Em formação

Por que os territórios cromossômicos são importantes?


Os cromossomos ocupam regiões discretas do núcleo, conhecidas como 'Territórios Cromossômicos'. Esta organização espacial está emergindo como um aspecto crucial da regulação do gene e estabilidade do genoma na saúde e na doença.

Mas como é esse o caso quando:

A maioria dos eucariotos parece ter Territórios Cromossômicos, mas fermento S. cerevisiae é uma exceção a isso.

Portanto, se alguns eucariotos têm e outros não, quais informações os Territórios Cromossômicos fornecem? Alguma literatura usa a frase 'arranjos territoriais cromossômicos não aleatórios'. Portanto, estou confuso.

Territórios cromossômicos são organizados aleatoriamente em alguns eucariotos.

Como os territórios cromossômicos são cruciais para regulação do gene e estabilidade do genoma na saúde e na doença em alguns eucariotos, mas aleatória em outros eucariotos?


Em primeiro lugar, essa ideia foi desacreditada ou ignorada durante várias décadas, alguns estudos sugerem que a TC é aleatória em alguns eucariotos que não é necessária a verdade. Não é nada fácil determinar se as TCs são aleatórias ou não

Em segundo lugar, nem todos os organismos eucarióticos são iguais. As plantas e os fungos têm paredes celulares, os animais não. Os fungos podem ter uma célula dicariótica ou mesmo sofrer hibridação somática.

Terceiro, "os cromossomos são mais desdobrados em eucariotos inferiores, como a levedura". Territórios dos cromossomos: o arranjo dos cromossomos no núcleo

Este artigo não menciona que S. cerevisiae é uma exceção, pelo contrário "e pode até valer para eucariotos de uma única célula, como fermento de brotamento e fissão".

Obrigado pela pergunta, aprendi muito enquanto procurava por uma resposta


Cromossoma

UMA cromossoma é uma longa molécula de DNA com parte ou todo o material genético de um organismo. A maioria dos cromossomos eucarióticos inclui proteínas de empacotamento chamadas histonas que, auxiliadas por proteínas chaperonas, se ligam e condensam a molécula de DNA para manter sua integridade. [1] [2] Esses cromossomos exibem uma estrutura tridimensional complexa, que desempenha um papel significativo na regulação da transcrição. [3]

Os cromossomos são normalmente visíveis ao microscópio óptico apenas durante a metáfase da divisão celular (onde todos os cromossomos estão alinhados no centro da célula em sua forma condensada). [4] Antes que isso aconteça, cada cromossomo é duplicado (fase S), e ambas as cópias são unidas por um centrômero, resultando em uma estrutura em forma de X (foto acima), se o centrômero estiver localizado equatorialmente, ou um centro de dois braços estrutura, se o centrômero estiver localizado distalmente. As cópias unidas agora são chamadas de cromátides irmãs. Durante a metáfase, a estrutura em forma de X é chamada de cromossomo metafásico, que é altamente condensado e, portanto, mais fácil de distinguir e estudar. [5] Em células animais, os cromossomos atingem seu nível de compactação mais alto na anáfase durante a segregação cromossômica. [6]

A recombinação cromossômica durante a meiose e subsequente reprodução sexuada desempenha um papel significativo na diversidade genética. Se essas estruturas forem manipuladas incorretamente, por meio de processos conhecidos como instabilidade cromossômica e translocação, a célula pode sofrer uma catástrofe mitótica. Normalmente, isso fará com que a célula inicie a apoptose levando à sua própria morte, mas às vezes as mutações na célula dificultam esse processo e, portanto, causam a progressão do câncer.

Alguns usam o termo cromossomo em um sentido mais amplo, para se referir às porções individualizadas da cromatina nas células, visíveis ou não à microscopia de luz. Outros usam o conceito em um sentido mais restrito, para se referir às porções individualizadas da cromatina durante a divisão celular, visíveis à microscopia de luz devido à alta condensação.


