Em formação

10.8: Introdução à Transcrição - Biologia


O que você aprenderá a fazer: delinear o processo de transcrição

Você já teve que transcrever algo? Talvez alguém tenha deixado uma mensagem em sua caixa postal e você teve que anotar no papel. Ou talvez você tenha feito anotações em aula e depois as reescreveu ordenadamente para ajudá-lo a revisar.

Como esses exemplos mostram, transcrição é um processo no qual as informações são reescritas. A transcrição é algo que fazemos em nossa vida cotidiana, e também é algo que nossas células devem fazer, de uma forma mais especializada e definida de forma restrita. Em biologia, transcrição é o processo de copiar a sequência de DNA de um gene no alfabeto semelhante de RNA.


Histona

Em biologia, histonas são proteínas altamente básicas abundantes em resíduos de lisina e arginina que são encontrados em núcleos de células eucarióticas. Eles agem como carretéis em torno dos quais o DNA se enrola para criar unidades estruturais chamadas nucleossomos. [1] [2] Os nucleossomos, por sua vez, são envolvidos em fibras de 30 nanômetros que formam a cromatina compactada. As histonas impedem que o DNA se enrosque e o protegem de danos ao DNA. Além disso, as histonas desempenham papéis importantes na regulação do gene e na replicação do DNA. Sem as histonas, o DNA desenrolado nos cromossomos seria muito longo. Por exemplo, cada célula humana tem cerca de 1,8 metros de DNA se completamente esticada, no entanto, quando enrolada em histonas, esse comprimento é reduzido para cerca de 90 micrômetros (0,09 mm) de fibras de cromatina de 30 nm de diâmetro. [3]

Existem cinco famílias de histonas que são designadas H1 / H5 (histonas ligantes), H2, H3 e H4 (histonas centrais). O núcleo do nucleossomo é formado por dois dímeros H2A-H2B e um tetrâmero H3-H4. O forte envolvimento do DNA em torno das histonas é, em grande parte, resultado da atração eletrostática entre as histonas carregadas positivamente e a estrutura de fosfato carregada negativamente do DNA.

As histonas podem ser modificadas quimicamente por meio da ação de enzimas para regular a transcrição do gene. As modificações mais comuns são a metilação de resíduos de arginina ou lisina ou a acetilação de lisina. A metilação pode afetar a forma como outras proteínas, como os fatores de transcrição, interagem com os nucleossomos. A acetilação da lisina elimina uma carga positiva na lisina, enfraquecendo a atração eletrostática entre a histona e o DNA, resultando no desenrolamento parcial do DNA, tornando-o mais acessível para a expressão gênica.


Sites

Domínio do professor: Transcrição e tradução celular

O Domínio do Professor é um recurso educacional gratuito produzido pelo WGBH com financiamento da NSF, que abriga milhares de recursos de mídia, materiais de apoio e ferramentas para aulas em sala de aula. Um desses recursos se concentra nos tópicos de transcrição e tradução. Este recurso é um atividade interativa que começa com uma visão geral do dogma central da biologia molecular e, em seguida, entra em detalhes mais específicos sobre os processos de transcrição e tradução. Além da atividade interativa, o recurso também inclui uma narrativa de fundo e questões para discussão que podem ser usado para avaliação. Embora o material seja designado como conteúdo apropriado para as séries, 9-12, ele serviria como uma excelente introdução ao tópico para formandos em biologia, ou seria bem adequado para formandos não-biologia no nível pós-secundário . Veja: Domínio do Professor: Transcrição e Tradução Celular

O DNA Learning Center's (DNALC) DNA interativo do Howard Hughes Medical Institute (DNAi) Centro de Aprendizagem de Ciências Genéticas da Universidade de Utah

O site do DNA Learning Center (DNALC), o site interativo do DNA do Howard Hughes Medical Institute (DNAi) e o site do Genetic Science Learning Center da University of Utah listados abaixo contêm excelentes animações narradas que descrevem a transcrição e tradução. Essas animações são úteis como um suplemento de aula ou para os alunos revisarem por conta própria. As animações DNALC cobrem dogma central, transcrição (básica e avançada), splicing de mRNA, splicing de RNA, código tripleto e tradução (básico e avançado). Os módulos DNAi, "Lendo o Código" e "Copiando o Código", descrevem a história do processo, os cientistas envolvidos na descoberta e os fundamentos do processo, e também incluem uma animação e um jogo interativo. Particularmente úteis para os alunos são as animações interativas da Universidade de Utah que permitem, por exemplo, "Transcrever / Traduzir um Gene" ou examinar os efeitos da mutação do gene enquanto "Testam a Atividade da Neurofibromina em uma Célula".

