Em formação

Como o tempo de expressão do gene é controlado no desenvolvimento do embrião?


Eu entendo como a diferenciação celular funciona em geral (gradientes de proteínas homeobox, etc.), mas como o tempo é controlado? Por que alguns genes são ativados em um momento muito específico de desenvolvimento e, em seguida, são desativados? Eu imagino que o tempo poderia ser habilitado pelas mesmas proteínas homeobox (os genes são ativados assim que as proteínas se difundem o suficiente e desligados assim que o homeobox se esgota), mas talvez haja algum mecanismo especial de temporização da expressão gênica ?


Como o tempo de expressão do gene pode afetar a formação de um embrião em desenvolvimento?

Devemos saber que a impressão genética é transmitida. A formação de um embrião não. Alguns tomam forma quando provocados, é muito parecido com quando os oócitos são estimulados com uma duplicação de estímulo. Acontece automaticamente. O embrião é afetado pela proximidade das células. Aglomerados, espalhados e distantes. Todos fazem com que as células se comportem automaticamente. Mas é a primeira ignição do desenvolvimento que desencadeia o crescimento. As células passaram por muitas fases e o tempo não é controlado por proteínas ou genes.


Nova compreensão do momento da expressão gênica fornece uma visão sobre o desenvolvimento e a doença

Um novo estudo realizado por cientistas do Weill Cornell Medical College revela um mecanismo pelo qual a expressão dos genes é controlada - uma descoberta que chama a atenção para mutações genéticas que podem prejudicar o tempo de expressão do gene. Essas mutações podem afetar o desenvolvimento de um organismo e também podem causar câncer ao ativar os genes certos na hora errada.

O estudo, publicado na edição de 29 de outubro da PLoS Biology, analisa como o momento da expressão do gene é regulado no notocórdio, o precursor evolutivo e de desenvolvimento da espinha dorsal. A notocorda é a principal característica que diferencia os humanos, camundongos, ascídias e animais relacionados (conhecidos coletivamente como cordados) das moscas, vermes e moluscos, sendo essencial para o seu desenvolvimento.

Um jogador crucial no desenvolvimento da notocorda é o gene Brachyury, cujo produto é uma proteína de ligação ao DNA. Em humanos, mutações no gene BRACHYURY foram associadas à espinha bífida, malformações vertebrais e cordoma, um câncer raro, mas insidioso. Brachyury controla a expressão de vários genes de notocórdio e garante seu desdobramento sequencial durante a formação dessa estrutura central. Era sabido que o Brachyury liga-se diretamente a sequências distintas de DNA - conhecidas como módulos cis-reguladores (CRMs) - que atuam como interruptores moleculares e controlam quando e onde os genes são expressos. A regulação temporal da expressão gênica é geralmente alcançada por meio de interruptores separados - CRMs iniciais e tardios fisicamente distintos - que são controlados por diferentes conjuntos de reguladores da expressão gênica.

Ainda não se sabia como esses interruptores podiam ser ativados por Brachyury em momentos diferentes.

Para esclarecer este ponto, os cientistas dos laboratórios da Dra. Anna Di Gregorio e da Dra. Yutaka Nibu, ambos do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, analisaram sistematicamente a estrutura e função de vários CRMs de notocórdio. O modelo que eles propuseram - usando financiamento do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH, da Fundação March of Dimes Birth Defects e da American Cancer Society - sugere que algumas mutações podem deixar as propriedades espaciais de um CRM intactas enquanto afetam o tempo de expressão do gene . "O trabalho chama a atenção para uma área inexplorada de regulação gênica e sugere que mutações elusivas em CRMs, particularmente aquelas que alteram o tempo de expressão gênica, podem explicar as origens moleculares de defeitos congênitos e doenças que não foram previamente ligadas a mutações em regiões codificadoras de proteínas ", diz o Dr. Di Gregorio, professor associado.

Eles descobriram que na água do mar, o Brachyury se liga aos CRMs associados a genes de início precoce em várias regiões, chamadas de sítios de ligação. No entanto, os genes que são expressos posteriormente durante o desenvolvimento do notocórdio são controlados por Brachyury por meio de locais de ligação individuais, enquanto os genes de notocórdio com os últimos inícios são controlados por Brachyury indiretamente, por meio de um mecanismo de retransmissão que envolve outros fatores de transcrição. Brachyury e esses fatores de transcrição adicionais fazem parte de uma grande rede reguladora de genes, que estudos no laboratório Di Gregorio dissecaram na última década.

O artigo mostra um exemplo desse tipo de mutação para o CRM que controla a expressão de notocórdio de um gene da laminina. "Os estudos da estrutura e função dos CRMs são caros e demorados na maioria dos modelos animais", diz o Dr. Di Gregorio. "Empregamos uma abordagem pronta para usar, que consiste no uso de um organismo modelo não convencional, o redemoinho Ciona. Além de ter um notocórdio experimentalmente acessível, o Ciona apresenta CRMs compactos, um cronograma de desenvolvimento rápido e um método fácil para a introdução de DNA sintetizado em laboratório nos embriões vivos de Ciona. "

Em ascídias, bem como em humanos, as lamininas são os principais componentes das membranas basais e da matriz extracelular que mantêm as células unidas dentro dos tecidos e são reguladores chave da migração celular, adesão celular e proliferação celular. O notocord CRM de Ciona laminin, que foi identificado no laboratório Di Gregorio, requer dois sítios de ligação cooperativos para Brachyury. Quando um desses sites sofre mutação, Brachyury é incapaz de se ligar a esse local, mas ainda pode se ligar ao outro local.

"Como consequência, o CRM ainda está ativo na notocorda, mas o início completo de sua atividade é atrasado por algumas horas, que é um intervalo crucial durante o desenvolvimento de um organismo", diz o Dr. Yutaka Nibu, assistente adjunto professor pesquisador e co-autor sênior do estudo. "Tal atraso pode causar um defeito de nascença ao retardar a síntese de um bloco de construção necessário para o organismo se formar adequadamente, ou pode adiar a ativação de um gene supressor de tumor e desencadear a formação de câncer."

“Imagine que o gene é a luz de um cômodo específico da sua casa e que o cômodo é uma célula específica do seu corpo”, acrescenta o Dr. Di Gregorio. "Para acender a luz, você precisa girar o interruptor de luz - o CRM. Uma mutação que desativa seu interruptor manteria seu quarto no escuro. No entanto, uma mutação que atrasa o início da atividade de seu interruptor ainda permite que você ligue acender a luz, mas só mais tarde. Se você tivesse que realizar alguma tarefa naquela sala que exigisse um certo nível de luz, você teria que esperar algumas horas até que a luz se acendesse. Durante essas horas preciosas, você não seria capaz de completar suas tarefas naquela sala, ou você poderia ter um ladrão aproveitando a escuridão para causar estragos lá. "


Uma expressão gênica espetacular: o embrião de drosófila em desenvolvimento

Duas horas após o óvulo ser fertilizado, o embrião de Drosophila melanogaster atinge o estágio de blastoderme, durante o qual o desenvolvimento da futura mosca da fruta & # 8217s é um foco de atividade. Cerca de 6.000 núcleos distintos na célula única do ovo migram para a superfície, onde são envolvidos por membranas e, em cerca de meia hora, tornam-se novas células individuais.

Expressão gênica e morfologia do Drosófila embrião, calculado em resolução celular para a superfície tridimensional da blastoderme, pode ser projetado em um cilindro circundante e desenrolado para produzir um mapa planar. (Anterior ou cabeça do embrião está à esquerda, posterior à direita. As bordas superior e inferior do mapa representam a linha média dorsal ou posterior do embrião, com a linha média anterior ou ventral no centro.)

Enquanto isso, a forma da blastoderme permanece a do ovo, um elipsóide liso, embora um tanto irregular. Mas essa simplicidade logo se perde. No próximo estágio de desenvolvimento, chamado gastrulação, o embrião começa a se enrugar, eventualmente dobrando-se no plano corporal intrincadamente articulado da mosca.

Como sua geometria é descomplicada e os núcleos e células resultantes estão todos próximos à superfície, a blastoderme é um alvo natural dos investigadores que desejam entender como os genes se ligam e desligam em seu caminho para formar o animal inteiro, coordenando sua expressão no tempo e espaço.

Recentemente, pela primeira vez, pesquisadores do Berkeley Lab, UC Berkeley e UC Davis, como membros do Berkeley Drosophila Transcription Network Project (BDTNP), desenvolveram métodos para olhar para o Drosófila blastoderme em três dimensões, na resolução de células individuais, ao mesmo tempo que mede com precisão a expressão de vários genes conforme eles interagem para dar forma à mosca.

& # 8220A visualização da expressão gênica e análise da morfologia de um organismo inteiro na resolução celular nunca foi feita antes, & # 8221 diz David Knowles do Berkeley Lab Life Sciences Division & # 8217s BioImaging Group.

Revelações 3-D em resolução celular

Em sua primeira aplicação, os novos métodos usados ​​pela equipe do BDTNP detectaram características morfológicas e de expressão gênica nunca vistas antes, derrubando algumas suposições arraigadas no processo.

Uma característica marcante do desenvolvimento durante o estágio de blastoderme é a formação de & # 8220 listras de expressão & # 8221 que circundam o embrião e se movem sobre sua superfície, as listras movendo-se do que seria a cabeça do organismo em direção à cauda. Os genes que dão origem a essas listras controlam a segmentação posterior do embrião. Antes do trabalho do BDTNP, os biólogos que estudavam esse sistema se limitavam a imagens bidimensionais da blastoderme obtidas em diferentes estágios de embriões fixos, nenhum dos quais idênticos.

Com esse arranjo, a expressão gênica não poderia ser atribuída a núcleos específicos de uma imagem de um embrião fixo para a próxima. A suposição surgiu, quase por padrão, que o movimento espacial dos padrões de listras era devido apenas à expressão gênica e não ao movimento de os núcleos - uma suposição altamente plausível, considerando que muitos dos produtos de expressão são fatores de transcrição que regulam a expressão de outros genes.

Calculado a partir de imagens tridimensionais brutas do embrião (à esquerda, com núcleos manchados de branco, expressão de um gene chamado Caracol manchado de vermelho, e a expressão de um gene chamado véspera manchado de verde), PointClouds podem ser renderizados como esferas ou blocos (direita), suas cores combinadas indicando o grau de expressão dos genes por cada núcleo em um determinado estágio. As setas nos painéis indicam os mesmos três núcleos.

