Em formação

14.3: Mobilidade de Patógenos - Biologia


Embora os patógenos microscópicos não sejam móveis de forma independente, seus hospedeiros são, e os patógenos desenvolveram maneiras engenhosas de modificar o comportamento de um hospedeiro para permitir sua transferência para outro hospedeiro.

Os reflexos de espirro e tosse, por exemplo, são respostas antigas para limpar obstruções do nariz e da garganta, e alguns patógenos enganosamente induzem essas respostas para uma saída (Figura ( PageIndex {1} )). O que chamamos de "sintomas de doença" não são, então, efeitos aleatórios de uma doença, mas muitas vezes podem ser uma maneira de um patógeno sair de um lago, por assim dizer, e entrar em outro. Qualquer uma das vias listadas no Capítulo 14.1 pode ser explorada por um patógeno, que ao fazer isso pode perturbar essas vias e causar grande sofrimento ao hospedeiro.

Figura ( PageIndex {2} ). Olhos-de-rosa e herpes labial.

Alguns patógenos, por exemplo, entram em seus olhos e lágrimas e enganosamente causam coceira e dor (Figura ( PageIndex {2} ), à esquerda), induzindo você a esfregar os olhos e transferir os patógenos para os dedos. Isso, por sua vez, pode movê-los com sucesso para outros locais, como alimentos, de onde podem entrar em outro hospedeiro pela via oral.

Outros patógenos são capazes de romper a pele e sair do corpo por conta própria. O herpes labial (Figure ( PageIndex {2} ), à direita), uma forma de herpes oral, forma-se ao redor da boca e do nariz, transmitindo para o que toca a ferida. Um herpes genital relacionado é transmitido sexualmente, embora a evolução esteja ocorrendo e a forma genital agora seja capaz de infectar oralmente e a forma oral genitalmente. Essa e outras doenças sexualmente transmissíveis vêm aumentando desde meados do século XX.

Um dos patógenos mais bem-sucedidos em usar os pulmões e a pele como vias para fora do corpo é a varíola (Figura ( PageIndex {3} )). Ele deixa seu hospedeiro com cicatrizes permanentes, geralmente por todo o corpo. A varíola é uma doença antiga, que data da época anterior às pirâmides, que pode matar a maioria das pessoas que infecta e, às vezes, pode infectar a maioria da população.

Figura ( PageIndex {3} ). Varíola, a primeira doença conscientemente extinta do mundo natural.

O próprio sucesso e horror da varíola foram parte de sua destruição final - sua erradicação foi a primeira vitória completa na conquista da doença. Graças à atenção diligente e prolongada em todo o mundo e, claro, à invenção da vacina, a varíola foi extinta no mundo natural. (Dizemos "mundo natural" porque as amostras de laboratório estão sendo retidas.)

William Foege, um jogador-chave na orquestração da extinção da varíola, disse que podemos vencer as doenças porque evoluímos muito mais rapidamente do que a doença. Isso pode ser surpreendente de se ouvir, visto que nossa evolução fisiológica é muito mais lenta do que a de vírus ou bactérias. Mas, explicou ele, como evoluímos socialmente muito mais rapidamente do que uma doença pode evoluir biologicamente, somos capazes de “superar” a doença.

A peste bovina, uma doença viral que causa altas taxas de mortalidade em bovinos e mamíferos selvagens, foi a segunda doença declarada extinta no mundo natural. Outros - como a poliomielite e a doença do verme da Guiné - podem surgir em breve, embora o último possa simplesmente ser erradicado das populações humanas por nosso isolamento contínuo de fontes de infecção.

As doenças podem explorar parasitas sugadores de sangue para mover-se diretamente da corrente sanguínea de um hospedeiro para a de outro. A doença de Lyme (Figura ( PageIndex {4} ), à esquerda), por exemplo, é transmitida por carrapatos, que perfuram a pele para obter uma refeição de sangue para si mesmos, mas no processo podem transferir patógenos. E o Ebola (Figura ( PageIndex {4} ), à direita) sai por quase todos os portais de saída listados, destruindo esses portais por transportar não apenas o patógeno, mas pedaços de pulmão, intestino ou pele no processo.

Figura ( PageIndex {4} ). Doença de Lyme (esquerda) e uma forma de Ebola (direita).

As populações humanas são tão grandes e densas que mesmo patógenos relativamente ineficientes podem ser bem-sucedidos. E as doenças, é claro, também afetam animais selvagens e domésticos, bem como plantações e outras plantas.

Como o próximo capítulo ilustra, muitas doenças podem evoluir para serem relativamente inofensivas para seus hospedeiros, promovendo a transmissão e permitindo que a doença se espalhe. Infecções por fungos de ferrugem, por exemplo, são comuns em muitas espécies de plantas, mas raramente levam à morte do hospedeiro. Oídio na planta da pradaria Monarda fistulosa é tão difundido que é usado em livros de identificação de plantas como forma de identificar as espécies (Figura ( PageIndex {5} ), à direita).

Os patógenos podem alterar dramaticamente o comportamento animal. A raiva passa primeiro pelas glândulas salivares e chega à saliva de um hospedeiro infectado. As mudanças fisiológicas então fazem o animal hospedeiro salivar profusamente - espumando pela boca - enquanto as mudanças psicológicas o fazem parecer louco e zangado. O animal então morde a pele de outro animal, transferindo o patógeno para a corrente sanguínea desse animal, e o ciclo continua. As alterações fisiológicas e psicológicas são causadas pelo patógeno e permitem que ele se espalhe, mesmo após a morte do hospedeiro inicial.

Figura ( PageIndex {5} ). Prarie Bush Clover e Monarda fistulosa.

“Comportamento de cachorro louco”, portanto, não é uma consequência acidental da doença, mas precisamente o meio que o patógeno desenvolveu para ir, por assim dizer, de um lago para outro.

É útil tentar pensar em todas as maneiras pelas quais um patógeno pode alterar o comportamento de seu hospedeiro para forçá-lo a transferir o patógeno. Este não é apenas um exercício intelectual, mas pode ajudar a identificar o potencial para novas doenças emergentes. Por exemplo, o que uma doença sexualmente transmissível deve fazer ao seu hospedeiro para se espalhar mais rapidamente? Deve tornar seu hospedeiro mais ativo sexualmente! E de fato isso acontece. As chimpanzés fêmeas normalmente acasalavam apenas a cada dois anos ou mais, depois de dar à luz e amamentar seus filhotes até o desmame. Mas as fêmeas de chimpanzé infectadas com SIV (vírus da imunodeficiência símia) atingem o estro a cada mês mais ou menos e não concebem. O patógeno muda seu comportamento de acasalamento para se espalhar mais do que uma ordem de magnitude mais rápido do que se espalharia de outra forma.

Inspirado a pensar dessa forma, um aluno teve uma ideia nova: imagine uma doença que pode escapar pelas glândulas sudoríparas sem prejudicar seu hospedeiro. Como modificação comportamental, faz com que os hospedeiros infectados queiram se submeter a exercícios extenuantes em grupos, como em ginásios - explicando assim todo o fenômeno dos exercícios modernos como uma doença! (Gerbils também podem abrigar esta doença.)


A análise de RNA-seq de célula única revela heterogeneidade específica do compartimento e plasticidade da microglia

Microglia são macrófagos residentes do sistema nervoso central (SNC) ubíquos que mantêm a homeostase dos tecidos neurais e os protegem de ataques de patógenos. No entanto, sua diferenciação em diferentes compartimentos permanece indefinida. Realizamos RNA-seq de célula única para comparar os subtipos microgliais no córtex e na medula espinhal. Uma análise comparativa de múltiplas vias foi realizada em amostras de camundongos transgênicos C57 / BL e HIV gp120 com dois, quatro e oito meses de idade. Os resultados revelaram populações microgliais sobrepostas, mas distintas no córtex e na medula espinhal. A heterogeneidade diferencial da microglia nessas regiões do SNC foi ainda sugerida por sua disparidade de plasticidade em resposta à progressão do tempo de vida e à proteína patogênica gp120 do HIV-1. Nossos resultados indicam que microglia em diferentes compartimentos do SNC são adaptados aos seus ambientes locais para cumprir funções biológicas específicas da região.

Palavras-chave: Developmental Biology Immunology Transcriptomics.

Declaração de conflito de interesse

Nenhuma divulgação foi relatada.

Bonecos

A análise de RNA-seq de célula única (scRNA-seq) revelou ...

A análise de RNA-seq de célula única (scRNA-seq) revelou subtipos microgliais específicos da região do tipo selvagem (Wt) de dois meses de idade ...

Diferente plasticidade temporal do mouse ...

Diferente plasticidade temporal da heterogeneidade cortical e espinhal microglial de camundongo (A) O temporal ...

Heterogeneidade microglial específica da região em crianças de dois meses ...

Heterogeneidade microglial específica de região em camundongos transgênicos gp120 (Tg) HIV-1 de dois meses de idade (A e B) ...

Comparação dos perfis temporais ...

Comparação dos perfis temporais de heterogeneidade cortical da microglia de Wt e gp120 ...

Verificação de MYE-M no ...

Verificação de MYE-M no tecido espinhal e cortical Wt e Tg de ...

Comparação dos perfis temporais ...

Comparação dos perfis temporais de heterogeneidade microglial espinhal de Wt e gp120 ...

