Em formação

Como são feitos os anticorpos monoclonais primários para a triagem de células mutantes, fisicamente?


Estou trabalhando com uma proteína bastante comum expressa em um grande número de organismos, digamos, uma proteína beta associada à queratina. Estou tentando desenvolver um processo que requer o rastreamento de anticorpos primário-secundário para a proteína beta associada à queratina. O problema é que é caro. Muito mesmo.

Não consigo encontrar o anticorpo por menos de $ 778 / mL e, depois de contabilizar a diluição e o volume necessário para o protocolo recomendado, não posso imaginar que serei capaz de terminar o projeto do processo com menos de 20mL. A proteína não pode ser alterada como uma restrição de design, então não há razão para que eu precise alterar meu anticorpo, mas se eu precisar tanto ... há alguma maneira de fazer eu mesmo?

Como esses anticorpos são realmente fabricados? Eu precisaria obter células B reais e usá-las, ou poderia isolar a maquinaria celular que produz os anticorpos e usá-la?


Os anticorpos monoclonais são tipicamente produzidos a partir de uma linha celular de hibridoma. Se você for capaz de obter hibridomas já feitos para o seu anticorpo (pouco provável), ou outro anticorpo contra a sua proteína, então é muito fácil produzir o anticorpo você mesmo. Os hibridomas secretam os anticorpos na mídia, então, depois de cultivar um monte de células, você pode purificar o anticorpo da mídia com uma coluna de proteína G.

No entanto, não existem muitas linhas de células de hibridoma disponíveis. É um processo demorado e caro para fazer o seu próprio (vários meses e milhares de dólares), mesmo com a ajuda de uma unidade / empresa central. Você forneceria à instalação vários miligramas de sua proteína, eles a usariam para imunizar camundongos, então, após 1-3 rodadas de triagem, você poderia obter clones de hibridoma.

Existem alguns bancos com hibridomas disponíveis para pesquisa, por exemplo:

http://dshb.biology.uiowa.edu/

http://www.cellbankaustralia.com/ecacc-hybridoma/


Auranofin revela potencial anticâncer terapêutico ao desencadear mecanismos distintos de morte celular molecular e imunidade inata no câncer de pulmão de células não pequenas p53 mutante

Auranofin (AF) é um medicamento anti-reumático aprovado pela FDA com propriedades anticâncer que atua como um inibidor da tiorredoxina redutase 1 (TrxR). Os mecanismos exatos pelos quais a FA atinge as células cancerosas permanecem indefinidos. Para esclarecer o modo de ação, este estudo fornece uma análise aprofundada sobre os mecanismos moleculares e imunogenicidade da citotoxicidade mediada por AF na linha de células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) NCI-H1299 (p53 Null) e seus dois derivados isogênicos com acumulação de p53 R175H ou R273H mutante.

O TrxR é altamente expresso em um painel de 72 pacientes com NSCLC, tornando-o um alvo válido para drogas no NSCLC para FA. A presença de superexpressão de p53 mutante foi identificada como um importante sensibilizador para FA em células NSCLC (isogênicas), pois foi correlacionada com níveis reduzidos de tiorredoxina (Trx) em vitro. A análise do transcriptoma revelou desregulação de genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, dano ao DNA, sinalização da granzima A (GZMA) e ferroptose. Embora funcionalmente AF pareça um potente inibidor de GPX4 em todas as linhas celulares NCI-H1299, a indução de peroxidação lipídica e, consequentemente, ferroptose foi limitada às células que expressam p53 R273H. Nas células p53 R175H, a FA induziu principalmente danos em grande escala ao DNA e estresse de replicação, levando à indução de morte celular por apoptose em vez de ferroptose. É importante ressaltar que todos os tipos de morte celular foram imunogênicos, uma vez que a liberação de sinais de perigo (ecto-calreticulina, ATP e HMGB1) e a maturação das células dendríticas ocorreram independentemente da expressão de p53 (mutante). Finalmente, mostramos que as células cancerosas sensibilizadas por FA para morte mediada por células assassinas naturais independentes de caspase por regulação negativa de vários alvos-chave de GZMA.

Nossos dados fornecem novos insights sobre a FA como uma droga potente, clinicamente disponível e sem patente, visando células cancerosas p53 mutantes por meio de mecanismos distintos de morte celular (apoptose e ferroptose). Além disso, a FA melhora a resposta imune inata em concentrações citostáticas (morte mediada por células natural killer) e citotóxicas (maturação de células dendríticas).


Como são feitos os anticorpos monoclonais primários para a triagem de células mutantes, fisicamente? - Biologia

As espectrinas são componentes ubíquos do esqueleto da membrana que organizam e estabilizam os microdomínios na membrana plasmática e nas organelas intracelulares. Por meio de suas numerosas interações com diversas famílias de proteínas, eles estão envolvidos em várias funções celulares. Usando pequena estratégia de RNA de interferência na linha celular WM-266 derivada de melanoma humano, descobrimos que a deficiência de αII-espectrina está associada a um defeito na proliferação celular, que está relacionado a uma parada do ciclo celular na região G1 fase (primeira fase de gap), avaliada por análise de DNA e fosforilação de Rb. Estas observações coincidiram com a expressão elevada do inibidor da quinase dependente da ciclina, p21 Cip. Concomitantemente, a perda de espectrina prejudicou a adesão e disseminação celular. Esses defeitos de adesão celular foram associados a modificações do citoesqueleto de actina, como perda de fibras de estresse, alterações de aderências focais e expressão modificada de algumas integrinas. Nossos resultados fornecem novos insights sobre as funções da espectrina, demonstrando o envolvimento da αII-espectrina na regulação do ciclo celular e na organização da actina.


Detecção e localização visual de proteínas celulares individuais usando um ensaio de ligação de proximidade


Autor: Paul Held Ph.D., Gerente de Laboratório, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT

A complexidade do proteoma cria a necessidade de maneiras mais precisas e precisas de detectar alvos. Os ensaios de ligação de proximidade (PLA) combinam a especificidade da detecção baseada em anticorpos com uma amplificação de sinal que permite a visualização de componentes por microscopia de fluorescência. Aqui nós descrevemos o uso do Cytation & trade 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader, uma combinação de imagens de células e leitor de microplacas de alto valor e baixo custo, para obter imagens e analisar rapidamente células de cultura de tecidos coradas com sondas Duolink & reg em microplacas.

Introdução

Com o mapeamento do proteoma humano, a compreensão das interações de proteínas e da localização em células de mamíferos torna-se cada vez mais complexa. A complexidade do proteoma e a compreensão de seu funcionamento interno criam a necessidade de maneiras mais precisas e precisas de detectar alvos. Além da detecção e localização geral de uma proteína, é necessário investigar seus parceiros de interação, modificações pós-tradução ou seu papel em complexos de proteínas, a fim de compreender o papel funcional completo de uma determinada proteína.

Figura 1. Especificidade da coloração Duolink & reg. Células MDA-MB-175 plaqueadas em microplacas de 96 poços e cultivadas durante a noite (A) Poços de controle onde o anticorpo 1 & deg foi omitido e (B) o anticorpo monoclonal primário de camundongo anti-TK1 foi adicionado antes do processamento subsequente. As células de ambas as figuras foram tratadas com anticorpos secundários Duolink & reg anti-camundongo PLUS e MINUS e o sinal amplificado com o Sistema de Detecção de Vermelho. As células foram contrastadas com DAPI e AlexaFluor 488-faloidina. As imagens foram tiradas com uma objetiva de 60x.

O ensaio de ligação de proximidade (PLA) é uma tecnologia que estende as capacidades dos imunoensaios tradicionais para incluir a detecção direta de proteínas, interações e modificações de proteínas com alta especificidade e sensibilidade. Alvos de proteína podem ser detectados e localizados com resolução de molécula única e quantificados em células e tecidos não modificados. Os reagentes Duolink & reg In Situ são baseados em PLA & reg in situ. Dois anticorpos primários criados em espécies diferentes reconhecem o antígeno alvo ou antígenos de interesse. Anticorpos secundários específicos da espécie, chamados de sondas PLA, cada um com uma única fita curta de DNA (MAIS e MENOS) anexada a eles, ligam-se aos anticorpos primários. Quando as sondas de PLA estão em estreita proximidade (& lt40 nm), as fitas de DNA podem interagir por meio de uma adição subsequente de dois outros oligonucleotídeos de DNA formadores de círculo. Após a união dos dois oligonucleotídeos adicionados por ligação enzimática, eles são amplificados por meio de amplificação por círculo rolante usando uma polimerase. Após a reação de amplificação (aproximadamente 700x) do círculo de DNA ter ocorrido, sondas oligonucleotídicas complementares marcadas iluminam o produto replicado. Isso resulta em uma alta concentração de fluorescência em cada produto de amplificação de molécula única que é visível como um ponto brilhante distinto quando visto com um microscópio de fluorescência (Figura 2).

Figura 2. Tecnologia Duolink e reg. Os reagentes Duolink & reg In Situ são baseados em PLA & reg in situ.

Materiais e métodos

Cultura de células

As células MDA-MD-175 e U-2 OS foram cultivadas em DMEM avançado suplementado com 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina a 37 & degC em 5% de CO2. As culturas foram rotineiramente tripsinizadas (0,05% de tripsina-EDTA) em 80% de confluência. Para as experiências, as células foram colocadas em microplacas de 96 poços de fundo transparente de lado negro Corning 3904 a 2.500 a 10.000 células por poço, dependendo da experiência.