Os colaboradores do BDTNP também começaram por imagens de embriões fixos, mas eles os imaginaram inteiros em três dimensões. Em seguida, eles aplicaram um conjunto sofisticado de ferramentas de modelagem e análise de dados. & # 8220 Montamos um pipeline para fazer e comparar milhares de imagens microscópicas de alta resolução de diferentes embriões em diferentes estágios de desenvolvimento da blastoderme, & # 8221 Knowles diz. & # 8220Para cada imagem, coramos o DNA total, que dá a localização de cada núcleo, além de corarmos os padrões de expressão de dois genes específicos. & # 8221

Por análise de computador de imagens brutas de embriões tridimensionais, cada uma com cerca de 500 megabytes de tamanho, as imagens foram convertidas em pequenos arquivos de texto fáceis de manipular chamados PointClouds. Cada PointCloud registra o centro de massa de todos os núcleos e a expressão de dois genes dentro e ao redor de cada núcleo de um embrião. Ao combinar dados para vários PointClouds, os pesquisadores puderam estimar as concentrações de vários produtos de genes diferentes em cada célula em desenvolvimento.

O biólogo Mark Biggin, da Divisão de Genômica, diz: & # 8220O estágio de desenvolvimento de cada embrião do qual nossos PointClouds foram derivados é conhecido, mas como podemos dizer que esta célula em um embrião é a mesma que a célula em outro? A resposta é: criamos um modelo - um modelo estatístico médio - com base em nossas observações. E então o testamos. & # 8221

Biggin explica, & # 8220Pomos capazes de preencher nosso modelo com pontos que poderíamos usar para prever qualquer possível movimento nuclear. E poderíamos medir separadamente o fluxo de expressão rastreando a coleção de genes expressos. & # 8221 Características inesperadas da blastoderme tornaram-se imediatamente aparentes.

& # 8220Com esse novo modelo de embrião, pudemos ver a mudança relatada anteriormente nas listras de expressão do gene & # 8221 diz Biggin & # 8220 mas também vimos que os núcleos de fato se movem. Os padrões de expressão gênica movem-se parcialmente em sincronia com essas mudanças na morfologia, mas parcialmente independentemente. Há uma interação intrincada entre quais genes são expressos e como os núcleos se movem. & # 8221

Os núcleos corados de um único embrião vivo foram rastreados durante o estágio de blastoderme. As setas vermelhas indicam os núcleos que se moveram mais longe, as setas azuis os que se moveram menos. O movimento dos núcleos em embriões vivos corresponde às previsões do modelo.

Para substanciar a previsão do modelo & # 8217s de que os núcleos se movem, os pesquisadores também acompanharam o desenvolvimento de embriões vivos durante o estágio de blastoderme. Embora os métodos para examinar embriões vivos forneçam apenas medições parciais e menos precisas, as previsões do modelo & # 8217s foram realmente confirmadas.

A capacidade de modelar todas as três dimensões da blastoderme revelou novas informações adicionais sobre o sistema. Por um lado, diz Knowles, & # 8220Expressão de genes que se pensava anteriormente apenas para regular o desenvolvimento ao longo do eixo ântero-posterior & # 8221 - o eixo da cabeça para a cauda - & # 8220 também muda ao longo do eixo dorsal-ventral & # 8221 - de trás para frente eixo. & # 8220 À medida que contornamos o embrião em 3-D, vemos mudanças na expressão ao longo de ambos os eixos. & # 8221

Direções futuras

Tendo produzido a primeira descrição quantitativa e tridimensional da expressão gênica e morfologia de todo o embrião na resolução celular, os pesquisadores estão ansiosos para avançar para o próximo estágio de descoberta.

& # 8220Sabemos tanto sobre a biologia deste organismo quanto de qualquer outro, mas na verdade não temos dados suficientes & # 8217t, & # 8221 Biggin diz. & # 8220 Uma aproximação de primeira ordem do que & # 8217s está acontecendo no embrião não é boa o suficiente. Quando você tem precisão até o nível da célula, como fazemos agora, tudo o que você precisa fazer é fazer uma pergunta e você descobrirá algo. Nosso estudo atual envolve um número limitado de genes agindo em uma pequena janela de tempo. Você apenas sabe que deseja esse tipo de informação para todo o curso de desenvolvimento da mosca e para milhares de genes. & # 8221

Os membros do Berkeley Drosophila Transcription Network Project incluem (da esquerda) Hanchuan Peng, Angela DePace, Oliver Rübel, Jitendra Malik, Charless Fowlkes, Mark Biggin, Mike Eisen, Soile Keränen, Bernd Hamman, Cris Luengo, Damir Sudar, Gunther Weber e David Knowles. (Imagem cortesia de David Knowles, visualização de plano de fundo do programa BDTNP PointCloudXplore.)

Os pesquisadores baseados em Berkeley não têm intenção de investigar essas questões sozinhos. & # 8220O objetivo é entender melhor a rede de transcrição, & # 8221 Knowles diz. & # 8220Nós & # 8217 lançamos todos os nossos dados atuais do PointCloud, não analisados, no site do Berkeley Drosophila Transcription Network Project, de onde qualquer pessoa pode baixá-los e usá-los em suas próprias pesquisas. & # 8221

As notáveis ​​descobertas do BDTNP & # 8217s até o momento são prova da força de & # 8220 unir diferentes talentos & # 8221, como diz Biggin: & # 8220especialistas em imagem, ciência da computação, visualização e biologia. & # 8221 É uma abordagem isso deve levar a uma melhor compreensão do desenvolvimento não apenas da mosca da fruta, mas também de muitos outros organismos.

O trabalho realizado pelo BDTNP é financiado por doações do National Institute of General Medical Sciences, do National Human Genome Research Institute e do Department of Energy & # 8217s Office of Science.


Regulação da expressão gênica durante o desenvolvimento

Uma questão fundamental em biologia é como os processos celulares são tão reproduzíveis, apesar das variações inerentes nas reações químicas que os governam. Durante o desenvolvimento de um organismo multicelular, o controle preciso da expressão gênica permite o estabelecimento reprodutível de padrões que levarão à formação de tecidos e órgãos na hora certa e no lugar certo. Enquanto vários estudos estabeleceram como a informação espacial é obtida e integrada por realçadores, pouco se sabe sobre as características temporais do controle transcricional. Isso é particularmente verdadeiro para a coordenação transcricional, que se refere à sincronia internuclear da ativação do gene e à distribuição homogênea de mRNAs em um campo de células em desenvolvimento coordenado. Nosso objetivo é para integrar os aspectos dinâmicos da transcrição para entender como uma coordenação temporal precisa na expressão gênica leva a decisões precisas sobre o destino das células durante o desenvolvimento.

Nós principalmente estudamos cedo Drosófila desenvolvimento: as primeiras 4 horas de embriogênese.

A abordagem é altamente integrativa com técnicas que vão desde genética clássica e biologia molecular até perfil de genoma completo e microscopia de imagem ao vivo de última geração. A quantificação de imagens e a modelagem matemática são aspectos importantes de nossa pesquisa.

Ativação da transcrição em embriões vivos

Figura 1: Transcrição de imagem em embriões vivos


Materiais e métodos

Maturação de ovócitos in vitro, fertilização e cultura de embriões

Os complexos cumulus-oócitos foram aspirados de pequenos folículos antrais (2 a 8 mm de diâmetro) de ovários bovinos obtidos em um matadouro local e foram lavados em TL (tirode-lactato) -HEPES e maturados em TCM-199, 10% fetal soro de bezerro (FCS), piruvato de sódio (0,2 mM), gentamicina (25 μg / ml), FSH (5 μg / ml, FSH-P Scherring-Plough Animal Health, Kennilworth, NJ) e 1 μg / ml de estradiol. Apenas oócitos com citoplasma uniformemente granulado rodeado por múltiplas camadas de células cúmulos compactas foram usados ​​nos experimentos. Dez complexos cúmulos-oócitos foram maturados por gota de 50 μl de meio de maturação sob óleo mineral a 39 ° C, 5% de CO2 em uma atmosfera úmida. Os espermatozoides móveis foram separados do sêmen congelado por centrifugação em gradiente de densidade [23] e adicionados às gotas de fertilização em uma concentração final de 1 × 10 6 espermatozoides / ml. A fertilização foi realizada em gotas de 50 μl de meio TALP contendo BSA (6 mg / ml) e suplementado com penicilamina (20 μM), hipotaurina (10 μM), epinefrina (1 μM) e heparina (2 μg / ml) [24 ] Vinte e quatro horas pós-inseminação (hpi), os embriões foram mecanicamente despojados, com uma pipeta de vidro, de células cumulus e espermatozóides fixados, lavados e cultivados em meio CR1-aa [25] sob as condições ambientais descritas acima.

Grupos de tratamento de inibição

Em todos os experimentos, os zigotos foram atribuídos aleatoriamente a um dos seguintes grupos: embriões de controle sem inibidor, alfa-amanitina (25 μg / ml), afidicolina (4 μg / ml) e TSA (100 nM). Um grupo controle (sem inibidor adicionado) (n = 30) foi sempre cultivado até o estágio de blastocisto, e a taxa de blastocisto foi em torno de 50%. Alfa-amanitina foi usada em uma concentração de 25 μg / ml, que demonstrou inibir mais de 80% da síntese de mRNA em embriões bovinos iniciais [26]. Esta concentração foi escolhida para evitar quaisquer efeitos colaterais. A afidicolina (4 μg / ml) inibe a replicação do DNA em embriões bovinos [27] e de camundongos [28]. O TSA foi usado em duas concentrações diferentes (930 e 100 nM) que deram os mesmos resultados, e os resultados com 100 nM foram relatados. Outra razão para relatar os resultados com 100 nM de TSA foi porque a cultura de embriões com 100 nM de TSA causou um ligeiro aumento na taxa de clivagem do embrião de 2 a 4 células e de 4 a 8 células (resultados não publicados). No mesmo estudo, também mostramos que o TSA a 100 nM causou uma redução na taxa de blastocisto. Isso sugeriu que a desacetilação / acetilação inadequada de histonas centrais desempenha papéis importantes no controle da expressão gênica durante o desenvolvimento embrionário inicial.

Para determinar a atividade transcricional e translacional durante o primeiro e segundo ciclo celular, zigotos (n = 150) e embriões de 2 células (n = 150) foram incubados com os inibidores de 10 hpi a 33 hpi e de 24 hpi a 44 hpi, respectivamente. Os inibidores estavam presentes durante a marcação de proteínas e RNA. Como um controle, os blastocistos do Dia 7 (n = 3 por tratamento) foram cultivados na presença ou ausência de alfa-amanitina, afidicolina, TSA e uridina fria (2 mg / ml), e foram marcados com [3 H] uridina para 2 h. Três blastocistos do dia 7 foram lisados ​​e ribonuclease (RNase) A (100 μg / ml) foi adicionada brevemente antes do isolamento total do RNA. Todas as experiências foram repetidas três vezes.

