Em formação

Separação de fragmentos de DNA menores e fragmentos maiores sem o uso de eletroforese em gel?


Para um próximo experimento, eu teria dois tipos de fragmentos de DNA em uma amostra após uma etapa de reação específica: Primeiro, haveria fragmentos de comprimento de aprox. 170 bps e então haveria fragmentos de comprimento de aprox. 270 bps ou mais.

Gostaria de manter todos os fragmentos com comprimento de 270 bps ou mais e descartar todos os fragmentos com comprimento de 170 bps.

Claro, eu poderia executar tudo em um gel e coletar apenas aquelas bandas acima de 170 bps. No entanto, estou me perguntando se há algo mais elegante para atingir esse objetivo. Por exemplo, poderíamos usar um filtro que coleta apenas os fragmentos com tamanho de 200 ou 250 bps ou mais e os fragmentos com tamanho menor passam pelo filtro. Isso é possível e, em caso afirmativo, como? Ou você sugeriria outra coisa?

Muito obrigado pelo seu apoio antecipadamente!


Uma opção é usar esferas SPRI, como as vendidas pela Ampure (esferas Ampure XP) para separar fragmentos de DNA por tamanho. Ao ajustar a proporção de grânulos para amostra, você pode ligar seletivamente fragmentos de certos comprimentos, excluindo aqueles de outros comprimentos, como pode ser visto na imagem a seguir:

A partir desta imagem, você pode tentar usar uma proporção de esferas para amostra de 0,7 para excluir fragmentos abaixo de 200 pb, ou uma proporção entre 0,7 e 0,6 para excluir apenas os fragmentos abaixo de algo entre 200 e 250 pb. A vantagem dos grânulos em relação ao gel é o tempo que leva. A seleção do tamanho por grânulos leva apenas cerca de 10 minutos, contra talvez 30 minutos ou mais para um gel (incluindo a extração).

Como acontece com qualquer procedimento de biologia molecular, é importante testá-lo e certificar-se de que funciona para você. Por exemplo, pode ser uma boa ideia pegar alíquotas de suas amostras e comparar os comprimentos e rendimentos que você obtém de uma gama de concentrações de grânulos e / ou comparar os rendimentos que você obtém com o uso de gel vs (neste caso) grânulos .


Na minha opinião, a separação em gel (usando um gel de porcentagem bastante alta para separar as bandas o máximo possível) e a excisão manual é de longe a melhor opção. O problema com os filtros de corte de peso molecular é que o valor que eles fornecem (5000 Da, por exemplo) é um média tamanho dos poros, não é exato. Portanto, qualquer tentativa de separar 270 bp de oligos de 170 bp terminará com parte da construção mais curta terminando no produto final e parte da sequência mais longa no fluxo direto. As chances de encontrar um produto pronto para uso que atenda exatamente aos seus requisitos de tamanho também são baixas. Use esses tipos de kits apenas se estiver separando um produto de PCR de 300 bp de primers não utilizados, por exemplo.

Você poderia fazer algum tipo de cromatografia em coluna usando uma matriz de exclusão de tamanho, mas isso é essencialmente a mesma coisa que usar um gel. A única vantagem é que ele pode ser escalonado, portanto, se você tiver grandes quantidades de produto de PCR para separar (digamos 5 ou 10 ml), seria mais fácil executar uma única coluna do que carregar tantas linhas em um gel.


Assista o vídeo: Eletroforese em gel. Biotecnologia. Biologia. Khan Academy (Novembro 2021).