Quebra de cromossomo ☆

Wendy J. Cannan, David S. Pederson, em Reference Module in Life Sciences, 2017

4 Como as quebras cromossômicas são reparadas?

Quebras cromossômicas indesejadas são consideradas a forma mais deletéria de dano ao DNA da célula. As duas principais vias de reparo de quebras de fita dupla, junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e reparo de recombinação mediada por homologia de DNA (HRR ou HR), são descritas em outro lugar com muito mais detalhes. Aqui, observamos apenas que (fora da meiose) HR usa a informação genética das cromátides irmãs como modelos para reparo e é relativamente livre de erros. Portanto, quebras de DNA que ocorrem durante a fase G1 ou início S não podem ser reparadas por meio de HR. Em vez disso, essas quebras são canalizadas para a via NHEJ, que une diretamente duas extremidades do DNA quebradas. Esses eventos de união envolvem a reação de ligação do DNA que pode ocorrer apenas se o substrato de DNA contiver um grupo 5'-fosfato e um grupo 3'-hidroxila. Quebras “limpas” de DNA, como as produzidas por endonucleases de restrição, podem ser ligadas de forma eficiente sem a participação de outros fatores. No entanto, quebras de DNA produzidas durante reações entre ROS e DNA raramente são limpas. As frações de DNA em ou perto das quebras geradas por IR podem incluir 3 '-fosfatos, 3' -fosfoglicolatos, 5 '-aldeídos e 5' -hidroxilos. Estes podem retardar ou inibir o reparo de quebra de fita dupla (Weinfeld e Soderlind, 1991). Nenhuma enzima pode remover todas essas porções, e o processamento final do DNA antes da ligação às vezes pode levar horas (revisado em Andres et al. (2015)). Da mesma forma, o processamento de DNA necessário para produzir extremidades ligáveis ​​freqüentemente produz deleções curtas, tornando o NHEJ mutagênico.


Meiose

Figura ( PageIndex <3> ): Visão geral da meiose. Durante a meiose, os cromossomos homólogos se separam e vão para células-filhas diferentes. Este diagrama mostra apenas os núcleos das células. Observe a troca de material genético que ocorre antes da primeira divisão celular.

O processo que produz gametas haplóides é denominado meiose. Meiose é um tipo de divisão celular em que o número de cromossomos é reduzido pela metade. Ocorre apenas em certas células especiais de um organismo. Em mamíferos, a meiose ocorre apenas em células produtoras de gametas dentro das gônadas. Durante a meiose, cromossomos homólogos (emparelhados) se separam e as células haploides se formam com apenas um cromossomo em cada par. A Figura ( PageIndex <3> ) dá uma visão geral da meiose.

Como você pode ver no diagrama de meiose, duas divisões celulares ocorrem durante o processo geral, portanto, um total de quatro células haplóides são produzidas. As duas divisões celulares são chamadas de meiose I e meiose II. A meiose I começa depois que o DNA se replica durante a interfase. A meiose II segue a meiose I sem que o DNA se replique novamente. Tanto a meiose I quanto a meiose II ocorrem em quatro fases, chamadas prófase, metáfase, anáfase e telófase. Você pode reconhecer essas quatro fases da mitose, a divisão do núcleo que ocorre durante a divisão celular de rotina das células eucarióticas.

Figura ( PageIndex <4> ): Estágios completos da meiose: uma célula animal com um número diplóide de quatro (2n = 4) prossegue através dos estágios da meiose para formar quatro células-filhas haplóides.

Meiose I

  1. Prófase I: O envelope nuclear começa a se quebrar e os cromossomos se condensam. Centríolos começam a se mover para pólos opostos da célula e um fuso começa a se formar. É importante observar que os cromossomos homólogos se emparelham, o que é exclusivo da prófase I. Na prófase da mitose e da meiose II, os cromossomos homólogos não formam pares dessa maneira. Durante a prófase I, ocorre o crossing-over. O significado do cruzamento é discutido na próxima seção chamada de variações.
  2. Metafase I: As fibras do fuso se ligam aos cromossomos homólogos emparelhados. Os cromossomos emparelhados se alinham ao longo do equador da célula. Isso ocorre apenas na metáfase I. Na metáfase da mitose e meiose II, são as cromátides irmãs que se alinham ao longo do equador da célula.
  3. Anáfase I: As fibras do fuso encurtam e os cromossomos de cada par homólogo começam a se separar um do outro. Um cromossomo de cada par se move em direção a um pólo da célula e o outro cromossomo se move em direção ao pólo oposto.
  4. Telófase I e citocinese: o fuso se quebra e novas membranas nucleares se formam. O citoplasma da célula se divide, resultando em duas células-filhas haplóides. Cada uma das células filhas possui uma variedade aleatória de cromossomos, com um de cada par homólogo. Ambas as células filhas passam para a meiose II.

