foram alinhados usando a lacuna para os resíduos 288 & # x02013386 da sequência da estrutura cristalina do Thermus thermophilus prolil ARNt sintetase (Pro-RS generosamente fornecido por S. Cusack do European Molecular Biology Laboratory, Grenoble, França) (13), correspondendo a um domínio de dobragem independente em Escherichia coli pro-RS identificado pela busca de explosão como sendo semelhante à sequência pol & # x003b3 - & # x003b2. Pequenas modificações deste alinhamento foram feitas de modo que as inserções e deleções caíssem em regiões entre as estruturas secundárias.

Modelagem Estrutural da Subunidade Acessório.

A previsão inicial da dobra tridimensional (3D) da subunidade acessória foi obtida do servidor Protein Fold Recognition (http://www.doe-mbi.ucla.edu/people/frsvr/preds.html) com base no algoritmo de Fischer e Eisenberg (14). Esta abordagem usa a estrutura secundária atribuída à sequência por phdsec (15) (http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html) e a matriz de substituição de aminoácidos Gonnet para avaliar a similaridade entre a sequência da sonda (por exemplo, a subunidade acessória) e sequências do Protein Data Bank (PDB) (16, 17) de estruturas de proteínas 3D. O uso de estruturas primárias e secundárias previstas na pesquisa aumenta sua sensibilidade na identificação da proteína com a dobra 3D mais semelhante à da sonda. Quando testado em um conjunto de 68 proteínas cujas estruturas 3D eram conhecidas, mas ignoradas, o servidor de reconhecimento de dobra pode reconhecer com sucesso a dobra 3D de uma nova sequência em 71 & # x00025 dos casos (14).

A modelagem 3D foi realizada usando Molecular Simulations & # x02019 (Waltham, MA) insightII e software de biopolímero em uma estação de trabalho gráfica Indigo2 da Silicon Graphics (Mountain View, CA). Usando o alinhamento de sequência entre a subunidade acessória de Drosophila melanogaster pol & # x003b3 e a estrutura cristalina 2.4 - & # x0212b dos resíduos 288 & # x02013386 de T. thermophilus pro-RS, a espinha dorsal do pro-RS foi usado como um modelo estrutural, e cadeias laterais diferindo em pol & # x003b3 - & # x003b2 foram substituídas individualmente. Para dois dos três loops curtos entre estruturas secundárias regulares que diferem entre pol & # x003b3 - & # x003b2 e pro-RS, a função searchloop em biopolímero foi usada para identificar um loop de estrutura conhecida com comprimento, geometria e empacotamento apropriados para uso como um modelo estrutural para o terceiro loop, entre & # x003b2-strands 4 e 5, o loop correspondente na estrutura de T. thermophilus histidil-RS (entrada PDB 1adj) (18) foi usado como um modelo, seguido por substituição da cadeia lateral quando necessário. Quando as substituições da cadeia lateral resultaram em colisões estéricas, elas foram resolvidas por ajustes mínimos de ângulo de torção no insight II, seguido por minimização de energia nas regiões de loop apenas, por 100 etapas de minimização de descidas mais íngremes com o campo de força de valência consistente CVFF usando software de descoberta (Molecular Simulations, Waltham, MA). A estereoquímica do modelo estrutural final do domínio C-terminal de pol & # x003b3 - & # x003b2 foi validada usando procheck (19, 20), e a favorabilidade de ambientes de aminoácidos dentro desta estrutura foi avaliada usando o método de Perfil 3D (21) por meio do servidor verify3D (http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify3D.html). As comparações estruturais 3D entre o modelo de subunidade acessória e as estruturas cristalográficas disponíveis de tioredoxina e a subunidade & # x003b4 & # x02032 da DNA polimerase III foram realizadas com o servidor dali (22) (http://www.embl-ebi.ac.uk / dali).


Resultados

Dobramento do subdomínio RED

Anteriormente, mostramos que o domínio de ligação ao DNA & # x02010 da transposase SB não forma uma estrutura estável em condições fisiológicas.17 No entanto, a reação de transposição ocorre no núcleo da célula, em ambiente extremamente aglomerado. Portanto, primeiro investigamos se o apinhamento induz dobramento do subdomínio RED. Dois agentes foram usados ​​para imitar o efeito de aglomeração, polietilenoglicol (PEG 6000) e Ficoll & # x0201070. Espera-se que esses agentes de aglomeração aumentem a compactação de uma proteína devido aos efeitos de volume excluídos.18,19 Figura & # x200B A Figura 1 (A, B) 1 (A, B) mostra os espectros de dicroísmo circular (CD) UV distante do RED subdomínio na presença de concentrações crescentes de PEG 6000 (painel A) ou Ficoll & # x0201070 (painel B). Os espectros de CD demonstram que o subdomínio RED sozinho não tem estrutura secundária significativa. Além disso, a presença de PEG 6000 ou Ficoll & # x0201070 não aumenta visivelmente a estrutura secundária no subdomínio RED nas concentrações usadas neste estudo. Figura & # x200B A Figura 1 (C, D) 1 (C, D) mostra os espectros 2D [1 H, 15N] e # x02010HSQC do subdomínio RED. A distribuição estreita de picos cruzados & # x02010 na dimensão do próton indica que o subdomínio RED sozinho está desordenado (painel C). Os picos são alargados, o que pode ser causado pela troca conformacional entre diferentes estados desordenados ou por associação. Na presença de Ficoll & # x0201070, os picos no espectro [1 H, 15N] & # x02010HSQC do subdomínio RED tornam-se significativamente mais nítidos. Tal mudança espectral sugere que o espaço conformacional amostrado pelo subdomínio RED (entre diferentes estados desordenados ou oligoméricos) é reduzido na presença de aglomeração. No entanto, a maioria dos picos cruzados & # x02010 permanecem em suas posições originais e a distribuição do deslocamento químico permanece estreita. Juntos, os dados de CD e NMR indicam que o subdomínio RED permanece desordenado em condições de superlotação.

Dobramento do subdomínio RED na presença de aglomeração. Far UV CD e [1 H, 15N] & # x02010HSQC NMR espectros do subdomínio RED na presença de PEG 6000 (A, B) e Ficoll & # x0201070 (C, D) foram coletados em tampão MES aquoso 20 mM em pH 5,0 . Aumentar a concentração de crowders não induz uma quantidade significativa de estrutura helicoidal alfa & # x02010. As setas indicam concentrações crescentes de crowders.

Em seguida, o efeito dos sais no dobramento do subdomínio RED foi investigado. Sabe-se que íons kosmotrópicos tendem a precipitar proteínas e estabilizar sua estrutura, enquanto os caótropos tendem a aumentar a solubilidade das proteínas e favorecer a desnaturação.20 Esse comportamento é mais pronunciado para ânions do que cátions, e a ordem típica para a série de Hofmeister do ânion é CO 3 2 & # x02212 & # x02009 & # x0003e & # x02009SO4 2 & # x02013 & # x02009 & # x0003e & # x02009H2PO4 1 x02009 ClO 4 & # x02212 e para a série de cátions é K + & # x02009 & # x0003e & # x02009Na + & # x02009 & # x0003e & # x02009Mg 2+ & # x02009 & # x0003e & # x02009Ca 2+ (kosmotropes no cloreto esquerdo), onde é o cloreto esquerdo geralmente considerada a linha divisória entre esses dois tipos de comportamento. Assim, testamos o efeito do Na2TÃO4, KCl, NaCl e NaClO4 na dobragem do subdomínio RED. Figura & # x200B A Figura 2 2 mostra os resultados dos experimentos de titulação com esses sais. Os espectros de CD de UV distante do subdomínio RED mostram que as características da estrutura secundária alfa & # x02010helical emergem após a adição de todos os sais, isto é, duas bandas negativas a 208 nm e 222 nm e uma banda positiva a 193 nm. As mudanças espectrais são consistentes com a observação de que proteínas carregadas positivamente seguem a série direta de Hofmeister em altas concentrações de sal (acima de 200 & # x02013300 mM de sal monovalente), 21 isto é, a adição de NaClO4 tem o menor efeito na estrutura do subdomínio RED. A adição de Na2TÃO4 leva à maior quantidade de alfa & # x02010 estrutura secundária helicoidal conforme avaliado pela magnitude da elipticidade em 222 nm (Fig. & # x200B (Fig.2). 2). Além disso, em contraste com Na2TÃO4, alguma redução na intensidade do espectro CD é observada após a adição de KCl, NaCl e NaClO4, o que pode ser tomado como a evidência indireta de auto & # x02010associação do subdomínio RED. Portanto, Na2TÃO4 foi selecionado para experimentos de NMR.

Dobramento do subdomínio RED na presença de diferentes sais. Espectros de CD de UV distante do subdomínio RED coletados em tampão MES aquoso 20 mM a pH 5,0 na presença de até 800 mM de NaClO4 (A), NaCl (B), KCl (C) e Na2TÃO4 (D). As setas indicam concentrações crescentes de sais. O maior conteúdo de alfa & # x02010helical é observado na presença de Na2TÃO4.

Estrutura da solução NMR do subdomínio RED

O espectro 2D [1 H, 15N] & # x02010HSQC com atribuições de sinal de NMR é relatado na Figura & # x200B Figura3. 3 As atribuições de ressonância foram realizadas conforme descrito na seção Materiais e métodos. Os números de resíduos mostrados na Figura & # x200B Figura 3 3 correspondem às posições na sequência de transposase SB original e # x02010 de comprimento total.7 A sequência de aminoácidos do subdomínio RED é mostrada na Figura & # x200B Figura 3 3 para referência. Os elementos da estrutura secundária do subdomínio RED foram identificados usando os softwares TALOS22 e CSI23. Ambos os métodos prevêem três & # x003b1 & # x02010helices (resíduos 67 & # x0201377, 84 & # x0201393 e 100 & # x02013109 de acordo com TALOS e 67 & # x0201374, 84 & # x0201393, 100 & # x02013109 de acordo com CSI) para o subdomínio VERMELHO (Fig. S1) ), de acordo com os experimentos de CD [Fig. & # x200B [Fig.2 2 (D)].

Estrutura da solução de NMR do subdomínio RED. (A) Atribuído [15N & # x02010 1 H] & # x02010HSQC espectro do subdomínio RED. O espectro foi registrado em 20 mM aquoso (5% D2O / 95% H2O) Tampão MES em pH 5,0 na presença de Na 650 mM2TÃO4. A sequência de aminoácidos do subdomínio RED, contendo os resíduos 63 & # x02013120 da sequência da transposase SB original, 7 é mostrada abaixo do espectro para referência. (B) Estrutura da solução de NMR do subdomínio RED. C & # x003b1 traços de 10 estruturas de energia mais baixas sobrepostas (esquerda) e a representação em quadrinhos da estrutura representativa de RED (direita) são mostrados. As alfa-hélices identificadas são rotuladas como H1, H2 e H3.