Verificação de INF-M no ...

Verificação de INF-M no tecido espinhal e cortical Wt e Tg de ...

O efeito do HIV-1 gp120 nas vias de sinalização nervosa microglial cortical e espinhal ...

Um gráfico de pizza resumido mostra ...

Um gráfico de pizza resumido mostra as proporções relativas de subtipos microgliais individuais em ...


O mecanismo de reconhecimento da proteína do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 pelas proteínas 14-3-3 humanas

A proteína do nucleocapsídeo do coronavírus (N) controla o empacotamento do genoma viral e contém vários locais de fosforilação localizados em regiões não estruturadas. A ligação de SARS-CoV N fosforilado à proteína hospedeira 14-3-3 no citoplasma foi relatada para regular o transporte de N nucleocitoplasmático. Todas as sete isoformas do 14-3-3 humano estão abundantemente presentes em tecidos vulneráveis ​​ao SARS-CoV-2, onde N pode constituir até

1% das proteínas expressas durante a infecção. Embora a associação entre as proteínas 14-3-3 e SARS-CoV-2 N possa representar uma das principais interações patógeno-hospedeiro, seu mecanismo molecular e os fosfositos críticos específicos são desconhecidos. Aqui, mostramos que os dímeros da proteína N SARS-CoV-2 N (pN) fosforilados, reconstituídos via co-expressão bacteriana com a proteína quinase A, se associam diretamente, de maneira dependente da fosforilação, com a proteína dimérica 14-3-3, mas não com seu mutante monomérico. Demonstramos que o pN é reconhecido por todas as sete isoformas humanas 14-3-3 com várias eficiências e deduzimos o K aparenteD a isoformas selecionadas, mostrando que estão em uma faixa micromolar baixa. Truncamentos em série identificaram um sítio de fosforilação crítico para Ser197, que é conservado entre coronavírus zoonóticos relacionados e localizado dentro da região funcionalmente importante, rica em SR de N. A associação 14-3-3 / pN relativamente estreita poderia regular o transporte nucleocitoplasmático e outras funções de N via oclusão da região rica em SR e também poderia sequestrar as vias celulares por sequestro 14-3-3. Como tal, a montagem pode representar um alvo valioso para intervenção terapêutica.

Palavras-chave: interações hospedeiro-patógeno estequiometria do complexo nucleocitoplasmático fosforilação fosforilação proteína-proteína.

Copyright © 2021 O (s) autor (es). Publicado pela Elsevier Ltd .. Todos os direitos reservados.

Declaração de conflito de interesse

Declaração de Concorrência de Interesses Os autores declaram que não conhecem interesses financeiros concorrentes ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.


Revelando igual importância de duas proteínas 14-3-3 para morfogênese, conidiação, tolerância ao estresse e virulência de um patógeno de inseto

Duas proteínas 14-3-3 conservadas ortólogas a Saccharomyces cerevisiae Bmh1 / 2 são mal compreendidas em fungos filamentosos. Aqui, mostramos que Bmh1 e Bmh2 contribuem igualmente para a biologia e fisiologia fundamentais de Beauveria bassiana, visando muitos conjuntos de proteínas / enzimas. Uma única deleção de Bmh causou regulação positiva semelhante de outro. Excelentes expressões knockdown (∼91%) de Bmh1 em ΔBmh2 e Bmh2 em ΔBmh1 resultaram em defeitos multifenotípicos igualmente mais graves do que as exclusões únicas, incluindo transição G2 / M, tamanho do blastosporo, utilização de carbono / nitrogênio, conidiação, germinação e tolerâncias conidiais a altas osmolaridade, oxidação, estresse da parede celular, alta temperatura e irradiação UV-B. Todos os mutantes de deleção e deleção / knockdown mostraram defeitos semelhantes no rendimento e densidade do blastosporo, septação de hifas e tamanho das células, respostas de hifas à maioria dos estresses químicos e virulência. Todos os defeitos eram evidentes com transcrições alteradas de genes relacionados ao fenótipo e bem restaurados por cada complementação de Bmh. Nossos transcriptomas específicos para Bmh1 e Bmh2 gerados sob estresse osmótico e oxidativo revelaram até 6% de genes diferencialmente expressos por pelo menos duas vezes no genoma do fungo. Muitos deles estavam muito deprimidos ou co-deprimidos em ΔBmh1 e ΔBmh2. Nossos resultados fornecem uma visão completa das funções e efeitos complementares das duas proteínas 14-3-3 no entomopatógeno filamentoso.


A biologia molecular e o controle imunológico de doenças crônicas Toxoplasma gondii infecção

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer e Centro de Imunologia Carter, Escola de Medicina da Universidade de Virgínia, Charlottesville, Virgínia, EUA.

Endereço para correspondência: Sarah E. Ewald, Carter Immunology Center MR-6 3706, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, Virginia 22908, EUA. Telefone: 434.924.1925 Email: [email protected]

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Departamento de Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer e Centro de Imunologia Carter, Escola de Medicina da Universidade de Virgínia, Charlottesville, Virgínia, EUA.

Endereço para correspondência: Sarah E. Ewald, Carter Immunology Center MR-6 3706, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, Virginia 22908, EUA. Telefone: 434.924.1925 Email: [email protected]

Toxoplasma gondii é um parasita incrivelmente bem-sucedido devido em parte à sua capacidade de persistir dentro das células por toda a vida do hospedeiro. Notavelmente, pelo menos 350 espécies hospedeiras de T. gondii foram descritos até o momento, e estima-se que 30% da população humana global esteja cronicamente infectada. A importância de T. gondii na saúde humana ficou claro com os primeiros relatos de toxoplasmose congênita na década de 1940. No entanto, a crise da AIDS na década de 1980 revelou o predomínio da infecção crônica, visto que os pacientes apresentavam toxoplasmose crônica reativada, ressaltando a importância de um sistema imunológico intacto para o controle do parasita. Nos últimos 40 anos, houve um enorme progresso na compreensão da biologia de T. gondii infecção usando modelos de roedores, sistemas experimentais de células humanas e dados clínicos. No entanto, ainda existem grandes lacunas em nossa compreensão de T. gondii biologia, incluindo os genes que controlam o desenvolvimento do parasita, os mecanismos de imunidade intrínseca às células T. gondii no cérebro e nos músculos, e os efeitos de longo prazo da infecção na homeostase do hospedeiro. A necessidade de compreender melhor a biologia da infecção crônica é enfatizada pelo recente aumento de doenças oculares associadas a haplótipos emergentes de T. gondii e nossa falta de tratamentos eficazes para esterilizar infecções crônicas. Esta revisão discute os tipos de células e mediadores moleculares, tanto do hospedeiro quanto do parasita, que facilitam a persistência T. gondii infecção. Destacamos as consequências da infecção crônica para a patologia específica do tecido e identificamos as questões em aberto nesta área do hospedeiro.Toxoplasma interações.

Toxoplasma gondii é um parasita protozoário intracelular obrigatório unicelular adquirido pela ingestão de alimentos contaminados. Espécies felinas são T. gondiiHospedeiros definitivos, o que significa que os gatos facilitam a recombinação sexual do parasita e eliminam milhões de oocistos altamente infecciosos e ambientalmente estáveis ​​(1). T. gondii é único em sua gama de hospedeiros intermediários incrivelmente ampla, que inclui humanos, gado (ovelhas e porcos são particularmente importantes para a transmissão humana), pássaros e roedores, entre outros (2). Esses hospedeiros intermediários suportam as formas de cisto tecidual taquizoíta e bradizoíta assexuado do parasita. Os moluscos, que concentram os oocistos por meio da filtragem da água contaminada, são um vetor adicional de transmissão ao homem (3). Após o consumo de cistos ou oocistos de tecido de bradizoíta, T. gondii invade o intestino delgado de seu hospedeiro (4, 5). Um trabalho recente do laboratório de Laura Knoll sugere que o parasita pode detectar o ácido linoléico no intestino felino como um sinal crítico para a diferenciação do estágio sexual nessas espécies (6). A passagem pelo gato confere um tremendo benefício ao parasita em termos de diversidade genética e expansão de alcance, e facilitar a transmissão para os gatos parece ser uma grande pressão que impulsiona a evolução do parasita. Dada a importância do ciclo predador-presa entre roedores e gatos, os roedores podem ser um hospedeiro particularmente importante para T. gondii. Como será discutido, esta conclusão é apoiada pelas observações de que T. gondii expressa um quadro sofisticado de efetores que cruzam a sinalização imune do camundongo (7 - 9) e que os roedores infectados perdem sua aversão natural à urina felina (10, 11) e podem se tornar gravemente desperdiçados (12 - 14), todos os quais podem facilitar a transmissão via predação de um hospedeiro roedor.