Meiose II

  1. Prófase II: O envelope nuclear se quebra e o fuso começa a se formar em cada célula filha haplóide da meiose I. Os centríolos também começam a se separar.
  2. Metáfase II: As fibras do fuso alinham as cromátides irmãs de cada cromossomo ao longo do equador da célula.
  3. Anáfase II: As cromátides irmãs se separam e se movem para pólos opostos.
  4. Telófase II e Citocinese: O fuso se quebra e novas membranas nucleares se formam. O citoplasma de cada célula se divide, resultando em quatro células haplóides. Cada célula possui uma combinação única de cromossomos.

Fermento e câncer

Nas últimas décadas, os pesquisadores interrogaram incansavelmente todas as mutações que causam câncer em humanos. O Dr. Leeland Hartwell, biólogo e ganhador do Prêmio Nobel de 2001, foi um dos primeiros cientistas a descobrir algumas das mutações envolvidas no câncer. Desde então, muitas das mutações encontradas até agora estão em genes envolvidos de alguma forma com a divisão celular e a replicação do DNA. E em muitos desses casos, como no caso do Dr. Hartwell, essas mutações foram encontradas em outros organismos, como a levedura, antes que sua relevância no câncer humano fosse percebida. Por meio do trabalho do Dr. Hartwell, ele descobriu que os genes envolvidos no "ciclo de divisão celular" (CDC) em S. cerevisiae, também foram encontrados em uma capacidade semelhante em humanos. Ao longo de sua carreira, ele identificou mais de 100 genes envolvidos no controle da divisão celular. As descobertas feitas pelo Dr. Hartwell e outros usando a levedura como organismo modelo contribuíram significativamente para a nossa compreensão de como a divisão celular é controlada nas células eucarióticas. Esse entendimento teve amplas aplicações em muitos campos biológicos, incluindo a prevenção, diagnóstico e tratamento do câncer.

Saiba mais sobre o impacto das descobertas do Dr. Hartwell neste artigo publicado por Fred Hutch.


Materiais e métodos

Células, procedimento de fixação e pré-tratamento 3D FISH.

Uma cultura de fibroblasto humano com crescimento vigoroso foi estabelecida a partir de uma biópsia de pele de um menino de 2 anos. Análises de bandas cromossômicas e M-FISH realizadas após a segunda passagem (divisão 1: 2) mostraram um cariótipo masculino normal (46, XY). As culturas excedentes foram gentilmente fornecidas pelo Abteilung Medizinische Genetik, Universidade de Munique, Alemanha. As células foram posteriormente cultivadas em nosso laboratório em meio DMEM suplementado com 10% de FCS, e as alíquotas foram congeladas em cerca de 5-7 passagens em nitrogênio líquido. As células dessas alíquotas foram posteriormente propagadas por 2–4 semanas, subcultivadas (1: 2) a cada 5 dias, e rotineiramente verificadas quanto à ausência de contaminações por micoplasma [56]. Para experimentos 3D FISH e ReFISH, as células foram semeadas em lamelas (26 × 76 mm, espessura de 0,17 ± 0,01 mm). Para estudos de populações de células quiescentes, as culturas foram cultivadas até a confluência e mantidas por 1 semana antes da fixação 3D ser realizada em paraformaldeído 4% / 1 × PBS por 10 min [30]. Experimentos de controle com marcação de pulso BrdU (1 h) e imunomarcação da proteína nuclear específica do ciclo celular Ki67 indicaram que mais de 99,5% das células estavam em um estado quiescente (G0) sob essas condições. Para investigar as células da fase G0 e S simultaneamente na mesma lamela, as células foram fixadas em aproximadamente 40% -50% de confluência. Os núcleos das células dentro e fora do ciclo celular foram discriminados por marcação de pulso BrdU (45 min) e coloração de pKi67. Culturas de fibroblastos em crescimento também foram usadas para obter rosetas de prometáfase. Os núcleos na fase S mostraram coloração com pKi67 e incorporação de BrdU, enquanto os núcleos G0 careciam de ambos os sinais (dados não mostrados). Uma cultura de células de líquido amniótico de um feto feminino (46, XX) foi estabelecida após amniocentese diagnóstica, e uma cultura de passagem inicial crescente foi marcada com BrdU (45 min) antes da fixação 3D. As etapas de permeabilização realizadas antes de 3D FISH incluíram tratamentos com 0,5% de Triton-X100 (20 min), 20% de glicerol em PBS (30 min), congelamento / descongelamento repetido em nitrogênio líquido e incubação em 0,1 M de HCl (5 min) ou pepsina (0,002% em HCl 0,01 M). As lâminas foram armazenadas a 4 ° C em 50% formamida / 2 × SSC até 3D FISH ser realizado.