O conjunto de 10 estruturas de energia mínima sobrepostas que foram selecionadas para a análise final é mostrado na Figura & # x200B Figura 3 (B). 3 (B).Essas estruturas têm RMSDs das coordenadas de átomos de backbone C & # x003b1 para resíduos bem & # x02010 ordenados (isto é, resíduos compreendidos em três elementos de estrutura secundária) de 0,8 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.2 & # x000c5. As coordenadas para as 10 estruturas de energia mais baixa foram depositadas no Protein Data Bank sob o código de acesso pdb 5UNK. O ID de BMRB para esta entrada é 30239. Figura & # x200B A Figura 3 (B) 3 (B) também mostra uma estrutura de energia mais baixa representativa do subdomínio RED na representação em desenho animado à direita. A estrutura experimental do subdomínio RED mostra a presença de três & # x003b1 & # x02010helices. As hélices abrangem os resíduos R67 & # x02010I78 (hélice H1), A84 & # x02010T94 (hélice H2) e I100 & # x02010L112 (hélice H3), onde as hélices H1 e H2 estão dispostas quase paralelas entre si, e a hélice H3 dobra em cima delas . As hélices são ligeiramente mais longas do que o previsto por TALOS e CSI. O conteúdo total da hélice do subdomínio RED é & # x0223c48%. As hélices H1 e H2 são conectadas por uma volta de quatro resíduos (resíduos N79 & # x02010T83), com prolina P80 constituindo o segundo resíduo. A hélice H2 da hélice predita & # x02010turn & # x02010helix motif termina com um resíduo de glicina e está ligada à hélice H3 por um laço longo de seis & # x02010resíduo. Este loop não forma uma curva beta canônica compacta & # x02010, mas forma uma curva & # x02010 como uma conformação estendida. A estrutura calculada revela a presença de um motivo de capeamento C3 & # x02032 & # x02192C3 / C & # x02032G hélice H2 que é formado pelos resíduos L91 & # x02010EETGTK & # x02010V98 representando um padrão hxxx & # x02010Gpxh = # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009indifferent, G & # x02009 = & # x02009glycine e p & # x02009 = & # x02009resíduos polares) .24 C & # x003b2 shifts podem prever hélice capping e beta & # x02010 turn motifs estruturais em proteínas com alta precisão.25 No caso de o subdomínio RED, os deslocamentos químicos C & # x003b2 do trecho de resíduos entre L91 e V98 seguem o padrão esperado para alfa & # x02010helix capping motif. Os resíduos K97 & # x02010I100 estão em conformação estendida, levando à hélice H3.

A estrutura do subdomínio RED se assemelha às estruturas do subdomínio correspondente de transposases Tc1 / mariner intimamente relacionadas Mos1 e Tc3,15, 26, no entanto, apresenta hélices mais longas H2 e H3 e loops conectando as hélices (Fig. & # X200B (Fig. 4 ). 4). A hélice H2 no subdomínio RED abrange 11 resíduos, enquanto nas transposases Tc3 e Mos1 ela abrange 9 e 5 resíduos, respectivamente. A hélice H3 no subdomínio RED abrange 14 resíduos versus 12 resíduos em Tc3 e 11 resíduos na transposase Mos1. O loop que conecta as hélices H1 e H2 no subdomínio RED tem 5 resíduos de comprimento, enquanto nas transposases Tc3 e Mos1 tem apenas 3 e 2 resíduos, respectivamente. O loop que conecta as hélices H2 e H3 tem 6 resíduos de comprimento no subdomínio RED e apenas 4 resíduos de comprimento nas transposases Tc3 e Mos1. O alinhamento de sequência de acordo com a correspondência das três estruturas feito com PROMALS3D sequência múltipla e servidor de alinhamento de estrutura 27 reflete essas diferenças (Fig. & # X200B (Fig.4 4).

Alinhamento estrutural do subdomínio RED da transposase SB e C & # x02010 DNA terminal & # x02010 subdomínios de ligação de transposases Tc3 (código pdb 1U78 26) e Mos1 (código pdb 3HOS 15). Estruturas de proteínas foram sobrepostas e, em seguida, simplesmente deslocadas ao longo x (eixo horizontal. O alinhamento estrutural foi feito usando PROMALS3D sequência múltipla e servidor de alinhamento de estrutura.27 O RMSD sobre átomos de backbone C & # x003b1 entre o subdomínio RED e as estruturas de subdomínio Tc3 ou Mos1 correspondentes é 3,5 & # x000c5 e 3,7 & # x000c5, respectivamente. As três hélices alfa são rotuladas como H1, H2 e H3. O motivo de hélice & # x02010hélice de volta nos subdomínios Tc3 e Mos1 é formado pelas hélices H2 e H3. O alinhamento da sequência de aminoácidos de acordo com a correspondência das três estruturas mostra baixa similaridade de sequência de aminoácidos entre o subdomínio RED e os subdomínios correspondentes das transposases Tc3 e Mos1, e os únicos três resíduos em posições conservadas estão sublinhados. Os resíduos que formam hélices alfa são mostrados em vermelho. A posição das hélices no subdomínio RED também é indicada por retângulos vermelhos acima da sequência de aminoácidos.

O subdomínio RED que se liga ao DNA do transposon

Anteriormente, determinamos que o subdomínio RED, quando faz parte do domínio de ligação de & # x02010 DNA & # x02010, se liga ao sítio de ligação externo na repetição do terminal invertido do transposon SB, embora fracamente.17 No entanto, devido ao alargamento severo de essencialmente todos os sinais de NMR originados do subdomínio RED, o sítio de ligação do DNA & # x02010 não pôde ser determinado. Para localizar o sítio de ligação do DNA & # x02010 no subdomínio RED, investigamos a interação do subdomínio RED isolado com a sequência de DNA correspondente ao sítio de ligação externo localizado na repetição do terminal invertido esquerdo do DNA do transposon, Lo, monitorando as alterações de deslocamento químico no espectro RED [1 H, 15N] & # x02010HSQC na presença de concentrações crescentes de DNA. Esses experimentos foram realizados a 650 mM de Na2TÃO4, porque em menor concentração de sal muitos sinais originados de resíduos em hélices mostraram um alargamento significativo devido ao regime de troca conformacional intermediário a lento entre conformações dobradas e desdobradas, portanto, não eram observáveis ​​ou facilmente distinguíveis no espectro. A presença de sal 650 mM diminuiu parcialmente a contribuição eletrostática para a ligação, mas o sal & # x02010 componente não & # x02010 eletrostático independente, proveniente de efeitos de desidratação, interações de van der Waals e ligações de hidrogênio, não foi afetado.28 Pequenas mudanças foram observadas no [1 H & # x02010 15 N] & # x02010HSQC do subdomínio RED após a adição de até 1: 1 razão molar de Lo, consistente com a imagem obtida na análise anterior de que a interação entre o subdomínio RED e o DNA do transposon é fraco e dinâmico.17 Devido a pequenas mudanças espectrais, não é possível determinar um valor constante de dissociação para a interação RED & # x02010Lo. Figura & # x200B A Figura 5 (A) 5 (A) exemplifica as alterações de sinal causadas pela ligação à sequência Lo. Tanto o deslocamento químico quanto a intensidade de alguns sinais mudam, indicando que a ligação está no regime de troca intermediário & # x02010 lento caracterizado por deslocamento moderado e alargamento significativo dos sinais [1 H, 15N] & # x02010HSQC de sua posição não ligada. Ressonâncias de amidas que experimentam a maior mudança de deslocamento químico após a ligação ao DNA, experimentam o alargamento de linha mais extenso no espectro [1 H, 15N] & # x02010HSQC. O espectro completo é dado na Figura S2. Mudanças de deslocamento químico e perdas de intensidade de sinal foram observadas para amidas em toda a proteína. Os resíduos afetados pela presença de Lo são codificados por cor azul na estrutura do subdomínio RED [Fig. & # x200B [Fig.5 (B)]. 5 (B)]. No entanto, o efeito foi mais pronunciado para os resíduos agrupados em torno das hélices H3 e da alça conectando as hélices H3 e H2, em linha com as previsões de que a hélice H3 é o principal local para a interação com o DNA em uma variação da hélice & # x02010turn & # x02010 motivo da hélice .29, 30 Este resultado é consistente com a localização esperada do sítio de ligação do subdomínio RED com base na comparação com as estruturas de raio X & # x02010 conhecidas de transposases Tc3 e Mos1 resolvidas na forma ligada ao DNA & # x0201015, 26 e para a forma recentemente proposta modelo estrutural da transposase SB & # x02010DNA complex.14 Também é consistente com a localização do DNA & # x02010binding site no C & # x02010 domínio terminal de outros DNA bipartido & # x02010binding PAIRED domínios, aos quais o DNA & # x02010binding domínio da SB transposase mostra similaridade .31, 32, 33, 34 Além disso, a hélice H3 é anfipática com as cadeias laterais & # x02010 de resíduos polares carregados positivamente (S101, T102, K104, R105, Y108 e R109) protuberantes vindo da superfície, capaz de fazer contato com o DNA.

Ligação do subdomínio RED ao DNA. (A) Seção do espectro [15N, 1H] & # x02010HSQC do subdomínio RED puro (azul) e do subdomínio RED na presença de razão molar de 1: 0,5 (ciano) e 1: 1 (vermelho) de sequência de DNA correspondendo ao local de ligação da transposase externa no ITR esquerdo (Lo). Os espectros foram coletados em aquoso (5% D2O / 95% H2O) tampão MES 20 mM a pH 5,0 na presença de Na 650 mM2TÃO4. (B) A estrutura de desenho do subdomínio RED mostra resíduos afetados pela ligação à sequência Lo em azul. As hélices H2 e H3 e o ligante entre elas formando uma conformação semelhante a curva & # x02010 correspondem à hélice & # x02010 curva & # x02010 motivo de hélice identificado nas transposases relacionadas Tc3 e Mos1. (C) Superfícies eletrostáticas plotadas em uma estrutura representativa do subdomínio RED. O potencial eletrostático foi calculado usando o solucionador adaptativo de Poisson & # x02010Boltzmann (APBS) 52 e visualizado com PYMOL.51 As superfícies são coloridas por carga (vermelho é negativo, azul é positivo, branco não tem carga ou é hidrofóbico). A escala é mostrada sob as superfícies. O subdomínio RED é mostrado em duas orientações giradas em 180 & # x000b0 em torno de seu eixo vertical.

