Em formação

Consumo de NAD + na glicólise


Das 10 etapas da glicólise, apenas uma reação - Gliceraldeído 3-fosfato (G3P) a 1,3-bisfosfoglicerato (PGP), usa NAD + e, portanto, produz NADH. Além disso, esta mesma etapa é a única responsável pelo ganho líquido de 2ATP na glicólise, uma vez que aqui a fosforilação ocorre sem o dispêndio de ATP.

Por que o NAD + é usado apenas nesta etapa? É possível prever por outras informações que esta é a única etapa para exigir o NAD +? É possível fazer essa reação acontecer sem o envolvimento de NAD (P) +? É possível pular esta etapa e produzir diretamente 3-fosfoglicerato (não vamos nos preocupar, mesmo que não possamos produzir ATP neste processo). Estou interessado nisso porque, esta etapa requer a fermentação para regeneração de NAD + em condição anaeróbia. E. coli produziu acetato como um efeito colateral, como esperado durante situações anaeróbicas, mas também inesperadamente durante situações aeróbicas e de alta taxa de crescimento (acetato-swtich, problema de transbordamento). A produção de acetato não é desejada em muitas aplicações industriais.


O NAD + é importante nesta etapa, pois é cofator para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH), que atua como aceptor para o átomo de hidrogênio do C1 (ver abaixo).

Se você observar a reação, o aldeído do C1 é oxidado a um ácido carboxílico que, em uma segunda etapa, é transformado em um fosfoéster. Para isso, uma cisteína do centro ativo do G3PDH ataca o G3P ​​e forma um hemiacetal. Este é oxidado em um tioéster, o hidreto que é separado nesta etapa é transferido para o NAD + ligado pelo G3PDH. Na segunda etapa, o tioéster formado entre a enzima e o G3P ​​é atacado por uma molécula de fosfato inorgânico para formar o 1,3-BPG. Esta etapa só é possível dividindo a ligação tioéster, muito rica em energia. Portanto, para que essa reação aconteça, você precisa de ambas as etapas, pois, de outra forma, a formação de uma ligação éster de fosfato rica em energia não aconteceria. Veja aqui para mais detalhes.

Para ir diretamente de G3P para 3-PG, você precisaria de uma enzima que oxide o grupo aldeído no G3P. E então você precisa novamente de um aceitador para o hidrogênio que é separado aqui.


  • Embora quatro moléculas de ATP sejam produzidas na segunda metade, o ganho líquido da glicólise é de apenas dois ATP porque duas moléculas de ATP são usadas na primeira metade da glicólise.
  • As enzimas que catalisam as reações que produzem ATP são etapas limitantes da taxa de glicólise e devem estar presentes em quantidades suficientes para que a glicólise complete a produção de quatro ATP, dois NADH e duas moléculas de piruvato para cada molécula de glicose que entra na via.
  • Os glóbulos vermelhos requerem glicólise como única fonte de ATP para sobreviver, porque não possuem mitocôndrias.
  • As células cancerosas e as células-tronco também usam a glicólise como a principal fonte de ATP (processo conhecido como glicólise aeróbica ou efeito Warburg).
  • piruvato: qualquer sal ou éster de ácido pirúvico, o produto final da glicólise antes de entrar no ciclo de TCA

Metabolismo NAD + e seus papéis nos processos celulares durante o envelhecimento

O dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD +) é uma coenzima para reações redox, tornando-a central para o metabolismo energético. NAD + também é um cofator essencial para enzimas não redox dependentes de NAD +, incluindo sirtuínas, CD38 e poli (ADP-ribose) polimerases. O NAD + pode influenciar direta e indiretamente muitas funções celulares importantes, incluindo vias metabólicas, reparo de DNA, remodelação da cromatina, senescência celular e função das células imunológicas. Esses processos e funções celulares são essenciais para a manutenção da homeostase metabólica e dos tecidos e para o envelhecimento saudável. Notavelmente, o envelhecimento é acompanhado por um declínio gradual nos níveis de NAD + nos tecidos e células em vários organismos modelo, incluindo roedores e humanos. Este declínio nos níveis de NAD + está relacionado causalmente a várias doenças associadas ao envelhecimento, incluindo declínio cognitivo, câncer, doenças metabólicas, sarcopenia e fragilidade. Muitas dessas doenças associadas ao envelhecimento podem ser retardadas e até mesmo revertidas com a restauração dos níveis de NAD +. Portanto, direcionar o metabolismo NAD + emergiu como uma abordagem terapêutica potencial para melhorar as doenças relacionadas ao envelhecimento e estender a expectativa de saúde e a expectativa de vida do ser humano. No entanto, ainda há muito a aprender sobre como o NAD + influencia a saúde humana e a biologia do envelhecimento. Isso inclui uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares que regulam os níveis de NAD +, como restaurar efetivamente os níveis de NAD + durante o envelhecimento, se isso é seguro e se a reposição de NAD + terá efeitos benéficos em humanos que envelhecem.


Destaques

O monóxido de carbono foi identificado como inibidor da agregação plaquetária, mas o mecanismo envolvido não foi definido.

Observamos que o efeito antiplaquetário do monóxido de carbono é acompanhado pela inibição da respiração mitocondrial e inibição da glicólise ao nível de GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase).

Na presença de piruvato exógeno, os efeitos inibitórios do monóxido de carbono na agregação plaquetária e glicólise foram perdidos, mas restaurados após a inibição da regeneração de NAD + citosólica, sugerindo um papel fundamental da depleção de NAD + nos efeitos observados.

O efeito antiplaquetário do monóxido de carbono é mediado pela inibição de ambos os processos de geração de ATP, respiração mitocondrial ao nível da citocromo c oxidase e glicólise, atribuída à depleção de NAD + citosólico

Introdução

Veja o editorial anexo na página 2344

O monóxido de carbono (CO) entregue a um organismo por inalação é letalmente tóxico. Portanto, por muito tempo, o CO foi referido como um assassino silencioso. No entanto, o CO produzido endogenamente durante a degradação do heme pelas enzimas hemoxigenase é uma importante molécula de sinalização endógena implicada nas respostas celulares a vários estímulos. 1 Por sua vez, o CO fornecido em quantidades relativamente baixas por moléculas liberadoras de CO (CORMs) proporciona efeitos citoprotetores e antiinflamatórios. 1,2

Numerosos relatórios fornecem evidências de que o CO, devido à sua ação antiplaquetária e antitrombótica, desempenha um papel importante na manutenção da homeostase vascular in vivo. Por exemplo, foi demonstrado que CO derivado de HO-1 (hemoxigenase 1) protege contra lesão de isquemia-reperfusão hepática através da inibição da adesão plaquetária aos sinusóides. 3 Além disso, a deficiência de HO-1 induz uma aceleração da trombose arterial, que ocorre por meio de vários mecanismos (incluindo ativação plaquetária), enquanto a inalação de CO 4 ou a liberação de CO por CORM-2 5 podem resgatar do fenótipo protrombótico da deficiência de HO-1. Esses relatórios confirmam a importância do CO derivado de HO-1 na regulação da tromboresistência vascular e sugerem que os CORMs podem representar uma nova classe de agentes antiplaquetários. De fato, CORM-A1, um CORM prototípico com liberação lenta de CO, 6 demonstrou proporcionar atividades antiplaquetárias e antitrombóticas in vivo sem qualquer efeito hipotensivo, enquanto CORM-3, que libera CO instantaneamente, exibiu efeitos antitrombóticos e hipotensivos. 7 Recentemente, vários novos CORMs com propriedades sintetizáveis ​​de liberação de CO foram sintetizados, todos os quais mostraram exibir atividade antiplaquetária semelhante ou até um pouco mais pronunciada do que CORM-A1, 8 confirmando os efeitos antiplaquetários significativos dos CORMs.

Apesar das evidências firmes sobre os efeitos antiplaquetários do CO em estudos in vivo e in vitro, os mecanismos envolvidos não foram elucidados até o momento. Embora altas concentrações de CO gasoso atuem nas plaquetas via sGC (guanil ciclase solúvel), 9,10 o efeito antiplaquetário de CORM-3, ao contrário dos doadores de NO, não foi mediado pela ativação de sGC. 11,12 Recentemente, foi sugerido que o envolvimento da fosforilação de HS1 mediada por glicoproteínas estava envolvido na supressão induzida por CORM-2 da ativação plaquetária por LPS (lipopolissacarídeo). 13 No entanto, esse mecanismo não explica o efeito antiplaquetário do CO relatado para a agregação plaquetária induzida por agonistas plaquetários clássicos, como o colágeno ou a trombina, 11,12 que acarretam vias intraplaquetárias mecanicamente distintas em comparação com a ativação plaquetária induzida por LPS. 14

A agregação de plaquetas é um processo que demanda energia. 15,16 Nos estados de repouso ou ativado, as plaquetas retiram energia da fosforilação oxidativa e da glicólise. 17–19 No entanto, além de alguns trabalhos que descrevem bioenergética alterada de plaquetas derivadas de pacientes com doença falciforme, 20 asma, 21 sepse, 22 doença de Parkinson 23 ou diabetes mellitus, 24 ainda pouco se sabe sobre o papel do metabolismo na regulação da função das plaquetas. Vários relatórios, incluindo o nosso, demonstraram que o CO modula a bioenergética celular em vários tipos de células, 25–30 incluindo células endoteliais. 31-33

Dado o fato de que a agregação plaquetária é um processo que demanda energia, formulamos a hipótese de que o CO pode modular a atividade plaquetária por meio da modulação da bioenergética plaquetária envolvendo fosforilação oxidativa e glicólise. No presente trabalho, caracterizamos a bioenergética das plaquetas nos estados de repouso e ativado e analisamos os efeitos do CORM-A1 na respiração mitocondrial, na glicólise e no metaboloma das plaquetas. Escolhemos CORM-A1 por causa de sua ação antiplaquetária bem documentada em modelos in vitro e in vivo. 7,12 Aqui, propomos que o mecanismo do efeito antiplaquetário do CO envolve a inibição de 2 vias principais de geração de ATP nas plaquetas - respiração mitocondrial e glicólise, pela inibição da citocromo c oxidase e depleção do dinucleotídeo nicotinamida adenina citosólica (NAD +) , respectivamente.