The DNA Learning Center's (DNALC): Biblioteca de Animação 3D
DNA interativo do Howard Hughes Medical Institute: (DNAi): Código
Centro de aprendizagem de ciências genéticas da Universidade de Utah: transcrever e traduzir um gene

Scitable

O site da Nature Education, Scitable, é um ótimo recurso de estudo para alunos que desejam aprender mais ou estão com dificuldade de compreensão, transcrição e tradução. O site contém uma biblioteca pesquisável, incluindo muitas "visões gerais" de transcrição, tradução e tópicos relacionados. Os alunos têm acesso a um "Pacote de estudos" de genética, que fornece explicações, animações e links para outros recursos. Além disso, o Scitable tem um recurso "Pergunte a um especialista" que permite aos alunos enviar perguntas específicas relacionadas à genética. Veja: Scitable

NHGRI Talking Glossário de termos genéticos, aplicativo e site para iPhone

O site do Talking Glossary of Genetics Terms e o aplicativo para iPhone fornecem uma referência facilmente transportável e acessível para seus alunos. Muitas vezes, o vocabulário desconhecido é o principal obstáculo para a compreensão do aluno. Este app / site fornece uma referência útil para termos comuns usados ​​na descrição dos componentes envolvidos na transcrição e tradução.
Glossário Falante de Termos Genéticos
Conversando sobre glossário de termos genéticos, aplicativo para iPhone

Coleção de estudos de caso da Universidade de Buffalo: decodificando a gripe

Este "estojo clicker" foi projetado para desenvolver a capacidade dos alunos de ler e interpretar informações armazenadas no DNA. Fazendo uso de sistemas de resposta pessoal ("clickers") junto com uma apresentação em PowerPoint, os alunos acompanham a história de "Jason", um estagiário dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC). Enquanto trabalhava com uma equipe do CDC no México, Jason é a única pessoa que não adoece devido a uma nova cepa de gripe. Cabe a Jason usar dados moleculares coletados de diferentes cepas locais de gripe para identificar qual delas pode estar causando a doença. Embora projetado para um curso introdutório de biologia para cursos de ciências ou não, o caso poderia ser adaptado para cursos de nível superior, incluindo problemas mais complexos e aspectos da expressão gênica, como a excisão de íntrons. "
Veja: Decodificando a Gripe

Animação de síntese de proteínas de Biology-Forums.com

Tradução é o processo de produção de proteínas a partir do mRNA. Este vídeo do YouTube mostra os componentes moleculares envolvidos no processo. Ele também anima como o peptídeo é alongado por meio da interação entre mRNA, ribossomo, tRNA e resíduos. Protein Synthese Animation

The Central Dogma Animation por RIKEN Omics Science Center

O 'dogma central' da biologia molecular é que 'o DNA faz o RNA faz a proteína'. Este anime mostra como as máquinas moleculares transcrevem os genes no DNA de cada célula em mensagens de RNA portáteis, como o RNA mensageiro é modificado e exportado do núcleo e, finalmente, como o código do RNA é lido para construir proteínas. Animação: O Dogma Central

Um Prezi dessas informações pode ser encontrado em: NHGRI Teacher Resouces-Central Dogma

Equipe Contribuinte de Educadores:

Kari D. Loomis, Ph.D., Mars Hill College
Luisel Ricks, Ph.D., Howard University
Mark Bolt, Ph.D., Universidade de Pikeville
Cathy Dobbs, Ph.D., Joliet Junior College
Changhui Yan, Ph.D., North Dakota State University
Solomon Adekunle, Ph.D., Southern University

Domínio do professor: Transcrição e tradução celular

O Domínio do Professor é um recurso educacional gratuito produzido pelo WGBH com financiamento da NSF, que abriga milhares de recursos de mídia, materiais de apoio e ferramentas para aulas em sala de aula. Um desses recursos concentra-se nos tópicos de transcrição e tradução. Este recurso é um atividade interativa que começa com uma visão geral do dogma central da biologia molecular e, em seguida, entra em detalhes mais específicos sobre os processos de transcrição e tradução. Além da atividade interativa, o recurso também inclui uma narrativa de fundo e questões para discussão que podem ser usado para avaliação. Embora o material seja designado como conteúdo apropriado para as séries, 9-12, ele serviria como uma excelente introdução ao tópico para formandos em biologia, ou seria bem adequado para formandos não-biologia no nível pós-secundário . Veja: Domínio do Professor: Transcrição e Tradução Celular