Taxas de humanos T. gondii a infecção varia de 10% nos Estados Unidos a mais de 50% na França, Colômbia e Brasil (15 - 17). A infecção aguda pode causar sintomas semelhantes aos da gripe, no entanto, os indivíduos imunocompetentes eliminam a maioria dos parasitas durante a infecção aguda. Os parasitas sobreviventes persistem como cistos de tecido de bradizoíta de crescimento lento, mais abundantes em tecidos com vigilância imunológica limitada, incluindo cérebro, olhos, coração e músculo esquelético (18). Contratante T. gondii durante a gravidez pode ser letal para o feto, que também possui um sistema imunológico mínimo (19). Tecidos que não foram classicamente considerados “imunoprivilegiados” também abrigam parasitas, com base na observação de que receptores de transplante de rim, fígado, coração ou pulmão contraíram toxoplasmose de um doador infectado (20 - 24). No entanto, a infecção crônica nesses tecidos é quase não estudada, pois a frequência do parasita é incrivelmente baixa. A resposta imune a T. gondii é sustentada durante a infecção crônica, e isso é evidente em casos elevados T. gondii–IgG e IFN-γ específicos no soro, ambos essenciais para a restrição do parasita (25). Se o sistema imunológico for suprimido durante a quimioterapia, transplante de órgãos ou AIDS, por exemplo, T. gondii pode reverter para a replicação de taquizoíta (26, 27). Esse processo, conhecido como recrudescência, pode ser letal se a parasitemia não for controlada com medicamentos. Os regimes prescritos com mais frequência são pirimetamina combinada com sulfadiazina ou clindamicina trimetoprim em combinação com sulfametoxazol podem ser usados ​​como alternativa (28). No entanto, esses tratamentos antiparasitários são mal tolerados e a hipersensibilidade aos medicamentos à base de sulfa é particularmente comum. Atualmente, nenhum tratamento foi desenvolvido para eliminar os cistos teciduais, talvez devido ao crescimento lento dos bradizoítos, seu sequestro dentro dos neurônios e / ou a dificuldade de desenvolver drogas que cruzem a barreira hematoencefálica. Esta é uma área de grande necessidade, como novos haplótipos de T. gondii estão surgindo que se associam com doença ocular grave em pacientes imunocompetentes (29, 30).

Na América do Norte e na Europa, isolados ambientais de T. gondii predominantemente pertencem a três principais cepas ou tipos: tipo I, tipo II e tipo III. Esses tipos são notáveis ​​em que a virulência, medida pela dose letal (LD), difere por vários logs em cepas consanguíneas de camundongos (por exemplo, C57BL / 6, CBA / J, BALB / c). Tipo I é o mais virulento (LD100 de 1-10 taquizoítos), em comparação com o tipo II (LD50 de 100-1000) e tipo III (LD50 do

100.000 a 1 milhão), que são substancialmente menos agressivos in vivo (31, 32). A infecção humana é dominada pelo tipo II na América do Norte e Europa, entretanto, um quarto tipo, o haplogrupo 12, foi recentemente isolado de pacientes norte-americanos e animais selvagens (33). Na Ásia e na África, linhagens clonais específicas de região também foram isoladas (34). As cepas que não se enquadram no padrão de expansão da linhagem clonal foram identificadas na América do Sul pertencentes aos haplogrupos 4 a 15 (35 - 37). O sequenciamento do genoma completo indica que a mistura genômica e a recombinação entre um número limitado de cepas ancestrais são responsáveis ​​por T. gondiiDiversidade genética. A relação entre as cepas foi determinada pela comparação do padrão de herança de grandes blocos de genes. Esses haploblocks codificam proteínas efetoras do parasita secretadas associadas à virulência, sugerindo que a variedade única de alelos efetores também pode controlar a patogênese e / ou as taxas de transmissão (38). É importante ressaltar que há evidências de coevolução entre haplótipos virulentos e genes de GTPase relacionada à imunidade induzível por IFN de camundongo (IRG), que são mediadores críticos da morte de parasitas intrínsecos em células em modelos de camundongos (39, 40).

Ativar uma resposta imune robusta é fundamental para a sobrevivência do hospedeiro e do parasita. Os cistos de bradizoíta são resistentes às proteases pépticas, mas os taquizoítos não: se o hospedeiro morre antes do estabelecimento da infecção crônica, a transmissão do parasita não ocorre. Seguindo esse paradigma, o parasita desenvolveu efetores que ativam seletivamente a sinalização da célula imune do hospedeiro, além de estratégias para evitar a imunidade esterilizante. Na infecção aguda e crônica, T. gondii cresce e persiste dentro de uma membrana de vacúolo parasitóforo (PVM). O PVM é gerado a partir da membrana plasmática do hospedeiro à medida que o parasita penetra na célula usando proteínas efetoras do parasita injetadas. Este processo evita o ambiente lítico dos compartimentos endo / lisossomais e é responsável pela notável capacidade do parasita de infectar quase qualquer tipo de célula nucleada in vitro (41). In vivo, entretanto, os tipos de células que abrigam o parasita são mais limitados. Depois que um cisto do parasita é ingerido, T. gondii invade o jejuno distal do intestino delgado em camundongos (42, 43). Os tipos precisos de células hospedeiras mediando a invasão (por exemplo, células M, células epiteliais) não são claros, no entanto, T. gondii esporozoítos e taquizoítos foram observados em células epiteliais intestinais (44). Os taquizoítas também são observados nas células do sistema imunológico infiltrante (43 - 45). O eixo da quimiocina CCL2 / CCR2 é um mecanismo conservado de recrutamento de monócitos em camundongos e humanos (46). Os efetores do parasita Tg14-3-3 e TgFoi demonstrado que WIP promove hipermotilidade em células dendríticas humanas e murinas infectadas (47, 48). A hipermotilidade das células dendríticas foi observada in vivo, sugerindo que pode ser um mecanismo furtivo que facilita a disseminação do parasita, evitando a detecção por efetores imunes circulantes (49, 50).

A longa relação evolutiva entre T. gondii e os hospedeiros mamíferos são evidentes na análise das vias que as células infectadas usam para detectar e destruir o parasita (39). Três braços principais de sensoriamento imune inato foram descritos em T. gondii infecção: os receptores Toll-like (TLRs), as GTPases induzíveis por IFN e os inflamassomas. A sinalização do receptor de TLR e IL-1 (IL-1R) através do MyD88 é um mediador central da secreção de IL-12 e da resposta protetora Th1 para T. gondii (51). Em camundongos infectados intraperitonealmente com T. gondii, a proteína profilina do parasita se liga e ativa diretamente o TLR11, contribuindo para a produção de IL-12 e a restrição do parasita (52). No entanto, a profilina é uma proteína modificadora da actina sequestrada dentro de parasitas e sinais TLR11 de compartimentos endossômicos, sugerindo que esta via pode ser ativada principalmente por parasitas fagocitados, mortos ou disfuncionais (Figura 1). Consistente com este modelo, após a infecção oral, camundongos deficientes em TLR11 tinham defeitos mínimos em sua resposta Th1 em comparação com camundongos deficientes em MyD88 ou TLR2, TLR4 e TLR9, no entanto, tratando camundongos deficientes em TLR11 com antibióticos fenocopiados em camundongos deficientes em MyD88 (53, 54). Esses dados indicam que a microbiota comensal intestinal pode preparar uma resposta imune protetora para T. gondii independente do reconhecimento do parasita por TLR11. É notável que o TLR11 humano é um pseudogene, indicando mecanismos de detecção inatos alternativos para detectar e destruir T. gondii em células humanas.

Sinalização imune inata e a influência de efetores de parasitas. T. gondii cresce dentro de uma membrana de vacúolo parasitóforo (PVM) que protege o parasita de sensores imunes citosólicos e evita a fusão com os compartimentos endolisossômicos contendo receptores Toll-like (TLRs). No mouse, o TLR11 reconhece Tg profilina, uma proteína modificadora da actina que é exposta assim que parasitas mortos ou danificados são fagocitados. TLR11 é um pseudogene em humanos. TgGRA15 pode promover a fosforilação do NF-κB do hospedeiro e a translocação nuclear. Em camundongos, a estimulação de NF-κB é necessária para a regulação da transcrição dos componentes do inflamassoma NLRP1, NLRP3 e IL-1, no entanto, os monócitos humanos podem envolver um inflamassoma de NLRP3 independente da pré-estimulação de NF-κB. Um mecanismo detalhado de ativação do inflamassoma, morte do parasita e morte da célula hospedeira permanece indescritível, particularmente no que diz respeito à integração do sinal com IFN-γ. A sinalização de IFN-γ induz a translocação de STAT1 para o núcleo e a regulação positiva de genes responsivos a IFN, incluindo GTPases relacionadas à imunidade (IRGs, camundongo) e proteínas de ligação ao guanilato (GBPs, humano e camundongo), que funcionam para atacar o vacúolo do parasita, levando a morte de parasitas e morte de células hospedeiras. Em células humanas, GBP1 é necessário para este processo, o que leva à ativação AIM2 de uma via alternativa de apoptose. As proteínas rhoptry do parasita tipo I, TgROP5, 17 e 18, podem desmantelar a função dos IRGs IRGa6 e IRGb6 de camundongos no PVM, inativando o ataque de GBP e a morte do parasita. O parasita denso grânulo efetor TgIST é um repressor nuclear da transcrição de STAT1. TgROP16 é uma quinase que fosforila e ativa o hospedeiro STAT3 e STAT6. TgEGGR afeta a expressão do gene do hospedeiro por meio de modificações epigenéticas mediadas por E2F3 e E2F4. Em monócitos infectados e células dendríticas (DCs), TgAs proteínas WIP e 14-3-3 promovem a mobilidade celular, um mecanismo putativo de disseminação intracelular do parasita in vivo.