Alguns resíduos distantes da hélice H3, por exemplo, localizados na hélice H1, também apresentaram alterações com a adição de DNA. Para obter mais informações sobre as propriedades de ligação do DNA do subdomínio RED e # x02010, analisamos a superfície eletrostática do subdomínio RED. Figura & # x200B Figura 5 (C) 5 (C) mostra o potencial eletrostático mapeado na superfície do subdomínio RED em duas orientações, uma sendo semelhante à orientação na Figura & # x200B Figura 5 (B) 5 (B) e outra é girado 180 & # x000b0 em torno do eixo vertical. O subdomínio RED é uma molécula altamente carregada positivamente contendo 9 resíduos de arginina e 7 de lisina. Cinco desses resíduos estão localizados na hélice H3, quatro na hélice H1 e duas lisinas estão localizadas na hélice H2 com cadeias laterais & # x02010 orientadas para fora na direção da hélice H3. A superfície eletrostática mostra uma grande região carregada positivamente formada por resíduos nas hélices H3 e H2 e no terminal C & # x02010 consistente com esta região formando um sítio de ligação de DNA & # x02010. No entanto, há outra região carregada positivamente formada pela hélice H1 no lado oposto da molécula. Dado que a interação entre o subdomínio RED e o DNA é fraca, este patch de carga positiva também pode participar de interações transitórias entre o subdomínio RED, pelo menos isoladamente, e o DNA Lo. Isso seria consistente com a atividade de ligação não específica ao DNA & # x02010 & # x02010 do subdomínio RED observado anteriormente.9 Por conseguinte, uma série de razões para a mudança no deslocamento químico e intensidade para resíduos longe da hélice H3 são plausíveis. Em primeiro lugar, como a mudança química é altamente sensível a qualquer tipo de variação estrutural, é provável que esses resíduos sejam indiretamente afetados por possíveis mudanças conformacionais na proteína após a ligação ao DNA. Na verdade, as cadeias laterais & # x02010 de alguns desses resíduos são orientadas para o interior da proteína (por exemplo, D68, E69 e V76). Em segundo lugar, as interações transitórias com DNA através do segundo patch carregado positivamente formado pela hélice H1 também podem fazer uma contribuição levando a mudanças de sinal (por exemplo, R70, R74 e K75).


Discussão

Determinamos a estrutura da solução de apo p63-DBD usando espectroscopia de RMN (Fig. 1) e caracterizamos a interação com vários sítios de ligação de DNA (Figs 3 e 4) e o membro da família Bcl2 anti-apoptótico BclxL (Fig. 5). O p63-DBD adota uma estrutura quase idêntica à do p53-DBD (Fig. 2b). No entanto, existem diferenças na especificidade de ligação ao DNA e em sua estabilidade termodinâmica que tornam o p63 um alvo atraente para compreender a base estrutural da especificidade de ligação ao DNA e estabilidade da proteína entre a família de proteínas p53.

Apesar da disponibilidade de informações estruturais e dados de ligação ao DNA, a especificidade do gene alvo de p63 ainda não está clara. A transativação de genes alvo de p53 que regulam a parada do ciclo celular por p63 foi demonstrada por na Vivo Ensaios de ligação de DNA 58 e experimentos de ChIP com fibroblastos de embrião de camundongo que expressam E1A revelaram ligação de p63 a genes alvos de p53 pró-apoptóticos, bem como MDM2, cuja expressão leva à degradação do p53 59. Outro fator é a ocorrência de variantes truncadas de p63 sem seu domínio de transativação N-terminal (TA) (ΔNp63). Essas variantes adotam um papel repressor da transcrição 4 e são capazes de inibir a transcrição dos genes alvo p53. Além disso, p63 e p73 contêm um SAM 26 C-terminal e domínio regulador 25 que influenciam sua capacidade de transcrever genes alvo. Outra camada de complexidade é adicionada pela presença de 13 estados oligoméricos diferentes, onde o dímero parece ser a espécie inativa para a transcrição e o tetrâmero, a espécie ativa. A formação de tetrâmeros e a ativação de ligação ao DNA de p63 resultante são promovidas pela fosforilação 13.

Foi demonstrado que o nocaute de p63 e p73 não afeta a transcrição de genes que regulam a parada do ciclo celular, como p21 59. No entanto, p63 e p73 parecem ser necessários para a indução eficiente de genes dependentes de p53 pró-apoptóticos. Esses resultados indicam que os genes relacionados à apoptose são especificamente regulados dentro de toda a família p53. Por outro lado, o desenvolvimento epitelial mediado pelo p63 não é afetado pelo nocaute do p53. Nossos ensaios de ligação de DNA (Fig. 3) indicam interação de p53 e p63 com elementos de resposta de DNA envolvidos na parada do ciclo celular, apoptose e desenvolvimento em vários graus. Foi relatado anteriormente que a ligação do DNA do p53 depende do estabelecimento de uma ponte dupla de sal 41, uma característica específica do p53. Portanto, introduzimos uma ponte salina dupla em p63-DBD e analisamos a mudança na afinidade de ligação em comparação com o p63 de tipo selvagem. A suposição é que o p63-DBD capaz de formar uma ponte salina se liga a genes dependentes de p53 com maior afinidade, ao passo que genes menos dependentes de p53 mostrariam dependência mais fraca ou nenhuma dependência da presença da ponte salina dupla. De acordo com publicado na Vivo dados 59 a maior mudança na afinidade pode ser observada para p21 RE, confirmando um papel menos dominante do p63 na indução da parada do ciclo celular. Um local de consenso específico para p53 (con2 × 5) mostrou uma dependência semelhante da presença da ponte salina dupla. O envolvimento da ponte salina dupla na ligação cooperativa de DNA de alta afinidade também pode ser confirmado por estudos de perturbação de mudança química NMR com p53-DBD contra wt-p63-DBD (Fig. 4). Esses dados demonstram que o p53 evoluiu para a ligação de alta afinidade ao DNA e, portanto, precisa ser rigidamente regulado por um equilíbrio de degradação e produção de proteínas cuidadosamente equilibrado. Em contraste, a ligação ao Bax RE não é significativamente afetado pela ponte salina dupla, confirmando que os genes pró-apoptóticos podem ser menos específicos para p53. O RE dependente de p63 de Jag-1 48, um gene envolvido na diferenciação e proliferação celular, mostra um padrão de afinidade independente de ponte salina semelhante como Bax. Estudos recentes mostraram que o p63 é menos sujeito à degradação pela via 60 da ubiquitina-proteassoma, devido à menor afinidade entre o Mdm2 e o p63. É, portanto, provável que a concentração celular de p63 seja maior do que a de p53, permitindo que p63 se ligue eficientemente a elementos de DNA e até mesmo compita com p53.

A importância do p63 na indução da apoptose é sublinhada pela sua interação com a proteína anti-apoptótica BclxL (Fig. 5). A superfície de interação entre ambas as proteínas consiste na interface de ligação de DNA carregada positivamente em p53 / p63-DBD (Fig. 3 suplementar) e uma área de superfície carregada negativamente em BclxL 50,57. Como mostrado anteriormente para p53, a interação direta com proteínas Bcl2 induz apoptose mitocondrial rápida 49,50,54,55,56 de uma maneira independente da transcrição. A fim de cumprir seu papel na proteção do desenvolvimento do membro e epitelial, o p63 pode utilizar as vias de apoptose direta e indireta. O potencial apoptótico de p63 também está de acordo com seu papel na proteção da linha germinativa feminina e seu forte padrão de expressão em oócitos 13, onde está envolvido na morte de oócitos induzida por danos no DNA, independente do p53.

Comparado com o p53, o p63-DBD mostra uma estabilidade térmica aumentada em mais de 20 ° C (Fig. 2c). Uma variedade de mutações pontuais de p53-DBD relacionadas ao câncer levam a uma desestabilização significativa da proteína já frágil, proibindo o dobramento adequado e a transativação do gene. A base para a baixa estabilidade do p53-DBD é o empacotamento desfavorável de seu núcleo hidrofóbico, causado por cadeias laterais polares isoladas e cavidades internas (Fig. 2f). Tem havido enormes esforços para projetar variantes de p53-DBD com estabilidade aumentada para estudos estruturais 31,32,33,43,44 que podem eventualmente ser usados ​​para abordagens terapêuticas genéticas 61. Para um desses estudos, nossa estrutura de solução de p63-DBD serviu como um modelo para o projeto semirracional de variantes de p53 44. Além disso, pequenas moléculas que estabilizam a conformação ativa foram relatadas para o p53 34,35. A qualidade do empacotamento hidrofóbico é significativamente melhorada em p63-DBD (Fig. 2e) e variantes de p53 otimizadas, consequentemente, mostram o mesmo tipo de aminoácido em posições críticas como encontrado em p63 ou ortólogos de p53 mais estáveis. Devido à sua alta estabilidade termodinâmica, a atividade de ligação ao DNA do p63 tem menos probabilidade de ser diminuída por mutações de ponto único em seu núcleo de proteína, como mostrado para o caso do p53. Além disso, nenhuma mutação desestabilizadora em p63-DBD foi encontrada em tecidos cancerosos 19. Portanto, foi sugerido que o p63 atua como um oncogene e não como um supressor de tumor. A forma oncogênica de p63 é a variante ΔN sem seu domínio de transativação N-terminal. Esta variante ainda pode se ligar a elementos de DNA e competir com p53 e p63 de comprimento total para suprimir a apoptose 62. Mutações em p63 foram identificadas em doenças do desenvolvimento, como EEC 63 e ADULT 64, afetando a capacidade de ligação ao DNA e não a estabilidade da proteína. Até agora, não está claro quais fatores governam a especificidade de ligação e as funções celulares dos membros individuais da família p53. Embora muitas informações estejam disponíveis para o p53, o p63 e, em particular, o p73, são muito menos explorados. Futuros estudos estruturais e funcionais são necessários para esclarecer essas questões em aberto.


Ferramentas para popularizar MD

A preparação para a simulação implica o seguimento de uma série de operações que estão longe de ser apenas rotineiras. Primeiro, a estrutura inicial vem do experimento. Os problemas esperados incluem regiões ou resíduos não estruturados ou ausentes, ligantes não padrão ou mesmo estruturas que apresentam erros na interpretação de dados experimentais. Quando um único sistema é simulado, todo o esforço na preparação do sistema vale a pena, pois garante a qualidade do resultado da simulação. Essa configuração geralmente é feita manualmente, com um considerável esforço humano. Um procedimento padrão para configurar um sistema implica uma série de procedimentos bem conhecidos: fixação de erros de estrutura, ionização de aminoácidos tituláveis, adição de moléculas de água estruturais, contra-íons e solvente e minimização de energia e equilíbrio do sistema na temperatura desejada. Um modelador especialista normalmente executa esses procedimentos usando um conjunto de programas auxiliares. Esse especialista possui o conhecimento necessário para superar problemas específicos que possam surgir. Por exemplo, o fluxo de trabalho usado no projeto MoDEL84 foi programado para ser executado automaticamente, mas uma fração não desprezível de mais de 1.500 proteínas preparadas falhou em algum ponto do processo. Com este cenário, para iniciantes na simulação de MD, até mesmo uma configuração de sistema único pode representar um problema inacessível. Pior ainda, os usuários não especialistas tendem a usar cegamente os procedimentos padrão que levam facilmente a trajetórias artificiais, que são difíceis de distinguir das corretas. Isso contribui fortemente para a falta de popularidade das simulações biomoleculares entre a bioinformática ou a comunidade bioquímica. As simulações de DM foram restritas aos grupos de pesquisa com a experiência necessária. Resolver este problema requer uma configuração automática do sistema de simulação. Estaríamos procurando por uma caixa preta inteligente para os não especialistas, mas também por um conjunto de software robusto que pode ser responsável por um grande conjunto de estruturas de proteínas não relacionadas. Todos os principais códigos MD56 e # x0201359 vêm com um conjunto de programas que o acompanham, que realizam a maioria das etapas da preparação. Além disso, uma série de iniciativas, combinando essas ferramentas com uma interface amigável, surgiram para resolver esse problema. CHARMM-Gui85 e CHARMMing, 86 para CHARMM, ou Guimacs, 87 Gromita, 88 e jSimMacs, 89 para GROMACS, fornecem funcionalidade de configuração automática. VMD90 fornece vários plug-ins que permitem lançar simulações com NAMD. A maioria dessas ferramentas proporciona um ambiente amigável para a preparação de sistemas para simulação sem a necessidade de um conhecimento profundo das operações subjacentes, facilitando assim o acesso ao campo para os iniciantes. Infelizmente, devido à falta de um padrão para a representação de dados de simulação molecular, a maioria dos aplicativos auxiliares são restritos a um único pacote de MD e os dados não são facilmente intercambiáveis. Além disso, embora a maioria use algum tipo de linguagem de script embutida, a automação de procedimentos não é uma tarefa simples. As lições aprendidas na preparação da base de dados MoDEL, pelo nosso grupo, levaram à geração de um novo conjunto de ferramentas, MDMoby e MDWeb91, que tentam cobrir os dois aspectos do problema. Por um lado, o MDMoby fornece um conjunto completo de serviços da web, cobrindo todas as operações de configuração, simulação e análise. A natureza modular de tal coleção de serviços da web permite incorporá-los como um kit de ferramentas para o projeto de protocolos de configuração complexos e para executá-los programaticamente. Por sua vez, o MDWeb, uma interface baseada na web, fornece uma bancada amigável onde o usuário pode verificar a qualidade da estrutura de entrada, ajustar seus próprios protocolos de configuração ou usar uma coleção de protocolos predefinidos.