O DNA Learning Center's (DNALC) DNA interativo do Howard Hughes Medical Institute (DNAi) Centro de Aprendizagem de Ciências Genéticas da Universidade de Utah

O site do DNA Learning Center (DNALC), o site interativo do DNA do Howard Hughes Medical Institute (DNAi) e o site do Genetic Science Learning Center da University of Utah listados abaixo contêm excelentes animações narradas que descrevem a transcrição e tradução. Essas animações são úteis como um suplemento de aula ou para os alunos revisarem por conta própria. As animações DNALC cobrem dogma central, transcrição (básica e avançada), splicing de mRNA, splicing de RNA, código tripleto e tradução (básico e avançado). Os módulos DNAi, "Lendo o Código" e "Copiando o Código", descrevem a história do processo, os cientistas envolvidos na descoberta e os fundamentos do processo, e também incluem uma animação e um jogo interativo. Particularmente úteis para os alunos são as animações interativas da Universidade de Utah que permitem, por exemplo, "Transcrever / Traduzir um Gene" ou examinar os efeitos da mutação do gene enquanto "Testam a Atividade da Neurofibromina em uma Célula".

The DNA Learning Center's (DNALC): Biblioteca de Animação 3D
DNA interativo do Howard Hughes Medical Institute: (DNAi): Código
Centro de aprendizagem de ciências genéticas da Universidade de Utah: transcrever e traduzir um gene

Scitable

O site da Nature Education, Scitable, é um ótimo recurso de estudo para alunos que desejam aprender mais sobre, ou estão com dificuldade de compreensão, transcrição e tradução. O site contém uma biblioteca pesquisável, incluindo muitas "visões gerais" de transcrição, tradução e tópicos relacionados. Os alunos têm acesso a um "Pacote de estudos" de genética, que fornece explicações, animações e links para outros recursos. Além disso, o Scitable tem um recurso "Pergunte a um especialista" que permite aos alunos enviar perguntas específicas relacionadas à genética. Veja: Scitable

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O site do Talking Glossary of Genetics Terms e o aplicativo para iPhone fornecem uma referência facilmente transportável e acessível para seus alunos. Muitas vezes, o vocabulário desconhecido é o principal obstáculo para a compreensão do aluno. Este app / site fornece uma referência útil para termos comuns usados ​​na descrição dos componentes envolvidos na transcrição e tradução.
Glossário Falante de Termos Genéticos
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Coleção de estudos de caso da Universidade de Buffalo: decodificando a gripe

Este "estojo clicker" foi projetado para desenvolver a capacidade dos alunos de ler e interpretar informações armazenadas no DNA. Fazendo uso de sistemas de resposta pessoal ("clickers") junto com uma apresentação em PowerPoint, os alunos acompanham a história de "Jason", um estudante estagiário nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC). Enquanto trabalhava com uma equipe do CDC no México, Jason é a única pessoa que não adoece devido a uma nova cepa de gripe. Cabe a Jason usar dados moleculares coletados de diferentes cepas locais de gripe para identificar qual delas pode estar causando a doença. Embora projetado para um curso introdutório de biologia para cursos de ciências ou não, o caso poderia ser adaptado para cursos de nível superior, incluindo problemas mais complexos e aspectos da expressão gênica, como a excisão de íntrons. "
Veja: Decodificando a Gripe

Animação de síntese de proteínas de Biology-Forums.com

Tradução é o processo de produção de proteínas a partir do mRNA. Este vídeo do YouTube mostra os componentes moleculares envolvidos no processo. Ele também anima como o peptídeo é alongado por meio da interação entre mRNA, ribossomo, tRNA e resíduos. Protein Synthese Animation

The Central Dogma Animation por RIKEN Omics Science Center

O 'dogma central' da biologia molecular é que 'o DNA faz o RNA faz a proteína'. Este anime mostra como as máquinas moleculares transcrevem os genes no DNA de cada célula em mensagens de RNA portáteis, como o RNA mensageiro é modificado e exportado do núcleo e, finalmente, como o código do RNA é lido para construir proteínas. Animação: O Dogma Central