Métodos

Os autores declaram que todos os dados de apoio estão disponíveis no artigo no Suplemento de Dados.

Isolamento de plaquetas humanas

O sangue venoso foi obtido de voluntários do sexo masculino no Centro de Banco de Sangue do Hospital Universitário. Os doadores voluntários não tomaram nenhum medicamento nas 2 semanas anteriores. O consentimento informado foi dado por um voluntário antes da coleta de sangue e o estudo obedeceu aos princípios descritos na Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinque. O sangue obtido de pelo menos 3 doadores por um experimento independente foi coletado em frascos contendo citrato de sódio (3,2%, 9: 1v / v) como agente anticoagulante. O sangue foi centrifugado (260g, 15 minutos) seguido por um ciclo de centrifugação / lavagem usando PBS contendo prostaciclina (PBS contendo albumina [1 g / L] e glicose [1 g / L]), de acordo com o método descrito anteriormente. 34 Plaquetas lavadas (WP) foram finalmente suspensas em meio de ensaio (Seahorse XF Base Medium Minimal DMEM suplementado com glicose [1 g / L] e glutamina [2 mmol / L], pH 7,4) a uma densidade de 2 × 10 5 plaquetas / µL, salvo indicação em contrário. A contaminação de neutrófilos em WP foi de & lt1 / 10 6 plaquetas.

Ensaio de agregação plaquetária em humanos

A agregação de plaquetas sanguíneas foi avaliada no WP por meio de um agregômetro de canal duplo (CHRONO-LOG) de acordo com o método previamente descrito por Born. 35 WP (500 µL) foram equilibrados durante 2 minutos a 37 ° C com uma agitação contínua a 800 rpm e depois estimulados com colagénio ou trombina para causar agregação. No início de cada experimento, as concentrações de trombina (na faixa de 0,1–0,5 U / mL) que induziram a resposta de agregação submáxima foram determinadas. CORM-A1, inibidores metabólicos e outros compostos testados foram adicionados 2 minutos antes da estimulação das plaquetas com colágeno ou trombina. A transmitância foi lida em 6 minutos após a estimulação das plaquetas com um agonista. As concentrações de CO liberado de CORM-A1 foram medidas com ensaio de mioglobina (Figura I no Suplemento de Dados), conforme descrito anteriormente 36 com pequenas alterações (Materiais no Suplemento de Dados).

Análise de bioenergética celular usando tecnologia de fluxo extracelular

Para medir a função mitocondrial e a glicólise em plaquetas humanas isoladas, foi usado um analisador Seahorse XFe96 (os detalhes estão em Materiais no Suplemento de Dados). Resumidamente, plaquetas recém-isoladas suspensas em meio de ensaio foram introduzidas nas placas de 96 poços Seahorse XFe (10 x 10 6 de plaquetas por poço), seguido por centrifugação (5 minutos, 700g) e incubação com meio de ensaio com baixo teor de tampão livre de bicarbonato (1 hora, 37 ° C) ao ar sem CO2 antes do início do ensaio. Mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) foram avaliadas ao longo do tempo por injeções sequenciais de reagentes nas portas A, B, C e D. Concentrações de oligomicina, FCCP (cianeto de carbonila 4- [trifluorometoxi] fenil-hidrazona) , rotenona e antimicina A foram otimizados (dados não mostrados). O teste de estresse mitocondrial permitiu a determinação dos seguintes parâmetros-chave da função mitocondrial: resposta aguda, vazamento de prótons, respiração máxima, capacidade respiratória sobressalente, produção de ATP e consumo de oxigênio não mitocondrial (calculado conforme descrito em Materiais no Suplemento de Dados). Além disso, calculamos a resposta aguda e as alterações induzidas pela oligomicina no ECAR. Analisamos os efeitos do CORM-A1 nas alterações induzidas pela trombina no OCR (Δ [Thr-A1]mt. respiração) e em ECAR (Δ [Thr-A1]glicolise), calculado com base nas diferenças de OCR e ECAR antes e depois da injeção de trombina. Com base nos experimentos com oligomicina, analisamos a capacidade das plaquetas pré-tratadas com CORM-A1 e trombina para maximizar ainda mais sua glicólise em resposta à oligomicina, refletindo uma capacidade glicolítica sobressalente (Δ [O-Thr]), embora com base nos experimentos com FCCP / piruvato, analisamos a capacidade das plaquetas pré-tratadas com CORM-A1 e trombina para maximizar ainda mais sua respiração mitocondrial em resposta ao FCCP, refletindo uma capacidade respiratória sobressalente (Δ [FCCP-Thr]).

Medições de lactato

As medições de lactato foram realizadas pelos métodos fotométricos enzimáticos, utilizando um analisador bioquímico automático Pentra 400 (Horiba, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram suspensas em tampão de ensaio a uma densidade de 3 × 10 4 plaquetas / μL e tratadas com compostos testados por 8 minutos a 37 ° C ou pré-incubadas com compostos testados por 2 minutos e então ativadas com trombina por 6 minutos a 37 ° C, seguido por centrifugação (1000g, 10 minutos) e medição da concentração de lactato no sobrenadante.

Análise de metabólitos intraplaquetários

A detecção dos metabólitos intraplaquetas foi realizada de acordo com o protocolo descrito anteriormente, 33,37 com pequenas alterações. Resumidamente, WP (suspenso em PBS contendo 1 g / L de glicose e 2 mmol / L de glutamina, em um número de 500 × 10 6 por 0,5 mL por amostra) foram não tratados ou pré-incubados por 2 minutos com 300 μmol / L de CORM-A1, seguido pela adição de trombina (0,1 U / mL) e posterior incubação por 6 minutos. O metabolismo foi então extinto pela adição de 0,5 mL de solução de extração (acetonitrila: metanol: água, 5: 2: 3, v / v / v) resfriado a −80 ° C. Metabólitos foram extraídos por sonicação por 15 minutos em gelo, centrifugados (15.000g, 15 minutos, 4 ° C) e liofilizado. Antes da análise, as amostras foram reconstituídas em água, injetadas em uma coluna de cromatografia líquida e analisadas em um QTRAP 5500 (Sciex, Framingham, MA) acoplado a UFLC (cromatografia líquida ultra-rápida) Nexera (Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação por cromatografia foi alcançada em uma coluna analítica Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm 3,0 × 100 mm (Waters, Milford, MA). As amostras foram analisadas duas vezes no modo MRM de ionização positiva e negativa (monitoramento de reação múltipla). Para a análise em ionização positiva usando acetonitrila, 100 mmol / L de formato de amônio (pH 5,0) 95: 5 v / v e 5 mmol / L de formato de amônio (pH 5,0) foram usados ​​como fase móvel usando gradiente de eluição. O tempo total de execução foi de 8 e 10 minutos para os modos de ionização negativo e positivo, respectivamente.

Análise das atividades GAPDH e PFK-1

A atividade de GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase) foi analisada em amostras de WP (suspensa em PBS contendo 1 g / L de glicose e 2 mmol / L de glutamina, em um número de 300 × 10 6 por 0,5 mL por amostra) não tratada ou incubada por 8 minutos com CORM-A1, processado conforme descrito por Schmidt e Dringen 38 e medido de acordo com o protocolo descrito por Bisswanger. 39 A atividade de PFK-1 (fosfofrutocinase 1) foi analisada seguida de incubação de WP (500 × 10 6 por 0,5 mL por amostra) com CORM-A1 por 8 minutos ou 30 minutos, de acordo com o protocolo descrito anteriormente. 40,41 Os detalhes são descritos em Materiais no Suplemento de Dados.

Análise da concentração metabólica de ATP

As medições foram realizadas em amostras tratadas por 8 minutos com os compostos testados, na presença de apirase (1 U / mL), utilizando o ATPlite 1step Luminescence Assay System (PerkinElmer).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando o software ORIGINPRO 9.1 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) ou o software Graphpad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Os resultados foram expressos como médias ± DP. Para análise estatística, os dados foram analisados ​​quanto à normalidade e o teste ANOVA de 1 via foi realizado com o teste de Benferroni com P valores sendo fornecidos nas legendas (*P& lt0.05, # P& lt0,01, $ P& lt0.001 e & amp P& lt0.0001).

Resultados

Efeitos de CORM-A1 na respiração mitocondrial e glicólise em plaquetas em repouso

Em repouso WP humano, CORM-A1 induziu uma diminuição dependente da concentração em OCR e alterações bifásicas em ECAR conforme analisado pela técnica Seahorse XFe (Figura 1). Um leve efeito inibitório de CORM-A1 na respiração mitocondrial (Figura 1A) já era visível nas concentrações de 10 e 30 μmol / L, com efeitos mais fortes atingindo ≈50% a 60% da inibição basal de OCR em concentrações de 100 a 300 μmol /EU. O teste de estresse mitocondrial (Figura 1C) revelou que CORM-A1 induziu uma diminuição na respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente, que podem ter resultado da inibição da citocromo c oxidase por CO. CORM-A1 induziu a ligeiro aumento no vazamento de prótons, mas não afetou o consumo de oxigênio não mitocondrial. CORM-A1 também diminuiu a concentração de ATP intra-plaquetária, conforme avaliado por ensaio bioquímico (Figura 1D).