Os anticorpos primários em conjunto com os anticorpos secundários conjugados com PLA Duolink & reg e o sistema de detecção Red Duolink foram usados ​​para detectar alvos celulares específicos. O anticorpo monoclonal anti-TK-1 de camundongo (cat. # WH0007083M2) foi adquirido na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), enquanto o anticorpo monoclonal anti-elF4E de camundongo (cat. # Ab171091) e anti-elF4E de coelho (fosfo S209) anticorpo monoclonal (cat. # ab76256) foram obtidos de Abcam & reg (Cambridge, MA). Duolink anti-camundongo PLUS (cat. # DUO92001), anti-camundongo MINUS (cat. DUO92004), anticorpos secundários anti-Rabbit MINUS (cat. # DUO92005) e os Reagentes de Detecção de Vermelho (cat. # DUO92008), foram obtidos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

As experiências foram fotografadas usando um leitor multimodo Cytation & trade 5 Cell Imaging (BioTek Instruments, Winooski, VT) configurado com cubos de luz vermelha DAPI, GFP e Texas. O gerador de imagens usa uma combinação de fontes de luz LED em conjunto com filtros passa-banda e espelhos dicróicos para fornecer luz de comprimento de onda apropriado. Os cubos de luz DAPI usam um filtro de excitação 337/50 e um filtro de emissão 447/60, o cubo de luz GFP usa um filtro de excitação 469/35 e um filtro de emissão 525/39, enquanto o cubo de luz Texas Red usa uma excitação 585/29 e Filtros de emissão 624/40.

Análise de imagem

Vários ladrilhos de imagens sobrepostas em três cores foram costurados digitalmente usando o software Gen5 & trade. Normalmente, as imagens eram capturadas capturando uma montagem de imagens e criando uma imagem composta costurada de um campo de visão mais amplo. A contagem de células objeto do canal DAPI foi usada para identificar os núcleos das células. A análise de subpopulação foi usada para determinar a intensidade média de fluorescência do canal Texas Red como um meio para avaliar células positivas para TK-1.

Resultados

O efeito da concentração de anticorpo primário no sinal de PLA foi testado. Células MDA-MB-175 fixas foram tratadas com várias concentrações de anticorpo primário de antitimidina quinase de camundongo e subsequentemente tratadas com anticorpos secundários Duolink & reg anti-camundongo PLUS e MINUS. Nestas condições, percentagens crescentes de células tornam-se positivas para a presença de sinal de TK com o aumento do anticorpo primário até que a saturação seja atingida. Como visto na Figura 3, a porcentagem de células TK positivas aumenta com concentrações de anticorpos de até 10 & caneca / ml. Nesta concentração, os epítopos da enzima estão saturados e qualquer aumento adicional na concentração de anticorpos não resulta em células mais positivas.

Figura 3. Efeito da concentração de anticorpo primário no sinal Duolink e reg. As células MDA-MB-175 foram semeadas em microplacas de 96 poços e cultivadas durante a noite a 37 ° C, em um CO a 5% umidificado2 ambiente. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e testadas usando um anticorpo monoclonal de camundongo anti-timidina quinase com tecnologia de detecção Duolink & reg red. Três montagens coloridas (40x) foram obtidas pela costura de várias imagens sobrepostas. A análise de imagem identificou o número de células usando a contagem de objetos de núcleos de células coradas com DAPI. A análise de subpopulação de núcleos que excedem um limite (11.000) para fluorescência RFP média identificou células TK positivas. Os dados foram expressos como uma porcentagem do total. Os pontos de dados representam a média de 4 determinações em cada concentração de soro.

Usando níveis de saturação de anticorpo primário, o efeito da concentração de soro nos níveis de proteína timidina quinase em células U-2 OS foi examinado. As células foram semeadas e fixadas por 16 horas em soro a 10%. As células foram então trocadas para meios contendo várias concentrações de soro variando de 0,1% a 10%. Conforme mostrado na Figura 4, quantidades crescentes de soro resultam em uma diminuição na porcentagem de células observadas como positivas para timidina quinase. Aproximadamente 60% dos núcleos em células tratadas com soro baixo (0,1%) são positivos para TK, enquanto menos de 5% das células em 10% de soro são positivas.

Figura 4. Efeito da estimulação do soro nos níveis de proteína timidina quinase. As células U-2OS foram privadas de soro durante 24 horas após o que várias concentrações de soro foram adicionadas. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e testadas usando a tecnologia Duolink & reg usando um anticorpo anti-timidina quinase. A análise de imagem identificou o número de células usando a contagem de objetos de núcleos de células coradas com DAPI. A análise de subpopulação de núcleos que excedem um limite (20.000) para fluorescência RFP média identificou células TK positivas. Os dados foram expressos como uma porcentagem do total. Os pontos de dados representam a média de 4 determinações em cada concentração de soro.

A localização celular como resultado da modificação pós-tradução de proteínas pode ser discernida com a tecnologia Duolink & reg. O fator de tradução eucariótico 4E (elF4E) é um fator de tradução envolvido no direcionamento dos ribossomos para a estrutura cap dos mRNAs e é considerado o determinante limitante da taxa de síntese protéica [3]. A proteína é fosforilada na posição 209 e é a versão fosforilada que é considerada ativa [4]. A Figura 5 demonstra diferenças na localização do elF4E do fosf-elF4E. Quando as células U-2 OS são sondadas com um anticorpo monoclonal primário de camundongo para elF4E, que detecta todos os elF4E, a proteína é encontrada distribuída por todo o citoplasma, quando reagida com anticorpos secundários PLUS anti-camundongo e anti-camundongo MINUS Duolink. No entanto, quando as mesmas células são sondadas com um anticorpo primário anti-elF4E de rato e um anticorpo primário anti-fosfo-elF4E de coelho e tratadas com conjugados de anticorpo secundário anti-rato PLUS e anti-coelho MINUS (Ver Tabela 1), a proteína fosforilada é observada principalmente na região perinuclear do citoplasma. Isto sugere uma migração da proteína modificada pós-tradução para esta região ou que apenas aquelas proteínas nesta região estão disponíveis para modificação.

Figura 5. Localização da proteína total vs. fosfo-elF4. Células U-2OS plaqueadas em microplacas de 96 poços e cultivadas durante a noite a 37 & degC, 5% CO2 em DMEM avançado, suplementado com soro FBS a 10%, glutamina 2 mM. As células foram então trocadas para soro 0,1% e soro privado por 24 horas. As células foram então tratadas com 100 ng / mL de EGF durante 15 minutos e depois fixadas em paraformaldeído a 4%, permeabilizadas e bloqueadas antes da ligação do anticorpo e do processamento Duolink. (A) Coloração Duolink usando um anticorpo monoclonal 1 & deg de camundongo anti-lF4 em conjunto com anticorpos secundários anti-camundongo PLUS e MINUS. (B) Coloração Duolink usando um anticorpo monoclonal anti-elF4 de camundongo e um anticorpo antifosfo-elF4 1 & deg de coelho em conjunto com anti-camundongo PLUS e anticorpos secundários MINUS anti-coelho. Ambas as reações foram tratadas com o sistema de detecção Red.

Tabela 1. Combinações de anticorpos primários e secundários usados ​​para estudos elF4E. A espécie e o alvo para os anticorpos primários usados ​​para delinear a localização de elF4E e fósforo-elF4E são indicados. Além disso, as espécies alvo para os conjugados de anticorpos secundários PLUS e MINUS Duolink são anotadas.

Discussão

Esses dados demonstram que a tecnologia Duolink & reg é compatível com o formato de 96 poços. Esta tecnologia é normalmente realizada em um pequeno número de amostras usando lâminas de microscópio ou lamínulas como substrato. Aqui, demonstramos que um grande número de amostras experimentais pode ser analisado usando microplacas e, mais importante, as etapas do processo podem ser automatizadas como resultado do uso de um formato padronizado.

Usando a tecnologia Duolink em combinação com a análise baseada em imagens, mudanças celulares quantitativas e qualitativas podem ser observadas. As experiências iniciais demonstraram a importância da saturação do alvo do epítopo pelo anticorpo primário antes da amplificação. Com quantidades saturantes de anticorpo primário, observou-se que o efeito da concentração sérica na quantidade de proteína timidina quinase é dependente da concentração. Mudanças qualitativas na localização da proteína também foram demonstradas usando anticorpos discriminando entre elF4E e fosfo-elF4E. A proteína fosforilada é encontrada na porção perinuclear do citoplasma, enquanto a proteína não fosforilada é observada em todo o citoplasma.

Ensaios de ligação de proximidade, como Duolink & reg, funcionam muito bem com alvos de baixo número de cópias. A tecnologia produz um sinal fluorescente amplificado que está fisicamente ligado ao alvo via ligação de anticorpos e amplificadores de ácido nucleico conjugados. O resultado é um ponto brilhante representativo de um único evento de ligação de epítopo pelo anticorpo primário. Como os alvos celulares são fixados com um agente de reticulação, sua localização dentro da célula pode ser identificada.

Esta tecnologia pode ser usada para identificar proteínas específicas dentro da célula ou pode ser usada para identificar interações proteína-proteína específicas. Duolink usa dois conjugados de anticorpos secundários diferentes (PLUS e MINUS) que precisam estar em estreita proximidade para a interação de suas caudas de conjugado de ácido nucleico com os oligonucleotídeos adicionados como parte da reação de ligação. Ao usar pares de anticorpos primários de espécies diferentes e seus anticorpos secundários correspondentes, dois epítopos separados, localizados em uma única proteína ou localizados em proteínas diferentes, podem ser identificados. Somente quando as duas proteínas diferentes estão em estreita proximidade, o sinal amplificado será gerado. Se os epítopos estiverem em proteínas separadas, a produção de sinal de PLA sugeriria interação proteína-proteína.