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Conceitos básicos na evolução do vírus de RNA

Para quem os pedidos de correspondência e reimpressão devem ser endereçados, em: Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,” Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid, Espanha. Pesquise mais artigos deste autor

Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,”, Universidad Autónoma, 28040 Madrid, Espanha

Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,”, Universidad Autónoma, 28040 Madrid, Espanha

Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,”, Universidad Autónoma, 28040 Madrid, Espanha

Departamento de Genética e Servei de Bioinformàtica, Facultat de Biología, 46100 Buijassot, Valência, Espanha

Departamento de Biologia e Centro de Genética Molecular, Universidade da Califórnia em San Diego, La Jolla, Califórnia, 92093-0116 EUA

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Resumo

Uma marca registrada dos genomas de RNA é a natureza propensa a erros de sua replicação e retrotranscrição. A principal base bioquímica da fidelidade de replicação limitada é a ausência de revisão / reparo e mecanismos de correção de erro pós-replicação que normalmente operam durante a replicação do DNA celular. Apesar dessa característica única dos replicons de RNA, a dinâmica das populações virais parece seguir os mesmos princípios básicos que a genética populacional clássica estabeleceu para organismos superiores. Aqui, revisamos as evidências recentes dos efeitos profundos que os gargalos genéticos têm no aumento dos efeitos deletérios da catraca de Muller durante a evolução do vírus de RNA. A validade da hipótese do Red Queen e do princípio de exclusão competitiva para vírus de RNA são vistos como o resultado esperado da natureza altamente variável e adaptável das quasispécies virais. A aptidão viral, ou capacidade de replicar a progênie infecciosa, pode variar um milhão de vezes em curtos intervalos de tempo. Paradoxalmente, estudos funcionais e estruturais sugerem limitações extremas à variação do vírus. A adaptabilidade dos vírus de RNA parece ser baseada na ocupação de porções muito estreitas do espaço de sequência em qualquer momento. - Domingo, E., Escarmís, E., Sevilla, N., Moya, A., Elena, SF, Quer, J., Novella, IS e Holland, JJ Basic concepts in RNA virus evolution. FASEB J. 10, 859-864 (1996)


Materiais e métodos

Preparação de vermes para voo espacial

O nematóide Caenorhabditis elegans A cepa Bristol N2 foi pré-cultivada em C. elegans meio de manutenção [CeMM (Szewczyk et al., 2003)] durante 1 mês a 20 ° C. Aproximadamente 10.000 vermes de estágio larval misto foram transferidos para sacos de cultura de 2,5 ml contendo CeMM fresco. Um total de 40 ml de sacos de cultura foram colocados em um EC-1 ventilado (o Biorack Experiment Container tipo 1, desenvolvido pelo Professor Eberhard Horn de Ulm, Alemanha), que permite a troca de ar entre o ambiente e os sacos de cultura experimental. EC-1s foram colocados dentro de KUBIK, uma incubadora modular desenvolvida pela Agência Espacial Europeia (ESA) para experimentos de voos espaciais que podem garantir um aumento de temperatura de 6 ° C para 37 ° C em incrementos de 1 ° C (http: //www.esa .int / esaHS / SEMS9D638FE_iss_0.html). Os nemátodos em recipientes EC-1 foram cultivados em KUBIK a 12 ° C durante 5 dias e depois a 12 ° C durante os 2 dias imediatamente anteriores ao lançamento na nave espacial Soyuz. Após o lançamento, os vermes foram mantidos a 20 ° C em KUBIK acomodados na espaçonave Soyuz até que ela atracasse na Estação Espacial Internacional (ISS). Os vermes de vôo foram cultivados em KUBIK a 20 ° C por 10 dias, e após o pouso foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Uma descrição completa do design experimental ICE-FIRST e hardware foi enviada para publicação em outro lugar.

Extração de RNA total

Após descongelar as amostras, os vermes foram lavados duas vezes com tampão M9 (Sulston e Hodgkin, 1988) para remover CeMM. Os vermes foram repetidamente congelados e descongelados cinco vezes. O RNA total do voo espacial e os vermes de controle do solo foram extraídos usando um kit de purificação de RNA da Isogen (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japão) seguindo o protocolo do fabricante. A concentração e a pureza do RNA extraído foram determinadas usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). O perfil de expressão gênica foi analisado usando o Affymetrix GeneChip C. elegans Genome Array (22.150 espécies de genes, 22.500 elementos de array) (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) realizado pelo Dragon Genomics Center (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japão).