Figura 1. Efeitos de CORM-A1 na respiração mitocondrial e glicólise em plaquetas humanas em repouso, monitorados pelo Seahorse XFe96 Analyzer. Taxa de consumo de oxigênio (OCR UMA) e taxa de acidificação extracelular (ECAR B) medições de plaquetas humanas lavadas (WP) tratadas com PBS (controle), CORM-A1 (A1 10–300 μmol / L) ou CORM-A1 inativo (iA1 300 μmol / L) seguido por adição sequencial de oligomicina (1 μg / mL), FCCP (cianeto de carbonil 4- [trifluorometoxi] fenil-hidrazona) / piruvato (0,3 μmol / L / 1 mmol / L) e rotenona / antimicina A (0,5 / 0,5 μmol / L). Parâmetros bioenergéticos da respiração mitocondrial e glicólise (C) foram calculados conforme descrito em Materiais no Suplemento de Dados. Os dados representam as médias ± DP de 2 experimentos independentes n = 4-6 repetições em cada experimento. D, Concentração intracelular de ATP medida em plaquetas tratadas com PBS ou CORM-A1 junto com apirase (1 U / mL) para remover ATP extracelular liberado. Os dados representam as médias ± DP de 3-5 experimentos independentes *P& lt0,05 em comparação com o grupo PBS.

Os efeitos bifásicos de CORM-A1 na glicólise compreendem um ligeiro aumento no ECAR para as concentrações mais baixas (10-100 μmol / L) e uma diminuição no ECAR para as concentrações mais altas (200 e 300 μmol / L) de CORM-A1 (Figura 1B ) Para confirmar que todos os efeitos descritos do CORM-A1 foram induzidos pelo CO, foi utilizado o CORM-A1 inativo, que não induziu alterações na respiração mitocondrial nem na glicólise. Os níveis de LDH (lactato desidrogenase) liberados no meio de ensaio após CORM-A1 ou tratamento com tampão de lise confirmaram que CORM-A1 na faixa de concentração de 10 a 300 μmol / L não afetou a viabilidade das plaquetas (Figura II no Suplemento de Dados )

Efeitos de CORM-A1 na respiração mitocondrial e glicólise em plaquetas ativadas

Para caracterizar os efeitos do CO na bioenergética das plaquetas ativadas, foi realizado teste de estresse mitocondrial em WP, as quais foram pré-tratadas com CORM-A1 e posteriormente ativadas com trombina (0,1 U / mL). A trombina induziu um ligeiro aumento (de 11 ± 2,2%) no OCR, que foi posteriormente aumentado pelo FCCP (Figura 2A e 2E). Em contraste com a ativação leve do OCR, a trombina induziu um aumento substancial (em 116 ± 0,7%) no ECAR, que foi ainda aumentado pela oligomicina (Figura 2D e 2E). Na presença de CORM-A1, o aumento induzido por trombina no OCR foi diminuído, em particular para 100 ou 300 μmol / L CORM-A1 em comparação com as plaquetas de controle (Δ [Thr-A1] na Figura 2E). Quando a respiração mitocondrial foi posteriormente ativada com FCCP, CORM-A1 de uma maneira dependente da concentração em uma ampla faixa de concentrações (10–300 μmol / L) diminuiu o aumento de OCR (Δ [FCCP-A1]). Os efeitos do CORM-A1 na glicólise ativada pela trombina foram mais notáveis ​​do que no aumento do OCR induzido pela trombina, devido à ativação mais forte da glicólise pela trombina. Na presença de 100 a 300 μmol / L de CORM-A1, a glicólise ativada por trombina foi substancialmente diminuída. Apenas um ligeiro aumento no ECAR após a trombina (em cerca de 30%) foi observado para 100 μmol / L CORM-A1 (Δ [Thr-A1] na Figura 2), enquanto 300 μmol / L CORM-A1 inibiu a glicólise tão fortemente que a trombina -aumento induzido em ECAR foi revogado (Δ [Thr-A1] na Figura 2E). CORM-A1 diminuiu também o aumento induzido por oligomicina na glicólise (Δ [O-A1]) de uma maneira dependente da concentração (10–300 μmol / L). Para confirmar que as alterações observadas no ECAR resultaram das alterações no fluxo glicolítico, a extrusão de lactato pelas plaquetas foi medida após a estimulação da trombina com ou sem CORM-A1 (Figura 2F). A trombina (0,1 U / mL) aumentou a liberação de lactato, enquanto CORM-A1 de uma maneira dependente da concentração (100-1000 μmol / L) diminuiu a concentração de lactato no sobrenadante de plaquetas em repouso ou estimuladas por trombina (Figura 2F).

Figura 2. Efeitos de CORM-A1 na respiração mitocondrial e glicólise em paralelo à agregação em plaquetas ativadas. Taxa de consumo de oxigênio (OCR UMA e C) e taxa de acidificação extracelular (ECAR B e D) medições de plaquetas humanas lavadas (WP) tratadas com PBS (controle) ou CORM-A1 (A1 10–300 μmol / L) seguido pela adição de trombina (0,1 U / mL) e posterior adição sequencial de FCCP (cianeto de carbonila 4 - [trifluorometoxi] fenil-hidrazona) / piruvato (0,3 μmol / L / 1 mmol / L) e rotenona / antimicina A (R / A 0,5 / 0,5 μmol / L UMA e B) ou oligomicina (1 μg / mL) e R / A (C e D) Parâmetros bioenergéticos da respiração mitocondrial e glicólise (E) foram calculados conforme descrito no Suplemento de Dados. Os dados representam as médias ± DP de 3 experimentos independentes n = 4-8 repetições em cada experimento. F, Os dados de concentração de lactato extrudado de plaquetas (WP) tratados com CORM-A1 (0, 100, 300, 1000 µmol / L CONT) ou CORM-A1 e trombina (0,1 U / mL Thr) representam as médias ± DP de 4 independentes experimentos n = 2 repetições em cada experimento. G, Agregação de plaquetas (WP) tratadas com CORM-A1 (10, 30, 100, 300 µmol / L) e ativadas com trombina (0,5 U / mL) em comparação com os dados de controle representam as médias ± DP de 4 experimentos independentes n = 2 repetições em cada experimento. *P& lt0.05, #P& lt0,01, $P& lt0.001, & ampP& lt0.0001 em comparação com o grupo de controle.

A comparação dos efeitos do CORM-A1 na bioenergética plaquetária e na agregação revelou que as concentrações de CORM-A1, que proporcionaram a inibição quase completa da agregação plaquetária (100-300 μmol / L, Figura 2G), também levaram à inibição simultânea e completa da glicólise e respiração mitocondrial (100–300 μmol / L, Figura 2A a 2E). A bioenergética de plaquetas tratadas com 10 ou 30 μmol / L de CORM-A1 foi prejudicada em menor grau, o que foi associado a um efeito antiplaquetário mais fraco. CORM-A1 inativo (300 μmol / L) não afetou a agregação plaquetária (99,8 ± 2,61% do controle, n = 5), confirmando o envolvimento de CO nos efeitos induzidos por CORM-A1. Ao todo, os efeitos antiagregantes dependentes da concentração de CORM-A1 foram espelhados pela inibição dependente da concentração da bioenergética plaquetária.

Efeitos dos inibidores da respiração mitocondrial e da glicólise na bioenergética plaquetária e na plasticidade metabólica da agregação plaquetária das plaquetas

Para caracterizar a dependência das plaquetas na respiração mitocondrial versus glicólise, os efeitos da oligomicina (inibidor da ATP sintase), rotenona (inibidor do complexo I), antimicina A (inibidor do complexo III), UK-5099 (inibidor do portador de piruvato mitocondrial) , 2-desoxi-D-glicose (inibidor glicolítico competitivo 2DG) e 3PO (inibidor de PFKFB3 [6-fosfofruto-2-quinase / frutose-2,6-bifosfatase 3]) em OCR, ECAR e agregação plaquetária foram investigados .

2DG inibiu profundamente a glicólise, enquanto quase não afetou a respiração mitocondrial (Figura 3A e 3B). Apenas na concentração mais alta de 100 mmol / L, 2DG reduziu significativamente o OCR para 95 ± 0,6% do valor basal (P& lt0.05). O 3PO, outro inibidor da glicólise, reduziu levemente a ECAR; no entanto, embora o efeito fosse estatisticamente significativo, não era dependente da concentração e estava associado à redução concomitante de OCR. Por sua vez, a oligomicina de 0,5 a 1 μg / mL reduziu quase completamente o OCR, o que foi acompanhado por um aumento substancial na ECAR. A antimicina A e a rotenona reduziram quase completamente o OCR e aumentaram muito o ECAR, enquanto o UK-5099 reduziu ligeiramente o OCR e aumentou o ECAR. Notavelmente, a inibição completa da fosforilação oxidativa por oligomicina, antimicina A ou rotenona foi compensada por um aumento de quase 3 vezes no ECAR.