O EL406 & trade Washer Dispenser é uma ferramenta ideal para realizar as etapas do processo de ensaio necessárias antes da imagem. O EL406 fornece lavagem de placa completa (96 ou 384 poços) usando um manifold patenteado Dual-Action & trade que foi otimizado para lavar monocamadas de células frouxamente aderentes. O dispensador de lavadora também possui duas seringas de bomba de seringa e uma seringa peripump para dispensar o reagente. Reagentes a granel de baixo custo, como fixador ou tampão de permeabilização, podem ser adicionados usando os dispensadores de bomba de seringa, enquanto reagentes mais caros, como anticorpos, podem ser adicionados usando o dispensador de peripump. Além de ter um baixo volume morto, o design da peribomba permite a purga de fluxo reverso das linhas que permite a recuperação do reagente não utilizado deixado nas linhas dos tubos.

O Cytation & trade 5 possui vários recursos que permitem a geração de imagens Duolink & reg. Quatro posições separadas de LED permitem imagens de fluorescência multiplex usando várias objetivas de microscópio de ampliação diferentes. Além da identificação da (s) proteína (s) de interesse, a contracoloração para marcadores citoplasmáticos ou núcleos fornece informações de localização celular. Além disso, o gerador de imagens possui 6 objetivas com ampliação de até 60x. O software Gen5 & trade fornece focagem automática de células em microplacas, captura de imagens com parâmetros automáticos ou definidos pelo usuário (intensidade do LED, ganho de CCD, tempo de integração, etc.) e algoritmos de análise celular que permitem segmentação e contagem de células. O software Gen5 usado para controlar a função do leitor também é capaz de realizar análises automatizadas de imagens, como a contagem de células que atendem ao limite de fluorescência e aos critérios de tamanho.

A fusão da detecção Duolink (PLA) com um formato padronizado, como microplacas, permite que a automação seja aplicada no processo de tratamento de amostras e na detecção baseada em imagens. O EL406 Washer Dispenser e o Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader são exemplos ideais de dispositivos automatizados para permitir que esta tecnologia seja executada com um grande número de amostras.


Resultados

As células HEK293T têm expressão constitutivamente alta de HLA-A na superfície celular, mas baixa expressão de HLA-B

As expressões de superfície celular de HLA-A e -B em células HEK293T foram medidas por citometria de fluxo quantitativa usando anticorpos monoclonais primários específicos de alelo contra HLA-A3 ou -B7, uma vez que as células são homozigóticas para ambos (Fig. 1). Descobrimos que o HLA-A3 foi altamente expresso constitutivamente com uma mediana de 71.204 moléculas por célula (Figs 1B e 2A). Isso foi 9,2 vezes maior do que o de HLA-B7 (Figs 1B e 2A). Tanto a expressão de HLA-A3 quanto de HLA-B7 aumentaram após estimulação com IFN-γ. A expressão de HLA-A3 aumentou 1,8 vezes (P = 0,0022) e HLA-B7 3,0 vezes (P = 0,0022).

Os dados são representativos para todos os experimentos de citometria de fluxo. (A) Gráfico de dispersão frontal vs. dispersão lateral. (B) Histograma mostrando a expressão da superfície celular de HLA-A3 e -B7 usando anticorpos específicos de alelo não estimulados ou após estimulação de IFN-γ.

As linhas horizontais indicam valores medianos. (A) Medidas quantitativas da expressão da superfície celular HLA classe I determinadas por citometria de fluxo indireta. (B) Níveis de transcritos do gene HLA classe I determinados por PCR quantitativo em tempo real. * Indica valor P significativo (P & lt 0,05).

IFN-γ aumenta a expressão da superfície celular, mas não os níveis de mRNA de HLA-A e -B em HEK293T

Em seguida, a quantidade de transcritos de mRNA de HLA-A * 03 e -B * 07 foi determinada usando PCR quantitativo em tempo real para investigar se a diferença na expressão medida na superfície celular poderia ser uma consequência direta de diferentes níveis de transcrição. Na verdade, o nível de transcrição de A * 03 foi 4,3 vezes maior do que o de B * 07. Surpreendentemente, nenhum aumento significativo foi visto em resposta ao IFN-γ (Fig 2B, A * 03: P = 0,94, B * 07: P = 0,31) indicando que o aumento na expressão da superfície celular era independente dos níveis de mRNA nesta linhagem celular e, conseqüentemente, deve ser regulado por um mecanismo pós-transcricional.

As diferenças de sequência de codificação entre HLA-A e -B têm um efeito importante na expressão de HLA na superfície celular

Para elucidar a diferença na expressão entre HLA-A e -B, construímos plasmídeos contendo apenas a sequência codificadora de HLA-A * 02: 01: 01 ou HLA-B * 08: 01: 01 (Fig. 3). Estes plasmídeos foram transfectados separadamente em células HEK293T, os clones transfectados de forma estável foram isolados e a expressão da superfície celular foi medida por citometria de fluxo quantitativa utilizando anticorpos monoclonais específicos HLA-A2 e -B8 (Fig 4A).

Aminoácidos idênticos são mostrados como pontos. As setas indicam os locais de transição entre as construções quiméricas. Números de acesso do GenBank para HLA-A * 02: 01: 01: 01, HG794376.1 e para HLA-B * 08: 01: 01, HG794374.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank /).

(A) Medição quantitativa realizada por citometria de fluxo indireta da expressão da superfície celular HLA classe I. As linhas horizontais indicam valores medianos. * Indica valor P significativo (P & lt 0,05). (B) Expressão da proteína da superfície celular de A2 e B8 como uma função do número de cópias de mRNA em relação ao número de cópias do gene de referência.

Os níveis de expressão médios constitutivos resultantes espelharam os das moléculas endógenas quando comparados ao local (A2: 54.031 moléculas por célula versus 71.204 para A3 em células não transfectadas 2.466 e 7.778 para B8 e B7, respectivamente) (Figs 2 e 4A). Assim, a expressão constitutiva do HLA-B8 foi significativamente menor do que a do HLA-A2 com uma diferença de 15 vezes na expressão mediana. Quando estimulado com IFN-γ, os níveis de expressão mediana aumentaram 1,9 vezes (P & lt0.0001) para HLA-A2 e de forma semelhante, mas insignificante, 2,7 vezes (P = 0,13) para HLA-B8 levando a uma diferença de 22 vezes na expressão relativa nível de HLA-A2 e -B8 (Fig 4A).

Os níveis de transcrição gênica dos clones transgênicos HLA-A2 e -B8 foram medidos durante condições basais não induzidas e induzidas por IFN-γ usando PCR em tempo real quantitativo específico de alelo HLA e comparados com sua expressão de proteína de superfície celular (Fig. 4B ) Os níveis de mRNA não induzidos foram semelhantes para HLA-A * 02 e -B * 08 (P = 1) e não mudaram por estimulação com IFN-γ (A * 02: P = 0,60 B * 08: P = 0,73). Isso era esperado porque apenas as sequências de codificação de HLA-A * 02 e -B * 08 estavam presentes no vetor sem seus componentes reguladores naturais.

Curiosamente, não encontramos nenhuma correlação entre a expressão da proteína da superfície celular e os níveis de transcrição, mostrando que a disponibilidade de mRNA não foi um fator limitante para a expressão de HLA (HLA-A2 no IFN-γ: P = 0,29, IFN-γ estimulado: P = 0,4 HLA- B8 sem IFN-γ: P = 0,27, estimulado com IFN-γ: P = 0,46). Esta descoberta mostra que a grande variação na expressão da superfície celular das moléculas HLA-A- e -B correspondentes foi causada por diferenças nas sequências de codificação e resultou de diferenças na velocidade de tradução ou no processamento pós-tradução das proteínas.

A parte terminal do domínio alfa 2 e o domínio alfa 3 são especialmente importantes para a expressão de HLA na superfície celular

Para explorar a contribuição dos domínios individuais da molécula HLA para a expressão de HLA na superfície celular, vários construtos quiméricos foram feitos onde as sequências que codificam os domínios funcionais de HLA-B8 foram substituídas pelos domínios correspondentes de HLA-A2 e vice-versa (Fig 3). Cada uma das construções de fusão foi transfectada em células HEK293T e a expressão da proteína HLA quimérica foi medida usando anticorpos monoclonais específicos anti-HLA-A2 e -B8 (Fig 5).

Medição quantitativa determinada por citometria de fluxo indireta, as linhas horizontais indicam os valores médios. (A) Células transfectadas com B8 ou construtos quiméricos começando N-terminalmente como B8 e terminando C-terminalmente como A2. (B) Células transfectadas com A2 ou construtos quiméricos começando N-terminalmente como A2 e terminando C-terminalmente como B8. * Indica um valor P significativo após a correção de Bonferroni (P & lt 0,017).

A substituição do domínio citoplasmático ou dos domínios citoplasmático e transmembranar (TM) de HLA-B8 pelos domínios HLA-A2 correspondentes não teve um efeito significativo na expressão da superfície celular das proteínas de fusão (Fig 5A, construtos HLA-B81-308/ A2309-341 e -B81-284/ A2285-341) No entanto, quando a troca entre HLA-B8 e -A2 foi colocada na parte terminal do domínio alfa 2 (construção B81-176/ A2177-341), a expressão da construção quimérica foi 8 vezes maior do que a de HLA-B8 (Fig 5A). Comparando a expressão do HLA-B81-176/ A2177-341 e -B81-284/ A2285-341 proteínas quiméricas (Fig 5A) com a de HLA-A2 (Fig 5B) indicaram que os aminoácidos 177-284 compreendendo os seis aminoácidos terminais do domínio alfa 2 e todo o domínio alfa 3 (Fig 3) poderiam explicar 65% ( 33.434 moléculas por célula) da diferença absoluta na expressão da superfície celular de HLA-A2 e -B8 (51.565 moléculas por célula).