O inflamassoma liga a detecção de componentes microbianos ou danos celulares associados à infecção à liberação de citocinas da família IL-1 e, frequentemente, à morte celular inflamatória. Embora a resposta do inflamassoma aos protozoários seja pouco estudada em comparação com patógenos bacterianos e virais, o que se sabe sobre T. gondii o reconhecimento sugere diferenças importantes (55, 56). Os sensores do inflamassoma NLRP1 (em camundongos) e NLRP3 (em camundongos e humanos) demonstraram processar e liberar IL-1β em resposta a T. gondii infecção (Figura 1 e referências 57 - 59). Camundongos deficientes em NLRP3, caspase-1 e / ou caspase-11 têm uma carga parasitária maior in vivo (57, 58, 60). No entanto, ao contrário dos gatilhos de inflamassoma mais bem estudados (por exemplo, a toxina letal de protease antraz de NLRP1 ou patógenos bacterianos que ativam NLRP3), a morte de células hospedeiras piroptóticas não é observada em células de camundongo ou humanas (57 - 59). Ao contrário dos macrófagos murinos, o inflamassoma NLRP3 em monócitos humanos é ativado independentemente da via TLR via Syk e sinalização CARD9 e a liberação de IL-1β é independente da gasdermina D formadora de poros (59, 61-63). Questões em aberto no mecanismo molecular da resposta do inflamassoma a T. gondii inclua quais sinais do parasita ativam o inflamassoma, por que a proptose não está ativada e se isso é resultado da manipulação ativa do parasita.

Dados recentes também sugerem crosstalk entre o inflamassoma e as GTPases induzíveis por IFN, uma via que examina a célula em busca de membranas estranhas ou danificadas e as direciona para eliminação a jusante de IFN-γ. Em células humanas, a proteína 1 de ligação ao guanilato da superfamília de dinamina (GBP1) localiza-se no PVM e desencadeia a liberação de DNA do parasita no citosol da célula hospedeira, onde é detectado pelo sensor de inflamassoma AIM2 (Figura 1 e referências 63, 64) . Por razões que ainda não estão claras, uma resposta do inflamassoma piroptótico não é ativada em vez disso, uma via apoptótica alternativa de morte da célula hospedeira é ativada (63, 64). Ao contrário do sistema humano, os ratos contam com uma família expandida de IRGs p47 para detectar o vacúolo do parasita a jusante do IFN-γ. IRGM1 e IRGM3 de camundongo regulam a interação entre IRGa6, IRGb6 e fosfolipídios no PVM (65). Uma gama mais ampla de GBPs de mouse tem sido implicada em T. gondii depuração no entanto, o mecanismo de morte do parasita e morte celular do hospedeiro em células de camundongo não é conhecido (66 - 68). A importância do sistema IRG na eliminação do parasita é enfatizada pela observação de que os parasitas do tipo I expressam uma tríade de efetores secretados, proteína rhoptry 5 (ROP5), ROP17 e ROP18, que se ligam e inativam a função GTPase de IRGa6 e IRGb6 ( 69, 70). Esta inativação é o principal mecanismo de virulência específica do tipo, uma vez que parasitas tipo II e tipo III expressam alelos de Rop5 ou Rop18, respectivamente, que não pode subverter efetivamente o ataque de IRG. Embora tenha havido um enorme progresso na identificação das classes de sinalização imunológica autônoma celular em resposta a T. gondii, o campo carece de um modelo integrado de detecção autônoma de células através dessas vias para sistemas de camundongos e humanos, particularmente em tipos de células diferentes de fibroblastos, monócitos e macrófagos.

T.gondii o reconhecimento por sensores imunes inatos desencadeia uma resposta imune dependente de células T CD8 + polarizada Th1 que é necessária para a sobrevivência do hospedeiro. Existem muitas revisões excelentes sobre a imunobiologia da infecção (7, 8, 71, 72), portanto, abordaremos brevemente os aspectos da resposta imune aguda que são necessários para a progressão para infecção crônica. Camundongos deficientes em IL-12, TNF-α e IFN-γ ou em suas vias de sinalização morrem de crescimento excessivo do parasita na infecção aguda (73 - 76). A deficiência de IFN-γ e IL-12 é rara em humanos e não foi correlacionada com o aumento da suscetibilidade à toxoplasmose, no entanto, macrófagos derivados de monócitos de IFNGR1- pacientes deficientes não conseguem restringir T. gondii após estimulação com IFN-γ em comparação com macrófagos de doadores saudáveis ​​(77, 78). Camundongos deficientes na via da IL-6 falham em montar uma resposta protetora das células B e morrem no início da infecção crônica (79). A IL-10 e as células T reguladoras desempenham um papel igualmente importante na sobrevivência do hospedeiro, limitando a magnitude da resposta inflamatória e danos ao espectador (80-85).

Um número crescente de T. gondii foram identificados efetores que são secretados na célula hospedeira para controlar a sinalização imunológica. Esses efetores são liberados de organelas secretoras conhecidas como rhoptries (ROP) e grânulos densos (GRA), e muitos dos efetores são polimórficos entre as cepas e desempenham um papel na virulência (Figura 1). GRA15 ativa NF-κB e GRA24 ativa a via p38 MAPK para promover a expressão de IL-12 e IL-18, os reguladores a montante de IFN-γ e ativação de células T (86, 87). ROP16 é uma serina-treonina quinase que fosforila diretamente STAT3 e STAT6 e amortece a produção de IL-12, o que pode ser consistente com o conceito de que o ajuste fino da resposta imune é necessário para a sobrevivência do hospedeiro e a transmissão do parasita (88, 89). No entanto, o efetor TgIST was recently identified as an inhibitor of IFN receptor signaling. TgIST binds STAT1 and forms an inhibitory complex with the nucleosome remodeling deacetylase (Mi-2/NuRD) complex. This suppresses transcription of IRF1-dependent cytokines, MHC class II expression and antigen presentation, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, which kills parasites by producing reactive nitrogen species ( 90 , 91 ). Similarly, TgTEEGR interacts with E2F3 and E2F4 transcription factors, and forms a nuclear complex with a catalytic subunit of polycomb repressor complex to block NF-κB–mediated expression of proinflammatory cytokines like IL-1β and IL-6 ( 92 ). These effectors are among 200–300 predicted secreted effector proteins in the parasite genome, the majority of which have not been characterized, particularly in the context of chronic infection.

In chronic infection, the central nervous system contains the highest frequency of parasites per gram of tissue. The potential implications of neural infection for host behavior and homeostasis have led to great interest in understanding the biology of T. gondii infection in the brain. Our understanding of chronic central nervous system infection is almost exclusively based on murine models of infection. There are many open questions, beginning with how the parasite traverses the blood-brain barrier (BBB). Using intravital microscopy, T. gondii has been imaged replicating within brain endothelial cells and then directly entering the brain ( 93 ). Mice infected intravenously with the T. gondii RH strain had a higher brain parasite load than mice infected with the CPS strain, which cannot replicate in vivo, suggesting that T. gondii growth within vascular endothelial cells may be an important stopover before direct entry into the brain (Figure 2A and ref. 93 ). Perfusion of Evans blue dye shows increased BBB permeability during chronic T. gondii infection, accompanied by reduced blood flow and capillary rarefication which may permit immune cell entry into the brain ( 94 ). Using intravital microscopy, CCR2 + monocytes are found to accumulate, exhibiting rolling and cradling behavior at the BBB ( 95 ). This observation, coupled with the high frequency of infection of dendritic cells and their hypermotility phenotype, has led to the Trojan horse hypothesis: that parasites traverse the BBB within immune cells (Figure 2A and refs. 49 , 96 ). Although direct evidence for this model is lacking, antibody depletion of CD11b + leukocytes correlated with reduced brain parasite load and adoptive transfer of T. gondii–infected CD11c + or CD11b + cells into naive mice led to neural infection ( 97 ).

T. gondii entry and control of persistent infection in the brain. (UMA) In acute infection, T. gondii is frequently observed in immune cells, including monocytes and dendritic cells, with hypermigratory behavior. During infection, blood-brain barrier (BBB) permeability increases and monocytes accumulate in the endothelial lumen, interacting with endothelial cells. These observations have led to the hypothesis that migratory immune cells deliver T. gondii to the BBB and, perhaps, smuggle them into the brain. Replicating parasites are also observed in brain endothelial cells, whose subsequent lysis may be a mechanism of T. gondii entry into the brain. (B) During acute infection parasites are observed infecting neurons, astrocytes, microglia, and infiltrating immune cells. Astrocytes and microglia as well as peripheral monocytes can clear parasites with cell-autonomous immune pathways. (C) As chronic infection progresses, infected astrocytes and microglia or the parasites within them are cleared and cysts are primarily observed within neurons. Most parasite cysts are not associated with immune infiltrate however, individual parasites or parasite debris can be observed colocalizing with immune infiltrate.

Analysis of mouse brain sections and an extremely limited number of healthy human brain samples indicates that most intracellular cysts are not associated with immune infiltration ( 98 ). However, within the same brain section, inflammatory foci can be observed containing parasites or parasite debris, activated microglia, macrophages, and T cells ( 99 ). Depleting IFN-γ or CD4 + and CD8 + T cells leads to parasite recrudescence ( 100 ). Taken together these data suggest that intracellular cysts are relatively immunologically silent however, cysts that lyse (spontaneously or through recrudescence) are recognized and quickly contained by infiltrating immune cells (Figure 2C).