Figura 3. Efeitos da inibição única ou combinada da respiração mitocondrial e da glicólise por inibidores metabólicos na agregação plaquetária. Taxa de consumo de oxigênio (OCR UMA) e taxa de acidificação extracelular (ECAR B) medições de plaquetas humanas lavadas (WP) não tratadas (CONT) ou tratadas com DMSO (como um veículo), 2-desoxi-D-glicose (2DG), 3PO (3- [3-piridinil] -1- [4-piridinil ] -2E-propen-1-ona), oligomicina (OLIG), antimicina A (AA), rotenona (ROT) ou UK-5099, apresentados como% do basal 20 minutos após a adição dos reagentes. Os dados representam as médias ± DP de 3 experimentos independentes n = 4-8 repetições em cada experimento. C, Agregação de plaquetas (WP) não tratada (CONT) ou tratada com 2DG, 3PO, oligomicina, antimicina A, rotenona ou UK-5099, e ativada com trombina (0,5 U / mL), apresentada como% dos dados de controle representam as médias ± SD de 4 experimentos independentes, n = 1-3 repetições em cada experimento. D, Medições de OCR e ECAR de WP tratado com inibidores combinados: 2DG e oligomicina apresentadas como% do basal 20 min após a adição dos reagentes. E, Agregação de WP tratada com inibidores combinados: 2DG e oligomicina (10 μg / mL) ativada com trombina (0,5 U / mL) apresentada como% de controle. Os dados representam as médias ± DP de 3 experimentos independentes. F, Concentração intraplaquetária de ATP em WP tratado com inibidores combinados: 2DG e oligomicina, medida na presença de apirase (1 U / mL). Os dados representam as médias ± DP de 3 experimentos independentes. *P& lt0.05, #P& lt0,01, $P& lt0.001, & ampP& lt0.0001 em comparação com o grupo de controle.

Como mostrado na Figura 3C, os inibidores que reduziram exclusivamente a respiração mitocondrial (oligomicina, antimicina A, rotenona, UK-5099) não inibiram substancialmente a agregação plaquetária (menos de 10%). 2DG reduziu a agregação plaquetária para 80% do controle, no entanto, nesta concentração, 2DG também reduziu ligeiramente o OCR. Entre os inibidores metabólicos, o mais eficaz foi o 3PO, que na concentração de 30 μmol / L reduziu a agregação plaquetária para 68% do controle (Figura 3C). No entanto, como demonstrado na Figura 3A e 3B, o 3PO reduziu não apenas ECAR, mas também OCR.

Efeitos da inibição simultânea da respiração mitocondrial e glicólise na agregação plaquetária

A Figura 3D demonstra a bioenergética de WP após adição de oligomicina e 2DG individualmente ou em combinação. Oligomicina a uma concentração de 0,5 μg / mL, que na ausência de 2DG até mesmo aumentou ligeiramente a atividade metabólica (OCR diminuiu para 20 ± 4,5% do basal, mas ECAR aumentou até 221 ± 20,8% do basal), em combinação com 2DG, causou uma inibição profunda da bioenergética plaquetária que resultou na inibição significativa da agregação plaquetária (Figura 3E). De fato, a oligomicina sozinha (mesmo em uma concentração de 10 µg / mL) inibiu a agregação plaquetária em apenas 8% (Figura 3E), 2DG sozinha (até 100 mmol / L) em 21%. Cada um deles sozinho diminuiu apenas ligeiramente a concentração de ATP intraplaquetária. No entanto, a combinação de 2DG e oligomicina (10 µg / mL) induziu uma queda substancial na concentração de ATP intra-plaquetária (Figura 3F), explicando uma inibição profunda da agregação plaquetária sob tratamento combinado com 2DG e oligomicina (Figura 3E).

Efeito de CORM-A1 nas vias metabólicas em plaquetas - análise metabolômica

Para explorar os efeitos do CORM-A1 na bioenergética plaquetária, quantificamos o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e os metabólitos da glicólise por análise metabolômica direcionada em plaquetas pré-tratadas com CORM-A1 e estimuladas com trombina. Conforme apresentado na Figura 4, as concentrações de metabólitos do ciclo de TCA nas plaquetas não foram alteradas substancialmente no sexto minuto após a ativação da trombina, enquanto na presença de CORM-A1, elas foram reduzidas (fumarato em 40% e malato em mais de 50%). Além disso, as alterações induzidas por CORM-A1 nos níveis de metabólitos de TCA foram acompanhadas por uma redução em NAD + e um aumento nas concentrações de NADH que está de acordo com os efeitos inibitórios de CO na respiração mitocondrial em plaquetas. Curiosamente, uma soma de NAD reduzido e oxidado (NADH junto com NAD +) foi significativamente diminuída, enquanto uma proporção de NADH / NAD + foi apenas ligeiramente (não significativamente) aumentada após CORM-A1. Por sua vez, os metabólitos glicolíticos medidos no sexto minuto após a estimulação da trombina também não foram alterados significativamente, enquanto CORM-A1 induziu um aumento maciço nas concentrações de metabólitos glicolíticos proximais. A concentração de hexose-6-P aumentou 2 vezes, enquanto os níveis de frutose-1,6-bis-fosfato e triose-fosfato (fosfato de dihidroxiacetona [DHAP] e gliceraldeído 3-fosfato [GA3P]) foram & gt10 vezes maiores comparando para controlar as plaquetas não tratadas com CORM-A1. Surpreendentemente, CORM-A1 não induziu alterações nas concentrações de metabólitos glicolíticos distais (3-fosfo-glicerato, fosfoenolpiruvato e piruvato Figura 5). Digno de nota, o equilíbrio alterado entre os metabólitos glicolíticos proximal e distal foi associado a um maior desvio de glicose para a via da pentose fosfato (PPP). De fato, CORM-A1 induziu um aumento nas concentrações de metabólitos PPP (ribose-5-fosfato, sedoheptulose-7-fosfato e eritrose-4-fosfato) que não foi associado a um aumento na razão NADPH ou NADPH / NADP + (Figura 5).

Figura 4. Efeitos de CORM-A1 nos metabólitos do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e no conteúdo de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD +) em plaquetas. Plaquetas humanas lavadas (WP) suspensas em PBS contendo glicose (1 g / L) e glutamina (2 mmol / L) não foram tratadas (8 min C), tratadas com CORM-A1 (300 μmol / L 8 min A1), tratadas com trombina (0,1 U / mL T) ou tratada com CORM-A1 e trombina (2 + 6 min A1 / T). Os dados mostram quantidades de subprodutos metabólicos no ciclo do TCA. Os dados são apresentados como médias ± DP (nmoL / 10 9 plaquetas) de 4 experimentos independentes *P& lt0,05 vs controle.

Figura 5. Efeitos de CORM-A1 na glicólise e metabólitos da via da pentose fosfato (PPP) em plaquetas. Plaquetas humanas lavadas (WP) suspensas em PBS contendo glicose (1 g / L) e glutamina (2 mmol / L) não foram tratadas (8 min C), tratadas com CORM-A1 (300 μmol / L 8 min A1), tratadas com trombina (0,1 U / mL T) ou tratada com CORM-A1 e trombina (2 + 6 min A1 / T). Os dados mostram quantidades de subprodutos metabólicos na glicólise e PPP. Os dados são apresentados como médias ± DP (nmoL / 10 9 plaquetas) de 4 experimentos independentes. DHAP indica fosfato de dihidroxiacetona F-1,6-BP, frutose-1,6-bis-fosfato GA3P, gliceraldeído 3-fosfato PEP, fosfoenolpiruvato e TCA, ciclo do ácido tricarboxílico. *P& lt0,05 vs controle.

Esses resultados, mostrando uma ativação de PPP e acúmulo de metabólitos glicolíticos proximais, sugerem fortemente que a inibição da glicólise por CORM-A1 foi direcionada ao nível de GAPDH. No entanto, uma atividade de GAPDH nas plaquetas não foi inibida diretamente por CORM-A1 (Figura 5). Da mesma forma, outra etapa limitante da taxa de glicólise proximal - a reação catalisada por PFK-1 - não foi modulada por CORM-A1, como evidência pela falta de efeitos de incubação de 8 minutos com CORM-A1 na atividade de PFK-1 em plaquetas (dados não mostrados). Apenas a incubação prolongada de 30 minutos permitiu observar uma inibição desta enzima (Figura IA), que foi, no entanto, não relevante para a inibição da glicólise por exposição de curto prazo de CORM-A1. Outra possível explicação para a inibição da glicólise ao nível de GAPDH por CORM-A1 pode ter sido ligada diretamente à depleção de NAD + (Figura 4).

Reversão dos efeitos do piruvato na inibição da agregação plaquetária induzida por CORM-A1 e na glicólise do papel da LDH e da regeneração de NAD +