Construções quiméricas semelhantes foram feitas onde HLA-A2 foi substituído por HLA-B8 da parte terminal de alfa 2, imediatamente antes da região citoplasmática ou antes da região TM incluindo a região citoplasmática (Fig 5B). Novamente, não houve efeito significativo de substituição da região citoplasmática ou ambas as regiões TM e citoplasmática (construções A21-308/ B8309-338 e A21-284/ B8285-338) Em contraste, quando a sequência da construção HLA-A2 foi trocada com a sequência correspondente de HLA-B8 perto do final do domínio alfa 2 (construção HLA-A21-176/ B8177-338), resultou em uma expressão 11 vezes menor (Fig 5B), confirmando assim a influência substancial desta parte da molécula.

Os níveis de expressão de superfície celular também foram medidos após estimulação de IFN-γ, onde uma regulação positiva comparável entre células transfectadas estimuladas e não estimuladas foi encontrada para todos os construtos quiméricos (Fig S1).

As diferenças nas sequências de codificação de HLA-A * 02 e -B * 08 do códon de início para a posição 176 no domínio alfa 2 são responsáveis ​​por uma pequena parte da diferença na expressão da superfície celular

Ao comparar a expressão de HLA-B8 (Fig 5A) com a de HLA-A21-176/ B8177-338 construção quimérica (Fig 5B), encontramos uma expressão 2,1 vezes (P = 0,045) maior da construção quimérica contendo a sequência HLA-A2. Uma diferença semelhante foi observada ao comparar a expressão de HLA-A2 ao HLA-B81-176/ A2177-341 construção (2,6 vezes, P = 0,0015). Mais uma vez, ter a sequência de codificação HLA-A2 resultou em níveis de expressão mais elevados do que ter HLA-B8 na mesma região.

Em resumo, os plasmídeos que codificam as sequências HLA-A2 levaram a uma expressão de superfície celular muito maior do que os plasmídeos que codificam o HLA-B8, e tendo sequências HLA-A2 na parte terminal de alfa 2 e no domínio alfa 3 foi responsável pela maior parte deste efeito , enquanto um efeito menor, mas significativo, pode ser atribuído às sequências upstream. Em contraste, nenhum efeito consistente foi observado ao trocar apenas a TM e / ou regiões citoplasmáticas.


Discussão

O desenvolvimento de uma vacina segura e eficaz para prevenir a infecção ou doença por VSR é uma alta prioridade, e uma série de vacinas candidatas estão atualmente sob avaliação clínica e pré-clínica [37]. A maioria da resposta de anticorpos neutralizantes de RSV no soro humano convalescente é dirigida a epítopos específicos para a forma de pré-fusão da glicoproteína de superfície F de RSV, sugerindo que uma vacina de subunidade estabilizada com F de pré-fusão, como DS-Cav1, provocaria imunidade protetora contra o doença [16, 20]. Mutações projetadas racionalmente estabilizam DS-Cav1 na conformação de pré-fusão, e a reatividade de DS-Cav1 para o anticorpo D25 específico de pré-fusão, sítio Ø-binding, é amplamente mantida após incubação a 4 ° C por uma semana [20]. Recentemente, no entanto, foi relatado que a ligação do anticorpo específico da pré-fusão ao DS-Cav1 armazenado a 4 ° C por até 50 dias foi reduzida, indicando que sua integridade estrutural foi comprometida [38]. Usando um anticorpo anti-RSV F recentemente identificado, 4D7, juntamente com microscopia eletrônica de transmissão e fluorimetria de varredura diferencial, buscamos caracterizar ainda mais a estabilidade de longo prazo de DS-Cav1 a 4 ° C.

O epítopo 4D7 foi mapeado para o local antigênico I previamente definido usando mutagênese shotgun, e três resíduos na proteína F críticos para a ligação de 4D7 (V384, D385 e F387) foram identificados. Embora o sítio de ligação 4D7 adote uma conformação semelhante em ambas as estruturas RSV F de pré-fusão e pós-fusão, os experimentos de SPR revelaram que 4D7 se liga ao F pós-fusão e não reage à forma de pré-fusão contendo o sítio Ø da proteína. O sítio de ligação 4D7 parece estar totalmente exposto na ponta da pós-fusão F, enquanto a disponibilidade do epítopo pode ser restrita na conformação de pré-fusão onde o sítio de ligação 4D7 está localizado na base do domínio principal (Fig. 1). O impedimento estérico, em vez de uma diferença na conformação do epítopo entre as formas F de pré-fusão e pós-fusão, pode ser a razão pela qual muitos anticorpos reativos ao local I, como 4D7, se ligam especificamente ao F pós-fusão [18, 32, 33].

Além dos resíduos críticos primários já descritos, os experimentos de mapeamento de epítopos também identificaram dois resíduos críticos secundários, R235 e P246 (dados não mostrados). Esses resíduos estão enterrados no núcleo da estrutura F pós-fusão e, portanto, é improvável que entrem em contato com 4D7 diretamente [13]. Na pós-fusão, mas não na pré-fusão, da estrutura do trímero F, os resíduos R235 formam pontes de sal com os resíduos E232 em monômeros adjacentes [13, 21], provavelmente contribuindo para a estabilidade estrutural do F pós-fusão e permitindo a ligação de anticorpos reativos pós-fusão, como 4D7 . Consistente com esta interpretação, a mutação R235A reduziu a reatividade de outro anticorpo específico pós-fusão de ligação ao sítio I, 3B1, à proteína F, mas não teve efeito significativo na ligação de anticorpos monoclonais específicos de pré-fusão, como D25 [39].

Além de se ligar à conformação pós-fusão de RSV F, mostramos que 4D7 reage a um subconjunto da proteína encontrada em preparações de DS-Cav1 purificado. Este subconjunto de proteínas foi incapaz de se ligar a D25, indicando que a mistura de conformações de proteínas encontradas nas preparações de DS-Cav1 pode ser distinguida por sua capacidade de se ligar a 4D7 ou D25. Além disso, o armazenamento de longo prazo de DS-Cav1 a 4 ° C levou a um aumento nas formas 4D7 reativas com uma diminuição paralela na reatividade D25. Estes dados sugeriram que, ao longo do tempo a 4 ° C, a conformação de pelo menos um subconjunto da proteína DS-Cav1 muda de uma conformação de pré-fusão contendo o local para uma forma na qual o epítopo 4D7 é exposto. Nossos experimentos demonstraram que os epítopos D25 e 4D7 não estão presentes na mesma molécula de proteína, portanto, a preparação DS-Cav1 armazenada a 4 ° C deve ser uma mistura de pelo menos duas isoformas de proteínas diferentes.

A microscopia eletrônica de transmissão foi incapaz de distinguir múltiplas conformações de proteínas na amostra DS-Cav1 armazenada por longo prazo a 4 ° C, embora a proteína armazenada a 4 ° C parecesse mais heterogênea do que aquela descongelada imediatamente antes da análise. No entanto, ficou claro a partir da imagem TEM que a proteína DS-Cav1 armazenada a 4 ° C não adotou uma estrutura semelhante à pós-fusão, provavelmente porque as mutações de estabilização de pré-fusão introduzidas em DS-Cav1 bloqueiam o domínio da cabeça e evitam o grande conformacional rearranjo necessário para adotar a estrutura do tipo "pirulito" pós-fusão [20].

Em contraste, a análise por fluorimetria de varredura diferencial livre de marcador foi capaz de distinguir biofisicamente o DS-Cav1 armazenado a 4 ° C de DS-Cav1 recém-descongelado e pós-fusão F. A temperatura de fusão intermediária medida para DS-Cav1 armazenado a 4 ° C sugeriu que, ao ser armazenado a 4 ° C, o DS-Cav1 muda para uma conformação mais termoestável. A análise de SPR e ELISA sugeriu que pelo menos duas isoformas de proteína estavam presentes na preparação de DS-Cav1 armazenado por longo prazo a 4 ° C. No entanto, apenas um único Tm foi observado quando essas amostras foram analisadas por DSF. Dada a amplitude dos picos de transição medidos para as preparações de RSV F e a sobreposição observada, pode não haver resolução suficiente para distinguir isoformas distintas dentro da amostra DS-Cav1 armazenada a 4 ° C. Alternativamente, é possível que a maioria da preparação DS-Cav1, após armazenamento a 4 ° C por 3 meses, tenha adotado algum número de conformações alternativas, todas as quais mostraram um aumento semelhante na termoestabilidade.

Em relação à pós-fusão F ou DS-Cav1 armazenado a 4 ° C, a transição de desdobramento de DS-Cav1 recém-descongelado foi ampla, abrangendo mais de 30 ° C (Fig 6A). Embora transições de desdobramento estreitas, como aquelas observadas para F pós-fusão ou DS-Cav1 armazenado a 4 ° C, sejam indicativas de estruturas mais rígidas [40], a ampla transição observada para a amostra DS-Cav1 recém-descongelada sugere que há flexibilidade conformacional na estrutura tipo pré-fusão. Isso é consistente com a mobilidade atômica descrita anteriormente para DS-Cav1 [20].

A curva de fusão térmica de DS-Cav1 15 μM recém-descongelado, mas não DS-Cav1 armazenado a 4 ° C ou F pós-fusão, revelou uma segunda temperatura de transição menos pronunciada com Tm de aproximadamente 60 ° C (Fig 6A e 6C) . A contribuição desta transição inicial aumentou à medida que a concentração de proteína diminuiu (S3A Fig). Uma vez que o monômero no monômero: equilíbrio do trímero se torna mais abundante em baixa concentração de proteína [41], uma possível explicação para essa transição inicial de baixa temperatura é que ela representa o desdobramento do monomérico, ao invés do trimérico, DS-Cav1. A curva de fusão térmica de 1 μM de DS-Cav1 armazenado a 4 ° C também pode mostrar uma transição inicial semelhante (Fig 6B), sugerindo novamente que, embora o DS-Cav1 armazenado a 4 ° C seja mais estável do que o DS-Cav1 recém descongelado , provavelmente não é tão estável quanto F pós-fusão, para o qual nenhuma segunda temperatura de transição foi detectada em qualquer uma das concentrações de proteína testadas. Isso pode não ser surpreendente, uma vez que as mutações de estabilização de pré-fusão que definem DS-Cav1 evitam que a proteína se converta na conformação de baixa energia adotada pela pós-fusão F.