CONCLUSÕES / PERSPECTIVA

Apesar dos enormes avanços no campo da biologia estrutural do motivo i nos últimos anos, muitos aspectos ainda requerem mais investigação. Os presentes dados sugerem fortemente que os motivos i se formam transitoriamente na célula. No entanto, mais na Vivo estudos são definitivamente necessários para confirmar a formação do motivo i em diferentes fases do ciclo celular. Além disso, pesquisas adicionais sobre o reconhecimento do motivo i por proteínas e pequenos ligantes em vitro e na Vivo são essenciais para elucidar o papel dos motivos i em diferentes processos biológicos. Devido à natureza dinâmica dos motivos-i, esses estudos são dificultados, particularmente na Vivo, pela dificuldade de discriminar entre o reconhecimento de sequências ricas em C ou o reconhecimento da estrutura real do motivo i. As construções de motivos i sintéticos estabilizados por modificações químicas (por exemplo, 2′F-ANA) podem facilitar essas investigações por "congelamento" dessas sequências intrinsecamente dinâmicas na conformação do motivo i potencialmente ativo. Motivos i quimicamente modificados, estáveis ​​em uma ampla gama de condições em comparação com suas contrapartes não modificadas, também podem ser usados ​​para experimentos de triagem para identificar novas proteínas e pequenos ligantes que reconhecem especificamente esta estrutura.

Ainda há muito a saber sobre estruturas i-motif. Em comparação com G4s, existem apenas algumas estruturas de motivo i determinadas por NMR ou métodos cristalográficos. No momento, não é possível prever a estabilidade de um motivo i com base em sua sequência. Portanto, mais informações estruturais são necessárias para compreender completamente o efeito das interações de cobertura e os loops que conectam os tratos C na estabilidade do motivo i. Apesar das descobertas recentes de ligantes do motivo i, o número de ligantes específicos do motivo i é muito limitado em comparação com os ligantes G4. Nenhuma estrutura tridimensional de um complexo i-motivo / ligante foi determinada ainda. Esta será uma grande conquista para o desenvolvimento de drogas potenciais baseadas no reconhecimento do motivo i.

Desde os primeiros anos do século, vários aspectos do G4s ganharam considerável interesse em pesquisas, principalmente devido à sua estabilidade termodinâmica em condições fisiológicas. No entanto, a estrutura do motivo i tem sido o patinho feio da família das estruturas de DNA não canônicas por muitos anos. Os resultados recentes lançaram uma nova luz sobre o campo do i-motif, que florescerá nos próximos anos.