Sondas de DNA, protocolos de rotulagem, 3D FISH e detecção de sonda.

Sondas de pintura de cromossomos inteiros foram gentilmente fornecidas por Malcolm Ferguson-Smith (Universidade de Cambridge, Reino Unido). As sondas foram estabelecidas a partir de cromossomos humanos classificados por fluxo e amplificadas por DOP-PCR.

Para experimentos de FISH 3D de 24 cores em um único ensaio, as sondas de pintura cromossômica para todos os 24 tipos de cromossomos (HSAs 1–22, X e Y) foram marcadas usando um esquema de marcação combinatória com sete nucleotídeos diferencialmente marcados, incluindo dietilaminocumarina (DEAC NEN Life Science Products, Zaventem, Belgium), Fluorogreen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, Estados Unidos), TexasRed (Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos), Cy3, Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech), biotina-dUTP (Rockland Immunochemicals , Gilbertsville, Pennsylvania, Estados Unidos) e digoxigenin-dUTP (Roche, Basel, Suíça) [31]. Uma mistura contendo as 24 sondas marcadas em 50% de formamida / 10% de sulfato de dextrana / 1 × SSC foi hibridizada por 3 dias a 37 ° C, conforme descrito anteriormente [30]. Lavagens pós-hibridização foram realizadas três vezes com 0,5 × SSC a 60 ° C. Avidin-Cy5.5 foi usado para detecção de biotina e anti-dig-Cy7 (feito sob encomenda) para a imunodetecção de digoxigenina.

Para a coloração diferencial de todos os 24 tipos de cromossomos em experimentos ReFISH [30,32], as sondas de pintura específicas para cromossomos de todos os 24 tipos de cromossomos humanos foram marcadas com biotina-dUTP, TAMRA-dUTP ou Spectrum Green-dUTP. Duas misturas de hibridização diferentes foram preparadas de forma a permitir a discriminação inequívoca de cada tipo de cromossomo em dois experimentos de hibridização subsequentes. Após a hibridização do primeiro subconjunto de sondas, as sondas biotiniladas foram detectadas por Avidin-Cy5.5. Pilhas de imagens confocais foram adquiridas conforme descrito abaixo e as coordenadas das células foram registradas. Posteriormente, as mesmas células foram re-hibridizadas com o segundo subconjunto de sonda, seguido novamente pela detecção com Avidin-Cy5.5 e microscopia confocal.

Em experimentos FISH 3D de duas cores visando a visualização simultânea de dois pares de CTs homólogos, usamos sondas de tinta cromossômica marcadas com biotina e digoxigenina para HSAs 18/19, HSAs 17 / Y e HSAs 1/20.

Microscopia.

Após 3D FISH de todos os 24 tipos de cromossomos em um único ensaio, os núcleos foram fotografados com um microscópio de campo amplo de epifluorescência (DMRXA, Leica, Wetzlar, Alemanha), equipado com uma objetiva de imersão em óleo Plan Apo 63 × / 1.4, um filtro de 8 roda com filtros de banda estreita (Chroma Group, San Bruno, Califórnia, Estados Unidos) e um motor z-step automatizado [57]. Para a captura das imagens, foi utilizada uma câmera Sensys CCD (PhotoMetrics, Huntington Beach, Califórnia, Estados Unidos). Tanto a câmera quanto o microscópio foram controlados pelo software Leica QFluoro. Pilhas de seções ópticas com uma distância axial de 250 nm foram coletadas de núcleos com uma forma regular mostrando sinais de hibridização aparentemente completos e específicos em todos os canais. Para cada seção óptica, as imagens foram coletadas sequencialmente para todos os fluorocromos. Pilhas de imagens 2D em escala de cinza de 8 bits foram obtidas com um tamanho de pixel de 110 nm no x e y direções e um tamanho de imagem de 256 × 256 pixels.