Em conclusão, esses dados destacam a utilidade do anticorpo monoclonal de camundongo 4D7 recém-identificado como um reagente para monitorar mudanças conformacionais de DS-Cav1 e potencialmente outros antígenos F de pré-fusão estabilizados que ocorrem com armazenamento prolongado a 4 ° C. Os dados também descrevem a existência de pelo menos, mas não se limitando a, duas isoformas DS-Cav1 distintas, uma que se liga ao anticorpo D25 específico da pré-fusão, mas não a 4D7, e outra que se liga a 4D7, mas não a D25. Após armazenamento a 4 ° C, a quantidade de isoformas de ligação a D25 diminui, consistente com resultados publicados anteriormente que mostram que DS-Cav1 armazenado a 4 ° C é menos reativo ao longo do tempo para outro anticorpo específico de pré-fusão, CR9501 [38]. Em paralelo à diminuição observada na conformação do tipo pré-fusão, a quantidade de formas 4D7-reativas aumenta.Este aumento, no entanto, não é causado por uma mudança para uma conformação semelhante a pós-fusão, mas para uma estrutura alternativa que é mais termoestável do que a forma de pré-fusão.

Não está claro se as mudanças biofísicas aqui descritas diminuiriam a resposta imune funcional fornecida pelo antígeno da vacina. No entanto, a potência superior dos anticorpos monoclonais dirigidos ao local Ø sugere que uma redução na quantidade de proteína F contendo o local Ø pode ter um efeito negativo na eficácia da vacina [20]. Assim, explorar maneiras de estabilizar ainda mais o DS-Cav1 é de interesse, seja por meio da formulação, com a adição de excipientes estabilizadores de proteínas, ou por projeto racional, com a adição de outras mutações estabilizadoras de pré-fusão, particularmente aquelas que estabilizariam ainda mais as regiões próximas sítio antigênico Ø e sítio I, mostrado neste documento como sendo detectavelmente alterado por armazenamento de longo prazo a 4 ° C. Além disso, 4D7 poderia ser usado para isolar e caracterizar ainda mais subconjuntos específicos da proteína DS-Cav1, fornecendo uma compreensão que ajudaria no projeto racional de moléculas F de pré-fusão com estabilidade melhorada.


Uma entrevista com Susan Strome

Susan Strome é distinta professora de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento na Universidade da Califórnia, Santa Cruz, EUA. Recentemente nomeada editora da Development, seu laboratório estuda a regulação do desenvolvimento de células germinativas em C. elegans, com um foco particular na transmissão epigenética dos estados de cromatina. Conversamos com Susan para discutir sua mudança no início de carreira de procariontes para vermes, suas experiências com pequenas e grandes ciências e por que o ensino é tão importante para ela.

Vamos começar do início: houve alguma coisa que o fez se interessar por ciência, e biologia em particular, em primeiro lugar?

Quando eu era jovem, a ciência e a matemática eram minhas zonas de conforto. Meu pai era engenheiro e, embora eu não goste quando as pessoas categorizam os tipos de cérebro, acho que era assim que meu cérebro parecia funcionar. Na universidade, estudei química, embora não me lembre por que escolhi entrar para a química. Depois de obter meu diploma de bacharel em química, pensei em cursar medicina ou pós-graduação. Decidi contra a faculdade de medicina em parte porque essa carreira envolveria interagir com pessoas o tempo todo, e eu me via mais como uma pessoa solitária, sem perceber, é claro, que ir para a faculdade e dirigir um laboratório seria muito voltado para as pessoas e que adoraria esse aspecto da minha carreira eventual. Também achava que ser médico e responsável pela vida das pessoas requer uma memória muito boa, e não tinha certeza se podia confiar na minha memória. Com o fim da faculdade de medicina, era natural gravitar em torno da pós-graduação. Decidi seguir em direção a uma química mais orientada para a biologia (ou seja, bioquímica) e me inscrevi em um programa de doutorado em bioquímica na Universidade de Washington, em Seattle.

Do seu PhD vieram três publicações no Journal of Molecular Biology em 1978 e 1980, com foco em um gene do bacteriófago T7. Como você entrou neste trabalho?

Selecionei um laboratório de pesquisa e um projeto que me proporcionaria uma boa experiência de treinamento. Na minha opinião, o objetivo da pesquisa de doutorado não é escolher o sistema ou questão que você deseja estudar para o resto de sua vida, mas aprender como identificar questões, formular hipóteses, projetar experimentos para testar suas hipóteses, interpretar seus resultados e projetar os próximos experimentos. Os sistemas procarióticos são ótimos para isso porque tudo é muito rápido - eu pratiquei muito repetidamente o método científico, em vez de ter que esperar semanas ou meses para ver os resultados. Meu orientador Ted Young foi um ótimo mentor, e concluí meu diploma em quatro anos e meio, o que é relativamente raro atualmente. Houve um evento realmente transformador - Ted saiu em licença sabática na Suíça por um ano, deixando apenas eu e o técnico no laboratório. Este era um pré-e-mail, então escrevíamos cartas para frente e para trás. Um dia escrevi para dizer a ele que estava pensando em fazer um determinado experimento. Enviei minha carta e comecei a fazer o experimento. Três semanas depois, recebi sua resposta, dizendo 'Não acho que esse experimento funcione e seja informativo por esses motivos ...' Mas a essa altura eu já tinha feito o experimento e tinha obtido um ótimo resultado, que se transformou em um dos meus três Artigos de doutorado. Essa experiência foi fortalecedora porque percebi que poderia pensar por conta própria - não exigi que meu orientador me dissesse o que fazer ou como fazer.

Minha pesquisa de doutorado foi um ótimo treinamento, mas minha área de pesquisa não era o que eu queria perseguir por décadas. Eu estava mais interessado em células, órgãos, tecidos e animais, e o que fiz na pós-graduação foi muito reducionista, coisa de tubo de ensaio. Comecei a ter aulas de fisiologia no Departamento de Enfermagem para aprender como as células, tecidos e órgãos funcionam, como funciona o metabolismo e assim por diante, e isso me encaminhou para a biologia do desenvolvimento. Então eu tive que encontrar meu nicho dentro do campo. Encontrei-o e, desde 1979, estudo os mesmos tipos de questões num mesmo organismo, mudando com o tempo e adoptando novas tecnologias.

Esse organismo era C. elegans, que você conheceu como pós-doc com Bill Wood em Boulder, Colorado - como era o campo de vermes quando você se juntou a ele?

É interessante notar que era bastante comum para os primeiros C. elegans investigadores começaram como pesquisadores procarióticos - Sydney Brenner é um exemplo óbvio, muitos outros luminares de nosso campo também começaram lá, e eu também. No final dos anos 1970, estudando C. elegans o desenvolvimento era um campo jovem e florescente. Eu provavelmente poderia ler todos os artigos sobre desenvolvimento de worms em uma tarde! Não havia garantias de que se transformaria no sistema principal que Drosófila era, mas eu queria trabalhar com minhocas no nível do solo. Não havia muitas comunidades de worm na época. A meca foi Cambridge, no Reino Unido. Notavelmente, Boulder tinha dois laboratórios - David Hirsh e Bill Wood - focados em C. elegans, e o laboratório de Dick McIntosh também fez alguns vermes. Havia muitos pós-doutorandos e alunos de graduação excelentes em Boulder, e tivemos encontros maravilhosos sobre vermes - conheci pessoas com quem mantive contato por décadas.

Também me senti muito atraído pelo estilo de Bill Wood de fazer ciência. Ele era um pesquisador procariótico e fora reconhecido por seu influente trabalho na montagem do fago T4. Eu imaginei e esperava que ele trouxesse para C. elegans - e me ajude a trazer para C. elegans - o tipo de pensamento que avançaria o campo, e isso acabou sendo verdade. Ele foi um mentor maravilhoso para mim.

Percebi que poderia pensar sobre isso sozinho - não exigi que meu orientador me dissesse o que fazer ou como fazer

Que pergunta você pretendia responder em seu pós-doutorado?

Eu queria testar se o local de entrada do espermatozóide dita a polaridade do embrião e queria entender como as células adquirem seu destino. O trabalho do laboratório mostrou que células diferentes se desenvolvem em tecidos diferentes e, na época, pensava-se que o embrião era muito mais "mosaico" do que as análises subsequentes mostraram (não sabíamos que havia tanta sinalização celular quanto nós sabe agora). Então, eu estava interessado em como o embrião inicialmente aprende anterior e posterior, e então se divide de forma que a célula filha menor gere linha germinativa e a célula filha maior gere tipos de células somáticas.

Comecei criando anticorpos para os componentes do esperma, para ver se eles marcavam o ponto de entrada do esperma e podiam ditar qual extremidade do embrião se torna posterior. Adotei uma abordagem deselegante e de força bruta para coletar esperma ou triturar C. elegans embriões, injetando-os em camundongos, fazendo anticorpos monoclonais e examinando-os em busca de padrões de coloração interessantes - eu poderia encontrar algo que fosse anterior, posterior ou específico do destino celular?