Parte 2: Dentro de uma máquina de emenda de RNA

00: 00: 07.19 Sou Anna Marie Pyle, da Universidade de Yale
00: 00: 09.27 e hoje vou falar sobre a estrutura
00: 00: 12.20 e a função de uma máquina de splicing de RNA,
00: 00: 15.10 que é uma molécula de RNA que pode cortar cataliticamente
00: 00: 18.15 e religar pedaços de RNA, costurando-os juntos.
00: 00: 24.28 A máquina na qual vou me concentrar hoje é chamada de intron de auto-emenda do Grupo II
00: 00: 29.03 e esta molécula é uma ribozima muito grande, ou RNA catalítico,
00: 00: 33.19 que pode catalisar seu próprio splicing e sua própria transposição,
00: 00: 37.02, o que significa voltar aos locais de união anteriores.
00: 00: 41.09 E estas são enzimas muito, muito grandes
00: 00: 44.01 e estão entre as maiores ribozimas da natureza.
00: 00: 47,27 E como você pode ver aqui,
00: 00: 49,09 esta é a reação que eles catalisam - ela passa por duas etapas.
00: 00: 52.21 Na primeira etapa, o íntron se dobra em uma estrutura
00: 00: 56.11 que pode catalisar a reação de splicing,
00: 00: 59.18 que é mediado pela água,
00: 01: 01.12 ou o grupo 2 'hidroxil (2'-OH) de uma adenosina dentro do íntron.
00: 01: 05.15 Após essa etapa, você obtém um intermediário de laço e,
00: 01: 09.00 na segunda etapa de emenda,
00: 01: 10.16 o grupo 3'-OH do site de splice 5 'ataca novamente,
00: 01: 14.22 liberando um íntron lariat e exons ligados.
00: 01: 19.07 Isso deve parecer familiar para você
00: 01: 20.13 porque é o mesmo tipo de reação que é catalisada
00: 01: 23,12 por seu spliceossomo nuclear,
00: 01: 25.06 que é a máquina de emenda importante para processar todos os nossos RNAs.
00: 01: 30.14 Para colocar isso em perspectiva,
00: 01: 32.10 perceber que a maioria de seus pré-mRNAs, ou mensagens precursoras,
00: 01: 37.15 tem até 10 íntrons e às vezes mais.
00: 01: 40.29 E estes têm que ser removidos através da função do seu spliceossomo.
00: 01: 44,16 Portanto, é muito importante que entendamos a especificidade
00: 01: 47.02 e o mecanismo dessa reação.
00: 01: 50.02 Como sistema modelo,
00: 01: 50.25 Concentrei-me no sistema de auto-união de intrões do Grupo II.
00: 01: 55.03 A diferença entre esses sistemas é que a estrutura dobrada
00: 01: 58.07 do próprio íntron catalisa essa reação
00: 02: 01,25 na ausência de quaisquer proteínas,
00: 02: 03.25 enquanto o spliceosome requer centenas de proteínas
00: 02: 07.23 e um conjunto de moléculas de RNA altamente conservadas
00: 02: 09,28 para catalisar a mesma reação.
00: 02: 12.08 São sistemas paralelos úteis para compreender a mecânica da emenda.
00: 02: 19,21 Então, vamos nos concentrar um pouco mais na aparência dos íntrons do Grupo II:
00: 02: 23.02 sua arquitetura de domínio e estrutura secundária é composta por seis radicais ou domínios
00: 02: 27,27 que irradiam de uma roda central como esta.
00: 02: 31.13 Domínio 1, ou o maior domínio,
00: 02: 33.14 é sempre transcrito e dobrado primeiro
00: 02: 36,23 e é uma espécie de domínio de andaime no qual todos os outros domínios se encaixam.
00: 02: 40.28 Ele também contém sequências para reconhecimento de alvos
00: 02: 44.08 que vai atacar e fender,
00: 02: 46.02 especialmente seu próprio exon 5 '.
00: 02: 49,10 Os outros domínios não são críticos para a catálise,
00: 02: 52.03 mas a parte mais importante de um intrão do Grupo II
00: 02: 54.20 é este pequeno loop em gancho aqui chamado Domínio 5.
00: 02: 58.16 É a única parte de um intron do Grupo II que é
00: 03: 00.29 quase invariante entre as diferentes espécies
00: 03: 03.25 e isso é interessante porque os íntrons do Grupo II são moléculas enormes.
00: 03: 07.20 Eles têm 400-1000 nucleotídeos de tamanho
00: 03: 10,23 e é irônico que apenas este 34 nucleotídeo um pouco aqui
00: 03: 14.20 é seu recurso mais conservado.
00: 03: 17.16 Outra parte importante de um intron do Grupo II é o Domínio 6,
00: 03: 20.12 e este é o domínio que contém a adenosina
00: 03: 22.28 que contém o nucleófilo para a primeira etapa de splicing.
00: 03: 26.15 Muitos íntrons do Grupo II, no entanto, usam água como o nucleófilo para a primeira etapa.
00: 03: 31,11 Portanto, esse é o plano organizacional básico para um intron do Grupo II.
00: 03: 36.03 Qual é o mecanismo de reação deles?
00: 03: 38.03 Bem, eles catalisam uma reação SN2 muito simples,
00: 03: 41.11 que é um ataque nucleofílico em linha,
00: 03: 43.18 em que um álcool, que é o grupo 2'-OH em
00: 03: 48.23 outra ribose, ou água,
00: 03: 50,27 ataca em linha neste fosfato,
00: 03: 53.05 dando-lhe um intermediário trigonal bipiramidal
00: 03: 57.07 e a liberação deste fosfato e grupo 3'-OH
00: 04: 01.06 com inversão de configuração.
00: 04: 03.29 Usando técnicas de biologia química,
00: 04: 05.27 Joe Piccirilli descobriu que esta é uma reação
00: 04: 09.28 que é catalisado por íons metálicos no núcleo do intron do Grupo II.
00: 04: 14,26 E então os íntrons do Grupo II, como muitas ribozimas,
00: 04: 17.07, mas não todos eles,
00: 04: 17.22 é uma metaloenzima e usa metais da seguinte maneira.
00: 04: 23.25 Ele mostrou que o magnésio coordena o grupo de saída
00: 04: 26,26 e o ​​nucleófilo
00: 04: 27,28 para estabilizar o acúmulo de carga negativa
00: 04: 30,23 neste estado de transição.
00: 04: 33,03 Portanto, é uma reação relativamente simples
00: 04: 34,27 e é quase a mesma reação na primeira e na segunda etapa
00: 04: 37,26 de emenda.
00: 04: 42.10 Então, sabíamos o plano corporal básico desses RNAs
00: 04: 44.20 e sabíamos que tipo de reação eles estavam catalisando,
00: 04: 47.12 mas não entendíamos realmente o mecanismo preciso da catálise química.
00: 04: 51.19 E também sabíamos que este RNA era provável
00: 04: 53.22 para ter todos os tipos de motivos estruturais terciários interessantes.
00: 04: 57,24 Então, se quiséssemos entender a arquitetura desta molécula
00: 05: 00.27 e seu mecanismo preciso,
00: 05: 03.00 precisávamos de uma estrutura de cristal de alta resolução.
00: 05: 06.18 Então, basicamente, o que precisávamos fazer era ir da estrutura secundária,
00: 05: 10.25 ou roadkill map da molécula, como gosto de chamá-lo,
00: 05: 14.06 para a estrutura terciária.
00: 05: 16.12 E vou contar um pouco sobre essa jornada
00: 05: 18.15 e como começamos a visualizar o núcleo de uma máquina de emenda.
00: 05: 25.01 Tudo começou com a identificação de um intrão do Grupo II
00: 05: 28.02 que cristalizaria prontamente.
00: 05: 29.28 E procuramos por esta molécula por cerca de 10 anos,
00: 05: 32.24 olhando para muitos, muitos tipos diferentes de íntrons do Grupo II
00: 05: 35.08 e tentando encontrar um que fosse excepcionalmente estável e cristalizável.
00: 05: 39.09 Finalmente encontramos um que cristalizou prontamente
00: 05: 42,29 na sequência da eubacterium Oceanobacillus iheyensis.
00: 05: 47.07 E quando transcrevemos esta molécula,
00: 05: 49.01 descobrimos que ele se juntou e se estabilizou
00: 05: 51.20 com íons fisiológicos de magnésio e temperaturas muito baixas.
00: 05: 56.08 E por isso era um candidato promissor.
00: 05: 59.27 Em seguida, passamos a fazer cerca de 120 construções diferentes desta molécula
00: 06: 04.20 para tentar embalá-lo
00: 06: 07.11 e faça lindos cristais
00: 06: 09.01 a partir da qual poderíamos resolver a estrutura.
00: 06: 12,07 E o número 87, de todas essas construções,
00: 06: 14,27 finalmente cristalizou para a resolução de 3.1 Angstrom,
00: 06: 18.11 que está no intervalo alvo para resolver a estrutura.
00: 06: 21.04 E só para mostrar como modificamos esta molécula
00: 06: 23,23 para melhorar a cristalização gradualmente,
00: 06: 25.17 você deve saber que modificamos os comprimentos de todas essas hastes diferentes,
00: 06: 29.00 a composição do loop,
00: 06: 30.25 mudou muitas, muitas coisas diferentes
00: 06: 32.12 para otimizar o empacotamento e a cristalização da molécula.
00: 06: 37.10 Então, finalmente, ao atingir esse nível de qualidade do cristal,
00: 06: 43.03 fomos capazes de resolver sua estrutura usando cristalografia de raios-X.
00: 06: 47.07 E o motivo pelo qual gosto de mostrar esta figura,
00: 06: 49.07 que ilustra a densidade de elétrons do íntron Oceanobacillus,
00: 06: 53,28 é para lhe mostrar isso,
00: 06: 55.03 quando você, pela primeira vez, vislumbrar a densidade do elétron,
00: 06: 58.09 ou a saída do experimento cristalográfico,
00: 07: 00.22 você pode ver as belas hélices que são aparentes
00: 07: 04.06 e você pode ver o plano geral da molécula muito bem
00: 07: 07,22 no caso de RNA.
00: 07: 09.07 Nas proteínas, muitas vezes é mais difícil de ver
00: 07: 11.19 as características estruturais secundárias do que em um RNA.
00: 07: 16.18 Portanto, esta foi a ilustração do nosso primeiro vislumbre desta molécula.
00: 07: 21.14 Quando finalmente fomos capazes de modelar todos os nucleotídeos neste mapa,
00: 07: 26.08 conseguimos resolver basicamente a estrutura completa deste intrão.
00: 07: 32.00 E você pode ver logo de cara que esta é uma forma extraordinariamente globular.
00: 07: 37.01 Esta não é uma simples dupla hélice
00: 07: 38.14 e não é uma série desordenada de fios,
00: 07: 40.26 é uma molécula globular muito compacta,
00: 07: 43.09 tanto quanto você pensaria sobre uma proteína globular.
00: 07: 46.03 E há uma série de características arquitetônicas que vale a pena observar
00: 07: 49.10 e vou me concentrar nisso em um momento.
00: 07: 51,24 Mas você pode ver que há uma espécie de andaime ao longo do topo aqui,
00: 07: 56.13 e cria uma cavidade na qual o sítio ativo se insere.
00: 08: 00.26 O site ativo é este duplex vermelho,
00: 08: 03.26 e esse é o Domínio 5 sobre o qual falei antes.
00: 08: 06.27 O RNA muito, muito altamente conservado
00: 08: 09.06 que sabemos há algum tempo é provavelmente o site ativo.
00: 08: 12.21 E, curiosamente, essas hélices que projetam as pontas aqui,
00: 08: 18.16 estes geralmente contêm espaços nos quais os íntrons do Grupo II podem codificar
00: 08: 21.28 quadros de leitura abertos para proteínas que são transportadas dentro da própria sequência de íntron.
00: 08: 27.00 E é interessante porque você pode ver que se este RNA fosse muito maior
00: 08: 31.19 se estenderia e não atrapalharia
00: 08: 34.04 o local ativo da ribozima conforme está dobrado aqui.
00: 08: 42.17 Então, ao olhar cuidadosamente para esta molécula,
00: 08: 44.23 fomos capazes de aprender muitas coisas,
00: 08: 46.09 e o primeiro tipo de coisa que vou falar sobre
00: 08: 49.05 é como nos informou sobre as interações terciárias
00: 08: 52.08 e características estruturais terciárias no RNA.
00: 08: 54.26 Muitos novos conceitos foram revelados por esta molécula
00: 08: 57.11 e a maioria deles estava dentro do Domínio 1 do intron.
00: 09: 01.20 Lembre-se de que eu disse que aquele domínio mais 5 'de um íntron do Grupo II
00: 09: 05.04 dobra primeiro e dobra autonomamente
00: 09: 07.16 em uma estrutura terciária específica.
00: 09: 10.14 Dentro da estrutura do intron do Grupo II,
00: 09: 12,22 podemos ver isso aqui.
00: 09: 14,24 O resto do intron eu esmaeci em cinza
00: 09: 17.04 para que você possa se concentrar no Domínio 1 em todas essas cores.
00: 09: 22.11 Neste domínio existem vários motivos muito interessantes
00: 09: 24.11 e vou mostrar alguns deles.
00: 09: 27.25 Por exemplo, dois deles que gosto de focar são mostrados aqui.
00: 09: 32.09 E para mostrar onde eles estão na estrutura,
00: 09: 35.07 e esta região aqui na estrutura secundária é uma junção de cinco vias,