Marcação de RNA e isolamento de RNA total

Cinquenta zigotos ou embriões de 2 células foram cultivados em 50 μl de meio CR1-aa (sem FCS adicionado) suplementado com 250 μCI / ml [5, 3H] uridina (atividade específica 26-28 Ci / ml Amersham, Arlington Heights, IL ) por 5 h entre 28 e 33 hpi, e 39 e 44 hpi para os zigotos e embriões de 2 células, respectivamente. Após a marcação, zigotos e embriões foram lavados quatro vezes em 3 ml de TL-HEPES e armazenados em um freezer a -70 ° C até serem processados ​​para isolamento de RNA.

O RNA total foi isolado usando um kit de Isolamento de Micro RNA (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, zigotos e embriões de 2 células (n = 150) foram congelados e descongelados três vezes. As amostras foram agitadas vigorosamente por 3 min após a adição do seguinte em cada tubo de amostra: 100 μl de solução desnaturante (isotiocianato de guanídio 4 M, citrato de sódio 0,02 M e sarcosil 0,5%) e 0,72 μl 14,4 M de beta-mercaptoetanol, 10 μl 2 Acetato de sódio M (pH 4,0), 100 μl de fenol saturado com água (pH 5,5) e 20 μl de clorofórmio: álcool isoamílico. As misturas foram então microfugadas por 5 min (13.000 rpm), e a fase superior (contendo RNA) foi transferida para um tubo estéril livre de RNase. Um microlitro de 2 mg / ml de glicogênio, 100 μl de isopropanol e 2 μl de 1 mg / ml de tRNA transportador (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) foram adicionados a cada amostra e misturados por inversão. As amostras foram microfugadas (13.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. O sobrenadante foi removido para outro tubo. O pellet de RNA foi lavado duas vezes com 200 μl de etanol 75% em água estéril tratada com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC).

Determinação da incorporação e absorção de [3 H] uridina

Os pellets de RNA foram ressuspensos em 50 μl de água estéril tratada com DEPC a 0,1% e os tubos foram incubados em banho-maria a 60 ° C por 5 min para facilitar a dissolução do RNA. Quatro mililitros de líquido de cintilação foram adicionados e a radioatividade foi determinada como contagens por minuto (cpm) em um Beckman LS 500TD Liquid Scintillation Counter (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). A incorporação de fundo foi determinada como cpm de embriões não marcados ou água. A captação foi determinada da seguinte forma: durante o isolamento de RNA, todas as fases que não continham RNA (ou seja, interfases e fases inferiores após a primeira centrifugação, sobrenadante após a segunda centrifugação e as duas soluções de lavagem do pellet de RNA) foram salvas em tubos separados e os cpm foram determinados. Essas contagens mais as cpm do RNA total isolado foram determinadas. O cpm para absorção foi determinado subtraindo cpm de 10 μl da última solução de lavagem após a rotulagem do embrião (como fundo) dos cpm anteriores. Os experimentos foram repetidos três vezes usando diferentes pools de embriões. Os dados foram analisados ​​por ANOVA, e as médias foram comparadas por diferença de menor significância protegida [29].

Rotulagem de proteínas e PÁGINA bidimensional (2D)

Zigotos e embriões foram cultivados em gotas de 50 μl de lactato piruvato de albumina de Tyrode (TALP) contendo BSA (6 mg / ml) e suplementado com penicilamina (20 μM), hipotaurina (10 μM), epinefrina (1 μM) e heparina (2 μg / ml) [24]. Duas horas antes da marcação, as células foram transferidas para gotas de 50 μl de meio TALP pré-calibrado sob óleo mineral contendo os inibidores, mas não penicilamina, hipotaurina, epinefrina, BSA ou FCS. Para marcar as proteínas zigóticas e embrionárias recém-sintetizadas, zigotos e embriões foram cultivados por 4 h entre 29 e 33 hpi, e 40 e 44 hpi, respectivamente, em meio sem FCS e BSA suplementado com 0,1% (w: v) de polivinilpirrolidona (Sigma Chemical Co.) e 1 mCi / mL [35 S] metionina (atividade específica 1000 Ci / mmol Amersham). Após a marcação, zigotos e embriões foram lavados quatro vezes em 3 ml de TL-HEPES e armazenados em freezer a -70 ° C até serem processados ​​para 2D-PAGE.

Kendrick Laboratories, Inc. (Madison, WI) realizou 2D-PAGE. A focalização isoelétrica foi realizada em tubos de vidro de diâmetro interno de 2 mm, usando 2,0% de pH 4-8 anfolinas (BDH Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) para 9600 volts / h. Após equilíbrio por 10 min em tampão de amostra de SDS (190% de glicerol, ditiotreitol 50 mM, SDS de 2,3% e Tris 0,0625 M, pH 6,8), os géis de tubo foram selados no topo de géis de placa de acrilamida a 10% (0,75 mm de espessura) , e a eletroforese em gel de placa de SDS foi realizada durante cerca de 4 h a 12,5 mA / gel. As seguintes proteínas (Sigma Chemical Co.) foram adicionadas como padrões de peso molecular a um poço na agarose que selou o gel do tubo ao gel da placa: miosina (220 kDa), fosforilase A (94 kDa), catalase (60 kDa), actina (43 kDa), anidrase carbônica (29 kDa) e lisozima (14 kDa). Esses padrões aparecem como linhas horizontais nos géis de placa de 10% de acrilamida corados com prata [30]. Os géis foram secos entre folhas de papel celofane com a borda ácida à esquerda. A autorradiografia foi realizada com filme Kodak X-OMAT AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) com exposição de 4, 9 ou 12 dias a -70 ° C. Os filmes foram revelados usando o revelador e fixador Kodak. Os experimentos para os estágios de 1 e 2 células foram realizados duas vezes, e os mesmos resultados foram obtidos.

Análises de 2D-PAGE

Dois pesquisadores experientes dos Laboratórios Kendrick analisaram as autorradiografias independentemente para determinar os polipeptídeos que estavam no controle, mas não no grupo alfa-amanitina (esses grupos de polipeptídeos seriam zigóticos / embrionários na origem). A presença ou ausência desses polipeptídeos foi então determinada para os grupos afidicolina e TSA. As autorradiografias foram então escaneadas, as densidades de pixel de cada ponto foram medidas e as densidades de pixel do mesmo volume de uma área de fundo foram subtraídas das densidades de pixel de cada ponto por software de computador (NIH, Bethesda, MD] Analisador de Imagens) em nosso laboratório . As densidades de pixel de cada ponto nos grupos de tratamento foram comparadas ao ponto correspondente no grupo de controle que não teve nenhum inibidor adicionado. O alto nível de marcação foi mostrado como “++” se as densidades de pixel dos grupos de tratamento fossem mais de 3 vezes maiores do que as dos grupos de controle. Se as diferenças nas densidades de pixel dos pontos nos grupos de tratamento e nos grupos de controle fossem entre 1 e 2 vezes menor ou maior, eles recebiam "+" para indicar a marcação do meio se fossem 2 a 3 vezes menores do que o do controle, eles receberam “±” para indicar rotulagem fraca e se eles fossem mais de 3 vezes menores, eles receberam “-” para indicar nenhuma rotulagem. Outras formas de analisar as autorradiografias, como expressar as densidades em relação às densidades de uma proteína de referência (proteína 12 nas autoradiografias deste estudo), também foram levadas em consideração. No entanto, as densidades desta proteína de referência flutuaram entre os grupos experimentais e, portanto, esta opção não foi perseguida. As comparações de intensidade dos pontos foram realizadas apenas dentro de cada estágio da célula, não entre os dois estágios da célula. O maior dos pontos polipeptídicos no estágio de 2 células pode ser devido à exposição mais longa desses géis aos filmes, uma vez que esses géis foram expostos aos filmes por mais tempo do que aqueles do estágio de 1 célula. Cada gel foi carregado com a mesma quantidade de proteínas celulares totais (solúveis). Todos os géis para o mesmo estágio de célula foram expostos a filmes pelos mesmos períodos de tempo, ou seja, 4, 9 ou 12 dias, e os filmes que tiveram os mesmos tempos de exposição foram usados ​​para as análises.


Como a estrutura do cromossomo influencia o desenvolvimento

Uma reconstrução 3D dos cromossomos maternos (vermelho) e paternos (azul) de uma única célula embrionária de camundongo após três dias e meio de desenvolvimento. IMAGEM: Csilla Várnai

Cientistas do grupo Heard da EMBL Heidelberg investigaram a organização tridimensional do DNA em embriões iniciais. Eles descobriram que, durante os primeiros estágios da vida de um embrião, centenas de regiões do genoma estão ativas em apenas uma cópia de um cromossomo - seja aquele recebido da mãe ou do pai - mas quase nunca em ambos ao mesmo tempo. Suas descobertas são relatadas em Natureza.

Um pacote altamente organizado

Em cada uma de nossas células, temos cerca de dois metros de DNA, compactados em um núcleo com menos de um centésimo de milímetro de diâmetro - dez vezes menor que a largura de um fio de cabelo humano. O DNA envolve proteínas chamadas histonas, que ajudam a comprimir o longo fio em uma forma densa e gerenciável: nossos cromossomos. Esse empacotamento não é aleatório, mas altamente organizado, e desempenha um papel importante na regulação da expressão de nossos genes, para que nossas células possam funcionar adequadamente.

Durante os primeiros momentos de nossa vida, o material genético de duas células germinativas - óvulo e esperma - é mesclado para criar as primeiras células que se multiplicarão e formarão nosso corpo. Assim que as células germinativas se fundem, seus cromossomos precisam ser reorganizados. Até agora, não se sabia como isso aconteceu.

Domínios parentais e desenvolvimento inicial

Neste estudo, o grupo Heard da EMBL Heidelberg adaptou uma técnica desenvolvida no laboratório de Peter Fraser na Florida State University, para estudar a estrutura dos cromossomos nos primeiros estágios do desenvolvimento do embrião de camundongo. O método usado pelo Grupo Heard é chamado de captura de conformação cromossômica de alta capacidade de célula única (Hi-C de célula única) e é usado para estudar a estrutura tridimensional dos genomas e as ligações entre essa estrutura e a atividade do genoma. Esta é a primeira vez que um mapa completo da organização dos cromossomos paternos e maternos durante o desenvolvimento inicial do camundongo foi gerado na resolução de uma única célula em um grande número de células - centenas, neste caso.

Os cientistas ficaram surpresos ao descobrir que os dois genomas parentais eram organizados de maneira completamente diferente. “Algumas regiões do genoma formam domínios, como bolas de fios de DNA”, explica Samuel Collombet, pós-doutorado no grupo Heard e primeiro autor do estudo. “Seus cromossomos vêm em pares - um de cada pai - e na maioria das vezes os domínios são basicamente os mesmos em cada cópia do par.”