Eu estava rastreando anticorpo por anticorpo para um padrão de coloração interessante, e passei por algumas rodadas de rastreio sem ver nada notável. E então comecei um novo experimento. Era tarde da noite e eu estava examinando várias lâminas de oito poços, cada poço com um anticorpo diferente. Eu fui para a sala do microscópio escuro e na minha primeira amostra no meu primeiro slide eu vi pequenos grânulos brilhantes, mas apenas em certas células do embrião - eles estavam em uma célula do embrião de duas células, uma célula do embrião de quatro células embrião, uma célula do embrião de oito células, etc. Eu pensei, uau, os pequenos grânulos são exclusivamente na célula germinativa de cada embrião! Os grânulos eram claramente um marcador específico de linhagem. Eu estava tão animado que corri para o laboratório para contar a um colega de laboratório, mas ninguém estava lá (eram 11:30 da noite), então corri para o corredor e agarrei o zelador e o fiz olhar pelo microscópio em meus lindos grânulos. Eu queria que ele dissesse 'Oh, isso é incrível!', Mas ele apenas disse 'Oh, isso é bom', claro que não entendia muito por que eu estava tão animado. Depois da minha superexcitante amostra 1, fui para a amostra 2 - e vi os mesmos pequenos grânulos específicos da linha germinativa. Em seguida, amostra número 3 - novamente pequenos grânulos nas células germinativas. Então fui para o meu controle "sem anticorpo primário" e vi a mesma coisa! Era o anticorpo secundário que estava manchando aqueles grânulos - não era a fonte de anticorpos que eu queria, mas me disse que os grânulos existem e os anticorpos me permitiram vê-los.

Bill Wood e eu compramos todo o lote daquele anticorpo secundário para usar como reagente, e comecei a pesquisar anticorpos monoclonais primários que manchariam os grânulos de maneira semelhante, e encontrei alguns. Isso me colocou no caminho de buscar grânulos de germe - que chamamos de grânulos P nos vermes porque eles são segregados na linhagem P. Os grânulos foram observados por microscopia eletrônica em Drosófila e sapos e até vermes, mas você não pode estudar a composição e o papel de um grânulo usando apenas a microscopia. Os anticorpos abriram caminho para as questões que eu enfrentaria quando iniciasse meu próprio laboratório na Universidade de Indiana. De que são feitos os grânulos de germe? Como eles são enviados para a linhagem do germe? O que eles fazem? Eles são necessários para a fertilidade?

Você trabalhou com células germinativas por 30 anos - o que o manteve interessado por tanto tempo e quais são as principais questões sem resposta no campo?

Eu diria que os grânulos P me apontaram para as células germinativas. O que mais focou minha atenção nas células germinativas foi fazer triagens genéticas avançadas para mutantes estéreis que têm genética de efeito materno, com o objetivo de identificar mutantes defeituosos nos grânulos P. Não encontramos nenhum mutante P-granule, por razões que entendemos agora, mas na época eram misteriosas. Em vez disso, identificamos um pequeno conjunto de genes que chamamos de genes estéreis de efeito materno (MES) quando a mãe é homozigota mutante para um gene MES, ela gera descendentes que são todos estéreis. Os genes MES revelaram ser modificadores de histona: três compõem o complexo repressivo poliforme 2 (PRC2), que metila um aminoácido na cauda da histona H3, e outro (MES-4) metila um aminoácido histona H3 diferente da cauda perto de onde PRC2 sim. De repente, estávamos na cromatina, estávamos na epigenética - as proteínas MES são reguladoras epigenéticas necessárias para o desenvolvimento das células germinativas, e não necessárias para o desenvolvimento do corpo somático.

Curiosamente, desde o início, buscar os reguladores da cromatina MES foi um caminho mais fácil do que buscar os grânulos P. Os grânulos de P foram um desafio para dissecar bioquímica e funcionalmente. Uma virada aconteceu quando Dustin Updike, que agora dirige seu próprio laboratório, ingressou no meu como pós-doutorado. Ele trouxe grande imaginação, determinação e excelentes habilidades técnicas para seu projeto, e publicou vários artigos seminais sobre P grânulos. Quando ele saiu do meu laboratório para começar seu próprio laboratório, eu praticamente disse 'você toma P grânulos, e eu vou me concentrar na cromatina'. Então, P granules me lançou e tenho sido uma parte importante do laboratório por 30 anos, e agora Dustin está acompanhando eles. Atualmente, meu laboratório está estudando principalmente a regulação da cromatina - é uma história muito empolgante. Precisamos pular na onda que é a epigenética, que David Allis e outros lançaram há algumas décadas e que continua a ser um campo realmente quente.

Publicamos um artigo em 2014 que foi muito influente - mostrou que os cromossomos com marcas repressivas colocadas por PRC2 são transferidos para o embrião unicelular de ambos os gametas (espermatozoide e óvulo) e que as marcas repressivas são então transmitidas cis às cromátides filhas durante a replicação do DNA. Invocamos que os fatores MES estão enviando uma memória de padrões de expressão de genes que são apropriados para células germinativas de células germinativas progenitoras para células germinativas descendentes. Estamos continuando a estudar isso agora. Esperamos que isso nos ajude a responder a uma das questões-chave da epigenética: como a informação epigenética é transmitida através das gerações? O canal de transmissão de informações entre gerações são as células germinativas. Uma questão candente é se e como uma memória da experiência dos pais - ambiente, dieta, estresse - pode ser enviada através das células germinativas para a progênie. Meu laboratório está bem posicionado para lidar com essa questão em vermes.

Uma questão candente é se e como uma memória da experiência dos pais - ambiente, dieta, estresse - pode ser enviada através das células germinativas para a progênie

O que organismos modelo como vermes contribuem para a epigenética como um todo?

Aqueles de nós que estudaram organismos-modelo invertebrados ao longo de nossas carreiras tememos que as seções de estudo do NIH fechem a porta ao nosso financiamento em favor do financiamento de estudos em mamíferos. Mas meu último pedido de financiamento ao NIH propondo experimentos em C. elegans obteve uma pontuação perfeita! Há o reconhecimento de que nos organismos modelo podemos fazer perguntas mecanísticas realmente detalhadas, ao mesmo tempo que tentamos controlar todas as variáveis ​​que poderiam influenciar a herança epigenética. Edith Heard e Ruth Lehmann conduziram uma reunião maravilhosa financiada pela The Company of Biologists em Sussex em 2015. Naquela reunião, eu estava em um grupo com Marcus Pembrey e outros discutindo como é difícil controlar tudo que pode influenciar o transmissão de informações dos pais dos camundongos para seus filhos, como as luzes da sala dos animais, quem cuida dos camundongos e se as garrafas plásticas de água estão liberando compostos tóxicos. Mesmo em vermes, nos perguntamos se estamos controlando todas as variáveis ​​possíveis. Como eu disse, os organismos-modelo oferecem a oportunidade de aprofundar em questões mecanicistas detalhadas. A maior parte da herança epigenética - não toda ela - resume-se à metilação do DNA, modificações de histonas e RNAs. Podemos identificar os portadores epigenéticos e dissecar como eles funcionam em diferentes sistemas e, então, fornecer essa informação aos mamíferos. Vermes, moscas, sapos, peixes e leveduras estão fazendo grandes contribuições para o campo da epigenética, revelando como a epigenética pode influenciar o desenvolvimento e a saúde em organismos mais complicados.

Você fazia parte da unidade worm do modENCODE - qual foi sua experiência com o projeto?

O modENCODE estava focado em moscas e vermes, seguido do projeto ENCODE, que era principalmente humano. Eu estava em um consórcio de oito laboratórios - Jason Lieb era o investigador principal, e os co-PIs eram eu, Abby Dernburg, Julie Ahringer, Arshad Desai, Eran Segal e Shirley Liu (os dois últimos são bioinformáticos). Apresentamos uma proposta para caracterizar as modificações das histonas e a distribuição dos reguladores da cromatina no genoma do verme. Curiosamente, fomos encarregados de caracterizar e catalogar - não de fazer experimentos. Isso era muito diferente da maioria dos financiamentos do NIH, que não financiavam catálogos, mas nossa missão era catalogar e divulgar os dados para a comunidade pesquisar. Foi uma lição interessante sobre grandes ciências e trabalhar em grandes grupos - tivemos que ser altamente organizados e cooperativos. Quando começamos, nem sabíamos como fazer ChIP em worms, então primeiro tivemos que descobrir isso. O NIH queria dados de alta qualidade, então cada anticorpo que usamos para ChIP teve que ser validado por vários meios, o que por si só deu muito trabalho, mas foi útil para a comunidade (quando as pessoas fazem análises usando anticorpos ruins, pode turvar campo e ser um desserviço).

Acho que havia algum ressentimento na comunidade de worms sobre a quantidade de dinheiro que estava entrando nisso - mas se eu pensar em pegar a mesma quantia de dinheiro e distribuí-la entre vários laboratórios para tentar realizar a mesma coisa, eu não faço acho que tanto teria sido alcançado. Portanto, no geral, acho que o modelo de consórcio modENCODE foi bem-sucedido - era um tipo diferente de ciência, meu grupo aprendeu muito e acho que a comunidade herdou um bom corpo de dados para trabalhar.

Em 2013, você foi premiado com o Prêmio UCSC Excellence in Teaching - qual a importância do ensino para você?

Como muitos de meus cientistas favoritos, acredito firmemente que grande parte do nosso trabalho consiste em treinar alunos. Alcançamos relativamente poucos alunos no laboratório, mesmo que tenhamos regularmente alunos de graduação fazendo projetos de pesquisa. Quando eu entro em uma classe de 300 para ensinar genética, posso ter um impacto sobre muitos alunos. Se eu puder dar a eles uma base realmente sólida na base cromossômica da meiose, mitose, herança e doenças genéticas, isso é um verdadeiro presente. Eu não quero que eles memorizem, cuspam "fatos" memorizados no exame e, em seguida, esqueçam os conceitos importantes quando a aula terminar. Quero que saiam da universidade com uma compreensão profunda dos conceitos que abordamos, como cidadãos informados que podem conversar sobre algo como um diagnóstico de câncer ou tratamento com sua família e amigos. Minha estratégia tem sido tentar descobrir contra o que os alunos realmente lutam e, em seguida, tentar planejar uma atividade de aula, algo que lhes dê mais prática, para se sentirem mais confortáveis ​​com ela. Meu grande destaque são os cromossomos, em parte porque eu costumava chegar ao final do curso de genética e os alunos ainda não entendiam bem a diferença entre homólogos e cromátides irmãs. Nós realmente lidamos com isso, vindo de muitas direções diferentes. Por exemplo, usamos limpadores de cachimbo e contas, macarrão de piscina e dedos para modelar cromossomos, com o objetivo de formar uma memória duradoura em vez de temporária.Eu também faço os alunos trabalharem em grupos - eles trazem perspectivas diferentes e podem explicar conceitos de forma diferente de como eu faria, de uma forma que pode ressoar com outros alunos.