Experiments using parasites engineered to secrete Cre recombinase in Cre reporter mice have demonstrated that neurons are the major cell type interacting with the parasite in the brain, although T cells, monocytes or macrophages, microglia, and astrocytes are reporter-positive early in brain infection (Figure 2B and refs. 101 – 103 ). These data also suggest that rather than having a tropism for neurons, T. gondii is cleared from non-neuronal cell types in the brain. Consistent with this model, disabling the IFN-γ signaling in mouse astrocytes by knocking out the transcription factor STAT1 led to greater incidence of cysts within astrocytes ( 104 ) and IFN-γ depletion increased the percentage of infected astrocytes ( 102 ). Subsequently, the ability of mouse astrocytes to restrict T. gondii growth in response to IFN-γ was shown to depend on IRGM3 (IGTP), not iNOS IRGM3 and IRGa6 disrupted the PVM and, in one study, led to parasite egress ( 105 – 107 ). In human astrocytes, IL-1β in combination with IFN-γ induced iNOS-dependent killing of T. gondii ( 108 ), whereas TNF- and IFN-γ limited T. gondii growth by tryptophan starvation via upregulated indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ( 109 ). The parasite effector TgGRA15 has been shown to limit IDO-mediated parasite restriction in cultured glioblastoma and neuroblastoma cell lines ( 110 ). IFN-γ in combination with TNF-α or LPS has also been shown to activate parasite killing functions of human and murine microglia through iNOS-dependent and -independent mechanisms ( 111 – 113 ). Microglia can also produce IFN-γ and TNF-α, which are critical for central nervous system restriction of the infection ( 114 ) IFN-γ, in particular, has been shown to induce adhesion molecule expression on vascular endothelial cells and promote the expression of CXCL9, CXCL10, and CCL5, which recruit peripheral immune cells to the brain ( 115 , 116 ). Most of these data are from in vitro experiments, and better tools to study microglia and astrocyte function in vivo will be important to clarify which pathways control central nervous system infection.

While brain-resident immune cells contribute to T. gondii restriction, the role of cell-autonomous immunity in neurons is less clear. A recent study using OVA-expressing parasites and conditional MHC class I–deficient mice demonstrated that neurons can present T. gondii–derived antigens to initiate a CD8 + T cell response ( 117 ) however, whether endogenous parasite epitopes are efficiently presented on neurons is yet to be examined. Brain-infiltrating CD8 + T cells have been shown to control cyst burden indirectly through IFN-γ secretion, and, to a lesser extent, via perforin-dependent killing of infected cells ( 118 – 120 ). It is notable that perforin has been shown to trigger parasite egress in vitro, suggesting that perforin may limit parasite growth but other cells are responsible for parasite killing, potentially through cell-autonomous immunity ( 121 ). A minimal reliance on perforin-mediated T. gondii clearance also fits a model wherein cellular cytotoxicity should be limited in the brain to promote survival of neurons, which have an extremely limited regenerative capacity.

Currently there are no therapeutic tools that effectively target bradyzoite cysts and sterilize chronic infection. Our understanding of bradyzoite biology is weaker than our understanding of tachyzoite biology. This is linked to long-standing technical challenges associated with genetic manipulation of bradyzoite-specific genes that are required to perform “necessary and sufficient” experiments. However, the recent bloom in CRISPR/Cas9 tools has led to gains in this arena ( 122 , 123 ).

The transition between tachyzoite and bradyzoite has commonly been referred to as “switching” however, recent studies suggest that stage conversion is a continuum under epigenetic and transcriptional regulation rather than a finite life stage. Bradyzoite polarization can be induced by cell stressors including alkaline media, heat shock, and oxidative stress (refs. 124 – 126 and Figure 3). IFN-γ treatment has been shown to induce bradyzoite gene expression in infected macrophages but not fibroblasts, suggesting that cell type–specific differentiation signals may also exist ( 127 ). Compared with fibroblasts, infected neuronal or skeletal muscle cells support a stronger expression of bradyzoite markers and a higher frequency of cyst development ( 128 ). It is worth noting that neurons and muscle cell types are historically difficult to culture, suggesting that cell stress signals may be relevant to bradyzoite development in these models. However, terminally differentiated myotubes are reported to support a higher frequency of bradyzoites compared with dividing myoblast progenitor cells, suggesting that cell cycle may provide developmental cues for the parasite development as well ( 129 ).

Environmental and host cell–specific pressures driving the T. gondiitachyzoite to bradyzoite transition. Deixou: T. gondii tachyzoites can invade almost any nucleated host cell type and grow within the PVM formed from host plasma membrane. Em vitro, a range of tissue culture stress conditions can upregulate bradyzoite-specific genes. As parasites polarize to a bradyzoite transcriptional profile, they synthesize a heavily glycosylated cyst wall beneath the PVM. The frequency and rate of bradyzoite differentiation are also influenced by the host cell type, cell cycle status, the host cell lifespan, and inflammatory signals in vitro. In vivo, cysts are most frequently observed in neurons, cardiac muscle, skeletal muscle, and retinal pigment epithelial cells. If the host is immune-suppressed, parasites shift toward a replicative tachyzoite form in a process referred to as recrudescence, which is associated with tissue damage, particularly in the eye.

Although the precise signals are unclear, histone methylation and acetylation are important epigenetic regulators of bradyzoite differentiation. Treating tachyzoites with arginine methyltransferase inhibitor, AMI-I, induces a reduction of histone H3R17 methylation and bradyzoite differentiation in vitro ( 130 ). o T. gondii histone acetyltransferase TgGCN5a is enriched at promoter regions of bradyzoite-specific genes, and TgGCN5a-deficient parasites fail to upregulate the bradyzoite markers Bag1 e Ldh2 under stress ( 131 ). Treating infected cells with the histone deacetylase inhibitor FR235222 induces bradyzoite differentiation through inhibiting TgHDAC3 ( 132 ). Phosphorylation of the T. gondii eukaryotic initiation factor 2 α subunit (TgeIF2α) is enhanced under stress conditions and is necessary for bradyzoite differentiation ( 133 ). Guanabenz, an eIF2α dephosphorylation inhibitor, has been shown to impair tachyzoite proliferation and promote bradyzoite differentiation in vitro ( 134 ).

The ApiAP2 family of transcription factors are emerging as central regulators of bradyzoite differentiation. This family consists of 67 genes, many of which are associated with bradyzoite stage–specific expression. Specifically, AP2XI-4– and AP2IV-3–knockout parasites have reduced expression of bradyzoite-specific genes after in vitro switch and AP2XI-4–null T. gondii forms fewer cysts in mice ( 135 , 136 ). AP2IV-4 knockouts express some bradyzoite-specific genes under tachyzoite culture, but had fewer brain cysts in mice ( 137 ). Using a CRISPR/Cas9 guide RNA library targeting mostly AP2 domain–containing proteins and predicted nucleic acid–binding proteins, bradyzoite formation deficient 1 (BFD1), a Myb-like transcription factor, was recently identified as a key regulator of bradyzoite differentiation in vitro and in vivo in mice. Interessantemente, Bfd1 mRNA is expressed in tachyzoites however, protein expression is only induced by stress conditions ( 138 ). It remains to be seen whether immunosuppression induces any parasite recrudescence in mice infected with BFD1-deficient parasites and how BFD1- and AP2-family proteins coordinate bradyzoite differentiation.

T.gondii bradyzoite cysts are often defined by formation of a cyst wall consisting of heavily glycosylated proteins underneath the PVM ( 139 ). The cyst wall is essential for transmission, protecting the parasite from gastric proteases and the low pH of the stomach. Parasites deficient in the cyst wall–localized bradyzoite pseudokinase 1 (BPK1) were more sensitive to pepsin digestion and less orally infectious than WT parasites ( 140 ). Parasites that were rendered genetically deficient in cyst glycoproteins, including loss of the nucleotide-sugar transporter TgNST1 or the heavily glycosylated cyst wall protein TgCST1, have defects in cyst number, cyst stability, and infectivity during oral infection ( 141 – 143 ). The cyst wall may also protect bradyzoites from enzymatic attack during chronic infection. The Wilson laboratory demonstrated that chitinase-expressing, alternatively activated (M2) macrophages were able to recognize and degrade chitin-like polysaccharides in the cyst wall ( 144 ). Consistent with this observation, a GWAS identified single-nucleotide polymorphisms in the intergenic region of the human CHIA locus, which expresses chitinase, that were significantly associated with T. gondii infection ( 145 ).