00: 09: 38.25 que, como você pode imaginar,
00: 09: 40.01 tem que adotar uma arquitetura bastante complexa para todas essas hélices
00: 09: 44.03 para apontar na direção certa e para a formação da dobra terciária.
00: 09: 48.02 Então, deixe-me mostrar esta junção de cinco vias no espaço tridimensional.
00: 09: 52.11 Essa é essa estrutura aqui.
00: 09: 55.00 É um conjunto notável de interações terciárias
00: 09: 57.16 e motivos concatenados.
00: 10: 00.18 O meu favorito, aqui em cima, é chamado de motivo T-loop,
00: 10: 03.23 e o que você vê é que este azul vira aqui
00: 10: 07.09 é uma reminiscência de um motivo que vemos frequentemente em estruturas,
00: 10: 11.21 chamado GNRA tetraloop,
00: 10: 15,21 mas é quase como se contivesse um buraco:
00: 10: 18.01 falta uma base nesta posição
00: 10: 20.07 e é preenchido por uma adenosina que vem
00: 10: 23.00 desta porção cinza da molécula.
00: 10: 25.02 Então, muito desse RNA é mantido unido da mesma maneira
00: 10: 28.16 uma mesa antiquada teria sido construída,
00: 10: 30,25 com pinos encaixando em ranhuras e segurando juntos
00: 10: 34.00 todo o andaime dessa forma,
00: 10: 35.27 e estabilizado principalmente por interações de empilhamento de base.
00: 10: 40.04 E você pode ver mais das interações de empilhamento conservadas
00: 10: 43.14 e redes que são formadas nesta posição aqui.
00: 10: 47.16 Outro tipo de parte favorita da molécula para mim é chamada de âncora Z.
00: 10: 52.01 E na estrutura secundária,
00: 10: 54.08 podemos ver que este é o mecanismo
00: 10: 57.03 pelo qual a hélice verde torna-se, na verdade, perfeitamente paralela
00: 11: 02.09 com a hélice laranja, aqui, como você pode ver nesta estrutura.
00: 11: 05.18 Portanto, essas duas hélices precisam ficar lado a lado.
00: 11: 09.00 Como isso funciona?
00: 11: 10.24 Dois loops dentro deles meio que se fundem da seguinte maneira.
00: 11: 14,25 Então aqui está a hélice laranja, aqui está parte da hélice verde,
00: 11: 19.01 e o que ocorre quando a hélice laranja surge,
00: 11: 22.09 você vê que seus pares de bases normais aqui,
00: 11: 25.20 e, em seguida, uma das bases vira
00: 11: 27.29 e em vez de formar um par de bases com outro fio laranja,
00: 11: 31.06 forma um par de bases com o fio verde.
00: 11: 34.00 Seu próximo vizinho chega e forma um par de base
00: 11: 36,24 com outro fio de laranja,
00: 11: 38.14 e, em seguida, a próxima base vira mais uma vez,
00: 11: 41.14 formando este zigue-zague de conexões entre bases e dois fios,
00: 11: 46,02 em vez de um único fio.
00: 11: 49.03 Então, essa estrutura de três fios é uma maneira muito interessante
00: 11: 51.27 que os RNAs podem diversificar o reconhecimento de uma fita central.
00: 11: 59.09 Outro tipo de conceito para as porcas e parafusos
00: 12: 01.29 para juntar o RNA que foi revelado
00: 12: 04.08 e exemplificado pelo intron do Grupo II
00: 12: 09.11 é o motivo do zíper ribose.
00: 12: 11.03 Isso foi descrito pela primeira vez por Cate e Doudna em 1996
00: 12: 14.09 em uma das primeiras estruturas cristalográficas de alta resolução
00: 12: 17,16 de uma molécula de RNA complexa.
00: 12: 20.16 E o que eles mostraram é este conceito importante:
00: 12: 24.11 que o grupo 2'-OH do açúcar ribose é muito pegajoso
00: 12: 27.07 e pode formar ligações de hidrogênio bifurcadas
00: 12: 29.28 que pode unir fios de RNA.
00: 12: 32,23 Então, se você tem uma fita de RNA aqui,
00: 12: 34.25 e uma fita de RNA aqui,
00: 12: 36.19 eles podem vir juntos
00: 12: 39.06 por interdigitação de seus grupos 2'-OH.
00: 12: 42.23 E isso é exatamente o que vemos em muitos locais dentro do intron do Grupo II.
00: 12: 47.05 Especificamente, aqui em cima,
00: 12: 49.16 há interação de laço de beijo de longo alcance chamada alfa-alfa ',
00: 12: 53.25 e estou mostrando esses pares de bases nesta representação aqui,
00: 12: 58.15 no final dessa interação,
00: 13: 00.07 as fitas de RNA ficam muito, muito próximas umas das outras, como você pode ver aqui.
00: 13: 04.19 E quando eles fazem isso,
00: 13: 05.21 eles fecham o zíper e as riboses e os grupos 2'-OH formam esta rede
00: 13: 11.20 que serve para colar todo o conjunto.
00: 13: 18.21 Então, falamos sobre as interações terciárias
00: 13: 20.25 que foram revelados por esta estrutura complexa.
00: 13: 23.14 Agora quero falar um pouco mais sobre o que está acontecendo
00: 13: 25,24 no sítio ativo do intron
00: 13: 28.02 e como catalisa a química.
00: 13: 30.29 Então, uma das coisas que me intrigou por muito tempo
00: 13: 33.00 quando eu estava olhando para a estrutura secundária
00: 13: 36.13 e as características conservacionais do íntron do Grupo II foram que,
00: 13: 39.11 embora o Domínio 5 fosse altamente conservado,
00: 13: 42.16 havia um nível de conservação ímpar e alto
00: 13: 45.10 nesta junção entre os Domínios 2 e 3.
00: 13: 48.24 E eu me perguntei, por que esses poucos nucleotídeos nessa junção
00: 13: 52.16 tão conservado quanto o Domínio 5.
00: 13: 55.15 E a resposta veio da estrutura, que revelou
00: 13: 57.01 que a razão pela qual eles são conservados no mesmo nível
00: 13: 59,29 é que eles fazem parte da mesma entidade estrutural.
00: 14: 03.12 Você pode ver que essa junção está chegando
00: 14: 05.08 e ligando na ranhura principal dessa hélice vermelha.
00: 14: 10,05 De perto, é algo assim:
00: 14: 12.09 forma uma bela tripla hélice,
00: 14: 14,17, portanto, esses nucleotídeos de junção vêm em
00: 14: 18.01 e formam ligações de hidrogênio com a borda do sulco principal
00: 14: 21.17 da haste inferior do Domínio 5
00: 14: 24.05 e outro é formado a partir de outro setor do Domínio 5.
00: 14: 30.04 Então, esta hélice tripla,
00: 14: 32.28 junto com uma torção acentuada na estrutura do RNA nesta posição,
00: 14: 37.14 criar uma plataforma de íons de metal muito forte dentro do núcleo do íntron do Grupo II.
00: 14: 43.15 E a razão disso estar acontecendo é que você pode imaginar aqui,
00: 14: 46.27 que há muitos, muitos fosfatos que estão se juntando
00: 14: 50.02 em um espaço muito, muito pequeno,
00: 14: 51.24 então o potencial eletrostático nesta região da molécula
00: 14: 55.02 está se tornando extremo
00: 14: 56.28 e está se tornando muito, muito propício
00: 14: 58.23 à ligação de íons metálicos em pontos específicos.
00: 15: 02.00 E de fato você vê
00: 15: 03.14 que dois cátions divalentes se ligam nesta posição
00: 15: 06.17 com exatamente 3,9 Angstroms de diferença.
00: 15: 10.13 E isso geralmente é uma assinatura para enzimas
00: 15: 14.01 que catalisa a clivagem da ligação da ribose ou desoxirribose
00: 15: 18.14 através de um mecanismo de íons de metal de dois.
00: 15: 23,12 Então, por meio desse trabalho e do trabalho adicional que fizemos,
00: 15: 26.03 descobrimos que os metais 1 e 2 nessas posições
00: 15: 30.01 são de fato os íons de metal catalítico necessários para o splicing,
00: 15: 33.26, tal como Joe Piccirilli previra a partir de experiências de biologia química.
00: 15: 37.29 E eles estão posicionados bem sobre a ligação tesoura
00: 15: 40.13 para clivar essa ligação em um substrato alvo.
00: 15: 45.10 Então, isso foi muito satisfatório porque estava claro
00: 15: 47.07 que tínhamos uma metaloenzima que era semelhante em alguns aspectos a outras enzimas
00: 15: 51.28 e ainda sabíamos que esta não era toda a história.
00: 15: 55.05 E isso porque, na resolução cristalográfica
00: 15: 59.01 que estávamos usando para estudar esta molécula,
00: 16: 01.02 vimos densidade de elétrons adicional que era consistente com outros íons de metal.
00: 16: 05.21 Mas os dados não eram bons o suficiente para interpretar de forma inequívoca a posição deles.
00: 16: 09.22 Então, trabalhamos mais nisso,
00: 16: 11.26 aumentando a resolução e usando espalhamento anômalo,
00: 16: 14.15 que é uma ferramenta para fixar a posição dos íons de metal.
00: 16: 19.25 Especificamente, quando melhoramos a resolução de nossos cristais,
00: 16: 24.07 vimos que era muito provável que houvesse íons de metal
00: 16: 27,06 também nesta posição e nesta posição.
00: 16: 30.18 E devido à forma como o RNA circundante estava interagindo com eles,
00: 16: 34.03 era muito provável que fossem íons de potássio.
00: 16: 37.09 Então, isso foi surpreendente para nós,
00: 16: 38.26 que um cátion monovalente simples poderia aparecer
00: 16: 41.10 por estar desempenhando um papel tão importante no site ativo.
00: 16: 45.02 Para realmente fazer uma declaração forte sobre isso,
00: 16: 46.26 tivemos que identificar inequivocamente a posição deles,
00: 16: 49.21 e isso foi feito substituindo-os por um íon pesado
00: 16: 52.26 que difrata os raios X excepcionalmente bem
00: 16: 56.20 e isso é uma boa imitação do potássio.
00: 16: 58,28 Então, resolvemos mais 14 estruturas de cristal
00: 17: 02.08 do íntron em todas essas diferentes combinações de metais.
00: 17: 06.09 E, em particular, vou chamar a sua atenção para esta condição,
00: 17: 09.01 em que o potássio foi substituído por tálio
00: 17: 12.18 e o magnésio foi mantido o mesmo.
00: 17: 15.06 E nesta estrutura,
00: 17: 16.16 você pode ver de um mapa de diferença
00: 17: 18.16 que o tálio está ocupando as posições exatas
00: 17: 22.23 que tínhamos hipotetizado eram ocupados por potássio.
00: 17: 25.25 E por causa de sua semelhança no raio iônico e função
00: 17: 29,23 e também a semelhança com dados de rubídio paralelo,
00: 17: 32.23 que faz a mesma coisa,
00: 17: 34.16 ficamos confiantes de que havíamos eliminado o potássio
00: 17: 37.09 como um componente importante do site ativo.
00: 17: 43.00 Portanto, neste conjunto particular de estruturas,
00: 17: 46.00 estávamos olhando para o intron livre,
00: 17: 48.05 sem qualquer substrato ligado,
00: 17: 50.06 com resolução razoável e boa.
00: 17: 52.09 E pudemos ver neste caso a seguinte imagem:
00: 17: 55.08 pudemos ver que havia dois íons de metal divalentes
00: 18: 00.16 (na ausência de um substrato, eles foram coordenados com água)
00: 18: 01.14 e estava claro que havia potássios que estavam muito, muito próximos deles.
00: 18: 05.18 E chamamos os próximos de K1 e K2.
00: 18: 09.12 Uma inspeção detalhada revelou que K1 é quase como uma pedra angular
00: 18: 13.08 para a formação do sítio Metal 2 (M2).
00: 18: 16.03 Então, este íon de metal catalítico, que é absolutamente necessário para a química,
00: 18: 19.20 é mantido no lugar pelo arranjo de ligantes
00: 18: 22.25 que são posicionados por este potássio.
00: 18: 25.16 E estruturas posteriores mostraram,
00: 18: 27.03 como vou contar a vocês em um momento,
00: 18: 28.29 se você bagunçar este site por meio de mutação
00: 18: 33.00 ou substituição por um íon de metal de tamanho errado,
00: 18: 35.14 O metal 2 não se liga e mata a ribozima.
00: 18: 41.14 Portanto, este foi apenas um experimento de controle para nos dizer
00: 18: 43.17 que em todos esses íons de dispersão estranhos e anômalos,
00: 18: 46.29 se ainda estávamos recebendo química de ribozima ou não.
00: 18: 50.26 Portanto, esta é a condição normal,
00: 18: 52.23, onde você vê um RNA precursor sendo clivado no fragmento de íntron e fragmentos exônicos.
00: 18: 58,24 E aqui você pode ver que no tálio,
00: 19: 01.02 é quase mais feliz: você vê o precursor indo para o íntron e componentes exônicos,
00: 19: 06.17 e mesmo em um estado intermediário,
00: 19: 08.06 a uma taxa mais rápida do que no caso do potássio.
00: 19: 10.18 Então, mesmo no tálio e magnésio sozinho,