Como o LDH é uma importante fonte enzimática para a regeneração de NAD +, testamos se o piruvato poderia reverter os efeitos antiplaquetários de CORM-A1. Como mostrado na Figura 6A, na presença de piruvato (1 mmol / L) o efeito inibitório de CORM-A1 na agregação plaquetária foi perdido (Figura 6A) com aumento concomitante na liberação de lactato (Figura 6B) e ECAR (Figura 6C), em contraste com a ausência de piruvato (Figura 1). Esses dados confirmaram uma alta atividade do LDH, catalisando a conversão do piruvato exógeno em lactato, acompanhada pela regeneração do NAD + citosólico do NADH. É importante ressaltar que na presença de 1 mmol / L de piruvato, o acúmulo de intermediários de glicólise proximal (frutose-1,6-bis-fosfato e DHAP / GA3P Figura 6D a 6F) foi anulado, e o fluxo de glicólise foi eficiente novamente, como também evidenciado pela falta de acúmulo de intermediários de PPP (ribose-5-fosfato, sedoheptulose-7-fosfato, eritrose-4-fosfato Figura 6H a 6K). Esses resultados sugerem que a regeneração de NAD + dependente de LDH induzida por piruvato reverteu a inibição da glicólise no nível de GAPDH. Além disso, esses resultados demonstram que o efeito antiagregante de CORM-A1 era dependente da disponibilidade de NAD +, que foi modulada pela atividade de LDH. Para substanciar o achado sobre o papel da LDH e da regeneração dependente de piruvato de NAD + na reversão dos efeitos induzidos por CORM-A1, demonstramos que na presença de GSK2837808A (inibidor de LDH 5 μmol / L) o efeito do piruvato ( 100 μmol / L) foi perdido e 300 μmol / L CORM-A1 inibiu a agregação plaquetária novamente (Figura 6P). Digno de nota, GSK2837808A na ausência de piruvato, quando adicionado sozinho, apenas reduziu ligeiramente a agregação plaquetária, mas em combinação com CORM-A1 exibiu efeito antiplaquetário significativo (Figura 6P). Além disso, a combinação de GSK2837808A com antimicina A resultou em um efeito antiagregante nítido, embora nenhum deles, administrado sozinho, tenha afetado a agregação plaquetária (Figura 6Q). Para testar um papel funcional putativo do NAD + derivado da lançadeira malato-aspartato em plaquetas, combinamos CORM-A1 ou antimicina A com ácido aminooxiacético (um inibidor da lançadeira malato-aspartato), mas em contraste com a combinação de CORM-A1 com GSK2837808A, não observamos aumento dos efeitos antiagregantes de CORM-A1 (dados não mostrados). Dimetil malonato, que intracelularmente é convertido em malonato (um inibidor de SDH [succinato desidrogenase]), não mostrou efeitos antiagregantes significativos sozinho ou em várias combinações, excluindo um possível papel de SDH e transporte malato-aspartato para regenerar NAD + em CORM- Plaquetas tratadas com A1.

Figura 6. Efeitos do piruvato na atividade antiplaquetária de CORM-A1 em plaquetas. Plaquetas humanas lavadas (WP) foram suspensas em meio de ensaio (DMEM) suplementado com glicose (1 g / L) e glutamina (2 mmol / L) com ou sem piruvato (1 mmol / L). UMA, Agregação de WP tratado com CORM-A1 (300 µmol / L) e ativado com trombina (0,1 U / mL) em comparação com os dados de controle representam as médias ± DP de 4 experimentos independentes n = 1–2 repetições em cada experimento. B, Os dados de concentração de lactato extrudado de plaquetas (WP) tratados com CORM-A1 (0, 100, 300, 1000 µmol / L) representam as médias ± DP de 3 experimentos independentes. C, Medições da taxa de acidificação extracelular (ECAR) de WP tratado com PBS (controle) ou CORM-A1 (A1 100, 300, 1000 μmol / L) em DMEM suplementado com glicose (1 g / L), glutamina (2 mmol / L) e piruvato (1 mmol / L) Seahorse XFe96 Analyzer. Os dados representam as médias ± DP de um experimento representativo, n = 3-6 repetições técnicas. FAZ, WP humano suspenso em PBS contendo glicose (1 g / L) e glutamina (2 mmol / L) sem (C, A1) ou com piruvato (1 mmol / LP, A1 / P) não foram tratados ou tratados com CORM-A1 ( 300 µmol / L), seguido de ativação com trombina (0,1 U / mL 6 min), os dados demonstram que as concentrações de subprodutos metabólicos selecionados da glicólise, PPP ou respiração mitocondrial são apresentados como médias ± DP (nmol / 10 9 plaquetas) de 3 experimentos independentes, n = 2 repetições em cada experimento. P, Agregação de WP tratado com piruvato (100 µmol / L), CORM-A1 (300 µmol / L) e GSK2837808A (GSK 5 µmol / L). Q, Agregação do controle WP ou pré-incubado com malonato de dimetila (DMM 15 min) seguido por tratamento com antimicina A (AA 10 µmol / L) e GSK2837808A (GSK 3 µmol / L). Os dados representam as médias ± DP de 4 experimentos independentes n = 1–3 repetições em cada experimento. DHAP indica fosfato de dihidroxiacetona F-1,6-BP, frutose-1,6-bis-fosfato e NAD +, dinucleotídeo de nicotinamida adenina. *P& lt0.05, #P& lt0,01, $P& lt0.001, & ampP& lt0.0001.

Para confirmar ainda mais o papel fundamental da depleção de NAD + citosólico nos efeitos antiplaquetários de CORM-A1, examinamos os efeitos de CORM-A1 na agregação de plaquetas pré-tratadas com 78c (0,3-20 μmol / L), um inibidor de CD38— uma das principais enzimas que consomem NAD +. A inibição de CD38 por 1 µmol / L 78c atenuou o efeito antiagregante de CORM-A1 em 13%, apoiando ainda mais o papel fundamental da depleção de NAD + nos efeitos antiplaquetários de CORM-A1.

Discussão

A agregação plaquetária é um processo que demanda energia, 15,16 e evidências recentes sugerem uma alta plasticidade do substrato do metabolismo das plaquetas. 17,19,42,43 No presente trabalho, que sabemos pela primeira vez, fornecemos evidências de que o CO proporciona efeitos antiplaquetários pela inibição simultânea e eficiente de 2 vias principais de geração de ATP: respiração mitocondrial, atribuída à inibição do citocromo c oxidase e glicólise, atribuídas à depleção de NAD + citosólica. Curiosamente, uma inibição da glicólise ou da respiração mitocondrial individualmente, usando inibidores metabólicos clássicos, não inibiu a agregação plaquetária porque essas duas vias se compensam, como também sugerido anteriormente. 19 A inibição combinada da glicólise e da respiração mitocondrial com oligomicina e 2DG, respectivamente, proporcionou inibição plaquetária pronunciada. Nesse contexto, nossos resultados mostrando que CORM-A1 induziu uma inibição simultânea da glicólise e da respiração mitocondrial ressalta a capacidade do CO liberado pelo CORM-A1 de superar a plasticidade metabólica das plaquetas. O CO derivado de CORM-A1 inibe efetivamente a agregação plaquetária ao comprometer ao mesmo tempo 2 vias principais da bioenergética plaquetária por mecanismos distintos que culminam na depleção de NAD + e ATP. Dado o fato de que o sGC é um alvo para o gás CO nas plaquetas, 9 mas não para o CORM-A1 11,12, suspeitamos que os efeitos bioenergéticos do CORM-A1 podem não ser necessariamente compartilhados pelo CO gasoso.

Os efeitos do CO na respiração mitocondrial e glicólise, embora claramente observados para plaquetas em repouso, foram mais pronunciados em plaquetas ativadas metabolicamente por trombina, oligomicina (ativação da glicólise plaquetária Figura 3A e 3B) ou FCCP (ativação da respiração mitocondrial máxima Figura 1C). As plaquetas nas configurações de ativação protrombótica aumentam as demandas energéticas 15,16,19 e, aparentemente, em tais configurações, as plaquetas também se tornaram mais suscetíveis aos efeitos inibitórios do CO. Ao todo, a inibição dependente da concentração da agregação plaquetária por CORM-A1 foi acompanhada pela inibição dependente da concentração da bioenergética plaquetária, ambos resultaram na mesma faixa de concentrações CORM-A1 e pertenciam a 2 vias principais de geração de ATP, superando a plasticidade do substrato das plaquetas.

Na verdade, a plasticidade metabólica permite a agregação plaquetária mesmo após a inibição de uma única via metabólica, 16,19 porque as plaquetas usam diversos combustíveis metabólicos - não apenas glicose, ácidos graxos livres e glutamina, mas também glicogênio, citrato (adicionado ao sangue durante a coleta), albumina e acetato. 17,19,42,44 Recentemente, Ravi e cols. 19 demonstraram que a ativação das plaquetas com trombina resulta em reprogramação metabólica, levando ao aumento da glicólise aeróbia, oxidação de ácidos graxos e glutaminólise, que se compensam mutuamente. Confirmamos a plasticidade metabólica plaquetária em nossa configuração experimental (Figura 3), demonstrando que a inibição seletiva da respiração mitocondrial (por oligomicina, antimicina A, rotenona) não ou apenas ligeiramente (menos de 10%) inibiu a agregação plaquetária. Os inibidores únicos da respiração mitocondrial foram quase ineficazes na inibição da agregação plaquetária (Figura 3C), mas a inibição da respiração mitocondrial foi compensada por um aumento de quase 3 vezes na glicólise (Figura 3A e 3B), que provavelmente atendeu aos requisitos de energia da agregação plaquetária. Por sua vez, a inibição da glicólise por 100 mmol / L 2DG inibiu ligeiramente (por 21%) a agregação plaquetária, sugerindo que a glicólise pode ser mais importante para a atividade plaquetária. Foi sugerido que nas plaquetas em repouso o ATP é produzido principalmente (65%) na glicólise e apenas 35% na fosforilação oxidativa. 18 Claramente, após a ativação das plaquetas, as contribuições dessas vias metabólicas podem ser diferentes, dependendo da disponibilidade dos substratos, ressaltando a plasticidade das plaquetas. Curiosamente, o 3PO é conhecido como um inibidor da glicólise, 45 mas recentemente foi demonstrado que ele atinge e inibe também o ciclo do TCA e a cadeia respiratória mitocondrial. 46 Em nosso modelo, o 3PO pareceu inibir não apenas a glicólise, mas também o consumo de oxigênio (Figura 3A e 3B), resultando na inibição da agregação plaquetária em contraste com outros inibidores metabólicos administrados individualmente. A inibição combinada da glicólise e da fosforilação oxidativa com 2DG e oligomicina (Figura 3D e 3E) resultou na inibição quase completa do metabolismo e redução substancial concomitante da agregação plaquetária. Dada a extraordinária plasticidade metabólica plaquetária, a alta eficácia do CO liberado pelo CORM-A1 na inibição da agregação plaquetária depende da inibição da fosforilação oxidativa e da glicólise e do subsequente bloqueio eficiente da produção de ATP necessária para a agregação plaquetária.