Em experimentos ReFISH, as imagens para os três fluorocromos foram obtidas dos mesmos núcleos após a primeira e a segunda hibridização com um microscópio confocal LSM 410 da Zeiss (Oberkochen, Alemanha) equipado com uma objetiva 63 × Plan Apo e filtros para FITC, Cy3 e Cy5 . Varreduras foram realizadas sequencialmente para os três fluorocromos em cada seção de luz-óptica. Um alinhamento das duas pilhas de imagens obtidas para cada núcleo após a primeira e a segunda hibridização foi realizado em uma estação de trabalho Silicon Graphics (Mountain View, Califórnia, Estados Unidos) (OS Irix 6.2) usando o programa Correlator [58] no ambiente de desenvolvimento integrado Khoros (Khoral, Albuquerque, Novo México, Estados Unidos). Este procedimento permitiu o ajuste das duas pilhas de imagens com precisão de subvoxel. A comparação da forma nuclear após a primeira e a segunda hibridização não revelou uma diferença notável, mas observamos um ligeiro aumento de volume, que foi corrigido pelo algoritmo do computador.

Deconvolução e processamento de imagens.

Cada canal de fluorocromo foi normalizado para um valor de intensidade máxima de 255 e submetido à deconvolução pelo software Huygens (Scientific Volume Imaging, Hilversum, Holanda). Posteriormente, os cromossomos nas pilhas de imagens foram classificados de acordo com seu esquema de rotulagem usando o software goldFISH [33] rodando em uma estação de trabalho Silicon Graphics. Este software realizou uma classificação automatizada de áreas coradas por fluorescência em cada seção nuclear ótica-luz com base no esquema de marcação combinatória. Uma cor falsa representando o tipo de cromossomo classificado foi alocada para cada território classificado. O software calculou os IGCs 3D de cada território classificado, bem como o CN ou o CR por meio da pilha de imagens DAPI. As projeções de intensidade máxima das pilhas de imagens foram feitas com o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Estados Unidos). As sobreposições exibidas foram processadas com Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, Califórnia, Estados Unidos). As reconstruções tridimensionais de pilhas de imagens foram realizadas usando Amira 2.3 (Mercury Computer Systems, Chelmsford, Massachusetts, Estados Unidos). A sobreposição de TCs em núcleos ou de cromossomos em rosetas mitóticas fixas em 3D pode ser uma fonte de classificação incorreta. Por causa do achatamento notável dos núcleos de fibroblastos em G0 (altura máxima de aproximadamente 6 μm, com CTs frequentemente expandidos da parte inferior do núcleo para o topo), erros devido a sobreposições de CT são menos prováveis ​​do que em núcleos esféricos.

Avaliação de dados.

Para cada PC e TC classificados, determinamos seu IGC 3D, juntamente com o CR e o CN, respectivamente. Coordenadas IGC foram importadas para o Excel (Microsoft, Redmond, Washington, Estados Unidos), e as seguintes distâncias e ângulos foram medidos: (1) distâncias 3D CR – PC e 3D CN – CT (distâncias radiais 3D), (2) 3D PC Distâncias –PC e 3D CT – CT entre todos os pares possíveis de PCs ou CTs homólogos e heterólogos e (3) ângulos 3D PC – CR – PC e 3D CT – CN – CT. Para comparação de diferentes núcleos, as distâncias 3D foram normalizadas usando o seguinte procedimento. Um sistema de coordenadas foi aplicado a cada núcleo individual com o centro nuclear como origem (coordenadas polares). O ângulo α entre o eixo da célula mais longo e o x-eixo do sistema de coordenadas foi determinado, e as coordenadas foram recalculadas após uma rotação: x ′ = cosα x - sinα y e y ′ = sinα x - cosα y. Para medição do tamanho dos núcleos, o DNA foi corado com DAPI ou TOPRO-3. Os diâmetros em X e Y foram então medidos usando a seção ótica-luz com expansão nuclear lateral máxima. A altura foi medida entre o plano superior e inferior mostrando a coloração DAPI mais periférica ao longo do z-eixo. A distância radial relativa r de um PC ou CT foi calculado como r = (r1/r0) · 100, onde r1 representa a distância CN – CT ou CR – PC, respectivamente, e r0 denota a distância entre o CR e a borda da prometáfase ou entre o CN e a borda nuclear, traçando uma linha através do IGC do cromossomo analisado. Os ângulos foram calculados entre os IGCs de CTs ou PCs homólogos usando o CN ou CR como o ponto médio. A distância radial relativa entre PCs heterólogos ou CTs foi calculada como uma fração do diâmetro nuclear.

As medidas de distância e ângulo obtidas para IGCs de TCs e PCs foram comparadas com distâncias e ângulos calculados entre pontos estatisticamente colocados por um gerador de números aleatórios (“modelo de distribuição de pontos aleatórios”).