T.gondii infection is the most frequent cause of posterior uveitis, also referred to as chorioretinitis or inflammation of the retina and choroid (pigmented vascular coat of the eye) ( 30 ). This is one area of T. gondii infection that has been more extensively studied in patients than in animal models, which have been limited until recently. Type II strains, most frequently associated with infection in Europe and North America, are associated with chorioretinitis ( 146 , 147 ). Historically, ocular toxoplasmosis was associated with congenital infection however, rates of disease associated with postnatal infection are rising and associated with new T. gondii strains ( 148 ). Over 70% of patients presenting with acute ocular toxoplasmosis already have ocular scars, suggesting that disease progression is driven by the inflammatory response to recrudescent T. gondii leading to the accumulation of tissue damage over time ( 149 ). Immune-competent individuals are able to control ocular infection, but early antiparasitic treatment is critical to limit the extent of retinal damage ( 150 ). Human retinal vascular endothelial cells are more sensitive to infection than other endothelial cell types, suggesting a potential mechanism of entry into the eye ( 151 ). T. gondii cysts have been observed in retinal pigmented epithelial cells ( 152 ). In a mouse model of ocular toxoplasmosis, retinal pigment epithelial cells and infiltrating immune cells expressed the T cell inhibitory ligand PD-L1 ( 153 ). This may be an important mechanism to limit tissue pathology, although the parasites may exploit this axis for persistence. IFN-γ and IL-6, which are both critical in restricting systematic parasitemia ( 79 , 100 ), were elevated in the vitreous humor of mice with ocular lesions. However, intraocular injection of an IFN-γ–blocking antibody impaired parasite control and worsened tissue damage, while, perhaps counterintuitively, injection of an IL-6–blocking antibody improved parasite control and minimized ocular damage ( 154 – 156 ). Patients infected with virulent South American haplotypes of T. gondii, which have been associated with aggressive chorioretinitis, had less IFN-γ and IL-17 but higher IL-13 and IL-6 levels in the eye compared with European patients infected with virulent type I ( 157 ). However, it is currently not clear whether these differences in immune regulation control ocular disease severity.

In mice and rats, infection with T. gondii leads to a well-established loss of innate aversion behavior to felines, which has been proposed to benefit the parasite by facilitating transmission via predation ( 11 , 158 , 159 ). Whether these behavioral phenotypes are driven by specific changes in neural activity or a more general effect of inflammation is an open question. The observation that T. gondii expresses two aromatic amino acid hydrolases that produce l -DOPA, AAH1, and AAH2 led to the hypothesis that the parasite could modulate dopaminergic neuron function. However, deletion of AAH2 failed to alter brain dopamine levels, neuroinflammation, or behavioral alterations in T. gondii–infected mice ( 160 , 161 ), although these genes are necessary for oocyst development in the cat ( 162 ). Notably, mice infected with an avirulent mutant of type I T. gondii or the related organism Neospora caninum, which are cleared before establishing chronic infection, exhibit loss of aversion behavior even though chronic infection is not sustained ( 163 ). These data suggest that acute inflammation may be sufficient to trigger sustained behavioral changes, although the molecular bases for behavioral changes in T. gondii infection are unclear. Recently, the olfactory GPCR trace amine-associated receptor 4 (TAAR4) was shown to recognize 2-phenylethylamine, a metabolite enriched in urine of predators, including feline species. There is no homolog of TAAR4 in humans, but mice deficient in TAAR4 do not engage in avoidance behavior to bobcat and mountain lion urine ( 164 ). That the olfactory neurons expressing TAAR4 are altered or damaged during T. gondii infection is a compelling hypothesis that remains to be tested.

Sustained interaction with the immune system is a hallmark of T. gondii infection: throughout chronic infection humans and mice have high titers of T. gondii–specific IgG and sera cytokines. There is growing evidence that T. gondii infection is associated with cachexia in mice, an immune-metabolic disease of sustained muscle wasting. Cachexia positively correlates with parasite load and inflammation severity however, hypermetabolic weight loss cannot be rescued by diet supplementation ( 13 , 165 – 167 ). In oral infection, intestinal barrier inflammation resolves during chronic infection, but commensal dysbiosis does not ( 14 , 168 ) however, dysbiosis is not sufficient for cachexia, as uninfected cage mates experienced a similar microbial shift but did not develop cachexia ( 14 ). Chronically infected mice have sustained changes in splenic and lymph node architecture and are more susceptible to acute viral challenge ( 169 ). Moreover, cachectic mice were more susceptible to LPS challenge than mice that recovered weight ( 170 ). Recently, mice deficient in the IL-1R axis were shown to recover from acute cachectic weight loss, although chronic parasite burden was similar to that in wild-type mice ( 171 ). A study from the Wohlfert laboratory showed that infection-induced myositis could be reversed by depletion of regulatory T cells, which were enriched in skeletal muscle ( 172 ). Parasite biology that promotes behavior modification and cachexia in rodent hosts may provide a selective advantage to T. gondii by increasing the likelihood of predation and transmission to feline hosts. It is important to note that there is currently no evidence of cachexia in immune-competent humans with chronic T. gondii infecção. However, cachexia is a predictor of mortality in almost every chronic human disease with limited experimental tools to probe sustained disease. The interaction between T. gondii and mice is proving an informative model to understand the pathophysiology of cachexia, which can be applied to understand other disease settings.

T.gondii’s ability to establish a persistent chronic infection is essential for parasite transmission. However, there is much to learn about this stage of infection in animal and human hosts. Deep sequencing has unraveled a far greater diversity in T. gondii gene assortment than originally thought, which has opened the door to understanding how parasite genetics influences pathology associated with chronic infection. CRISPR/Cas9 tools are expanding our ability to manipulate the T. gondii genome to understand how gene expression in bradyzoites controls differentiation, cyst stability, and oral infectivity of the parasite. Bradyzoite biology is intimately linked to the immune response during chronic infection. The coming decades will likely reveal mechanisms of cell-autonomous immunity to chronic T. gondii infection in the brain and other chronically infected tissues, as well as reveal the costs of the chronic inflammatory response for host homeostasis. A better understanding of this biology is needed to develop therapeutic strategies that effectively target bradyzoite cysts. Given the long evolutionary relationship between mammalian hosts and T. gondii, such studies are likely to discover important information about the regulation of immune functions during chronic inflammation more broadly.

Conflict of interest: The authors have declared that no conflict of interest exists.


Materiais e métodos

Antibodies and reagents

Antibodies used were: mouse anti-Flag mAb (Sigma), mouse anti-GFP mAb (Roche), goat anti-GST pAb (GE Healthcare), mouse anti-GluGlu mAb (Hiss Diagnostics), rabbit anti-14-3-3 pAb (K19), mouse anti-14-3-3 mAb (H8), rabbit anti-GFP pAb (FL) and mouse anti-Rho mAb (26C4) (Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-DLC1 mAb (BD), mouse anti-α-tubulin mAb (Sigma). Mouse anti-Myc mAb, clone 9E10, and mouse anti-HA mAb, clone 12CA5, were kindly provided by Heiner Böttinger (University of Stuttgart, Germany). HRP-labeled secondary anti-mouse and anti-rabbit IgG antibodies were from Amersham, HRP-labeled secondary anti-goat IgG antibody was from Santa Cruz Biotechnology alkaline-phosphatase-labeled secondary anti-goat IgG antibody was from Sigma Alexa Fluor 546-labeled secondary anti-mouse IgG antibody was from Molecular Probes. Staurosporine and okadaic acid were from Alexis Gö6983, Gö6976, PDBu and doxycycline were from Calbiochem, and LMB was from Biomol.

DNA constructs

pCS2+MT-DLC1 encoding Myc-tagged DLC1 was kindly provided by Irene Ng (The University of Hong Kong, China). Full-length DLC1 cDNA was amplified by PCR using pCS2+MT-DLC1 as a template with primers containing BamHI restriction sites (DLC1-for, 5′-cgcggatcc tgcagaaagaagccggaccc-3′ and DLC1-rev, 5′-cgcggatcctcacctagatttggtgtctttgg-3′) and cloned into Flag-pEFrPGKpuro, pEGFPC1, and pcDNA5/FRT/TO-GFP (see below) vectors. Truncated DLC1 variants were generated by PCR amplification using the following primers: DLC1-ΔSAM (5′-cgcggatccattagtcctcatcggaaacgaag-3′ and DLC1-rev) DLC1-ΔStart (DLC1-for and 5′-cgcggatcctcacaggtgcccgagtgcttc-3′) DLC1-ΔC (DLC1-for and 5′-cgcggatcctcacatgaacttgggcacggcc-3′) DLC-ΔN (5′-cgcggatccaagaggatcaaggttccagac-3′ and DLC1-rev). DLC1 point mutants were generated by QuikChange site-directed PCR mutagenesis according to the manufacturer's instructions (Stratagene). The forward primers used were: S236A-for (5′-gctgaaacggatggaggccctgaagctcaagagc-3′) S327A-for (5′-gttacgaggacccgggccctcagtgcgtgc-3′) S419A-for (5′-cctcaggagggaaaacgctagcgacagccccaagg-3′) S431A-for (5′-ctgaagagacgcaatgcttccagctccatgagc-3′) R415/416G-for (5′-gccacatcagcctcgggggggaaaacagtagcg-3′) R428/429G-for (5′-cccaaggaactgaagggaggcaattcttccagctcc-3′). To generate the inducible DLC1 expression vector pcDNA5/FRT/TO-GFP-DLC1, the enhanced GFP cDNA was excised from the pEGFPC1 vector with Eco47III and KspA1 and ligated with pcDNA5/FRT/TO digested with MssI. The DLC1 cDNA was then inserted in frame as a BamHI fragment. All amplified cDNAs were verified by sequencing. Oligonucleotides were purchased from MWG Biotech. pEGFPN1-PKD1, pGEX-14-3-3τ WT and R56/60, HA-tagged 14-3-3τ and EE-tagged 14-3-3γ and ζ in pEF vectors have been described previously (Hausser et al., 2005 Hausser et al., 2006 Olayioye et al., 2003). pGEX-DLC1(aa242-569)-WT, pGEX-DLC1-S327/431A and pGEX-DLC1-S327/419/431A constructs were generated by subcloning of Ecl136II fragments from the respective full-length constructs into the pGEX6P1 vector linearized with SmaEU.