Nos estágios iniciais do embrião, no entanto - quando é feito de uma a quatro células - a maioria dos domínios são formados no genoma materno, alguns no paterno e quase nenhum nas partes correspondentes de ambos ao mesmo tempo. . Em outras palavras, a maioria das regiões mostra uma organização 3D específica em apenas uma cópia dos dois cromossomos parentais. Em estágios posteriores, quando o embrião é feito de oito células, esses domínios parentais desaparecem e os domínios clássicos que estão presentes em ambos os cromossomos começam a se formar.

Os domínios parentais no embrião inicial provaram ser silenciosos - os genes dentro desse feixe organizado não foram expressos. Uma vez que apenas uma cópia de cada região cromossômica é organizada, apenas uma cópia de cada gene é silenciosa, enquanto a cópia do outro pai é expressa. “Já sabíamos que alguns genes, algumas dezenas, são expressos apenas no genoma materno no início do desenvolvimento”, diz Samuel. “Mas o que descobrimos agora é que centenas de regiões do genoma se comportam dessa maneira.”

Um mapa da organização dos cromossomos

Essas regiões contêm muitos genes que são muito importantes para o desenvolvimento inicial, como Xist - um gene que controla a inativação do cromossomo X em fêmeas de mamíferos, que é um tema-chave de pesquisa no grupo Heard. Como as mulheres têm dois cromossomos X, um deles é desativado para evitar que recebam uma dose dupla prejudicial de produtos do gene do cromossomo X, em comparação com os homens. “Outros genes devem ser mantidos em silêncio ou expressos em um nível baixo para permitir que o embrião se desenvolva, e isso pode ser conseguido herdando uma cópia silenciosa”, diz Samuel.

Com base em seus resultados, os cientistas do grupo Heard podem agora estudar o mecanismo pelo qual os domínios dos pais controlam a expressão do gene e, em particular, a expressão de Xist, que o grupo já está estudando extensivamente. Samuel explica que esta é a primeira vez que eles puderam estudar a organização 3D do cromossomo X e vinculá-lo à expressão do gene durante o desenvolvimento do embrião. “É também a primeira vez que alguém mostra que podemos acompanhar o desenvolvimento do embrião observando apenas a organização dos cromossomos em células individuais”, diz ele. “Isso levanta novas questões sobre o papel da organização dos cromossomos na determinação de como as células se especializam durante o desenvolvimento”.

O estudo fornece um mapa da organização dos cromossomos no genoma do camundongo que agora pode ser usado por outros grupos de pesquisa, como explica Samuel: “Os resultados também fornecem centenas de candidatos a novos genes que podem ser importantes para o desenvolvimento, que nós e outros desejaremos estudar."


Como o tempo de expressão do gene é controlado no desenvolvimento do embrião? - Biologia

Duas horas após o óvulo ser fertilizado, o embrião de Drosophila melanogaster atinge o estágio de blastoderme, durante o qual o desenvolvimento da futura mosca da fruta é um foco de atividade. Cerca de 6.000 núcleos distintos na única célula do ovo migram para a superfície, onde são envolvidos por membranas e, em cerca de meia hora, tornam-se novas células individuais.

Expressão gênica e morfologia do Drosófila embrião, calculado em resolução celular para a superfície tridimensional da blastoderme, pode ser projetado em um cilindro circundante e desenrolado para produzir um mapa planar. (Anterior ou cabeça do embrião está à esquerda, posterior à direita. As bordas superior e inferior do mapa representam a linha média dorsal ou posterior do embrião, com a linha média anterior ou ventral no centro.)

Enquanto isso, a forma da blastoderme permanece a de um ovo, um elipsóide liso, embora um tanto irregular. Mas essa simplicidade logo se perde. No próximo estágio de desenvolvimento, chamado gastrulação, o embrião começa a se enrugar, eventualmente dobrando-se no plano corporal intrincadamente articulado da mosca.

Como sua geometria é descomplicada e os núcleos e células resultantes estão todos próximos à superfície, a blastoderme é um alvo natural dos investigadores que desejam entender como os genes se ligam e desligam em seu caminho para formar o animal inteiro, coordenando sua expressão no tempo e espaço.

Recentemente, pela primeira vez, pesquisadores do Berkeley Lab, UC Berkeley e UC Davis, como membros do Berkeley Drosophila Transcription Network Project (BDTNP), desenvolveram métodos para olhar para o Drosófila blastoderme em três dimensões, na resolução de células individuais, ao mesmo tempo que mede com precisão a expressão de vários genes conforme eles interagem para dar forma à mosca.

"Visualizar a expressão do gene e analisar a morfologia de um organismo inteiro na resolução celular nunca foi feito antes", diz David Knowles, do Grupo de BioImaging da Berkeley Lab Life Sciences Division.

Revelações 3-D em resolução celular

Em sua primeira aplicação, os novos métodos usados ​​pela equipe do BDTNP detectaram características morfológicas e de expressão gênica nunca vistas antes, derrubando algumas suposições arraigadas no processo.

Uma característica marcante do desenvolvimento durante o estágio de blastoderme é a formação de "listras de expressão" que circundam o embrião e se movem sobre sua superfície, as listras movendo-se do que seria a cabeça do organismo em direção à cauda. Os genes que dão origem a essas listras controlam a segmentação posterior do embrião. Antes do trabalho do BDTNP, os biólogos que estudavam esse sistema se limitavam a imagens bidimensionais da blastoderme obtidas em diferentes estágios de embriões fixos, nenhum dos quais idênticos.

Com este arranjo, a expressão gênica não poderia ser atribuída a núcleos específicos de uma imagem de um embrião fixo para a próxima, a suposição surgiu, quase por padrão, que o movimento espacial dos padrões de faixa era devido apenas à expressão gênica e não ao movimento de os núcleos & # 151 uma suposição altamente plausível, considerando que muitos dos produtos de expressão são fatores de transcrição que regulam a expressão de outros genes.

Calculado a partir de imagens tridimensionais brutas do embrião (à esquerda, com núcleos manchados de branco, expressão de um gene chamado Caracol manchado de vermelho, e a expressão de um gene chamado véspera manchado de verde), PointClouds podem ser renderizados como esferas ou blocos (direita), suas cores combinadas indicando o grau de expressão dos genes por cada núcleo em um determinado estágio. As setas nos painéis indicam os mesmos três núcleos.

Os colaboradores do BDTNP também começaram por imagens de embriões fixos, mas eles os imaginaram inteiros em três dimensões. Em seguida, eles aplicaram um conjunto sofisticado de ferramentas de modelagem e análise de dados. "Montamos um pipeline para fazer e comparar milhares de imagens microscópicas de alta resolução de diferentes embriões em diferentes estágios de desenvolvimento da blastoderme", diz Knowles. "Para cada imagem, coramos o DNA total, o que dá a localização de cada núcleo, além de corar os padrões de expressão de dois genes específicos."

Por análise de computador de imagens brutas de embriões tridimensionais, cada uma com cerca de 500 megabytes de tamanho, as imagens foram convertidas em pequenos arquivos de texto fáceis de manipular chamados PointClouds. Cada PointCloud registra o centro de massa de todos os núcleos e a expressão de dois genes dentro e ao redor de cada núcleo de um embrião.Ao combinar dados para vários PointClouds, os pesquisadores puderam estimar as concentrações de vários produtos de genes diferentes em cada célula em desenvolvimento.

O biólogo Mark Biggin, da Divisão de Genômica, diz: & quotO estágio de desenvolvimento de cada embrião do qual nossas PointClouds foram derivadas é conhecido, mas como podemos dizer que esta célula em um embrião é a mesma que a célula em outro? A resposta é: criamos um modelo & # 151 uma média, modelo estatístico & # 151 com base em nossas observações. E então o testamos. & Quot

Biggin explica: “Conseguimos preencher nosso modelo com pontos que poderíamos usar para prever qualquer possível movimento nuclear. E poderíamos medir separadamente o fluxo de expressão rastreando a coleção de genes expressos. ”Características inesperadas do blastoderma tornaram-se imediatamente aparentes.

“Com esse novo modelo de embrião, pudemos ver a mudança relatada anteriormente nas listras de expressão gênica”, diz Biggin, “mas também vimos que os núcleos de fato se movem. Os padrões de expressão gênica movem-se parcialmente em sincronia com essas mudanças na morfologia, mas parcialmente independentemente. Há uma interação intrincada entre quais genes são expressos e como os núcleos se movem. & Quot

Os núcleos corados de um único embrião vivo foram rastreados durante o estágio de blastoderme. As setas vermelhas indicam os núcleos que se moveram mais longe, as setas azuis os que se moveram menos. O movimento dos núcleos em embriões vivos corresponde às previsões do modelo.

Para comprovar a previsão do modelo de que os núcleos se movem, os pesquisadores também acompanharam o desenvolvimento de embriões vivos durante o estágio de blastoderme. Embora os métodos para examinar embriões vivos forneçam apenas medições parciais e menos precisas, as previsões do modelo foram realmente confirmadas.

A capacidade de modelar todas as três dimensões da blastoderme revelou novas informações adicionais sobre o sistema. Por um lado, diz Knowles, & quotExpressão de genes que se pensava anteriormente apenas para regular o desenvolvimento ao longo do eixo anterior-posterior & quot & quot & quot & quot & quot & quot; o eixo cabeça-cauda & & # 151 & & quot; quotalso muda ao longo do eixo dorsal-ventral & quot & quot & # 151 back to front. & quotAo contornar o embrião em 3 & # 8209D, vemos mudanças na expressão ao longo de ambos os eixos. & quot

Direções futuras

Tendo produzido a primeira descrição quantitativa e tridimensional da expressão gênica e morfologia de todo o embrião na resolução celular, os pesquisadores estão ansiosos para avançar para o próximo estágio de descoberta.

“Sabemos tanto sobre a biologia deste organismo quanto de qualquer outro, mas na verdade não temos dados suficientes”, diz Biggin. & quotUma aproximação de primeira ordem do que está acontecendo no embrião não é boa o suficiente. Quando você tem precisão até o nível da célula, como fazemos agora, tudo o que você precisa fazer é fazer uma pergunta e descobrirá algo. Nosso estudo atual envolve um número limitado de genes agindo em uma pequena janela de tempo. Você apenas sabe que deseja esse tipo de informação para todo o curso de desenvolvimento da mosca e para milhares de genes. & Quot

Os membros do Berkeley Drosophila Transcription Network Project incluem (da esquerda) Hanchuan Peng, Angela DePace, Oliver R bel, Jitendra Malik, Charless Fowlkes, Mark Biggin, Mike Eisen, Soile Ker nen, Bernd Hamman, Cris Luengo, Damir Sudar, Gunther Weber e David Knowles. (Imagem cortesia de David Knowles, visualização de plano de fundo do programa BDTNP PointCloudXplore.)