PCR quantitativo em tempo real

Para medir as diferenças de expressão de genes relacionados ao músculo entre vermes de controle terrestre e vermes que voam no espaço, foi realizada PCR em tempo real. A preparação do cDNA foi realizada utilizando o kit de reagentes ExScript RT (TaKaRa Bio) e o termociclador iCycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Posteriormente, a preparação da mistura de reação para medir a quantidade de cDNA foi realizada usando Premix EX Taq (TaKaRa Bio) de acordo com as instruções do fabricante. O monitoramento da reação e da fluorescência foi feito usando um sistema de PCR em tempo real Smart Cycler com software Smart Cycler versão 2.0C (Cepheid, Sunnyvale, CA, EUA). Os seguintes pares de primers foram usados ​​para amplificação por PCR: gpd-2 (5′-ACCGGAGTCTTCACCACCATC-3 ′ e 5′-ACGACTACGAGGTTACAAGCA-3 ′), act-3(5′-ACGAACATTGGAGCATCAGCA-3 ′ e 5′-TCAATTGGGTACTTGAGGGTAAGG-3 ′), hlh-1(5′-GAGCACACCAAATGCCACAGA-3 ′ e 5′-CTCCGCCAGCAGTAGACGTT-3 ′), myo-3(5′-AAAGGTCAAGCCAATGCTCAA-3 ′ e 5′-TCTTCAACCAAATCGGCAAC-3 ′), unc-54(5′-CCCGACTTGAGGACGAACA-3 ′ e 5′-AGCCTTGGAACGGGATTGAC-3 ′), peb-1(5′-TGCGATTAGCGTGAGCAGTATG-3 ′ e 5′-TGTCTGGATTGTATCGGACAAATGA-3 ′), pha-4(5′-ATCTTGGCCTAATTGACCCATC-3 ′ e 5′-TCATCTGTGCTTGCGTGGTT-3 ′), myo-1(5′-GGTCCGTCAAGAACAAGAGCA-3 ′ e 5′-ATCATGGCACGTTCAGCATC-3 ′), myo-2(5′-CAAGCAACGTCCACGTGAAGA-3 ′ e 5′-CTCCGAGTCAATTCCGAAGCA-3 ′) e unc-15(5′-CGCCGATCTTGGATCACTCA-3 ′ e 5′-GGCACGCTCACGTTCAACTC-3 ′). Cada amplificação foi realizada em triplicado. Os valores foram analisados ​​estatisticamente usando o software PRISM (GraphPad software Inc., San Diego, CA, EUA). A significância foi aceita em P& lt0.05.

Western blotting

Para determinar os níveis de estado estacionário das proteínas da miosina, os western blots foram realizados em triplicado. A proteína total foi extraída usando solução de extração bidimensional (2D) [uréia 7 mol l -1 (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japão), tioureia 2 mol l -1 (Wako), 4% (p / v) CHAPS (Dojin , Osaka, Japão), 0,5% (v / v) de transportador anfólito (Bio-Rad), 40 mmol l -1 de ditiotreitol (Nacalai Tesque, Kyoto, Japão)]. A concentração de proteína total foi determinada usando um 2D Quant Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). 110 μg de proteína total foram coletados de aproximadamente 40.000 vermes de cada amostra de controle de solo e voo espacial. A solução de amostra foi preparada para conter 0,2 μg μl -1 de proteína total. Um volume igual de tampão de amostra 2 × Laemmli foi adicionado à solução de amostra. As amostras foram fervidas por 5 min e sonicadas por 1 min. As amostras contendo 2μg de proteína por pista foram submetidas à eletroforese em um gel de SDS-poliacrilamida (5-10%, Bio-Rad) e transferidas para uma membrana Hybond-P (Amersham) a 15 V por 60 min. A membrana foi lavada com solução de bloqueio [5% (p / v) de leite em pó desnatado, 0,05% (p / v) Tween 20, 100 mmol l -1 de Tris-HCl (pH 7,5) e 500 mmol l -1 NaCl]. MHC B e C foram detectados usando um anticorpo monoclonal de camundongo anti-MHC B e C (diluição de 5-12 1: 1.000), e a paramiosina foi detectada usando um anticorpo policlonal de coelho anti-paramiosina (diluição de 1:10 000). Ambos os anticorpos foram gentilmente fornecidos pelo Dr. Kagawa. Anticorpo anti-GAPDH (diluição 1: 1 000) (Imgenex, San Diego, CA, EUA) foi usado para detectar GAPDH como um padrão interno. IgG anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano IgG de camundongo anti-cabra (Pierce, Rockford, IL, EUA) e IgG anti-coelho de coelho com peroxidase de rábano anticorpo inteiro ligado a peroxidase de rábano (Amersham) foram usados ​​como anticorpos secundários. Cada anticorpo secundário foi usado em uma diluição de 1:10 000. Após o tratamento usando um kit de detecção de quimioluminescência ECL Plus (Amersham), as proteínas imunorreativas foram detectadas usando um sistema de detecção de quimioluminescência VersaDoc (Bio-Rad). Os valores foram analisados ​​estatisticamente usando o software PRISM (GraphPad). A significância foi aceita em P& lt0.05.