Os gráficos MDS foram gerados pelo SPSS 11 (SPSS, Chicago, Illinois, Estados Unidos). Este programa forneceu um mapa de distância 2D levando em consideração as distâncias CT-CT 3D heterólogas médias normalizadas calculadas para todas as combinações possíveis de CTs heterólogos. Todas as distâncias foram normalizadas para o diâmetro do núcleo antes de gerar os gráficos. As unidades após a transformação em um mapa MDS são arbitrárias, pois as distâncias são meramente relativas. Para uma avaliação 3D quantitativa das distribuições de TC em experimentos FISH 3D de duas cores, o programa de computador 3D-RRD foi usado (ver [25] e [59] para uma descrição detalhada). Resumidamente, o programa determina (1) o centro de gravidade de um dado núcleo e suas bordas, com base na contracoloração de DNA, e (2) todos os voxels de territórios cromossômicos pintados. O raio nuclear em qualquer direção do centro de gravidade nuclear até a borda nuclear segmentada foi normalizado para 100%, e o espaço nuclear foi dividido em 25 camadas concêntricas. Todas as cascas possuíam a mesma espessura ao longo de cada vetor radial possível do centro do núcleo à periferia. Consequentemente, a espessura dessas conchas em núcleos elipsoidais planos era muito maior ao longo do x- e y-eixo do que ao longo do z-eixo. Assim, a distribuição do DNA dos TCs pintados foi medida e expressa em função das distâncias relativas de cada casca ao centro do núcleo. Os testes de significância foram realizados com SPSS 11 ou Sigma Stat (SPSS). Se não for declarado de outra forma, um teste de significância K-S foi aplicado.

Modelagem de núcleos de células de fibroblastos humanos com distribuições estatísticas de CT.

Para simular a distribuição estatística de CTs em núcleos de fibroblastos humanos, o modelo SCD foi aplicado [25,41,60]. O conteúdo de DNA de cromossomos humanos individuais [61] foi usado para estimar o número de domínios de cromatina de 1 Mbp que constituem um determinado cromossomo modelo. Esses domínios foram representados por esferas de 500 nm de diâmetro. Os núcleos modelo foram gerados com uma forma elipsoidal com meios-eixos representando os meios-eixos médios de núcleos de fibroblastos G0 humanos determinados a partir de pilhas ópticas de luz (x = 10 μm, y = 5 μm, e z = 2,5 μm).

Resumidamente, as configurações iniciais que representam uma distribuição cromátide estatística em fibroblastos humanos diplóides masculinos (46, XY) na anáfase / telófase tardia foram estabelecidas como segue. A localização do centro de gravidade de cada cromátide foi inicialmente representada pelo centro de massa de uma pequena esfera inelástica (iS). O volume de um determinado iS era proporcional ao conteúdo de DNA de sua contraparte cromossômica natural, enquanto seu raio era muito pequeno em comparação com os meios-eixos do elipsóide. O volume total dos 46 iSs (representando os 46 cromossomos do complemento diplóide humano) compreendeu 22% do volume total do núcleo do modelo elipsoidal. Os centros de massa dos 46 iSs foram estatisticamente colocados no elipsóide como segue. Usando um gerador de números aleatórios, as coordenadas 3D para os centros de massa de todos os iSs foram geradas iterativamente de forma não sobreposta. Se a adição de um novo iS produzisse qualquer sobreposição com a posição do iS já existente, as coordenadas 3D eram descartadas e novas coordenadas 3D geradas aleatoriamente eram testadas. Esse processo foi repetido até que todos os 46 iSs estivessem localizados no núcleo do modelo. Em uma segunda etapa, as cromátides foram modeladas como pequenos bastonetes com uma seção transversal esférica de 500 nm (ver Figura 1D). Cada haste representa uma cadeia linear de domínios de cromatina de 1 Mbp esféricos. Para modelar o empacotamento denso de domínios de 1 Mbp em cromátides, uma distância de 13 nm foi simulada entre os centros de gravidade de quaisquer dois domínios de 1 Mbp adjacentes ao longo do eixo da cromátide. Por exemplo, um bastão representando uma cromátide com um conteúdo de DNA de 100 Mbp tinha um comprimento de 1.300 nm. Desta forma, modelamos cromátides altamente compactadas e rígidas. As hastes foram colocadas com uma orientação aleatória dentro dos 46 iSs de forma que seus centros de gravidade coincidissem com os centros dos iSs da primeira etapa. Como uma terceira etapa, o relaxamento das cromátides colocadas estatisticamente em TCs descondensadas foi simulado. Para este propósito, loops de relaxação Monte Carlo foram realizados com cerca de 400.000 passos para obter configurações de equilíbrio termodinâmico [14]. Para CTs descondensados, assumimos conexões de linker de 120 kb entre domínios de cromatina de 1 Mbp vizinhos, representando clusters de ordem superior de domínios de loop de 100 kb [62]. Essas conexões foram modeladas por potenciais de mola entrópica obrigando a uma distância média de 600 nm entre os centros de gravidade de domínios adjacentes. Para distâncias entre os centros de dois domínios adjacentes de 1 Mbp de 500 nm ou mais, presumimos que seu potencial repulsivo era zero. Quando as distâncias se tornaram menores que 500 nm, o potencial repulsivo tornou-se cada vez mais positivo, resultando em um aumento da repulsão mútua entre os dois domínios. Loops de relaxamento Monte Carlo de longo prazo mostraram que as duas suposições de um potencial de mola e um potencial de repulsão não são suficientes para manter a compactação experimentalmente observada dos TCs. Para alcançar CTs modelo com diâmetros comparáveis ​​aos CTs em núcleos de fibroblastos, introduzimos uma barreira de potencial fraco em torno de cada cadeia de domínio de cromatina simulada que representa um determinado cromossomo. Em cada etapa de Monte Carlo, as coordenadas 3D de um domínio de 1 Mbp escolhido aleatoriamente foram ligeiramente alteradas para cada CT. As novas coordenadas eram aceitas se a configuração do domínio da cromatina resultante se aproximasse do equilíbrio termodinâmico. Caso contrário, eles foram rejeitados e o processo repetido. As posições 3D dos centros de gravidade dos TCs após 400.000 passos de Monte Carlo representaram o arranjo estatístico dos TCs nos núcleos do modelo. A avaliação adicional de distâncias e ângulos entre CTs modelo foi realizada conforme descrito para núcleos de fibroblastos experimentais.