Os pesquisadores baseados em Berkeley não têm intenção de investigar essas questões sozinhos. & quotO objetivo é compreender melhor a rede de transcrição & quot, diz Knowles. & quotLançamos todos os nossos dados atuais do PointCloud, não analisados, no site do projeto da rede de transcrição de Berkeley Drosophila, onde qualquer pessoa pode baixá-los e usá-los em suas próprias pesquisas. & quot

As notáveis ​​descobertas do BDTNP até o momento são prova da força de & quotunião de diferentes talentos & quot, como diz Biggin: & quotspecialists em imagem, ciência da computação, visualização e biologia. & Quot É uma abordagem que deve levar a uma melhor compreensão do desenvolvimento não apenas em a mosca da fruta, mas também em muitos outros organismos.

O trabalho conduzido pelo BDTNP é financiado por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano e do Escritório de Ciência do Departamento de Energia.


EmExplorer: um banco de dados para explorar a ativação no tempo da expressão gênica em embriões de mamíferos

Compreender o desenvolvimento inicial oferece uma oportunidade notável para investigar doenças genéticas, células-tronco e tecnologia de reprodução assistida. Avanços recentes na tecnologia de sequenciamento de alto rendimento levaram ao crescente influxo de dados ômicos, que aumentaram rapidamente nossa compreensão dos mecanismos de desenvolvimento dos mamíferos. Aqui, revisamos o banco de dados EmExplorer (um banco de dados para explorar a ativação temporal da expressão gênica em embriões de mamíferos), que organiza sistematicamente os genes de vias relacionadas ao desenvolvimento, e que já estabelecemos e continuamos a atualizá-lo. A versão atual do EmExplorer incorpora mais de 26.000 genes obtidos de 306 vias funcionais em cinco espécies. As anotações de função de genes relacionados ao desenvolvimento também foram integradas ao EmExplorer. Para facilitar a extração de dados, o banco de dados também contém as seguintes informações. (i) Os valores de expressão dinâmica para cada estágio de desenvolvimento são combinados com os genes correspondentes. (ii) Uma ferramenta de pesquisa de duas camadas que oferece suporte à pesquisa com várias opções, como por símbolo oficial, nome do caminho e anotação de função. As entradas retornadas podem vincular diretamente aos resultados da análise para o gene ou via correspondente no módulo de análise. (iii) O módulo de análise fornece diferentes comparações de genes no nível de multiespécies e no nível da via funcional, o que mostra a especificidade da espécie e a especificidade do estágio no nível do gene ou da via. (iv) A análise baseada no teste de distribuição hipergeométrica revela o enriquecimento das funções gênicas em um determinado estágio da via de um organismo. (v) O navegador é projetado para usuários com objetivos de pesquisa ambíguos e ajuda muito os novos usuários a terem uma ideia geral do conteúdo do banco de dados. (vi) Os caminhos validados experimentalmente são selecionados manualmente e mostrados na página inicial. O EmExplorer será útil para elucidar os mecanismos de desenvolvimento inicial e explorar os genes de ativação no tempo. O EmExplorer está disponível gratuitamente em http://bioinfor.imu.edu.cn/emexplorer.

1. Introdução

O embrião pré-implantação é o estágio inicial do desenvolvimento embrionário dos mamíferos, cujo processo é bastante complexo. Durante esta fase, as redes que compreendem várias interações moleculares têm um papel crítico durante uma determinada fase da embriogênese [1]. A maioria dos desenvolvimentos embrionários pré-implantação de mamíferos são extremamente semelhantes e altamente ordenados. Durante o processo embrionário inicial, o zigoto unicelular continua a proliferar e, finalmente, forma um blastocisto, que é composto por um certo número de células. O desenvolvimento embrionário pré-implantação de mamíferos consiste em uma série de eventos importantes, como a maturação do oócito, a mitose da primeira célula, a transição materna para zigótica, a ativação do genoma embrionário e a decisão do destino celular [2–5]. Acredita-se que a fertilização seja controlada por programas reguladores de genes especializados, que controlam estritamente as diferentes expressões gênicas durante cada estágio de desenvolvimento [6-9]. A importância dos estudos no campo pré-implantação foi enfatizada anteriormente no nível molecular, o que demonstrou que o transcriptoma no estágio inicial de desenvolvimento desempenha papéis críticos no controle e manutenção da identidade celular. A implementação da reprogramação também depende de um conhecimento profundo do transcriptoma do mRNA [10].

Com o amplo uso da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, o conhecimento dos dados de expressão de genes de desenvolvimento embrionário inicial aumentou significativamente [11]. Após o primeiro perfil de transcriptoma obtido no Genome Array, transcriptomas dinâmicos de oócitos metafase II para blastocisto, que é o estágio terminal de embriões pré-implantação, foram testados com sucesso [12]. Os dados obtidos com esta tecnologia são descritos como o valor da expressão da sequência de tempo. Os dados experimentais ajudam muito os pesquisadores a decifrar as redes regulatórias que contribuem para as mudanças morfológicas no desenvolvimento do embrião. A análise de dados demonstrou que a principal transição materna para zigótica começa dos estágios de quatro células para oito células, durante os quais os maiores genes do genoma zigótico foram ativados [13]. Os biólogos estão encontrando métodos eficazes para coletar e classificar o maior número de genes. Com um quadro altamente ordenado, podemos fazer comparações entre diversos genes e até mesmo fazer comparações em nível de espécies cruzadas [14]. Por meio dessas comparações, os pesquisadores podem encontrar genes de expressão em estágio específico de uma determinada espécie. Além disso, parece ser de grande valor extrair genes de expressão específicos da espécie.

Até agora, alguns bancos de dados online foram desenvolvidos para mineração em profundidade de genes relacionados ao desenvolvimento e sua expressão dinâmica em diferentes estágios de desenvolvimento. Estudos anteriores também sugeriram que a análise das redes gênicas e das vias moleculares no nível do transcriptoma pode oferecer um ponto de entrada para a compreensão do mecanismo de temporização [15]. Uma análise mais aprofundada do transcriptoma revelou vários padrões de mudanças na atividade transcricional durante a transição através da compactação e formação de blastocisto [8]. Já existem vários bancos de dados existentes, como DevMouse [16], GED [17], DBTMEE [18], MetaImprint [19] e EMAGE [1]. Os dados ordenados por tempo nessas fontes online mostram vividamente as mudanças em cada estágio. No entanto, todos os bancos de dados acima têm os seguintes problemas: (i) eles são desenvolvidos principalmente para o desenvolvimento de embriões de camundongos, de modo que um banco de dados para várias espécies precisa ser estabelecido com urgência (ii) os genes ainda são unidades discretas nesses conjuntos de dados, pois não podem ser bem ordenado apenas na sequência de tempo (iii) a especificidade da expressão gênica está intimamente relacionada à sua função, porém existem poucos bancos de dados publicados neste campo (iv) os atuais bancos de dados online não têm conseguido fazer comparações entre diferentes espécies. Assim, o novo desafio é implementar um método de organização altamente eficiente entre genes que cruzam várias espécies. Nossa equipe de pesquisa havia relatado anteriormente o momento da ativação de todo o genoma da via funcional da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) na embriogênese pré-implantação de bovinos [20]. Os resultados confirmaram as principais vias funcionais de embriões bovinos, incluindo a via funcional relacionada à organela, vias de junção e vias de receptor, e que eles passam por uma ativação sucessiva ordenada no tempo [21,22]. Assim, parecia que reunir diversos genes por meio de diferentes vias funcionais é uma forma eficiente de estudar a rede entre diferentes genes. Além disso, as vias funcionais têm grande semelhança entre diferentes mamíferos. Portanto, coletar, categorizar e analisar cada via funcional não só pode classificar diversos genes, mas também parece ser uma maneira de obter comparações entre diferentes espécies.

Até onde sabemos, o EmExplorer é o primeiro recurso multiespécies baseado na Web com foco na expressão temporal de genes relacionados ao desenvolvimento. A versão mais recente do EmExplorer fornece um caminho molecular claro, anotação de função e informações de expressão dinâmica em diferentes estágios de desenvolvimento pré-implantação. Além disso, oferece uma ferramenta de análise online para pesquisar, navegar e visualizar os genes do desenvolvimento com suas expressões dinâmicas durante os diferentes estágios de desenvolvimento. Os usuários também podem fazer comparações de expressão para um gene específico ou via funcional entre diferentes espécies usando a ferramenta online. O EmExplorer pode ajudar os pesquisadores a entender a expressão temporal de genes específicos em cada estágio de desenvolvimento, o que pode inspirar biólogos e permitir que realizem estudos adicionais em reprogramação celular ou desenvolvimento de embriões. Este banco de dados ajudará em estudos adicionais em tecnologia de reprodução assistida e medicina regenerativa.

2. Material e método

2.1. Derivação de genes relacionados ao desenvolvimento

A versão atual do EmExplorer foi projetada para fornecer informações relacionadas ao gene do desenvolvimento embrionário inicial sobre a via, informações básicas, anotação de função e o valor de expressão temporal mais significativo. Conforme mostrado na figura 1, o banco de dados KEGG foi escolhido como a fonte de dados do caminho original. Foi pesquisado com palavras-chave específicas, inserindo "desenvolvimento embrionário", para diferentes espécies. Finalmente obtivemos uma média de 300 caminhos relevantes para cada organismo após filtrar o conjunto de dados de caminhos manualmente. A versão atual contém cinco mamíferos, e os números detalhados de vias para cada espécie são ilustrados na tabela 1. No total, os cinco mamíferos contêm 306 vias funcionais. Ao minerar os genes sob os caminhos de cada espécie, coletamos mais de 13.000 genes relacionados ao desenvolvimento (incluindo mais de 3200 genes comuns e genes específicos da espécie) para cinco espécies, incluindo 5098 Homo sapiens genes (humanos), 5874 Mus musculus genes (de camundongo), 6073 Bos taurus (gado) genes, 5565 Sus scrofa (javali) genes e 4290 Macaca mulatta (macaco rhesus) genes. O nome latino para organismos no EmExplorer corresponde ao nome latino no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) e bancos de dados KEGG, que são cepas específicas para cada espécie. As informações detalhadas para todos os genes foram comparadas às informações obtidas no NCBI. Os genes foram posteriormente anotados pelos termos correspondentes armazenados na Gene Ontology. A integração das anotações de função fornece informações mais abrangentes. Além disso, pode fornecer aos usuários percepções sobre a maneira como um gene realmente funciona.