Cell culture and transfection

HEK293T, COS7, MCF7 and MDAMB231 cells were grown in RPMI containing 10% FCS in a humidified atmosphere containing 5% CO2. HEK293T cells were transfected using TransIT293 reagent (Mirus). For immunofluorescence, MCF7 and COS7 cells were grown on glass coverslips and transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Flp-In T-Rex HEK293 cells (Invitrogen) were grown in DMEM containing 10% FCS, 100 μg/ml zeocin and 15 μg/ml blasticidin. These cells stably express the Tet repressor and contain a single Flp Recombination Target (FRT) site and were used to generate the Flp-In-DLC1 line. Cells were cotransfected with pcDNA5/FRT/TO-GFP-DLC1 and the Flp recombinase expression plasmid pOG44 at a ratio of 1:10 and then selected with 100 μg/ml hygromycin. Stable MCF7 lines were generated by transfection of vectors encoding Flag-tagged DLC1 wild type and S327/431, or empty vector as a control, followed by selection with 1.5 μg/ml puromycin for 10 days.

Immunofluorescence microscopy

Cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 minutes, washed and incubated with PBS containing 0.1 M glycine for 15 minutes. Cells were permeabilized with PBS containing 0.1% Triton for 5 minutes and blocked with 5% goat serum in PBS containing 0.1% Tween-20 for 30 minutes. Cells were then incubated with primary antibody diluted in blocking buffer for 2 hours, followed by incubation with secondary antibody diluted in blocking buffer for 1 hour. Coverslips were mounted in Fluoromount G (Southern Biotechnology) and analyzed on a confocal laser-scanning microscope (TCS SL, Leica) using 488 nm and 543 nm excitation and a 40.0/1.25 HCX PL APO objective lens.

Bacterial expression of GST proteins

E. coli were transformed with pGEX vectors encoding GST-14-3-3 proteins, DLC1(aa 242-569) variants or GST alone and expression was induced with 0.1 mM IPTG for 4 hours at 37°C. The bacterial cultures were harvested and pellets were resuspended in PBS containing Complete protease inhibitors (Roche). The suspension was then sonicated 3× for 10 seconds on ice, Triton X-100 was added to a final concentration of 1% and the lysate centrifuged for 10 minutes at 8000 g. Purification of GST-tagged proteins was performed with glutathione resin (GE Healthcare). The resin was washed with PBS and the purity and amount of bound GST proteins was then determined by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.

Pull-downs, immunoprecipitation and western blotting

Whole-cell extracts were obtained by solubilizing cells in Triton X-100 extraction buffer (TEB) (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM sodium fluoride, and 20 mM β-glycerophosphate plus Complete protease inhibitors). Lysates were clarified by centrifugation at 16,000 g for 10 minutes. Pull-downs were performed by incubating whole-cell extracts with immobilized GST proteins for 2 hours. Beads were washed three times with TEB. For immunoprecipitations, equal amounts of protein were incubated with specific antibodies for 2 hours on ice. Immune complexes were collected with protein-G-Sepharose (GE Healthcare) and washed three times with TEB. In the case of stably expressed Flag-DLC1, precipitation was overnight and washes were with TEB containing 0.5% Triton X-100. Precipitated proteins were released by boiling in sample buffer, subjected to SDS-PAGE and blotted onto PVDF membranes (Roth). After blocking with 0.5% blocking reagent (Roche) in PBS containing 0.1% Tween 20, filters were probed with specific antibodies. Proteins were visualized with HRP-coupled secondary antibody using the ECL detection system (Pierce) or alkaline phosphatase-coupled secondary antibody and NBT/BCIP as a substrate.

Kinase assays

Equal amounts of the purified GST-DLC1(aa242-569) proteins were mixed with kinase buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) containing 2 μCi [γ- 32 P]ATP and incubated for 5 minutes at 37°C in the presence or absence of 50 ng purified Myc-PKD1 (Dieterich et al., 1996). Samples were then resolved by SDS-PAGE, transferred to membrane and analyzed on a PhosphoImager (Molecular Dynamics), followed by immunoblotting.

Luciferase reporter assays

HEK293 Flp-In-DLC1 cells were grown on collagen-coated 24-well dishes and transfected with 50 ng each of the 3DA.Luc firefly luciferase reporter containing three SRF binding elements, pRL-TK, a Renilla luciferase plasmid under the control of the thymidine kinase promoter, and pEF-HA-14-3-3τ. After serum starvation overnight, DLC1 expression was switched on by addition of 10 ng/ml doxycycline and, 4 hours later, cells were stimulated with 100 nM PDBu for 4 hours. Cells were lysed with 300 μl passive lysis buffer (Promega) and luciferase activities in 10 μl lysate were measured by addition of 50 μl firefly substrate (470 μM D-luciferin, 530 μM ATP, 270 μM coenzyme A, 33 mM DTT, 20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, pH 7.8), followed by addition of 100 μl Renilla substrate (0.7 μM coelenterazine, 2.2 mM Na2EDTA, 0.44 mg/ml bovine serum albumin, 1.1 M NaCl, 1.3 mM NaN3, 0.22 M potassium phosphate buffer, pH 5.0). Luminescence was measured with a Tecan Infinite 200M plate reader.

Rho activity measurements

HEK293T cells transiently expressing the Raichu-RhoA biosensor were lysed in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium fluoride and 0.5% Triton X-100 and debris was removed by centrifugation at 16,000 g for 10 minutes. Emission ratios (FRET/CFP) were determined by measuring CFP and YFP fluorescence after background subtraction at 475 and 530 nm, respectively, using a Tecan Infinite 200M plate reader (excitation, 433 nm).

MTT assays

Approximately 2000 cells in 150 μl medium were plated into 96-well plates (n=5) and incubated with 15 μl of 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) solution (5 mg/ml) for 2 hours. Cells were lysed in 100 μl 50% dimethylformamide containing 10% SDS and absorbance at 595 nm was determined with background subtraction at 655 nm and absorbance of medium alone using a SpectraMax 340PC 384 reader (Molecular Devices).


Phosphoproteomics combined with quantitative 14-3-3-affinity capture identifies SIRT1 and RAI as novel regulators of cytosolic double-stranded RNA recognition pathway

N1 - Copyright © 2014, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology.

N2 - Viral double-stranded RNA (dsRNA) is the most important viral structure recognized by cytosolic pattern-recognition receptors of the innate immune system, and its recognition results in the activation of signaling cascades that stimulate the production of antiviral cytokines and apoptosis of infected cells. 14-3-3 proteins are ubiquitously expressed regulatory molecules that participate in a variety of cellular processes, and 14-3-3 protein-mediated signaling pathways are activated by cytoplasmic dsRNA in human keratinocytes. However, the functional role of 14-3-3 protein-mediated interactions during viral dsRNA stimulation has remained uncharacterized. Here, we used functional proteomics to identify proteins whose phosphorylation and interaction with 14-3-3 is modulated by dsRNA and to characterize the signaling pathways activated during cytosolic dsRNA-induced innate immune response in human HaCaT keratinocytes. Phosphoproteome analysis showed that several MAPK- and immune-response-related signaling pathways were activated after dsRNA stimulation. Interactome analysis identified RelAassociated inhibitor, high-mobility group proteins, and several proteins associated with host responses to viral infection as novel 14-3-3 target proteins. Functional studies showed that RelA-associated inhibitor regulated dsRNA-induced apoptosis and TNF production. Integrated network analyses of proteomic data revealed that sirtuin1 was a central molecule regulated by 14-3-3s during dsRNA stimulation. Further experiments showed that sirtuin 1 negatively regulated dsRNA-induced NF?B transcriptional activity, suppressed expression of antiviral cytokines, and protected cells from apoptosis in dsRNA-stimulated and encephalomyocar-ditis-virus-infected keratinocytes. In conclusion, our data highlight the importance of 14-3-3 proteins in antiviral responses and identify RelA-associated inhibitor and sirtuin 1 as novel regulators of antiviral innate immune responses.

AB - Viral double-stranded RNA (dsRNA) is the most important viral structure recognized by cytosolic pattern-recognition receptors of the innate immune system, and its recognition results in the activation of signaling cascades that stimulate the production of antiviral cytokines and apoptosis of infected cells. 14-3-3 proteins are ubiquitously expressed regulatory molecules that participate in a variety of cellular processes, and 14-3-3 protein-mediated signaling pathways are activated by cytoplasmic dsRNA in human keratinocytes. However, the functional role of 14-3-3 protein-mediated interactions during viral dsRNA stimulation has remained uncharacterized. Here, we used functional proteomics to identify proteins whose phosphorylation and interaction with 14-3-3 is modulated by dsRNA and to characterize the signaling pathways activated during cytosolic dsRNA-induced innate immune response in human HaCaT keratinocytes. Phosphoproteome analysis showed that several MAPK- and immune-response-related signaling pathways were activated after dsRNA stimulation. Interactome analysis identified RelAassociated inhibitor, high-mobility group proteins, and several proteins associated with host responses to viral infection as novel 14-3-3 target proteins. Functional studies showed that RelA-associated inhibitor regulated dsRNA-induced apoptosis and TNF production. Integrated network analyses of proteomic data revealed that sirtuin1 was a central molecule regulated by 14-3-3s during dsRNA stimulation. Further experiments showed that sirtuin 1 negatively regulated dsRNA-induced NF?B transcriptional activity, suppressed expression of antiviral cytokines, and protected cells from apoptosis in dsRNA-stimulated and encephalomyocar-ditis-virus-infected keratinocytes. In conclusion, our data highlight the importance of 14-3-3 proteins in antiviral responses and identify RelA-associated inhibitor and sirtuin 1 as novel regulators of antiviral innate immune responses.