00: 19: 12.28 esta é uma enzima muito feliz,
00: 19: 14,21 então faz sentido que o tálio substitua os locais de potássio.
00: 19: 20.11 Portanto, tudo o que mostrei até agora foi com o estado do produto do intron.
00: 19: 25.27 Este é um estado biologicamente relevante
00: 19: 28.09 porque esse íntron livre é capaz de splicing reverso
00: 19: 32.16 em RNAs de sequência semelhante e até mesmo em DNA.
00: 19: 36.14 Portanto, importa,
00: 19: 37.29 mas, ao mesmo tempo, estava muito curioso sobre
00: 19: 39.29 a função do local ativo no splicing,
00: 19: 42.20 e eu queria visualizar a primeira etapa da emenda.
00: 19: 45.21 Para olhar para o splicing, você tem que ter um exon de 5 '
00: 19: 48.04 que está conectado ao primeiro domínio do intron.
00: 19: 51.19 Portanto, embora este fosse o construto
00: 19: 52.24 que foi usado para as informações que falei anteriormente,
00: 19: 56.29 tivemos que criar um novo
00: 19: 58.13 e resolva um conjunto inteiramente novo de estruturas
00: 20: 01.25 com o exon 5 'anexado.
00: 20: 03.18 E nós fizemos isso.
00: 20: 06.07 Além disso, na presença de todos aqueles íons de metal incomuns.
00: 20: 09.28 E você vê a seguinte coisa interessante
00: 20: 11,29 quando você tem o exon 5 'anexado:
00: 20: 14.20 você pode ver a ligação scissile, onde a química vai acontecer,
00: 20: 17.20 inserido sobre os íons de magnésio catalítico
00: 20: 21.18 e você pode ver o fosfato cindível pronto
00: 20: 23.13 a ser atacado por uma água nucleofílica,
00: 20: 25.29 que também pudemos observar.
00: 20: 28,24 E você pode ver os dois potássios
00: 20: 30.13 desempenhando seus papéis importantes no suporte ao site ativo.
00: 20: 33,24 Obtivemos esta estrutura na presença de cálcio
00: 20: 36.22 e, neste estado particular, o fosfato não é clivado.
00: 20: 40,03 Mas quando você adiciona magnésio,
00: 20: 42.12 você vê clivagem
00: 20: 43.25 e você vê o fosfato clivado migrar
00: 20: 46,05 desta posição para o potássio 2.
00: 20: 49,27 Portanto, isso nos diz que o potássio 2 desempenha um papel fundamental no mecanismo:
00: 20: 53,26 é importante para estabilizar
00: 20: 55,18 o produto da reação da primeira etapa.
00: 20: 58.12 Portanto, cada íon metálico tem um papel importante em todo o processo.
00: 21: 06.05 Acabei de falar sobre K1 e K2,
00: 21: 07,29 M1 e M2,
00: 21: 09.09, mas não deixe que isso o faça pensar
00: 21: 11.18 que esses são os únicos metais importantes na estrutura.
00: 21: 14,13 Esses são os que são muito importantes para a química,
00: 21: 16.21 mas mais trabalho que fizemos na ocupação de íons de metal
00: 21: 20.22 em todo este RNA nos mostra que existem muitos, muitos íons de metal
00: 21: 24.29 que têm uma alta ocupação em todo este RNA
00: 21: 27.24 e que suportam os vários motivos da estrutura terciária.
00: 21: 31.28 Os íons metálicos desempenham um papel essencial na organização das moléculas de RNA
00: 21: 36.28 e assim continuamos a investigá-los também.
00: 21: 43.12 Então, o que aprendemos até agora?
00: 21: 46.05 O intron nos ensinou sobre o mecanismo de splicing do pré-mRNA em nível químico,
00: 21: 50.07 mas também revelou algumas novas ideias sobre o RNA como um catalisador.
00: 21: 54.18 Mostra-nos os seguintes conceitos:
00: 21: 57.03 que, não apenas os íons divalentes são importantes para a química das ribozimas,
00: 22: 01.19 íons monovalentes também podem desempenhar um papel,
00: 22: 04.13 e o potássio é particularmente importante tanto na estrutura quanto na catálise.
00: 22: 09.29 Durante o splicing do íntron do Grupo II,
00: 22: 11.14 vemos que o potássio 1 e 2 desempenham, cada um, um papel
00: 22: 14,24 no mecanismo que é importante.
00: 22: 16.26 Então, isso significa que os íntrons do Grupo II,
00: 22: 18.00 e possivelmente outras ribozimas,
00: 22: 19.22 não são duas enzimas de íons metálicos simples.
00: 22: 23.00 Na verdade, muito parecido com as enzimas protéicas,
00: 22: 24.18 eles podem estar usando aglomerados de metal,
00: 22: 26.26 que é um exemplo muito, muito comum no mundo das proteínas.
00: 22: 30.23 Portanto, aglomerados de metais heteronucleares compostos por diferentes tipos de íons,
00: 22: 34.13 pode ser um tema importante.
00: 22: 37.19 E isso também nos leva ao fato de que quando você sobrepõe
00: 22: 40.01 o sítio ativo do íntron do Grupo II com enzimas de proteína,
00: 22: 43.07 você pode ver paralelos importantes
00: 22: 44.13 na maneira que eles estão fazendo química.
00: 22: 49.13 Agora vou falar um pouco sobre
00: 22: 51.11 o que aprendemos com a forma de sódio desta estrutura,
00: 22: 54.23 porque nos revelou pela primeira vez que existe um
00: 22: 57,26 conformação alternativa dentro do sítio ativo do íntron do Grupo II.
00: 23: 01.14 E direi como interpretamos isso.
00: 23: 05.00 Então, nós sabemos há muito tempo que se você acidentalmente fez seus buffers,
00: 23: 08.18 ou adicionado qualquer sódio a uma reação envolvendo
00: 23: 11.22 qualquer um dos introns do Grupo II com os quais trabalhamos,
00: 23: 14.05 você não vê nenhuma reação química.
00: 23: 15,24 Você não vê nenhuma emenda.
00: 23: 17.17 Então, isso faz sentido porque o sódio não tem o mesmo raio iônico que o potássio
00: 23: 21.16 e não se encaixa em sites de potássio.
00: 23: 24.12 E com certeza, vemos que a forma sódica do intron
00: 23: 27.11 adota uma conformação alternativa de local ativo.
00: 23: 32.14 Vemos o que parece ser uma alternância conformacional
00: 23: 35.01 entre as duas etapas de emenda que envolve a rotação de duas bases,
00: 23: 39.11 um aqui e um aqui.
00: 23: 42.14 O que vemos é que na forma anterior do intron,
00: 23: 44.24 você tem este grande triplex de groove aqui
00: 23: 47,29 e você tem aquela curva fechada no backbone do RNA,
00: 23: 50.20 e na forma de sódio, duas dessas bases mudaram.
00: 23: 54,22 Em um caso, 70 graus
00: 23: 56.05 e em um caso uma das moléculas catalíticas de guanosina
00: 23: 59,21 move-se desta posição até aqui,
00: 24: 02.17 agora interagindo com um domínio completamente diferente: Domínio 3.
00: 24: 06.26 Quando esse tipo de rearranjo arquitetônico ocorre,
00: 24: 10.02 os íons metálicos no local ativo realmente saem
00: 24: 13.02 e cria um grande buraco aberto no site ativo.
00: 24: 17.02 Isso é realmente necessário
00: 24: 18.08 porque entre as etapas de emenda
00: 24: 21.02 os reagentes para a primeira etapa têm que sair do caminho
00: 24: 23,24 e os reagentes para a segunda etapa devem entrar.
00: 24: 26.10 E então formulamos a hipótese de que pode ser
00: 24: 29.10 o rearranjo que deve ocorrer entre as etapas
00: 24: 32.03 para que possa realizar as alterações necessárias
00: 24: 34.04 para estimular a segunda etapa de emenda e concluir o processo.
00: 24: 38.15 Então, se você imaginar que o splicing de íntron do Grupo II
00: 24: 40.29 ocorre com essas duas etapas, como expliquei antes,
00: 24: 44.11 de perto, pode ocorrer da seguinte maneira.
00: 24: 47.14 Sabemos que a disposição do site ativo, antes,
00: 24: 51.00 e logo após a primeira etapa de emenda,
00: 24: 52,29 é algo assim,
00: 24: 54.11 com os dois íons de metais catalíticos e os potássios de suporte.
00: 24: 58.19 E formulamos a hipótese de que em um intermediário
00: 25: 01.05 entre os dois estados envolve a rotação de duas bases.
00: 25: 06.18 Depois que isso ocorre e a segunda etapa de emenda é configurada,
00: 25: 09.22 você obtém a reforma do site ativo
00: 25: 13,05 e os íons de metal, e retornar ao estado inicial.
00: 25: 20.16 Então, se pensarmos sobre a organização do site ativo
00: 25: 24,22 para a primeira etapa de emenda,
00: 25: 26.08 quer dizer o site que é competente para química,
00: 25: 30.10, conseguimos obter essas informações
00: 25: 33.12 e aprenda muito sobre a evolução do splicing
00: 25: 37,18 em eucariotos.
00: 25: 40.03 E a razão para isso é que a estrutura do intron do Grupo II
00: 25: 43.02 serviu como uma espécie de roteiro para pensar sobre como a arquitetura
00: 25: 46.16 do spliceossomo eucariótico pode ser organizado.
00: 25: 50.21 E a razão pela qual eu acho isso é a seguinte.
00: 25: 53.14 Domínio 5, este motivo altamente conservado que contém todos os elementos ativos do site,
00: 25: 58.10 é mostrado aqui em uma estrutura secundária como esta.
00: 26: 01.16 E estes, em linhas pontilhadas,
00: 26: 03.11 indicou as interações terciárias que foram reveladas por nossa estrutura cristalina.
00: 26: 08.01 E por acaso sabemos que uma das moléculas de RNA realmente conservadas
00: 26: 12,05 no seu spliceossomo,
00: 26: 13.13 chamado U6 pequeno RNA nuclear,
00: 26: 16.00 tem uma estrutura secundária que sempre lembra muito o Domínio 5 nos íntrons do Grupo II,
00: 26: 22.05 e por muitos anos as pessoas levantaram a hipótese de que havia uma semelhança entre eles.
00: 26: 25.11 Eles até ligaram dois íons de metal em lugares semelhantes.
00: 26: 29.11 Mas a estrutura que resolvemos
00: 26: 31.17 sugeriu que uma parte do U6
00: 26: 33.19 poderia fazer as mesmas interações moleculares
00: 26: 36.03 que observamos no íntron do Grupo II.
00: 26: 39.14 E o trabalho recente dos laboratórios de Joe Piccirilli
00: 26: 42.18 e John Stahley da Universidade de Chicago,
00: 26: 45.08 usando RNAs spliceosomal,
00: 26: 48.02 mostraram de fato que o sítio ativo spliceosomal
00: 26: 50.26 é muito, muito semelhante ao do Grupo II.
00: 26: 53.24 E, de fato, que M1 e M2 do spliceossomo
00: 26: 57.02 são posicionados da mesma forma,
00: 26: 58,28 e pelas bases previstas,
00: 27: 00.12 conforme observado no intron do Grupo II.
00: 27: 03.08 Então, isso é emocionante porque significa que,
00: 27: 05.19 como previsto há muito tempo,
00: 27: 07.29 que os íntrons do Grupo II e o spliceossomo
00: 27: 09.20 podem compartilhar um ancestral evolucionário comum.
00: 27: 15.04 Então, para concluir,
00: 27: 17.28 por meio de estudos dos íntrons do Grupo II do Oceanobacillus,
00: 27: 20.17 visualizamos a estrutura e o local ativo de uma máquina de splicing de RNA,
00: 27: 24.21 identificamos os íons de metal no núcleo do Grupo II,
00: 27: 27.21 encontrar papéis importantes para monovalentes e divalentes
00: 27: 30.18 em estrutura e química.
00: 27: 32.24 Esta ribozima usa um novo aglomerado de íons de metal,
00: 27: 35.25 significando que a química do RNA não é tão diferente da química das proteínas.
00: 27: 40.02 O aglomerado de metal está intacto, mesmo sem o substrato,
00: 27: 42.21 o que significa que é quase como se esta enzima tivesse dentes
00: 27: 45.08 o que faz sentido porque os íntrons do Grupo II são retroelementos que podem atacar o DNA.
00: 27: 51.04 E acreditamos que vimos uma alternância estrutural
00: 27: 53,06 entre as duas etapas de emenda
00: 27: 55.02 e que possamos começar a caracterizar suas características.
00: 27: 58.25 E, devido ao trabalho de outros,
00: 28: 00.11 agora está claro que os íntrons do Grupo II e o spliceossomo
00: 28: 03.03 têm um site ativo quase idêntico.
00: 28: 06.15 Então, a estrutura do Grupo II tem sido muito útil
00: 28: 07.27 porque nos ensinou sobre química, estrutura e evolução.
00: 28: 12.29 Então, todo esse trabalho foi feito por três pessoas muito talentosas:
00: 28: 16.19 Nav Toor,
00: 28: 17.29 Marco Marcia,
00: 28: 19.09 e Kevin Keating,
00: 28: 20.11 com grande ajuda de Raj Rajashankar
00h28: 22,12 e Olga Fedorova.
00: 28: 23.09 E sou muito grato a essas pessoas por seu trabalho árduo e dedicação.
00: 28: 26,26 E muito obrigado por ouvir esta apresentação.