Figura 1. Visão geral do processo de estabelecimento e fluxo de trabalho do EmExplorer. O EmExplorer integra genes associados ao desenvolvimento de recursos públicos e os classifica em caminhos funcionais. Os usuários podem inserir palavras-chave no mecanismo de consulta e as informações relevantes serão extraídas do banco de dados. As ferramentas de análise permitem que os usuários façam comparações entre genes em diferentes níveis. Todos os resultados de pesquisa e análise serão úteis para análises posteriores.


Coreografia Genética do Embrião Humano em Desenvolvimento

Anos atrás, quando eu estava ensinando em uma universidade estadual, tive o privilégio de mostrar embriões e fetos humanos reais para minhas aulas de genética. Um obstetra na década de 1950 os salvou depois que as pacientes abortaram, com permissão, me disseram, e doou a coleção para o departamento de biologia.

Meus alunos ficaram surpresos com as formas que flutuavam em ordem de tamanho em seus tubos de ensaio e frascos, culminando em um feto de 8 meses em um pote de maionese gigante. Lidei com eles com muito cuidado e respeito.

Uma vez, quando eu estava empurrando a coleção pelo campus em um carrinho de compras para chegar à aula, os alunos me abordaram, supondo que eu fosse uma pessoa com direito a viver a caminho de um evento. Não, eu expliquei, eles eram para uma aula de biologia. E um dia eu trouxe minha filha de 4 anos para o campus e ela viu o feto de 8 meses e começou a chorar & ndash parecia muito com sua irmãzinha.

Embrião humano que foi abortado espontaneamente 44 dias após a fertilização, próximo a um centavo.

Anos depois, encontrei um dos preciosos tubos de ensaio embrulhado em toalhas de papel em uma caixa de papéis de exame. Eu não aceitei intencionalmente. Coloquei em um lugar especial e desembrulhei para este post. O embrião foi coletado no dia 44 e aparece à direita próximo a um centavo para ter perspectiva.

Embriões e fetos humanos apresentam imagens poderosas. Para meus alunos, ver a coisa real foi inesquecível de uma forma que ilustrações, fotos e filmes podem ser. Hoje, outdoors perto de minha casa retratam bebês felizes com slogans anunciando em que semana um batimento cardíaco, impressões digitais e sorrisos surgiram, provavelmente para causar uma sensação de culpa nas mulheres que devem decidir interromper a gravidez. As mensagens me fazem ansiar por uma lata de tinta spray.

Os embriologistas (também conhecidos como biólogos do desenvolvimento) têm tradicionalmente usado um sistema de classificação de 23 & ldquoCarnegie estágios & rdquo com base nas características físicas visíveis em certas datas. Um embrião humano com 32 dias, por exemplo, tem de 4 a 6 milímetros de comprimento e tem botões nas pernas, fossos nas orelhas, espessamentos na camada externa que se tornarão lentes e 30 segmentos corporais (somitos) que se desenvolverão em partes especializadas do corpo. No dia 56, o embrião tem de 27 a 32 mm de comprimento e a cabeça agora compreende metade do corpo. Tem um queixo, membros estendidos com franjas nos dedos das mãos e dos pés, e a sensação de genitália.

O período do embrião vai da fertilização até o dia 58, final da semana 8. A marca de duas semanas é quando as três camadas de tecido primordial (ectoderme, endoderme e mesoderme) emergem e depois se curvam para formar a gástrula clássica, a partir da qual os órgãos se desdobram e se elaboram de acordo com um programa genético preciso.

A partir da semana 3, os rudimentos dos órgãos começam a se formar e, uma semana depois, esse período de organogênese se acelera. A transição embrião / feto ao final da oitava semana (contando desde a concepção, não o confuso atalho do período menstrual quolástico dos obstetras) é quando todas as estruturas precursoras estão presentes. Cuidado com os cartazes nos protestos da Paternidade planejada e na mídia que mesclam embrião e feto - eles são estágios biologicamente distintos do desenvolvimento pré-natal. Eu já vi materiais impressos em consultórios obstetras referindo-se a um embrião ou feto quando bebê.

Um modelo de um embrião humano de 8 semanas.

A encenação de Carnegie é baseada no que é visível. Mas o genoma controla o lançamento das mudanças anatômicas observáveis ​​que conduzem a jornada do embrião ao feto. Um artigo recente impressionante na revista eLife, de Dave T. Gerrard e Neil Hanley e colegas da University of Manchester e Central Manchester University Hospitals, National Health Service Foundation Trust no Reino Unido, oferece uma visão inteiramente nova do embrião humano com base em expressão gênica em e através de órgãos específicos.

A investigação difere de direções de pesquisas anteriores para sondar o desenvolvimento pré-natal, como analisar RNA de embriões inteiros, observar células-tronco conforme suas células-filhas se diferenciam, modelos animais de doenças humanas, criar organoides humanos nutridos em laboratório e inferir os desvios de desenvolvimento por trás de certos nascimentos defeitos.

SEGUINDO A EXPRESSÃO DO GENE À MEDIDA QUE OS EMBRIÕES SE DESENVOLVEM

O relatório, & ldquoAn integrative transcriptomic atlas of organogenesis in human embryos, & rdquo weds a ferramenta estatística de análise de componente principal (PCA) para vias de linhagem celular que se estendem como as divisões celulares de clivagem inicial e camadas de tecido tornam-se organogênese.O PCA reduz grandes conjuntos de dados a um número gerenciável que representa tendências ou subestruturas dentro de muitas variáveis. A abordagem, que os pesquisadores chamam de LgPCA para & ldquolineage guiado PCA & rdquo, identifica & ldquometagenes & rdquo, que são grupos de genes que participam da formação de partes específicas do corpo do embrião, alguns deles multi-tecidos.

O novo trabalho cataloga RNAs que são transcritos dos genes que são acessados ​​à medida que o desenvolvimento avança do final da terceira semana até o final da oitava. A pesquisa foi possível devido ao legado de décadas de obtenção ética de tecido embrionário de mulheres submetidas à interrupção voluntária da gravidez no Reino Unido. O site da Human Tissue Authority descreve todas as nuances do trabalho com células, tecidos e órgãos humanos. Inclui questões bioéticas, como consentimento e dignidade, exibições em museus, ideias religiosas e culturais sobre a doação de órgãos, uso de células-tronco e outras linhas de células e uso de tecido embrionário e fetal de interrupções da gravidez.

Os pesquisadores coletaram o material e então dissecaram 15 partes específicas para análise. As amostras incluíam órgãos inteiros, como glândulas supra-renais, bem como segmentos distintos, como o epitélio pigmentar da retina no olho, o estômago desequilibrado de seus esfíncteres e botões de membros. Os pesquisadores reuniram partes para isolar RNA suficiente para analisar e identificar as regiões do genoma a partir das quais foram transcritos.

Mais de 6.000 & ldquo CÓDIGOS TRANSCRIPCIONAIS & rdquo

A PCA guiada por linhagem permitiu aos pesquisadores rastrear a expressão gênica em partes feitas de vários tipos de tecido, como o palato.

Ao isolar RNAs de partes distintas do corpo, os pesquisadores puderam identificar as sequências de DNA por trás de anomalias congênitas complexas que envolvem mais de um tipo de tecido, como fenda palatina e algumas formas de doença cardíaca congênita.

A descoberta mais inesperada foi que cerca de 90 por cento dos 6.251 novos transcritos de RNA identificados não são a variedade usual de codificação de proteína, mas são & ldquolong intergênicos RNAs não codificantes & rdquo aka & ldquoLINC RNAs. & Rdquo Eles são altamente específicos para partes do corpo, onde eles aparentemente controlam a implantação de proteínas de fator de transcrição, que por sua vez dirigem o programa de ativação e supressão de genes que supervisiona diretamente as mudanças de desenvolvimento.

O enorme conjunto de dados rendeu 11 metagênios. Um exemplo é o & ldquometagene 2 & rdquo, que representa 39 genes que esculpem o fígado embrionário. Como a abordagem LgPCA é baseada em linhagens celulares, ela pode revelar os programas genéticos por trás das síndromes de desenvolvimento, como a síndrome de Holt-Oram que afeta os membros e o coração.

Conhecer esses controles genéticos por trás da organogênese pode talvez levar ao desenvolvimento de testes de diagnóstico ou até mesmo identificar alvos de drogas. Na frente de pesquisa, conhecer os padrões de expressão gênica e sinais que anunciam um evento & ndash a formação de um baço, por exemplo & ndash pode estabelecer referências que podem ser usadas na criação de células-tronco pluripotentes induzidas e induzindo-as à especialização.

Estou totalmente fascinado com essa nova lente da organogênese. Os pesquisadores descrevem melhor o impacto de seu trabalho: & ldquothe descoberta de um novo programa importante de transcrição não-codificante adiciona uma nova camada de detalhes sobre a regulação espaço-temporal do genoma humano. & Rdquo

Uma sequência de DNA não é n & rsquot & ldquojunk & rdquo apenas porque não sabemos sua função.

Acho que a identificação de um papel para RNAs não codificadores de proteínas na escultura dos órgãos do embrião está no mesmo nível da descoberta de que os genes estão em pedaços & ndash os íntrons cortados, deixando apenas os exons para codificar a proteína & ndash articulados tão lindamente por Walter Gilbert em 1978. A descoberta dos introns dissipou instantaneamente a visão de longa data do gene como um único e elegante código de DNA para uma molécula de RNA.

Como os íntrons, os RNAs do LINC também não eram bem compreendidos porque não codificam proteínas. A maravilha da genética é que muitas vezes pensamos que sabemos perto de tudo o que há para saber, apenas para descobrir mais uma linguagem oculta da vida.


Como o tempo de expressão do gene é controlado no desenvolvimento do embrião? - Biologia

Drosophila melanogaster: embriogênese
Por 13 mitoses, as membranas brotam para envolver os núcleos para formar células (blastoderma celular).

15 células posteriores (células polares) são sequestradas e se tornam a linha germinativa.
Durante o primeiro

3 horas grandes moléculas, como proteínas, podem mover-se entre os núcleos até que ocorra a celularização.
Uma única camada de células dá origem a todos os tecidos.
A gastrulação começa em

3 horas
1) Mesoderma formas de tecido ventral.
2) intestino médio de endoderma nas extremidades anterior e posterior.
3) Ectoderma permanece do lado de fora.

Drosophila melanogaster: gastrulação
o tubo mesodérmico formas do tecido ventral, em seguida, as células se separam e se movem para locais internos sob o ectoderma.
O mesoderma torna-se tecido muscular e de conexões.

Em insetos, o cordão nervoso encontra-se ventralmente (vertebrados: dorsal).
Neuroblastos forma uma camada entre o mesoderma e o ectoderma externo.
o intestino médio (anterior e posterior) crescem de fios e se fundem.
= intestino médio anterior e posterior
Ectoderma torna-se epiderme.
Sem divisão celular ocorre durante a gastrulação, mas a divisão reinicia depois.