Construction of arabinose inducible ExoS derivatives and infection of cells

To ensure protein stability of ExoS derivatives, mutant alleles were coexpressed with orf1, encoding the cognate nonsecreted chaperone of ExoS [ [38, 42] ]. In all cases, DNA was amplified by PCR using conditions described previously [ [43] ]. pMF366 was constructed from amplified DNA from pTS103 [ [38] ] harbouring wild-type orf1, which was cloned into the NcoI/XhoI (shown in italic type) sites of pBAD/Myc-His under the control of an arabinose inducible promoter using the orf1 specific primers porf1a (forward): 5′-GCCGCCTCCATGGACTCGGAACACGCC-3′ and porf1b (reverse): 5′-TCGCCCGACTCGAGTCAGCGTAGCTCTTC-3′. Wild-type exoS sequence was cloned into the XhoI/KpnI (shown in italic type) sites of pMF366 to generate the plasmid pMF384, using DNA amplified from pTS103 with the exoS specific primer pair pexoSa (forward): 5′-CGGAGAAACTCGAGGAGAAGGCAACCATC-3′, pexoSb (reverse): 5′-GTCTTTCTGGTACCACCGGTCAGGCCAGA-3′. pMF419 and pMF420 were obtained by replacing the C-terminal ClaI/KpnI fragment from pMF384 with DNA amplified and restriction enzyme cut with ClaI/KpnI from pGEX-2TK-ExoS(SΔ) and pGEX-2TK-ExoS (S3), respectively, using the exoS specific primers, pexoSseq3 (position 973–991 forward): 5′-AAGTGATGGCGCTTGGTCT-3′ and pexoSd (reverse): 5′-ATGCATGGTACCTCAGGCCAGATCAAGGCCGCG-3′. All constructs were confirmed by sequence analysis. Stable induction of protein expression in strains grown in the presence of 0.02% l (+) arabinose was confirmed by Western analysis as described previously [ [44] ], using polyclonal rabbit anti-ExoS [ [38] ]. Bacterial infection of cells was performed in the presence of 0.1% l (+)arabinose as described previously [ [45] ].


Phosphorylation-related modification at the dimer interface of 14-3-3ω dramatically alters monomer interaction dynamics

14-3-3 proteins are generally believed to function as dimers in a broad range of eukaryotic signaling pathways. The consequences of altering dimer stability are not fully understood. Phosphorylation at Ser58 in the dimer interface of mammalian 14-3-3 isoforms has been reported to destabilise dimers. An equivalent residue, Ser62, is present across most Arabidopsis isoforms but the effects of phosphorylation have not been studied in plants. Here, we assessed the effects of phosphorylation at the dimer interface of Arabidopsis 14-3-3ω. Protein kinase A phosphorylated 14-3-3ω at Ser62 and also at a previously unreported residue, Ser67, resulting in a monomer-sized band on native-PAGE. Phosphorylation at Ser62 alone, or with additional Ser67 phosphorylation, was investigated using phosphomimetic versions of 14-3-3ω. In electrophoretic and chromatographic analyses, these mutants showed mobilities intermediate between dimers and monomers. Mobility was increased by detergents, by reducing protein concentration, or by increasing pH or temperature. Urea gradient gels showed complex structural transitions associated with alterations of dimer stability, including a previously unreported 14-3-3 aggregation phenomenon. Overall, our analyses showed that dimer interface modifications such as phosphorylation reduce dimer stability, dramatically affecting the monomer-dimer equilibrium and denaturation trajectory. These findings may have dramatic implications for 14-3-3 structure and function in vivo.

Palavras-chave: 14-3-3 Protein Dimerisation Dynamic equilibrium Monomer Phosphomimetic mutation Phosphorylation.


Bacterial Pathogenesis

Pathogenesis is defined as the origination and development of a disease. Insights into disease etiology and progression, the two major aspects of pathogenesis, are paramount in the prevention, management and treatment of various diseases. In many cases the mechanical properties of the tissue or cellular environment contribute to disease progression or its onset, and this is also true in diseases arising from bacterial infection. For instance, the ability of a bacteria to invade a cell or tissue, to establish an infection within the body and to avoid or even exploit the immune response is often dependent on the bacteria&rsquos ability to manipulate the host cytoskeleton, and exploit various biochemical pathways that respond to changes in mechanical stimuli.

The mechanobiology of infection and bacterial pathogenesis

During an infection, an external virulent agent like bacteria, virus or fungi, invades into body tissues and proliferates, causing disease. These pathogens employ multiple mechanisms of invasion, evasion of host immune responses and survival or replication within the host. While some molecular mechanisms may be unique to a particular pathogen, some may be conserved across species. A component of the host cell that is modulated by pathogens, both extracellular and intracellular, is the plasma membrane , being the first point of contact between the pathogen and host cell. The nature and outcome of membrane modulation differs depending on the pathogen, for instance, some pathogenic bacteria produce pore-forming toxins that modulate the membrane, whereas some hijack the membrane trafficking pathways. Membrane modulation often leads to rearrangement of the host cell cytoskeleton that enables entry, transport and survival of the pathogens in the host cell.

The nature of cytoskeletal modification varies with the pathogen and stage of infection. While extracellular pathogens like Yersinia spp activate Rho GTPases to cause cell rounding and inhibition of phagocytosis , intracellular pathogens like Mycobacterium tuberculosis (MTb) exploit phagocytosis by alveolar macrophages for its entry into the host. In the case of the bacteriae Samonella typhimurium e Shigella flexneri, effectors of Type III secretion system 1 (T3SS-1), trigger host signaling pathways that rearrange the host actin cytoskeleton to induce membrane ruffling , thus invoking macropinocytosis and engulfment of the bacteria. The precise molecular mechanisms underlying bacterial uptake are not clear, although a mechanism involving direct activation of Rho GTPases leading to actin polymerization either through Arp2/3- or formin-dependent pathways is likely in the case of Salmonella [1] . Some bacteria like L. monocytogenes, S. flexneri, Ricketssia spp., use actin tails to move within and between cells [2] . Other cytoskeletal components like microtubules (Salmonella), intermediate filaments (Clamídia) and septins are also recruited/altered for pathogenesis.

Once internalized, bacteria thrive within vacuoles formed both in phagocytic and non-phagocytic host cells. The Salmonella Containing Vacuole (SCV) is integrated with the early endocytic pathway, but they escape lysosomal fusion and lysis [3] . During SCV maturation, an F-actin meshwork is formed around bacterial vacuoles in a process known as vacuole-associated actin polymerization (VAP) that reinforces the integrity of the vacuolar membrane. Mature SCVs are found in a perinuclear position, proximal to the Golgi apparatus. Salmonellae within SCVs also induce the formation of tubular aggregates along a scaffold of microtubules called Salmonella-induced filaments (SIFs) that extend from SCVs throughout the cell. Therefore, an intricate link exists between the host cytoskeleton and Salmonella pathogenesis at various stages. Other intracellular bacteria like Mycobacteria, Coxiella, Legionella, e Brucella also reside within vacuoles and exploit different components of the endocytic and secretory pathways for pathogenesis.

o enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) modulate the membrane and cytoskeleton through yet another unique mechanism. The EPEC T3SS encodes the translocated intimin receptor (Tir), which localizes to the plasma membrane to induce actin polymerization. This results in the formation of a pedestal structure beneath the bacterium [4] . o enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) also forms actin pedestals through a molecular mechanism distinct from that of EPEC [5] .

Os vírus também reconfiguram e reorganizam a actina após a entrada nas células hospedeiras [6]. Vírus tumorais como o citomegalovírus humano (HCMV) podem ter um papel oncomodulador dependendo do estado das isoformas Rho GTPase [7]. Muitos vírus também exploram os filópodes para a entrada em uma célula hospedeira e para a transmissão horizontal entre as células [8]. Os fungos patogênicos Candida albicans modificar a actina e alterar a migração celular para invadir os tecidos [9].

Ironicamente, o citoesqueleto do hospedeiro que os patógenos exploram para a virulência, também é utilizado pela célula hospedeira na imunidade celular autônoma, por meio da qual a célula hospedeira tenta eliminar o patógeno [10]. Na verdade, os rearranjos do citoesqueleto durante a infecção bacteriana auxiliam na detecção bacteriana e na iniciação de respostas imunes, fornecendo estruturas para a compartimentação de patógenos e realizando autofagia ou morte da célula hospedeira levando à eliminação do patógeno [11].


Assista o vídeo: Biología molecular en alimentos: Un enfoque en detección de patógenos By Melina Cruzado (Janeiro 2022).