Quase um ano após o início do novo governo, como você vê as perspectivas da ciência, e da pesquisa básica em particular, nos Estados Unidos?

Acho que os cientistas estão com medo - quanto dano ocorrerá no decorrer do mandato de quatro anos de Trump? Trump e os republicanos estão despejando na ciência. Por exemplo, eles propuseram uma lei tributária que taxaria os alunos de pós-graduação sobre as mensalidades e taxas que suas universidades pagam em seu nome, o que teria sido devastador. Os alunos de pós-graduação mal estão sobrevivendo financeiramente, e essa conta teria sido um grande golpe financeiro para eles. Felizmente, o imposto proposto sobre as mensalidades e taxas dos alunos de pós-graduação não foi adotado. Uma nota brilhante é que o cenário político atual nos Estados Unidos está levando muitas pessoas a serem mais pró-ativas e a fazerem o máximo que puderem para se opor a legislações inadequadas. Mas todos nós nos perguntamos o que quatro anos de uma administração Trump farão para a ciência. Eu e meus colegas estamos profundamente preocupados!

Recentemente, você ingressou no Development como editor, tendo publicado pela primeira vez conosco em 1986 - o que você espera alcançar em sua nova função e onde vê o futuro da revista?

Estou muito animado por ter começado esta posição. Geraldine Seydoux, minha muito estimada colega, estava deixando o cargo e perguntou se eu poderia intervir, já que temos experiência em muitas das mesmas áreas. Eu estava disposto e entusiasmado em fazer isso porque quero fazer minha parte para garantir que artigos de alta qualidade continuem a ser publicados na Development - enquanto os periódicos se esforçam para recrutar artigos, não quero que a barra seja rebaixada de forma alguma. Depois de alguns meses, estou aprendendo muito olhando as primeiras versões dos artigos, selecionando revisores e lendo as revisões. À medida que tiver uma noção melhor do diário, poderei contribuir para tentar descobrir o que está no futuro para o Desenvolvimento - para onde devemos ir? Como eu disse, acho que a epigenética é um tópico fascinante e em rápida evolução no campo do desenvolvimento, e há muitas tecnologias incríveis que estão avançando em nosso entendimento. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de uma única célula está nos permitindo analisar a expressão gênica em células individuais em vez de populações de células. O sequenciamento de uma única célula está abrindo toda uma fronteira que acho que iremos minerar nos próximos anos, senão décadas. Além disso, há imagens incríveis, como microscopia de super-resolução, sendo aplicadas para responder a perguntas de maneiras novas e informativas. Estou animado para trabalhar com o Desenvolvimento para descobrir o que fazer a seguir.

Você tem algum conselho para jovens cientistas que estão pensando em seguir carreira em pesquisa?

Tenho dois filhos que disseram que não fariam o que a mãe e o pai fazem (meu marido também é pesquisador) e que começaram a se formar em praticamente o que a mãe e o pai fazem, e então decidiram que queriam ir para a escola de pós-graduação. Mamãe e papai os aconselharam a ser técnicos por dois anos para se certificar de que pesquisa em tempo integral é o que eles gostam de fazer e que têm temperamento para enfrentar os altos e baixos. Ambos seguiram nosso conselho e se inscreveram para a pós-graduação depois de experimentar uma pesquisa em tempo integral. Esse seria o meu primeiro conselho - experimente uma pesquisa intensiva antes de entrar em um programa de doutorado.

Eu também aconselharia os novos alunos a seguir sua paixão - o treinamento de pós-graduação pode ser empolgante, emocionante e estimulante, mas também pode ser cansativo, e quando os alunos não obtêm sucesso, pode ser desanimador e decepcionante. Você tem que ser capaz de resistir aos altos e baixos - os altos e a sua fascinação pelo seu projeto precisam mantê-lo em movimento. Acho que é crucial escolher um bom mentor, um bom laboratório e um sistema no qual você aprenderá lições, e não acho que o sistema precisa ser aquele no qual você deseja trabalhar a longo prazo. Temos alunos que chegam e dizem "Eu quero trabalhar em XYZ" - eles não precisam necessariamente fazer seu trabalho de pós-graduação em XYZ. Os alunos devem escolher laboratórios nos quais terão um bom treinamento, onde eles e seu mentor identificaram grandes questões a serem abordadas, onde podem aprender pelo menos algumas tecnologias de ponta e onde sairão prontos para seguir em frente para o que eles querem estudar há décadas, sua área XYZ.

Finalmente, há algo que os leitores de Desenvolvimento ficariam surpresos em descobrir sobre você?

Eu não sinto que tenho uma parte da minha vida que seja particularmente selvagem ou surpreendente - eu não tenho cultivado muitas atividades extracurriculares, sendo principalmente mantida ocupada e gratificada pela família e pela ciência. Estou em uma família de cientistas - casada com um e dois filhos no caminho da ciência. Isso não é tão surpreendente, já que os cientistas tendem a se encontrar e as crianças costumam seguir os passos dos pais. O que as pessoas podem não saber é que eu era uma aspirante a dançarina de balé, mesmo durante a pós-graduação, mas nunca foi sério, apenas minha saída para fazer algo físico e esteticamente agradável. Talvez isso seja algo para retomar na aposentadoria, embora eu não ache que eu queira voltar em pé!


Introdução

O envelope nuclear consiste em duas camadas duplas de lipídios. A membrana externa é contínua com o retículo endoplasmático (RE) e é unida à membrana interna por complexos de poros nucleares (NPCs), que medeiam o tráfego molecular entre o citoplasma e o núcleo. A lâmina nuclear, uma estrutura fibrosa dinâmica localizada abaixo da membrana nuclear interna, é composta de lâminas do tipo A e do tipo B. Os lâminas são proteínas de filamento intermediário e têm uma estrutura comum, consistindo em um pequeno domínio globular N-terminal, um domínio de haste helicoidal central de comprimento constante e um domínio de cauda globular de tamanho variável. Eles entram no núcleo por meio de NPCs e se agrupam em filamentos e fibras mais grossas, sendo o ciclo de montagem-desmontagem regulado pela fosforilação da lâmina. As laminas interagem diretamente com a cromatina e várias proteínas integrais de membrana, incluindo proteínas associadas à lâmina (LAPs), emerina e o receptor da lâmina B (Stuurman et al., 1998 Gruenbaum et al., 2001 Hutchison et al., 2001 Morris, 2001 Wilson et al. al., 2001).

As laminas do tipo A, A e C, são produzidas a partir de produtos de mRNA em splicing alternativo do gene no cromossomo 1q21.3, sendo a lamina C uma forma mais curta da lamina A (Lin e Worman, 1993). O gene emerin no cromossomo Xq28 (Bione et al., 1994) codifica uma proteína de membrana integral tipo II de 254 aminoácidos que é ancorada à membrana nuclear interna por sua cauda C-terminal hidrofóbica (Manilal et al., 1996 Nagano et al. ., 1996) e interage diretamente com a lâmina A / C (Clements et al., 2000). Essa interação envolve a região da cauda globular comum às laminas A e C (Vaughan et al., 2001) e uma região central (aminoácidos 70-164) da molécula de emerina (Lee et al., 2001). Uma região semelhante da emerina (aminoácidos 107-175) é necessária para sua localização na borda nuclear (Tsuchiya et al., 1999, Östlund et al., 1999), sugerindo envolvimento da lâmina A / C, e isso foi confirmado pelo localização de emerin no ER no mouse knockout lamin A / C (Sullivan et al., 1999). No entanto, a localização parcial de emerina na borda nuclear ainda foi observada em alguns tecidos de camundongos knockout, sugerindo que outros fatores além da lamina A / C podem estar envolvidos (Sullivan et al., 1999).

A interação emerina-lamina A / C é de particular interesse porque mutações em ambas as proteínas causam distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD) (Bione et al., 1994 Bonne et al., 1999). No EDMD ligado ao X, a maioria das mutações da emerina resulta na ausência completa da proteína emerina (Manilal et al., 1998), embora os níveis reduzidos de emerina causados ​​por splicing de RNA alterado também possam resultar em EDMD (Holt et al., 2001b). Algumas mutações missense são conhecidas e produzem emerinas que são mais facilmente extraídas do núcleo (Fairley et al., 1999). No EDMD autossômico dominante, a maioria das mutações é mal-intencionada e uniformemente espalhada pelos domínios da haste helicoidal e da cauda globular comuns às laminas A e C. Parece provável que essas mutações exerçam um efeito negativo dominante sobre a função dos filamentos laminares multissubunidades ( Morris, 2001). Ambas as formas de EDMD compartilham as mesmas características clínicas de contraturas articulares precoces, perda muscular seletiva e defeitos de condução cardíaca, e ambas são extremamente variáveis ​​em gravidade, sugerindo que alguma função específica do complexo emerina-lamina A / C é afetada em ambos os casos (Morris, 2001). Mutações na lâmina A / C também são responsáveis ​​por uma forma de cardiomiopatia dilatada (CMD1A) (Fatkin et al., 1999) e por uma distrofia muscular de cintura-membro com defeitos de condução (tipo 1B) (Muchir et al., 2000). Como essas duas doenças estão intimamente relacionadas ao EDMD fenotipicamente, sua patogênese molecular é provavelmente semelhante, com variabilidade causada por antecedentes genéticos (Morris, 2001). Em três outras doenças, os efeitos moleculares das mutações da lamina A / C podem ser diferentes, porque seus fenótipos são bastante distintos do EDMD. Estes são lipodistrofia parcial familiar do tipo Dunnigan (FPLD) (Cao e Hegele, 2000 Shackleton et al., 2000), transtorno de Charcot-Marie-Tooth autossômico recessivo tipo 2 (De Sandre-Giovannoli et al., 2002) e displasia mandibuloacral hereditária (Novelli et al., 2002). Nestes casos, as mutações podem causar ganho ou perda de funções específicas da lamina A / C que não envolvem a interação emerina. Em FPLD, por exemplo, a ligação à lâmina A / C de um fator de transcrição específico no tecido adiposo pode ser afetada (Lloyd et al., 2002).