Ensaio de movimento

Animais vivos foram gravados em vídeo no local de pouso dentro de 2 h após o retorno utilizando um ProScope [Bodelin Technologies, Lake Oswego, OR, EUA (http://www.theproscope.com)]. Os animais foram colocados em uma câmara com temperatura controlada a 20 ° C e deixados em equilíbrio antes de os vídeos serem gravados. A iluminação de campo claro foi obtida usando um LED alimentado por bateria alojado dentro de uma placa de Petri de 60 mm. As amostras foram colocadas sobre esta placa de Petri e gravadas em um PC alimentado por bateria usando o ProScope em alta ampliação (aproximadamente 40 × ampliação total). A profundidade focal adequada foi alcançada utilizando um invólucro de plástico personalizado projetado pelo Dr. Conley para o ProScope, com iluminação incidente oblíqua. Vídeos foram usados ​​para determinar as taxas de movimento usando o teste de natação descrito anteriormente (Szewczyk et al., 2002). Dez animais selecionados aleatoriamente de cada condição foram avaliados, e a taxa de movimento de cada animal foi medida 10 vezes. Vídeos de amostra podem ser encontrados em http://weboflife.nasa.gov/celegans/questionsice.htm.


DISCUSSÃO

Garcia-del Portillo et al. (1992) detectou a indução de mgtB, um gene controlado por PhoPQ em bactérias dentro de SCV, e interpretou os dados como significando que [Mg 2+] estava baixo dentro do vacúolo. Esta premissa é baseada nos efeitos marcantes exercidos por este cátion na indução de PhoPQ in vitro (Soncini et al., 1996 e ver também a Figura 1) e baseia-se na suposição de que [Mg 2+] também é o predominante, senão o único determinante de PhoPQ in vivo (Garcia Vescovi et al., 1996 Groisman, 2001 Soncini et al., 1996). Contrariamente a esta noção, descobrimos que as alterações em [Mg 2+] desempenham um papel comparativamente menor na expressão inicial de PhoP no SCV, pelo menos em macrófagos. Esta conclusão é baseada nas seguintes descobertas: 1) phoP a indução é aparente nos primeiros 30 minutos de invasão e as medições diretas de [Mg 2+] não conseguiram detectar uma queda significativa durante este período de tempo 2) as tentativas de manipular o [Mg 2+] do SCV não conseguiram modificar a expressão sustentada do phoP:: GFP, e 3) a indução foi atribuída à acidificação luminal. Verificamos que a alteração do pH não prejudicou a homeostase do [Mg 2+] nem nossa capacidade de clampear artificialmente o [Mg 2+] usando ionóforos. A observação de que a própria acidificação é suficiente para induzir PhoP torna o controle do phoP promotor pelo pH do SCV a hipótese preferida.