Drosophila melanogaster: segmentação
o germband (blastoderme ventral) é a região principal do tronco.
O processo de extensão de banda germinativa empurra a extremidade posterior sobre o lado dorsal.
Os primeiros sinais de ranhuras de segmentação parecem delinear parassegmentos que dão origem a segmentos.
Os segmentos são formados a partir da parte posterior de um parassegmento e da parte anterior do próximo.
Existem 14 parassegmentos: 3 boca, 3 tórax, 8 abdominais.

Drosophila melanogaster: larvas
As larvas eclodem 24 horas após a fertilização.
As estruturas larvais dignas de nota incluem.
A extremidade anterior é o acron.
A extremidade posterior é o telson.
Junto com a cabeça, a larva possui 3 segmentos torácicos e 8 segmentos abdominais.
O lado ventral das larvas tem cintas denticulares, remendos alternados de pêlos do dentículo e cutícula em cada segmento, usados ​​para locomoção.

Drosophila melanogaster: metamorfose
Três estágios de vida larval são separados por mudas.

1º instar - (Molt) -> 2º instar - (Molt) -> 3º instar

Larvas de terceiro instar formam pupas (pupação) sofrer metamorfose.
Os tecidos adultos surgem de discos imaginais e histoblastos.
Os discos imaginais são pequenas folhas de epiderme (

40 células de cada blastoderme celular) que crescem ao longo da vida larval.
6 pernas, 2 asas, 2 haltere, 2 antenas oculares, além de órgãos genitais, discos de cabeça e

10 histoblastos (ninho de células no abdômen que dão origem aos segmentos abdominais).

Técnica: Mutagênese e triagem genética
Embora os mutantes possam surgir espontaneamente, a mutação induzida e a triagem tornaram-se a forma padrão de identificar genes importantes para o desenvolvimento.
Para gerar mutantes em um gene específico, um mutagênico químico, como metanossulfonato de etila (EMS), é alimentado para um grande número de moscas machos.
Os espermatozoides desses machos são expostos ao mutagênico.
Os machos são cruzados com fêmeas que carregam um cromossomo balanceador do gene de interesse.
Os indivíduos portadores de um cromossomo mutagenizado e um balanceador são isolados.
Eles são cruzados para indivíduos portadores do cromossomo balanceador.
Na próxima geração, os descendentes que carregam o cromossomo mutagenizado e o cromossomo balanceador (heterozigotos balanceados) são cruzados.
A progênie homozigótica é examinada e irmãos heterozigotos balanceados são selecionados para manter a linhagem.

Desenvolvimento da drosófila: o plano corporal
Os genes que controlam o desenvolvimento em Drosophila são muito semelhantes aos que controlam o desenvolvimento em vertebrados.
Drosophila é o sistema de desenvolvimento mais bem compreendido, com grande impacto em nosso conhecimento de todo o desenvolvimento. (por exemplo, os genes Hox foram encontrados pela primeira vez em Drosophila.)
A simetria bilateral é estabelecida pelos eixos A / P e D / V.
A larva possui um acrônio anterior, três segmentos torácicos e oito abdominais e um télson posterior.
O padrão inicial ocorre no blastoderma sincicial e se torna multicelular no início da segmentação.
Gradientes de concentração de proteínas (fatores de transcrição) podem se difundir, entrar nos núcleos e fornecer informações posicionais.

Desenvolvimento da drosófila: genes maternos e zigóticos
Os genes maternos estabelecem os eixos do corpo.
Produtos de genes maternos, mRNAs e proteínas são expressos no ovário.
Os genes zigóticos são expressos por um embrião.
Cerca de cinquenta genes maternos configuram os eixos A / P e D / V: a estrutura da informação posicional (distribuições espaciais de RNA e proteínas).
Os genes zigóticos respondem à expressão gênica materna.
Primeiro, regiões amplas são estabelecidas, depois domínios menores (com um conjunto único de atividades do gene zigótico) em uma hierarquia de atividade do gene.

Desenvolvimento da drosófila: o eixo A / P
Três classes de genes maternos configuram o eixo A / P
Os genes expressos pela mãe distinguem o anterior do posterior.
Mutantes de efeito materno resultam em fêmeas que não podem produzir progênie normal.
Três classes de mutantes são 1) anterior, 2) posterior e 3) classes terminais.
Classe anterior: perda de cabeça e tórax (às vezes substituído por posterior).
Classe posterior: perda de segmentos abdominais.
Classe terminal: acron e telson ausentes.
bicoid, corcunda, nanos e caudal são fundamentais para o eixo A / P.

Desenvolvimento da drosófila: genes maternos
bicoid é sequestrado no oócito durante a oogênese.
bicoid define um gradiente morfogênico A / P e controla os primeiros passos no desenvolvimento do embrião e, portanto, é essencial para o organismo em desenvolvimento.
O mRNA bicoid está localizado na extremidade anterior do ovo não fertilizado.
Após a fertilização, o mRNA é traduzido e um gradiente de concentração é formado ao longo do eixo A / P.
bicoid foi a primeira evidência de um gradiente de morfogênio.

Desenvolvimento da drosófila: pistas para o papel do bicoid
1) fêmeas bicoid (bcd) põem ovos que dão origem a embriões sem cabeça e tórax (e têm um télson anterior).
2) Embriões sem citoplasma anterior se assemelham a acima.
3) embriões bcd resgatados por injeções de citoplasma anterior.
4) O citoplasma anterior pode induzir segmentos ectópicos da cabeça e do tórax por injeção no meio de um ovo bicoide.
5) a hibridização in situ mostra que o RNA bicoide está na parte anterior do ovo não fertilizado (ligado ao citoesqueleto).
6) Proteína que não está no ovo, forma gradiente A / P após a fertilização.
7) bicoid: fator de transcrição e morfogênio amp.
8) outros genes maternos do grupo anterior (grupo 1) estão envolvidos na localização bicoid e no controle translacional.

O padrão posterior é controlado por nanos e gradientes de proteína caudal amp (grupo 2)
nanos mRNA está localizado no pólo posterior do ovo.
nanos NÃO é um morfogênio como bicoide, mas atua para suprimir a tradução de outro gene materno, corcunda (hb).
corcunda é maternal (presente em níveis baixos no embrião) E zigótico (o último é ativado por níveis altos bicoid).
nanos (e pumilio) se ligam ao mRNA de hb para evitar a tradução.
o mRNA caudal é distribuído uniformemente.
O gradiente P-A da caudal é estabelecido pela inibição da síntese protéica caudal por bicoid.
[bcd e hb correm em gradientes de A a P e amp caudal correm de P a A.]
Os extremos anterior e posterior são especificados pela ativação do receptor da superfície celular

Os genes maternos do grupo 3 especificam as regiões do acrônio e do télson.
os mutantes do torso não desenvolvem regiões de acrônio nem de télson.
o tronco codifica uma proteína receptora uniformemente distribuída que é ativada pelo ligante presente apenas nas partes anterior e posterior da membrana vitelina.
O ligante é liberado após a fertilização.
torso (um receptor tirosina quinase) sinaliza para dirigir a expressão do gene zigótico terminal.
A polaridade D / V é devida às proteínas da membrana vitelina.
Na fertilização, uma proteína depositada na membrana vitelina ventral inicia uma série de reações que, em parte, ativa (corta) o respingo: o ligante para o receptor uniformemente distribuído Toll.

dorsal fornece informações posicionais ao longo do eixo D / V
dorsal fornece informações posicionais ao longo do eixo D / V
No blastoderma sincicial, dorsal (um fator de transcrição) é ativado e entra nos núcleos próximos.
Dorsal está em maior concentração nos núcleos ventrais (pouco ou nenhum está presente nos núcleos dorsais).
Toll sinaliza a degradação do cacto protéico materno.
Sem sinal de pedágio, o cacto se liga dorsal para mantê-lo no citoplasma.
Dorsal e cacto são homólogos do vertebrado NF-kappa-B e I-kappa-B.

Polarização dos eixos do corpo durante a oogênese
Polarização dos eixos do corpo durante a oogênese
No germário, uma célula-tronco dá origem a 16 células por quatro divisões mitóticas que se tornam o oócito e 15 células nutridoras, todas as quais são conectadas por pontes citoplasmáticas.
Uma bainha de células foliculares somáticas envolve as células nutridoras e o oócito para formar a câmara do ovo que segregam a membrana vitelina e a casca do ovo.
Os sinais das câmaras de óvulos mais velhos atuam para polarizar os mais jovens.
Alguns sinais comuns estão aqui.

Os eixos A / P e D / V do oócito são especificados por interações com células foliculares
O oócito induz as células foliculares a adotarem o destino posterior e as células do folículo anterior não estão em contato com o oócito.
O sinal do oócito para as células foliculares é a proteína gurken, um membro da família TGF-alfa.
gurkin se liga ao torpedo, um receptor tirosina quinase semelhante ao receptor EGF.
As células foliculares sinalizam de volta para reorganizar o citoesqueleto dos oócitos, que direciona o mRNA bicoid para o anterior e o oskar mRNA (que especifica o plasma germinativo) e o nanos mRNA para o posterior.
Mais tarde, o eixo D / V é estabelecido por gurken (novamente) que sinaliza para estabelecer células foliculares dorsais (que não produzem as proteínas de células foliculares ventrais necessárias para estabelecer destinos embrionários ventrais).

A expressão do gene zigótico ao longo do eixo D / V é controlada pela proteína dorsal
dorsal direciona a expressão gênica para ativar e inativar vários genes, ligando-se aos genes reguladores de muitos dos genes que controla.
dorsal especifica as células mais ventrais como mesoderme prospectivo.
Altos níveis de dorsal ativam a torção e o caracol (necessário para mesoderme e gastrulação).
Níveis baixos de rombóide dorsal ativam (que é suprimido pelo caracol) para dar origem ao neuroectoderma.
decapentaplégico (dpp), tolloid e zerknult são suprimidos por dorsal e estão restritos às regiões mais dorsais.
zerknult especifica a amnioserosa.

Genes zigóticos modelam o embrião inicial
A região mais ventral torna-se mesoderme (músculo e tecido conjuntivo).
A ectoderme ventral torna-se neurectoderme (alguma epiderme e todo o tecido nervoso).
O ectoderma dorsal torna-se epiderme dorsal e a amnioserosa (uma membrana extra-embrionária).
O endoderma das regiões terminais, dá origem ao intestino médio.

A proteína dpp modela a região dorsal
dpp é um membro da família TGF-beta de fatores de crescimento secretados.
Após a celularização, o dpp é expresso em células que não possuem dorsal no núcleo.
Ele produz um gradiente de atividade ao se ligar a uma proteína inibidora sog (gastrulação curta).
sog é muito semelhante à proteína chordin de vertebrados.