Modelos de polímero e variabilidade célula a célula no dobramento da cromatina

Diferentes modelos de polímero também podem ser distinguidos por sua previsão da variabilidade célula a célula do dobramento da cromatina. Um modelo de polímero descreve o conjunto das configurações de dobramento do polímero e cada uma dessas conformações descreve uma possível estrutura geométrica do polímero. A configuração do polímero varia estatisticamente ao longo do tempo. Isso se traduz em uma variabilidade célula a célula que pode ser medida em uma população de células fixas - porque a fixação cria um instantâneo de cada célula - cada uma em uma configuração de dobramento de cromatina diferente no momento da fixação. Por exemplo, o modelo de polímero RW prevê que a distância física R entre dois monômeros definidos do polímero, quando medido em muitas células, mostra uma distribuição gaussiana. Em geral, as distribuições são caracterizadas por seus momentos, um conjunto de parâmetros que caracterizam de forma única a distribuição. Por exemplo, o primeiro momento é o valor médio da distribuição, o segundo momento é a sua largura (variância). Os momentos superiores descrevem outras características da distribuição. Aqui, a razão entre o quarto momento da distribuição e o segundo momento ao quadrado é de interesse, pois dá um número adimensional que é independente de qualquer parâmetro que possa ser ajustado aos dados experimentais. Usando esses momentos, as distribuições obtidas experimentalmente - quando medidas com precisão suficiente - podem ser comparadas com as previsões do modelo de polímero. Por exemplo, um conjunto de medições 3D FISH obtidas a partir de um grande número de células fixas individuais reflete a variação de célula a célula e produz uma distribuição da distância física R em função da distância genômica (Quadro 1). Para esta distribuição, pode-se calcular os momentos e comparar os dados experimentais com as previsões do modelo. Tal comparação mostrou que modelos lineares de polímeros, ou seja, modelos que não envolvem loops, são incompatíveis com os dados experimentais (Bohn e Heermann, 2009).

Relação entre distância física e distância genômica para modelos de polímeros lineares e em loop. (UMA) Representação esquemática da distância física R entre dois pontos em um cromossomo interfase e a distância genômica g. (B) Modelo de polímero linear que não assume looping. Este modelo prevê que a distância quadrada média ⟨R 2 ⟩ Aumenta linearmente com o aumento da distância genômica g. (C) Modelo que assume uma cadeia de cromatina em loop. Em contraste com o modelo linear, os modelos em loop prevêem que ⟨R 2 ⟩ Atinge um platô a grandes distâncias genômicas - como foi encontrado experimentalmente (Mateos-Langerak et al., 2009).