A extrusão do vacúolo de cátions divalentes diferentes de Mg 2+ é igualmente improvável que seja um determinante crítico da indução de PhoP, porque a eliminação ou expressão ectópica de Nramp1 em macrófagos não teve efeito significativo na expressão de GFP em SCVs formados em macrófagos primários ou em linhas de células de macrófagos transfectadas. Além disso, Nramp1 é expresso apenas em células mieloides e não em epitélios, onde PhoP também foi ativada. Nramp1 é uma bomba de efluxo de cátions divalentes dependente do pH na membrana fagossomal, que se acredita que atue restringindo a disponibilidade luminal de diferentes metais que podem ser necessários para a replicação intracelular de bactérias, incluindo Salmonella. Recentemente, Zaharik et al. (2004) observaram em macrófagos RAW264.7 que a depleção de metal mediada por Nramp1 causa aumento da expressão dos transportadores Mn 2+ / Fe 2+ MntH e SitA, consistente com a ideia de que SCVs positivos para Nramp1 estão esgotados para esses metais. Esses achados, juntamente com a falta de efeito de Nramp1 na indução de PhoPQ observada no presente estudo, indicam que: 1) Mn e Fe não desempenham um papel importante na indução de PhoPQ em SCVs, e 2) o mecanismo bacteriostático / bactericida de A ação de Nramp1 é independente da modulação de PhoPQ. Nossos resultados também são consistentes com os resultados anteriores (Cuellar-Mata et al., 2002) mostrando que os SCVs formados em macrófagos Nramp1-positivos e Nramp1-negativos se acidificam na mesma medida, sendo responsáveis ​​pelos níveis comparáveis ​​de indução de PhoP.

Alpuche-Aranda et al. (1992) demonstraram que a dissipação do gradiente de pH através do SCV deprimiu a indução de PhoPQ, identificando a acidificação luminal como um importante determinante in situ da indução. Esta noção foi confirmada e examinada em nosso manuscrito, onde a cinética dos eventos e a contribuição relativa do pH e outros fatores na ativação de PhoPQ foram esclarecidas. O principal papel do pH na indução de PhoPQ poderia ser direto, pela protonação de um ou mais componentes bacterianos que controlam a expressão gênica. No entanto, o efeito pode ser indireto, talvez por desalojar competitivamente o Mg 2+ de seus locais de ligação em PhoQ. Alternativamente, a acidificação pode controlar a fusão do SCV com compartimentos de endomembrana que podem entregar oxidantes, peptídeos, proteases ou outros ativadores potenciais de PhoPQ. Na verdade, foi recentemente demonstrado que os peptídeos antimicrobianos catiônicos são potentes indutores de PhoPQ (Bader et al., 2005) e pode regular Salmonella replicação em macrófagos (Rosenberger et al., 2004). A natureza amplamente díspar dos agonistas de PhoPQ sugere que o complexo pode de fato ser um sensor do formato e / ou rigidez da membrana. O papel bem estabelecido do Mg 2+ na manutenção da estrutura da parede bacteriana (Guo et al., 1998) explicaria seus efeitos na indução, enquanto a adição de peptídeos catiônicos pode agrupar porções carregadas negativamente na parede bacteriana, resultando em sua deformação. A protonação de componentes da parede ou membrana pode ter um efeito semelhante. Da mesma forma, os prótons podem afetar PhoQ participando da ligação ou geração de peptídeos catiônicos de seus precursores. Finalmente, um mecanismo independente de PhoQ de ativação de genes alvo PhoP foi recentemente demonstrado (Lejona et al., 2004), que também pode ser controlada pela acidificação vacuolar.

Também detectamos um componente da indução resistente ao CcA, presumivelmente independente da acidificação, embora seu mecanismo subjacente permaneça indefinido. Curiosamente, este componente secundário foi eliminado quando as células foram pré-tratadas com IFNγ, apesar do fato de que IFNγ per se era um ativador líquido da indução de PhoPQ. Vários processos são ativados pelo pré-tratamento com IFNγ e alguns deles podem potencializar a expressão de PhoPQ. Além disso, a secreção aumentada de proteases, peptídeos antimicrobianos ou espécies reativas de oxigênio podem contribuir para a desestabilização da membrana e ativação de PhoPQ. Alguns desses eventos podem agir sinergicamente com a acidificação vacuolar. Assim, as proteases lisossomais têm pH ótimo ácido e a dismutação do superóxido requer prótons. Desta forma, o sistema PhoPQ parece estar idealmente preparado para detectar as condições adversas que se desenvolvem dentro do SCV e é, portanto, capaz de alertar e preparar a bactéria para a sobrevivência intracelular.


Assista o vídeo: Síntese Proteica Parte 1 - Transcrição. Prof. Samuel Cunha (Novembro 2021).