O eixo A / P é dividido em amplas regiões por genes gap
Os genes gap, os primeiros genes expressos ao longo do eixo A / P, são fatores de transcrição.
Os genes gap são iniciados por bicoid no blastoderma sincicial.
corcunda atua para ajudar a ligar os outros genes gap (gigante, Kruppel e knirps).
Mutantes de genes gap possuem grandes seções do padrão corporal ausentes.
As proteínas do gene gap têm vida curta (meia-vida de minutos) e se estendem apenas ligeiramente para fora de onde o gene é expresso (distribuição da concentração em forma de sino).

proteína bicoid sinaliza expressão de corcunda anterior
A expressão do corcunda zigótica ocorre na metade anterior do embrião.
A supressão na metade posterior produz um gradiente que vai de A a P.
A expressão anterior é ativada por altos níveis de bicoid.
O aumento da expressão bicoid anterior resultará na extensão do gradiente corcunda em direção à metade posterior do embrião.
bicoid (fator de transcrição do homeodomínio) liga-se diretamente ao promotor corcunda em vários lugares.

corcunda ativa e reprime outros genes gap
Kruppel é ativado por uma combinação de bicoid e baixos níveis de corcunda, mas é reprimido por altos níveis de corcunda.
Isso localiza a expressão de Kruppel no centro do embrião.
knirps é reprimido por altos níveis de corcunda.
Desse modo, os gradientes iniciais de morfógenos podem levar ao estabelecimento de regiões dentro do blastoderma sincicial que levam ao início da segmentação.

Técnica: drosófila transgênica
A transformação do elemento P é realizada por meio da clonagem de uma sequência de interesse (região genômica, cDNA ou fusão região de controle / gene repórter) e um gene marcador (frequentemente o gene branco) em um elemento P transponível clonado.
O DNA clonado, juntamente com uma fonte de transposase (plasmídeo auxiliar), são injetados no plasma do pólo de um embrião em estágio inicial.
Se incorporada na linha germinativa, a progênie do indivíduo injetado que expressa o gene marcador pode ser selecionada.
Eles também carregam o transgene.
A transgênese permite a manipulação da segmentação dos processos de desenvolvimento: ativação do gene pair-rule

Parassegmentos (PS) são o módulo básico do desenvolvimento da mosca
Parassegmentos surgem primeiro e cada segmento é feito da parte posterior de um PS e da parte anterior do próximo.
Parassegmentos são delimitados por genes de regras de pares de expressão periódica (PR).
Sulcos transitórios na superfície do embrião (após gastrulação) definem o 14 PS.
Os parassegmentos agem como unidades de desenvolvimento: "mosca de farinha".

Genes pair-rule delimitam os parassegmentos
Os genes de regras de pares delimitam os parassegmentos e são expressos em 7 faixas transversais (a cada 2 parassegmentos).
Expressão de regra de par determinada pela atividade do gene gap para interpretar uma série de padrões de expressão ampla para fazer uma série repetida de listras.

A atividade do gene Gap posiciona listras de expressão de regra de par
Os genes de regras de pares são expressos em parassegmentos alternativos.
par-saltado define parassegmentos ímpares.
fushi-tarazu define até parassegmentos.
O padrão de expressão listrado de genes de regra de par começa logo antes da celularização.
Após a celularização, cada gene de regra de par é restrito a algumas células em sete faixas.
Alguns genes de regras de pares definem os limites do segmento.
As listras aparecem lentamente, primeiro difusas, depois tornam-se nitidamente definidas.
o mesmo-ignorado é primeiro expresso em nível baixo em todos os núcleos, mas depois é redefinido em listras.

Cada faixa é especificada de forma independente
A segunda faixa de pares saltados (véspera) requer bicoid e amp corcunda.
o gigante reprime a véspera para formar uma borda anterior nítida.
Kruppel reprime a véspera para formar uma borda posterior nítida.
Uma vez que cada faixa é controlada de forma independente por combinações de fatores de transcrição (genes gap).
Cada gene de regra de par tem regiões de controle complexas com vários locais de ligação para cada um dos diferentes fatores.
Alguns fatores ativam e outros inativam.
Alguns requerem a atividade dos genes primários de regra de par (como eve e hairy).

Genes e compartimentos de polaridade de segmento (SP)
Os genes de polaridade de segmento são.
1) um grupo diverso de genes (não apenas fatores de transcrição),
2) são expressos em 14 listras,
3) agir após a celularização e
4) são ativados pelos genes de regras de pares.
engrailed (um fator de transcrição) é expresso na parte anterior de cada parassegmento para definir um limite de restrição da linhagem celular.
gravado é um gene seletor que confere identidade por uma duração de expressão.

Técnica: mosaicos genéticos
Um mosaico genético é um indivíduo que possui alguns tecidos que carregam células de diferentes constituições genéticas.
Realizado formalmente por meio de raios-X.
Moscas carregando uma recombinase de levedura (FLP) e sequência alvo (FRT), podem ser induzidas a formar clones de tecido mutante em um indivíduo normal.

A expressão de gravado delimita um limite de linhagem celular e define um compartimento
gravado é expresso ao longo da vida da mosca (não transitório como os genes gap e pair rule).
Um parassegmento é um compartimento entre o qual as células não se movem (restrição da linhagem celular).
Compartimentos pode ser detectado marcando células e seguindo os destinos dos clones (descendentes das células).
gravado define a margem anterior do parassegmento e, portanto, a porção posterior do segmento.
Limites do compartimento pode ser estudado na asa adulta que normalmente é dividida em compartimentos anterior e posterior.
Em um mosaico, as células mutantes gravadas não respeitam o "limite A / P" e as linhagens não são restritas.

Os genes de polaridade do segmento modelam os segmentos e estabilizam o parassegmento e os limites do segmento
Cada segmento larval tem um padrão A / P: a parte anterior tem dentículos, enquanto a parte posterior tem cutícula nua.
Em mutantes sem asas e hedgehog amp, a cutícula nua é convertida em uma duplicação de imagem espelhada da parte anterior para dar o fenótipo "gramado de dentículos".
Os genes de polaridade do segmento são expressos em um subconjunto restrito de células de cada parassegmento.
O limite do parassegmento depende da sinalização intercelular entre as células em ambos os lados do limite do compartimento envolvendo genes de polaridade do segmento.
sem asas e hedgehog codificam proteínas altamente conservadas e fazem parte de vários sistemas de sinalização.
O processo de padronização também é aparente nos segmentos abdominais de adultos.

Diferentes mecanismos usados ​​por outros insetos para o plano corporal
O desenvolvimento de longa banda germinativa desenvolve todos os segmentos de uma vez (Drosophila).
Desenvolvimento de banda germinativa curta (Tribolium, o besouro da farinha), os segmentos anteriores são formados na blastoderme e os segmentos mais posteriores são adicionados pelo crescimento do posterior.
As bandas germinativas maduras parecem ser semelhantes (estágio filotípico, comum aos insetos).
Embora diferentes processos de crescimento estejam envolvidos nos mesmos genes (ou seja, Kruppel, sem asas e gravados têm funções conservadas).

Segmentação: seletor e genes homeóticos
Cada segmento possui uma identidade única.
Genes seletores homeóticos especifique cada segmento para controlar outros genes e manter a identidade do segmento.
Dois complexos [ou um complexo dividido] (Bithorax e Antennapedia: os genes HOM), juntos, são homólogos aos complexos de genes HOX de vertebrados.
Identificado pela primeira vez por genes homeóticos, mutações que causam homeose, a transformação de uma estrutura em outra estrutura.
Antena para perna (Antennapedia) ou cabresto para asa (Bithorax)

Genes homeóticos do complexo bitórax (BX-C) são responsáveis ​​pelos segmentos posteriores
O complexo Bithorax (BX-C) consiste em três genes homeobox (Ubx, abd-A e amp Abd-B).
Ubx é expresso a partir de PS 5 e posterior.
abd-A é expresso em PS 7 e posterior.
Abd-B é expresso em PS 10 e posterior (e suprime Ubx).
A expressão é controlada por genes gap & amp pair-rule.
As larvas sem o complexo de bitórax completo, desenvolvem PS 5-13 como PS4, portanto, BX-C diversifica PS5-13 e PS4 é o estado padrão modificado pelas proteínas BX-C.
Os genes BX-C impõem uma nova identidade aos segmentos (genes seletores).

Técnica: expressão gênica direcionada
Uma maneira de controlar a expressão do gene é fundir o promotor de choque térmico a um determinado gene.
Outro método envolve o sistema Gal4 / UAS de duas partes.
Gal4, um fator de transcrição de levedura, é fundido a sequências de controle de Drosophila por
1) clonagem de DNA recombinante (e produção drosófila transgênica)
e 2) armadilha intensificadora (integração / seleção aleatória)
para produzir o fator de transcrição em um padrão de desenvolvimento desejado
e gerar uma linha de driver.
A linha responsiva é gerada pela clonagem de uma região de codificação a jusante de várias cópias do UAS (sequência de ativação a montante) e transgênese.
Ao acasalar indivíduos dessas linhagens, o gene alvo é expresso nos momentos e locais selecionados.

Experiência: Substitua os componentes do BX-C em embriões sem o complexo.
Ausência de BX-C: PS1-4, mais dez outros segmentos semelhantes a PS4.
Os componentes BX-C foram substituídos por expressão gênica direcionada.
Ubx apenas (ausentes abd-A e Abd-B): PS1-6 seguido por mais sete segmentos do tipo PS6.
Ubx mais abd-A (sem Abd-B): PS1-9 mais 4 segmentos PS9.
Os parassegmentos devem atuar de forma combinatória.
Enquanto os genes gap e pair-rule controlam o padrão original da expressão do gene HOM, os grupos de genes polycomb e trithorax mantêm a expressão correta desses genes após as primeiras quatro horas.
O grupo polycomb mantém a repressão transcricional de genes homeóticos.
O grupo tritórax mantém a expressão de genes homeóticos.

O complexo de antenapédia controla a especificação das regiões anteriores
O complexo antenapedia (Antp-C) consiste em 5 genes homeobox.
Antp-C controla a expressão de parassegmentos anteriores de uma maneira semelhante a BX-C nos segmentos posteriores (descrito acima).
mutantes deformados afetam PS0 e amp1.
Mutantes reduzidos de sex combs afetam PS2 e amp3 reduzidos.
Mutantes de antenapedia afetam PS4 e amp5.
Tal como acontece com os genes HOX em mamíferos, a ordem de expressão do gene HOM corresponde à ordem dos genes no cromossomo.


Assista o vídeo: DNA i kod genetyczny (Dezembro 2021).