Relação entre distância física e distância genômica para modelos de polímeros lineares e em loop. (UMA) Representação esquemática da distância física R entre dois pontos em um cromossomo interfase e a distância genômica g. (B) Modelo de polímero linear que não assume looping. Este modelo prevê que a distância quadrada média ⟨R 2 ⟩ Aumenta linearmente com o aumento da distância genômica g. (C) Modelo que assume uma cadeia de cromatina em loop. Em contraste com o modelo linear, os modelos em loop prevêem que ⟨R 2 ⟩ Atinge um platô a grandes distâncias genômicas - como foi encontrado experimentalmente (Mateos-Langerak et al., 2009).


Cromossomos e divisão celular

Um dos elementos mais importantes de uma divisão celular bem-sucedida é a distribuição correta dos cromossomos. Na mitose, isso significa que os cromossomos devem ser distribuídos entre duas células-filhas. Na meiose, os cromossomos devem ser distribuídos entre quatro células-filhas. O aparelho fusiforme da célula é responsável por mover os cromossomos durante a divisão celular. Esse tipo de movimento celular se deve às interações entre os microtúbulos do fuso e as proteínas motoras, que trabalham juntas para manipular e separar os cromossomos.

É de vital importância que um número correto de cromossomos seja preservado nas células em divisão. Erros que ocorrem durante a divisão celular podem resultar em indivíduos com números cromossômicos desequilibrados. Suas células podem ter muitos ou poucos cromossomos. Este tipo de ocorrência é conhecido como aneuploidia e pode acontecer em cromossomos autossômicos durante a mitose ou em cromossomos sexuais durante a meiose. Anomalias nos números dos cromossomos podem resultar em defeitos de nascença, deficiências de desenvolvimento e morte.


A morte dos homens?

Como argumentamos em um capítulo de um novo e-book, mesmo que o cromossomo Y em humanos desapareça, isso não significa necessariamente que os próprios machos estão saindo. Mesmo nas espécies que realmente perderam seus cromossomos Y completamente, machos e fêmeas ainda são necessários para a reprodução.

Nesses casos, o gene SRY “switch master” que determina a masculinidade genética mudou para um cromossomo diferente, o que significa que essas espécies produzem machos sem a necessidade de um cromossomo Y. No entanto, o novo cromossomo de determinação do sexo - aquele para o qual o SRY passa - deve então iniciar o processo de degeneração novamente devido à mesma falta de recombinação que condenou seu cromossomo Y anterior.

No entanto, o interessante sobre os humanos é que, embora o cromossomo Y seja necessário para a reprodução humana normal, muitos dos genes que ele carrega não são necessários se você usar técnicas de reprodução assistida. Isso significa que a engenharia genética pode em breve ser capaz de substituir a função do gene do cromossomo Y, permitindo que casais do mesmo sexo ou homens inférteis concebam. However, even if it became possible for everybody to conceive in this way, it seems highly unlikely that fertile humans would just stop reproducing naturally.

Although this is an interesting and hotly debated area of genetic research, there is little need to worry. We don’t even know whether the Y chromosome will disappear at all. And, as we’ve shown, even if it does, we will most likely continue to need men so that normal reproduction can continue.

Indeed, the prospect of a “farm animal” type system where a few “lucky” males are selected to father the majority of our children is certainly not on the horizon. In any event, there will be far more pressing concerns over the next 4.6m years.


Is the genome now completely sequenced?

Well, no. An obvious omission is the Y chromosome, because the complete hydatidiform mole cells used to compile this sequence contained two identical copies of the X chromosome. However, this work is underway and the researchers anticipate their method can also accurately sequence the Y chromosome, despite it having highly repetitive sequences.

Even though sequencing the (almost) complete genome of a human cell is an extremely impressive landmark, it is just one of several crucial steps towards fully understanding humans’ genetic diversity.

The next job will be to study the genomes of diverse populations (the complete hydatidiform mole cells were European). Once the new technology has matured sufficiently to be used routinely to sequence many different human genomes, from different populations, it will be better positioned to make a more significant impact on our understanding of human history, biology and health.

Both care and technological development are needed to ensure this research is conducted with a full understanding of the diversity of the human genome to prevent exacerbation of health disparities by limiting discoveries to specific populations.