Em relação à inibição da fosforilação oxidativa, demonstramos que, em plaquetas em repouso, o CO liberado de CORM-A1 inibia a respiração mitocondrial de maneira dependente da concentração. Uma queda induzida por CORM-A1 nas concentrações de fumarato e malato (Figura 4) confirma o turnover reduzido do TCA na presença de CO, enquanto o desequilíbrio nas concentrações de NAD + e NADH, visto como razão NADH / NAD + aumentada, confirma a inibição de fosforilação oxidativa por CO. Em conjunto, os resultados metabolômicos, juntamente com o perfil dos efeitos induzidos por CORM-A1 no OCR, fornecem evidências de que CORM-A1 inibiu a respiração mitocondrial nas plaquetas, mais provavelmente pela ligação à citocromo c oxidase, que é uma boa alvo conhecido para ação CO. 47 Além disso, quedas induzidas por CORM-A1 em fumarato e malato (Figura 4) também podem sugerir succinato desidrogenase como outro possível alvo para CO na mitocôndria. No entanto, parece ter menos importância para a respiração mitocondrial das plaquetas, como evidenciado pela falta de efeitos antiplaquetários do malonato de dimetila (Figura 6Q), um precursor permeável às células do inibidor da succinato desidrogenase. 48 Surpreendentemente, as mitocôndrias nas plaquetas foram mais suscetíveis aos efeitos inibitórios do CO, em comparação com a microglia 30 ou células endoteliais, 31 onde apenas concentrações mais altas de CO inibiram a respiração mitocondrial. Esses resultados sugerem um importante papel regulador do turnover do ATP mitocondrial nas plaquetas.

Curiosamente, o CO modulou a glicólise plaquetária de forma bifásica - ativada por concentrações mais baixas e inibida por concentrações mais altas de CORM-A1 (Figura 1). Estes resultados sugerem que a ativação observada da glicólise em concentrações mais baixas de CORM-A1 foi uma resposta compensatória à inibição da respiração mitocondrial. No entanto, CORM-A1 em concentrações mais altas induziu a inibição da respiração mitocondrial e da glicólise, esta última possivelmente, por alvo citosólico separado para CO. Na presença de CORM-A1, notamos um forte aumento nos metabólitos proximais da glicólise (hexose-6- fosfato, frutose-1,6-bis-fosfato, DHAP e GA3P) e PPP, ao contrário dos metabólitos da glicólise distal (3-fosfo-glicerato, fosfoenolpiruvato e piruvato), que permaneceram inalterados (Figura 5). Esses resultados sugerem que a inibição da glicólise por CO pode ser direcionada a GAPDH, que contém uma porção heme, e a interação CO-heme pode inibir GAPDH. 49 No entanto, a atividade do GAPDH nas plaquetas não foi inibida pelo CORM-A1 (Figura 5). Outra razão para a inibição da atividade de GAPDH e subsequente inibição da glicólise (Figura 5) poderia ser uma queda substancial em NAD + (Figura 4), principalmente ligada à inibição da respiração mitocondrial por CO, e um aumento subsequente na razão NADH / NAD + . No entanto, devido à compartimentação de NAD + (as mitocôndrias contêm até 70% do conteúdo total de NAD 50), é necessário considerar um pool citosólico de NAD + separado envolvido na glicólise, que pode ser regenerado a partir do metabolismo do piruvato por LDH, ou através a ação da lançadeira glicerol-3-fosfato ou lançadeira malato-aspartato. 51 No presente trabalho, excluímos a importância do transporte malato-aspartato na regeneração de NAD + em plaquetas (ausência dos efeitos do ácido aminooxiacético adicionado sozinho ou em combinação com outros compostos nos dados de agregação plaquetária não mostrados), mas demonstramos que o adição de piruvato: (1) induziu a regeneração dependente de LDH de NAD + que acompanha a extrusão de lactato, (2) reverteu a inibição da glicólise no nível de GAPDH e, mais importante, (3) revogou os efeitos antiagregantes de CORM-A1 (Figura 6). De fato, na presença de piruvato, a razão NADH / NAD + foi normalizada e o acúmulo de glicólise proximal e intermediários de PPP foram revertidos (Figura 6D a 6F e 6H a 6K). Além disso, a inibição da regeneração de NAD + dependente de LDH por GSK2837808A resultou na eliminação do efeito do piruvato (100 µmol / L) na agregação plaquetária inibida por CORM-A1. A inibição de LDH com inibição simultânea da fosforilação oxidativa (Figura 6Q) reduziu a agregação plaquetária. Esses resultados confirmaram o papel fundamental da regeneração de NAD + dependente de LDH para o fluxo glicolítico, cuja inibição, juntamente com a inibição da respiração mitocondrial, resultou na inibição da agregação plaquetária. Consequentemente, a depleção de NAD + e a subsequente inibição da glicólise junto com a respiração mitocondrial são 2 alvos principais para a regulação negativa induzida por CO da bioenergética plaquetária. No presente trabalho, indicamos a importância do NAD + na glicólise e agregação plaquetária, e sugerimos que o CO, além de inibir a citocromo c oxidase na mitocôndria, tem outro (s) alvo (s) citosólico (s) diminuindo a disponibilidade de NAD +, que era, no entanto, não identificado em última instância aqui.

Geralmente, entre as enzimas envolvidas na renovação de NAD +, existem enzimas regeneradoras de NAD + (como LDH, lançadeira malato-aspartato, lançadeira glicerol-3-fosfato), enzimas NAD + -salvagem (como NAD + sintase) e NAD + –Enzimas de consumo (sirtuínas, poli [ADP-ribose] polimerases, cADP-ribose sintases). 51 Pouco se sabe sobre o turnover de NAD + nas plaquetas, no entanto, foi demonstrado que as plaquetas contêm uma maquinaria enzimática para metabolizar o ribosídeo de nicotinamida em NAD. 52 Direcionamos nossa atenção para o CD38 (cADP-ribose sintase), que gera uma molécula de cADP-ribose para cada 100 moléculas de NAD + hidrolisada, e desempenha um papel de principal regulador da disponibilidade celular de NAD +. 53 Na verdade, descobrimos que 1 μmol / L 78c (inibidor de CD38) induziu uma redução leve, mas significativa da inibição da agregação plaquetária induzida por CORM-A1, apoiando a visão de que a modulação da disponibilidade de NAD + por CD38 ou outras enzimas de NAD + turnover pode influenciar os efeitos antiplaquetários de CORM-A1. No entanto, um alvo direto para CO responsável pela deficiência de NAD + ainda precisa ser identificado. Foi demonstrado em ilhotas pancreáticas que o CO ativa o CD38 por meio da ativação de sGC. 54 No entanto, em plaquetas, o CO liberado de CORMs não atua por meio de sGC (consulte as Refs 11,12 e a Figura IV no Suplemento de Dados), tornando a via CO / cGMP / CD38 improvável de operar nas plaquetas.

Anteriormente, os efeitos do CO na glicólise foram demonstrados, entre outros, em células endoteliais, em que o CO inibiu a glicólise e ativou o PPP. 31-33 Alguns autores afirmam que a inibição de CO da glicólise é atribuída à inibição de CBS (cistationina-β-sintase), que por meio da redução da metilação de PFK-1 / frutose bifosfatase tipo 3 (PFKFB3 um ativador do fluxo glicolítico ) inibiu a glicólise no nível de PFK-1 e redirecionou a glicose para PPP. 55 Como mostrado na Figura 5, a concentração de frutose-1,6-fosfato, bem como a concentração combinada de DHAP e GA3P foram aumentadas em resposta a CORM-A1, enquanto as concentrações de 3-P-glicerato, fosfoenolpiruvato e piruvato foram inalterado (1,3-bisfosfoglicerato não foi analisado). À primeira vista, os dados podem excluir o envolvimento da redução da ativação de PFKFB3 nas plaquetas em resposta ao CO, porque o aumento, mas não a diminuição da concentração de frutose-1,6-fosfato foi medido. A incubação prolongada de 30 minutos de plaquetas com CORM-A1 permitiu observar uma inibição da atividade de PFK-1, no entanto, não forte o suficiente para evitar o acúmulo de frutose-1,6-bis-fosfato, DHAP e GA3P (Figura III nos Dados Suplemento). Esses dados sugerem que a inibição de CBS, e uma desmetilação de PFKFB3 consequente levando à inibição de PFK-1, não foi responsável pela inibição da glicólise em plaquetas tratadas com CORM-A1, que por sua vez foi atribuída aqui à depleção de NAD +.

Mais estudos são necessários para uma explicação detalhada dos mecanismos bioquímicos da ação do CO nas plaquetas no metaboloma NAD + e elucidação se os mecanismos dependentes ou independentes do heme estão envolvidos. Hemoproteínas, como canais de K + dependentes de voltagem 56 e canais epiteliais de Na +, 57 parecem improváveis ​​como alvos para CO em plaquetas, pois sua ligação com os processos de consumo de NAD + não é óbvia. Por sua vez, o canal de K + regulado por cálcio de grande condutância, conhecido por exibir uma afinidade relativamente alta para o CO, não é abundante nas plaquetas. 56

Em resumo, os resultados do presente trabalho, ao nosso conhecimento pela primeira vez, fornecem evidências de que o CO proporciona efeitos antiagregantes pela inibição da respiração mitocondrial e da glicólise, atribuídos à inibição da citocromo c oxidase e depleção do NAD + citosólico, respectivamente. Os resultados de nosso estudo não apenas revelam a ação específica do CO para as plaquetas na bioenergética, mas também apontam que estratégias terapêuticas antiplaquetárias direcionadas ao metabolismo podem ser úteis para inibir a ativação plaquetária excessiva em várias doenças.