Da variação da linha germinativa à variação funcional e implicações para doenças

A maioria das mutações nt alélicas IGHV conhecidas codificam para alterações de aminoácidos, e em muitos genes IGHV esses locais não sinônimos ocorrem desproporcionalmente nas regiões determinantes de complementaridade do gene IGHV, 42 que são consideradas as mais importantes para o reconhecimento do antígeno. 43, 44, 45 No entanto, esse padrão não é observado em todos os loci do gene IGHV, sugerindo que certos genes IGHV podem estar sob diferentes pressões seletivas. 42 Tais achados implicam que polimorfismos da linha germinativa do gene IGHV podem ter consequências funcionais importantes em nível de proteína. Na verdade, os papéis funcionais para alguns alelos são conhecidos. Por exemplo, o alelo IGHV3-23 * 03 se liga de forma mais eficaz Haemophilus influenzae polissacarídeo tipo b (Hib) comparado com o alelo mais freqüentemente encontrado, IGHV3-23 * 01. 5 Curiosamente, a frequência do alelo IGHV3-23 * 03 também mostrou variar consideravelmente entre as populações, ocorrendo em 21% dos asiáticos, mas apenas 9% nos afro-americanos e 1,4% nos caucasianos. 29 Além disso, Sasso et al. 29 mostraram que o número de cópias do IGHV3-23 era maior em asiáticos e caucasianos do que em afro-americanos. Não se sabe se as diferenças geográficas nos polimorfismos IGHV3-23 e CNV são resultado da seleção, mas considerados em conjunto com as diferenças funcionais observadas, esses dados sugerem que tais polimorfismos podem ser importantes para a suscetibilidade à doença.

Polimorfismos de sequência germinativa em loci IG também mostraram influenciar a expressão de anticorpos. O exemplo mais conhecido vem do gene IGKV2-29 (anteriormente VA2, consulte a correspondência na tabela 10 do gene IMGT), um gene V de cadeia leve de IG encontrado expresso em anticorpos contra Hib. 46 Uma única mutação nt no RS do alelo IGKV2D-29 * 02 neste locus diminui drasticamente a expressão do gene, em comparação com o alelo alternativo, IGKV2D-29 * 01 (referências 47, 48) (IGKV2D-29 * 01 e IGKV2D-29 * 02 foram previamente identificados como VA2a e VA2b, consulte a correspondência na tabela de genes IMGT 10). Curiosamente, esse alelo ocorre apenas em alta frequência em certas populações nativas americanas e está associado à suscetibilidade ao Hib nessas populações. 47, 48 Os efeitos dos polimorfismos RS no uso do gene IGHV não foram testados explicitamente. Na verdade, o RS da maioria dos genes V foi sequenciado apenas uma vez 9, portanto, as informações sobre a diversidade alélica em motivos RS do gene IGHV são limitadas. Além disso, as sequências regulatórias a montante para a maioria dos genes IGHV que não estão representados no genoma de montagem (Tabela 1) nunca foram sequenciadas. 2 Como resultado, não temos dados que liguem diretamente polimorfismos reguladores do gene IGHV específicos a repertórios expressos. No entanto, vieses alélicos observados em repertórios ingênuos de indivíduos heterozigotos em genes IGHV de cópia única implicam que polimorfismos nas sequências regulatórias do gene IGHV poderiam influenciar a expressão de alelos específicos, 6 mas essa ideia permanece não testada.

O impacto das variantes estruturais nos repertórios expressos também é amplamente inexplorado. Conhecemos apenas um estudo que testou diretamente os efeitos da CNV no agrupamento IGHV em repertórios expressos. Este estudo mostrou que o número de cópias do IGHV1-69, que varia de 2 a 4 cópias por indivíduo, se correlaciona fortemente com sua prevalência em repertórios de anticorpos expressos. 49, 50 As deleções do gene IGHV, em contraste com os casos de duplicação do gene IGHV, por definição levam à ausência desses genes em repertórios expressos. Existem vários exemplos de deleções homozigóticas contendo genes IGHV funcionais (Tabela 1). 28, 33, 38, 39, 51, 52 Além disso, uma análise de repertórios de genes IGHV de células B ingênuas usando sequenciamento 454 de próxima geração revelou que 15 dos 56 genes IGHV descritos a partir desses repertórios foram observados em apenas um subconjunto do 12 indivíduos selecionados. 6 Sete desses quinze genes foram relatados anteriormente como ocorrendo em polimorfismos de inserção / deleção e, portanto, esses "buracos" observados no repertório ingênuo são provavelmente devido a deleções homozigóticas. Também é interessante notar que as proporções de muitos genes nos repertórios expressos diferiam consideravelmente entre os indivíduos. 6 Por exemplo, a proporção do gene IGHV4-39 em repertórios expressos variou de 2 a 8%. Dado que IGHV4-39 é conhecido por ser parte de um haplótipo de deleção que ocorre a uma frequência de 17-25% em caucasianos, 38, 51, 52 é possível que a variação interindividual na expressão de IGHV4-39 esteja relacionada a diferenças no número de cópias neste locus. Boyd et al. 6 também mostrou taxas de uso distorcidas em repertórios individuais para alelos múltiplos expressos do mesmo locus em alguns casos, certos alelos foram expressos duas a três vezes mais do que outros alelos no mesmo indivíduo. Curiosamente, dois desses casos de viés alélico foram relatados para loci conhecidos por fazerem parte de haplótipos duplicados (por exemplo, IGHV1-69), sugerindo que, além de polimorfismos em regiões regulatórias, conforme discutido acima, o CNV também pode estar subjacente a alguns desses diferenças observadas. No entanto, é importante observar que o uso de sequenciamento de última geração (NGS) na análise de repertórios expressos pode introduzir certos vieses artefatos e, portanto, a interpretação desses dados deve ser tratada com cautela.

Um estudo recente de anticorpos expressos em dois pares de gêmeos monozigóticos revelou pela primeira vez que a variação no uso do gene IGHV em repertórios ingênuos tem um forte componente genético, pois as frequências de uso diferiam entre indivíduos não aparentados, mas não entre gêmeos geneticamente idênticos 7 semelhantes aos exemplos notado acima, quatro de seis das diferenças significativas entre indivíduos não aparentados estavam em loci do gene IGHV conhecido por variar no número de cópias. As frequências de uso do gene IGHV também foram correlacionadas em repertórios experimentados com antígenos entre pares de gêmeos monozigóticos e, apesar das pequenas diferenças para genes IGHV particulares, o uso do gene em repertórios experimentados com antígenos refletiu o uso observado nos repertórios ingênuos para muitos genes IGHV. 7 Conforme discutido por Glanville et al., 7 esse achado é criticamente importante para nossa compreensão do papel dos repertórios expressos na doença, pois há muitos casos em que o uso tendencioso de genes em repertórios de anticorpos foi associado a doenças infecciosas ou autoimunes específicas. Também é interessante notar que uma investigação recente de repertórios expressos em amostras de sangue do cordão fetal de dois bebês sugere que os vieses de uso do gene IGHV diferem entre repertórios de sangue do cordão e repertórios de adultos. 53 Observações de vieses de uso do gene IGHV relacionados a doenças, considerados em conjunto com o fato de que repertórios ingênuos expressos são hereditários, iluminam o potencial das variantes da linha germinativa para contribuir para diferenças em repertórios ingênuos expressos que estabelecem o terreno para diferenças entre indivíduos não aparentados em sua suscetibilidade à infecção ou doença autoimune, ou em sua capacidade de responder apropriadamente às vacinas.

Embora existam vários exemplos convincentes de tais vieses para genes IGHV (para uma revisão dos vieses de uso do gene V em doenças autoimunes, consulte Foreman et al. 54), discutimos um deles para ilustrar a importância potencial desses efeitos. Três pesquisas de anticorpos anti-HIV (Abs) mostraram o uso tendencioso de IGHV1-69, 55, 56, 57 e 9 de 12 Abs contra o local de ligação induzido por CD4 do epítopo do HIV-1, gp120 (CD4i Abs), usado este gene. 58 Além disso, vários estudos demonstraram que IGHV1-69 é preferencialmente usado na neutralização de anticorpos contra epítopos de hemaglutinina de cepas de influenza específicas de dados em três populações humanas. 59, 60, 61 A onipresença desses achados levou alguns a hipotetizar que o IGHV1-69 pode ter evoluído para responder no início da resposta imune contra infecções, 62 embora outros dados mostrem que o IGHV1-69 também pode ser importante na infecção crônica. 57 Uma característica única do IGHV1-69 é que é o único gene IGHV que codifica uma fenilalanina (Phe, F) na posição do aminoácido 62 no CDR2-IMGT (ver IMGT / DomainDisplay), 10 um local conhecido por ser crítico para ligação de hemaglutinina. 61 Também é importante notar, no entanto, que embora IGHV1-69 seja o único gene IGHV a codificar uma fenilalanina nesta posição, este sítio é polimórfico e apenas um subconjunto dos 14 alelos IGHV1-69 descritos codificam para este aminoácido. Além disso, como observado acima, IGHV1-69 é parte de uma região polimórfica de número de cópias multialélicas. Os indivíduos podem ter 0-4 alelos com F62 em seu CDR2-IMGT, e o número de cópias se correlaciona com os níveis de expressão. 49 Curiosamente, a variação entre os indivíduos nos níveis de anticorpos amplamente neutralizantes contra a hemaglutinina de cepas de H5N1 do soro de pré-vacinas foi observada recentemente, sugerindo um papel para polimorfismos da linha germinativa do gene IGHV interindividual. 63 Expandindo brevemente para além deste gene específico, anticorpos usando genes IGHV diferentes de IGHV1-69 também foram recentemente identificados de indivíduos infectados com o vírus da influenza H1N1 de 2009 (IGHV4-31, IGHV4-30-4, IGHV4-39, IGHV3-21, IGHV3-30). 64 É importante observar que quatro desses cinco genes IGHV da linha germinativa que contribuem para esses anticorpos variam em número de cópias. 33, 38, 40, 41, 51, 52 Tomadas em conjunto, tais observações fornecem um exemplo potencial para o qual as descrições completas da variação estrutural alélica e genômica do gene IGHV podem ser essenciais para a compreensão da suscetibilidade a doenças infecciosas e úteis na administração de vacinas destinadas a desencadear anticorpos específicos.


Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa Médica e pela Sociedade Sueca do Câncer. Agradecemos a Samir El Andaloussi, Anna Berglöf e Roger Strömberg, Karolinska Institutet Mark A. Behlke, Integrated DNA Technologies (IDT), Inc. Peter B. Dervan, Instituto de Tecnologia da Califórnia Scott Henry, ISIS Pharmaceuticals Per Trolle Jørgensen, Erik B. Pedersen e Jesper Wengel, Universidade do Sul da Dinamarca e Rula Zain, Hospital Universitário Karolinska, pelos valiosos comentários. Pedimos desculpas a todos aqueles que contribuíram de muitas maneiras para o desenvolvimento de terapias de ON por não termos podido citar seu trabalho devido a limitações de espaço.


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