Resumo da seção

Esta seção discute o processo de fermentação. Devido à grande ênfase neste curso no metabolismo central do carbono, a discussão da fermentação enfoca compreensivelmente na fermentação do piruvato. No entanto, alguns dos princípios básicos que abordamos nesta seção se aplicam igualmente bem à fermentação de muitas outras moléculas pequenas.

O "propósito" da fermentação

A oxidação de uma variedade de pequenos compostos orgânicos é um processo utilizado por muitos organismos para acumular energia para manutenção e crescimento celular. A oxidação da glicose via glicólise é uma dessas vias. Várias etapas importantes na oxidação da glicose a piruvato envolvem a redução do transporte elétron / energia NAD + para NADH. Você já foi solicitado a descobrir quais opções a célula poderia razoavelmente ter para reoxidar o NADH em NAD + a fim de evitar consumir os pools disponíveis de NAD + e, assim, evitar a interrupção da glicólise. Em outras palavras, durante a glicólise, as células podem gerar grandes quantidades de NADH e lentamente exaurir seus suprimentos de NAD +. Para que a glicólise continue, a célula deve encontrar uma maneira de regenerar o NAD +, seja por síntese ou por alguma forma de reciclagem.

Na ausência de qualquer outro processo - isto é, se considerarmos apenas a glicólise & mdashit não é imediatamente óbvio o que a célula pode fazer. Uma opção é tentar colocar os elétrons que antes eram retirados dos derivados de glicose de volta no produto a jusante, o piruvato ou um de seus derivados. Podemos generalizar o processo descrevendo-o como o retorno de elétrons à molécula que foram removidos, geralmente para restaurar pools de um agente oxidante. Em suma, isso é fermentação. Como discutiremos em uma seção diferente, o processo de respiração também pode regenerar os pools de NAD + do NADH. Células sem cadeias respiratórias ou em condições onde o uso da cadeia respiratória é desfavorável podem escolher a fermentação como um mecanismo alternativo para acumular energia de pequenas moléculas.

Um exemplo: fermentação de ácido láctico

Um exemplo cotidiano de reação de fermentação é a redução do piruvato a lactato pela reação de fermentação do ácido lático. Esta reação deve ser familiar para você: ocorre em nossos músculos quando nos esforçamos durante o exercício. Quando nos esforçamos, nossos músculos requerem grandes quantidades de ATP para realizar o trabalho que exigimos deles. À medida que o ATP é consumido, as células musculares são incapazes de atender à demanda de respiração, O2 torna-se limitante e o NADH se acumula. As células precisam se livrar do excesso e regenerar o NAD +, então o piruvato atua como um aceptor de elétrons, gerando lactato e oxidando o NADH em NAD +. Muitas bactérias usam essa via como forma de completar o ciclo NADH / NAD +. Você pode estar familiarizado com esse processo de produtos como chucrute e iogurte. A reação química da fermentação do ácido láctico é a seguinte:

Piruvato + NADH & ácido lático harr + NAD +

Figura 1. A fermentação do ácido láctico converte o piruvato (um composto de carbono ligeiramente oxidado) em ácido láctico. No processo, o NADH é oxidado para formar NAD +. Atribuição: Marc T. Facciotti (trabalho original)

História da energia para a fermentação do piruvato em lactato

Um exemplo (embora um pouco longo) de história de energia para a fermentação de ácido láctico é o seguinte:

Os reagentes são piruvato, NADH e um próton. Os produtos são lactato e NAD +. O processo de fermentação resulta na redução do piruvato para formar ácido lático e na oxidação do NADH para formar NAD +. Elétrons do NADH e um próton são usados ​​para reduzir o piruvato a lactato. Se examinarmos uma tabela de potencial de redução padrão, vemos sob condições padrão que uma transferência de elétrons do NADH para o piruvato para formar o lactato é exergônica e, portanto, termodinamicamente espontânea. As etapas de redução e oxidação da reação são acopladas e catalisadas pela enzima lactato desidrogenase.

Um segundo exemplo: fermentação de álcool

Outro processo de fermentação familiar é a fermentação do álcool, que produz etanol, um álcool. A reação de fermentação do álcool é a seguinte:

Figura 2. A fermentação do etanol é um processo de duas etapas. O piruvato (ácido pirúvico) é primeiro convertido em dióxido de carbono e acetaldeído. A segunda etapa converte acetaldeído em etanol e oxida NADH em NAD +. Atribuição: Marc T. Facciotti (trabalho original)

Na primeira reação, um grupo carboxila é removido do ácido pirúvico, liberando dióxido de carbono como gás (alguns de vocês podem estar familiarizados com isso como um componente-chave de várias bebidas). A segunda reação remove elétrons do NADH, formando NAD + e produzindo etanol (outro composto familiar - geralmente na mesma bebida) do acetaldeído, que aceita os elétrons.

As vias de fermentação são numerosas

Embora as vias de fermentação de ácido láctico e de fermentação de álcool descritas acima sejam exemplos, existem muitas outras reações (numerosas demais para serem analisadas) que a Natureza desenvolveu para completar o ciclo NADH / NAD +. É importante que você entenda os conceitos gerais por trás dessas reações. Em geral, as células tentam manter um equilíbrio ou proporção constante entre NADH e NAD +, quando essa proporção se torna desequilibrada, a célula compensa modulando outras reações para compensar. O único requisito para uma reação de fermentação é que ela use um pequeno composto orgânico como um aceptor de elétrons para o NADH e regenere o NAD +. Outras reações de fermentação familiares incluem a fermentação do etanol (como na cerveja e no pão), a fermentação propiônica (é o que faz os buracos no queijo suíço) e a fermentação malolática (é o que dá ao Chardonnay seu sabor mais suave e quanto mais conversão de malato em lactato, mais suave vinho). Na Figura 3, você pode ver uma grande variedade de reações de fermentação que várias bactérias usam para reoxidar NADH em NAD +. Todas essas reações começam com piruvato ou um derivado do metabolismo do piruvato, como oxaloacetato ou formato. O piruvato é produzido a partir da oxidação de açúcares (glicose ou ribose) ou outras moléculas orgânicas pequenas e reduzidas. Também deve ser notado que outros compostos podem ser usados ​​como substratos de fermentação além do piruvato e seus derivados. Isso inclui a fermentação de metano, a fermentação de sulfeto ou a fermentação de compostos nitrogenados, como os aminoácidos. Não se espera que você memorize todos esses caminhos. No entanto, espera-se que você reconheça um caminho que retorna elétrons para produtos dos compostos que foram originalmente oxidados para reciclar o pool NAD + / NADH e associar esse processo à fermentação.

Figura 3. Esta figura mostra várias vias de fermentação usando piruvato como substrato inicial. Na figura, o piruvato é reduzido a uma variedade de produtos por meio de reações diferentes e, às vezes, de várias etapas (as setas tracejadas representam possíveis processos de várias etapas). Todos os detalhes não são mostrados deliberadamente. O ponto principal é reconhecer que fermentação é um termo amplo não associado apenas à conversão do piruvato em ácido lático ou etanol. Fonte: Marc T. Facciotti (obra original)

Uma nota sobre a ligação entre a fosforilação ao nível do substrato e a fermentação

A fermentação ocorre na ausência de oxigênio molecular (O2) É um processo anaeróbico. Observe que não há O2 em qualquer uma das reações de fermentação mostradas acima. Muitas dessas reações são bastante antigas, supostamente algumas das primeiras reações metabólicas geradoras de energia a evoluir. Isso faz sentido se considerarmos o seguinte:

  1. A atmosfera primitiva era altamente reduzida, com pouco oxigênio molecular prontamente disponível.
  2. Moléculas orgânicas pequenas e altamente reduzidas estavam relativamente disponíveis, surgindo de uma variedade de reações químicas.
  3. Esses tipos de reações, vias e enzimas são encontrados em muitos tipos diferentes de organismos, incluindo bactérias, arquéias e eucariotos, sugerindo que se tratam de reações muito antigas.
  4. O processo evoluiu muito antes de O2 foi encontrado no ambiente.
  5. Os substratos, pequenas moléculas orgânicas altamente reduzidas, como a glicose, estavam prontamente disponíveis.
  6. Os produtos finais de muitas reações de fermentação são pequenos ácidos orgânicos, produzidos pela oxidação do substrato inicial.
  7. O processo é acoplado a reações de fosforilação em nível de substrato. Ou seja, moléculas orgânicas pequenas e reduzidas são oxidadas e o ATP é gerado primeiro por uma reação vermelho / boi seguida pela fosforilação em nível de substrato.
  8. Isso sugere que as reações de fosforilação e fermentação em nível de substrato coevoluíram.

Consequências da fermentação

Imagine um mundo onde a fermentação é o principal modo de extrair energia de pequenas moléculas. À medida que as populações prosperam, elas se reproduzem e consomem a abundância de pequenas moléculas orgânicas reduzidas no ambiente, produzindo ácidos. Uma consequência é a acidificação (diminuição do pH) do meio ambiente, incluindo o meio celular interno. Isso pode ser prejudicial, uma vez que as mudanças no pH podem ter uma influência profunda na função e nas interações entre as várias biomoléculas. Portanto, mecanismos necessários para evoluir poderiam remover os vários ácidos. Felizmente, em um ambiente rico em compostos reduzidos, a fosforilação e a fermentação em nível de substrato podem produzir grandes quantidades de ATP.

É hipotetizado que este cenário foi o início da evolução do F0F1-ATPase, uma máquina molecular que hidrolisa ATP e transloca prótons através da membrana (veremos isso novamente na próxima seção). Com o F0F1-ATPase, o ATP produzido a partir da fermentação pode agora permitir que a célula mantenha a homeostase do pH ao acoplar a energia livre da hidrólise do ATP ao transporte de prótons para fora da célula. A desvantagem é que as células agora estão bombeando todos esses prótons para o ambiente, que agora começará a se acidificar.


Tutor online de biologia

Este tutorial apresenta a fermentação em um nível apropriado para a maioria das aulas de biologia de graduação e o exame MCAT.

A fermentação permite que a glicólise continue na ausência de oxigênio, produzindo uma pequena quantidade de ATP. Durante a fermentação, 2 elétrons um próton são transferidos de cada produto NADH da glicólise para o piruvato ou uma molécula aceptora derivada para regenerar o NAD +. NAD + é usado para continuar a glicólise.

Os subprodutos da fermentação incluem lactato, butato e etanol.

RESPOSTAS DO TESTE

1. A fermentação é um processo de produção de energia porque permite que a glicólise continue na ausência de oxigênio. Uma vez que uma quantidade líquida de 2 ATP é produzida pela glicólise, uma quantidade líquida de 2 ATP também é produzida pela fermentação.

2. NAD + é necessário para completar a glicólise. O NAD + deve estar presente para aceitar o hidrogênio antes que qualquer ATP possa ser produzido.

3. Durante a glicólise, duas moléculas de NAD + são reduzidas a NADH.

4. Durante a fermentação do ácido láctico, o piruvato é reduzido a ácido láctico e o NADH é oxidado para regenerar o NAD +.

5. Na fermentação do ácido lático, átomos de hidrogênio (junto com dois elétrons) são adicionados diretamente ao piruvato, convertendo-o em ácido lático. O piruvato é o aceptor terminal de elétrons e o ácido lático é o produto.

TERMOS A SABER
trifosfato de adenosina (ATP)
fermentação de etanol
fermentação
glicose
glicolise
fermentação de ácido láctico
Dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD + / NADH)
piruvato
aceitador de elétron terminal

TÓPICOS RELACIONADOS (Observação: esses links ficarão ativos à medida que os vídeos forem exibidos online.)
glicolise
reações de oxidação-redução


A conversão de NAD + em NADH, e vice-versa, são reações essenciais na criação de ATP durante o que é chamado de respiração celular. O alimento que você consome passa por três fases para se tornar energia: glicólise, o ciclo de Krebs e a cadeia de transporte de elétrons.

Na glicólise e no ciclo de Krebs, as moléculas de NADH são formadas a partir de NAD +. Enquanto isso, na cadeia de transporte de elétrons, todas as moléculas de NADH são subsequentemente divididas em NAD +, produzindo H + e alguns elétrons também. Os H + são usados ​​para alimentar uma espécie de "bomba" que fica na membrana interna da mitocôndria, criando muita energia na forma de ATP. Depois que o H + passa pela bomba, eles subsequentemente se fundem com os elétrons e uma molécula de oxigênio para formar água. Todas as três fases da respiração geram ATP, entretanto, o maior rendimento de ATP é durante a cadeia de transporte de elétrons.

A célula também usa NAD + e NADH em outras reações fora da produção de ATP. Nas células do fígado, por exemplo, as enzimas álcool desidrogenase (ADH) e aldeído desidrogenase (ALDH) utilizam o NAD + como agente oxidante para decompor o etanol das bebidas alcoólicas em um composto menos tóxico chamado acetato. Em cada uma das reações enzimáticas, o NAD + aceita dois elétrons e um H + do etanol para formar o NADH.


Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Yoh Terada por seus conselhos úteis durante a criação desta análise. KJM recebeu o prêmio de bolsa de estudos da Heart and Stroke Foundation of Canada. CC é funcionário do Nestl & # x000e9 Institute of Health Sciences S.A. JA é o Nestl & # x000e9 Chair in Energy Metabolism. O trabalho no laboratório é apoiado pelo & # x000c9cole Polytechnique F & # x000e9d & # x000e9rale de Lausanne, os National Institutes of Health (R01AG043930), a Swiss National Science Foundation (31003A-124713) e os Systems X (51RTP0-151019).


Consumo de NAD + na glicólise - Biologia

A questão é a descrição de uma doença mitocondrial, que comumente se apresenta com acidose láctica. Há um aumento nas formas anaeróbias de produção de energia (glicólise). As mitocôndrias estão com defeito, então eles não podem usar o produto final da glicólise (piruvato) no TCA. Em vez disso, o piruvato é desviado e usado pela LDH (lactato desidrogenase) para gerar o piruvato.

À parte: Lembre-se de que o LDH usa NADH e gera NAD +. A deficiência de LDH pode levar à perda de regeneração de NAD + e inibir a glicólise.

Então, essa questão foi algo contra o qual eu realmente tive dificuldades. Não reconheci que a apresentação era de MERRF como alguém afirmou abaixo, e sei que você não precisa saber disso para responder à pergunta, mas teria sido útil. Minha maior frustração foi a formulação dos resultados da biópsia como "acúmulos anormais de mitocôndrias". Isso me incomodou porque a definição de fibras vermelhas irregulares (que presumo que fosse sua intenção) é "acúmulo de mitocôndrias anormais". Essas são duas declarações muito diferentes na minha mente, lol. O primeiro, para mim, significa apenas que há muitas mitocôndrias, mas o segundo significa que há muitas e elas não estão funcionando corretamente. É também apenas o fato de lembrar todos os termos para ETC no momento de ler a pergunta (ou seja, não pensei sobre o fato de que ETC também é chamado de respiração celular ou apenas respiração).

Eu também não entendi totalmente o que é VO2máx = "VO2máx, também conhecido como consumo máximo de oxigênio, é a medida da quantidade máxima de oxigênio que uma pessoa pode utilizar durante exercícios intensos. E é baseado na premissa de que quanto mais oxigênio consumido durante o exercício, mais o corpo irá gerar energia de trifosfato de adenosina (ATP) nas células. O VO2 máximo é atingido quando o consumo de oxigênio permanece estável, apesar de um aumento na carga de trabalho. É nesse patamar que o [músculo] se move do metabolismo aeróbio ao metabolismo anaeróbico "https://www.verywellfit.com/what-is-vo2-max-3120097.

Com base puramente nesta definição, onde VO2máx = essencialmente o tempo em que a aeróbica muda para respiração anaeróbica, minha interpretação de muitas mitocôndrias vs muitas e mitocôndrias ruins não importava, porque mesmo quando as mitocôndrias estão funcionando corretamente, elas chegam a um ponto e mudar para anaeróbico, portanto, se houvesse muitas mitocôndrias normais, isso ocorreria mais rápido porque haveria mais respiração celular geral ocorrendo, o que significa que o corpo mudaria para anaeróbico e utilizaria glicólise para produzir energia, pararia de utilizar as mitocôndrias e, assim, O VO2max diminuiria.

CONTUDO. porque esta é uma questão MERRF, a ordem dos eventos é um pouco diferente, apesar do resultado ser o mesmo (pelo menos é assim que eu entendo). Portanto, acho que a chave para qualquer distúrbio mitocondrial é lembrar que as mutações quase certamente afetarão uma proteína codificada e, portanto, uma deficiência dessa proteína. Um artigo que encontrei dizia que as mutações de tRNA (como em MERRF) causam: "interromper a síntese de proteínas mitocondriais, diminuindo a atividade do Complexo I e em menor grau do Complexo IV. O que diminui a respiração e diminui o bombeamento de prótons, diminuindo drasticamente o potencial de membrana e gradiente de potencial eletroquímico de prótons através da membrana interna mitocondrial. O gradiente de potencial eletroquímico de prótons é a força motriz para a síntese de ATP e diminuí-lo reduz substancialmente a taxa máxima de síntese de ATP. " https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1432-1327.1999.00066.x

Com base na minha compreensão da fosforilação oxidativa, o consumo de O2 (ou seja, pegar o elétron do complexo IV e colocá-lo em 1/2 O2 para criar H2O e H + direciona o gradiente de prótons que impulsiona a produção de ATP. Assim: oxidação respiratória deficiente (ou seja, mutações do mtDNA de as enzimas ETC) leva ao consumo reduzido de O2 (portanto, VO2 máx. reduzido), o que leva à produção de ATP reduzida e, portanto, mitocôndrias defeituosas. Em seguida, a função mitocondrial diminuída leva à diminuição da respiração aeróbica, desviando a produção de ATP para a respiração anaeróbica, impulsionada pela glicólise, e aumentando assim os níveis de lactato.

Espero que isto ajude! Isso me levou MUITO LONGO para descobrir, lol, mas espero que eu nunca esqueça isso, lol.


Somos gratos a Kubo T por sua excelente assistência técnica e aos membros do laboratório de Nakagawa por uma discussão útil.

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Palavras-chave: NAD +, nampt, alfa-cetoglutarato, desmetilação, adipócito, pré-adipócito, diferenciação, metabolômica

Citação: Okabe K, Nawaz A, Nishida Y, Yaku K, Usui I, Tobe K e Nakagawa T (2020). Frente. Cell Dev. Biol. 8: 586179. doi: 10.3389 / fcell.2020.586179

Recebido: 23 de julho de 2020 Aceito: 03 de novembro de 2020
Publicado: 24 de novembro de 2020.

Maria Barile, Universidade de Bari Aldo Moro, Itália

Brijesh Kumar Singh, Duke-NUS Medical School, Singapura
Tibor Kristian, Universidade de Maryland, Estados Unidos

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