A análise imunohistoquímica de fibroblastos embrionários de camundongo de tipo selvagem (MEFs) mostrou que a emerina está concentrada dentro do envelope nuclear, enquanto os MEFs do nocaute de lamina-A (lmna - / -) camundongos mostraram uma diminuição na emerina associada ao envelope nuclear e uma distribuição mais geral de emerina no ER periférico. Transfecção de lmna - / - MEFs com humanos lamina A O cDNA corrigiu a localização da emerina no envelope nuclear. Esses resultados sugerem que a expressão da lamina do tipo A é necessária para a localização correta da emerina (Sullivan et al., 1999). Em um estudo mais recente, lmna - / - MEFs foram transfectados com três lamina A cDNAs contendo mutações patogênicas de sentido incorreto (Raharjo et al., 2001). A lâmina A de tipo selvagem e a lâmina A com uma mutação de lipodistrofia foram capazes de restaurar a localização do envelope nuclear da emerina. No entanto, dois mutantes de lamina A / C causando CMD1A e um causando EDMD eram defeituosos na realocação de emerina do ER periférico para a borda nuclear (Raharjo et al., 2001). Um estudo de transfecção com uma gama mais ampla de mutantes de lamina A / C (Östlund et al., 2001) mostrou que alguns EDMD e mutantes de cardiomiopatia causaram a formação de focos nucleares, ou agregados, e interromperam a montagem de laminas endógenas em HeLa e mioblasto de camundongo linhas de celular.

No presente estudo, avançamos esses estudos anteriores por meio da transfecção lmna - / - MEFs com uma gama muito mais ampla de mutantes de lamina A / C, com atenção especial aos efeitos na localização da emerina. Como resultado, podemos agora racionalizar, pela primeira vez, os efeitos biológicos das mutações da lamina A / C com as funções conhecidas de diferentes domínios na molécula da lamina A / C. No novo modelo, as mutações EDMD no domínio da cauda globular afetam a interação da emerina diretamente. Mutações de bastonete afetam a montagem da lâmina tipo A e nós hipotetizamos que quaisquer efeitos na localização da emerina na borda nuclear resultam indiretamente disso.


2. Métodos

A Tabela Suplementar 1 contém todas as informações relevantes sobre a fonte e o identificador dos anticorpos, reagentes, ensaios, etc. usados ​​ao longo deste estudo.

2.1. Linhas de células e cultura de células

Um painel de oito linhas de células NSCLC e adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) com diferentes status de p53 foi usado neste estudo para cobrir um grande subconjunto de pacientes (Supl. Tabela 2). As linhas de células pancreáticas humanas incluem Mia-PaCa-2, Panc-1, Capan-2 e BxPC-3. As linhas de células NSCLC humanas incluem NCI & # x02013H1975, NCI & # x02013H2228, NCI & # x02013H596 e A549. Todas estas linhas celulares foram adquiridas da American Type Culture Collection, exceto para Mia-PaCa-2 (DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures).

Um painel da linha celular p53 & # x000a0 mutante adicional foi usado para a maioria dos experimentos realizados neste estudo e consistiu nas células NSCLC NCI & # x02013H1299 & # x000a0 parental (deleção parcial de p53 homozigótica, Nulo) e seus derivados isogênicos estavelmente transfectados para expressar qualquer p53 mutante R175H ou proteína R273H, de acordo com os protocolos estabelecidos [30] (fornecido pelo prof. Dr. Haupt no Peter MacCallum Cancer Centre, Austrália). O p53 mutante, R175H e R273H superexpressam o p53 mutante em comparação com a linha parental nula p53 para a qual nenhuma proteína foi detectada por Western blotting. Mia-PaCa-2 e Panc-1 foram cultivados no meio necessário sendo DMEM (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 1% de penicilina / estreptomicina (Life technologies) e 2 & # x000a0mM l - glutamina (tecnologias da vida). Capan-2, BxPC-3, NCI & # x02013H1975, NCI & # x02013H2228, NCI & # x02013H596 e as linhas de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0 foram cultivadas em RPMI (Life Technologies) suplementado conforme descrito acima. Para descartar diferenças na sensibilidade à FA devido a variações na concentração de selênio [31], todos os experimentos foram realizados usando o mesmo fornecedor de FBS (Gibco, 10270-106) e triplicados do sequenciamento de RNA, atividade TrxR, conteúdo de GSH e Western blot experimentos de validação de nível de proteína (Fig. 3 A & # x02013E) foram realizados com o mesmo lote de células tratadas e meio de crescimento. As células foram cultivadas como monocamadas e mantidas em fase de crescimento exponencial em 5% de CO2/ 95% de ar em uma incubadora umidificada a 37 & # x000a0 & # x000b0C. Um lote separado do mutante isogênico p53 NCI & # x02013H1299 & # x000a0cell lines foi transduzido de forma estável com o reagente Incucyte & # x000ae NucLight Red Lentivirus com um gene de puromicina para permitir o rastreamento de células no sistema IncuCyte ZOOM (Sartorius). Todas as linhas celulares foram confirmadas como livres de micoplasma usando o kit de detecção de micoplasma MycoAlert.

Efeito da FA no mRNA e alvos proteicos relacionados a mecanismos antioxidantes, ferroptose e danos ao DNA. (UMA) Atividade TrxR em & # x003bcMol / Minuto / mgProteína após o tratamento das linhas de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0c com uma concentração citostática (1 & # x000a0 & # x003bcM) e citotóxica (5 & # x000a0 & # x003bcM) AF. (B) Conteúdo de proteína GSH relativo após o tratamento das células NCI & # x02013H1299 & # x000a0 isogênicas com uma concentração de AF citostática (1 & # x000a0 & # x003bcM) e citotóxica (5 & # x000a0 & # x003bcM) AF por seis e 24 horas, em relação ao não tratado. Barras de erro representam o desvio padrão. * p & # x000a0 & # x02264 & # x000a00.05 diferenças significativas em comparação com o controle não tratado. (C) Análise da via de criatividade das vias afetadas após o tratamento com 1 & # x000a0 & # x003bcM AF por 24 horas nas linhas de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0. A legenda da chave colorida representa -log (valor p). (D) Genes expressos diferencialmente após o tratamento de AF, em relação ao não tratado, nas linhas de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0. A legenda da chave de cor representa o log da expressão2 proporção (vermelho & # x000a0 = & # x000a0upregulação verde & # x000a0 = & # x000a0regulação decrescente). (E) Western blot foi usado para determinar os níveis de proteína de NRF2, HMOX1, GPX4, SOD1 e Trx nas células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0células após tratamento com 1 & # x000a0 & # x003bcM AF por 24 horas de duas réplicas independentes (REP1 e REP2). & # x003b2 -actina foi usada como controle interno. Os pesos moleculares das proteínas são representados em quilodalton (kDa). (F& # x02013G) Box plot que representa & # x003b3 H2AX ocupação local (F) e intensidade nuclear pRPA32 (G) calculado usando um algoritmo no software Image J, nas linhas de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0cell tratadas com PBS, 1 & # x000a0 & # x003bcM e 2 & # x000a0 & # x003bcM AF por 24 horas. Imagens representativas são apresentadas na Fig. Suplementar 8. Os limites da caixa representam os quartis superior e inferior e a linha preta dentro representa a mediana. Os bigodes exibem o intervalo de confiança de 95%, enquanto os pontos fora dos bigodes representam outliers. As experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. * p & # x000a0 & # x02264 & # x000a00.05, ** p & # x000a0 & # x02264 & # x000a00.01, *** p & # x000a0 & # x02264 & # x000a00.001. (Para interpretação das referências à cor na legenda da figura, o leitor deve consultar a versão da Web deste artigo.)

2.2. Coorte de pacientes com NSCLC e espécimes de tecido

A coorte do estudo consistiu de 72 pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma NSCLC em estágio I-IV. Amostras de tecido de ressecções tumorais foram obtidas no Antwerp University Hospital Tumorbank como espécimes fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE). As amostras de tecido foram preparadas conforme descrito por Deben et al. [32,33]. Os principais parâmetros clínicos e patológicos do paciente estão resumidos no Supl. Tabela 3. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Antuérpia (número de referência 17/30/339).

2.3. Imunohistoquímica

Cinco seções & # x003bc m de espessura foram preparadas a partir de espécimes FFPE. As seções foram submetidas à recuperação de antígeno induzida por calor por incubação em um tampão de baixo pH (anti-TrxR) e um tampão de alto pH (anti-p53) por 20 minutos a 97 & # x000a0 & # x000b0C (PT-Link) (DAKO). Posteriormente, a atividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação das lâminas em tampão de bloqueio de peroxidase (DAKO) por 5 minutos. A incubação com anticorpos monoclonais primários anti-p53 (pronto para uso por 30 minutos) e anti-TrxR (1:50 por 40 minutos) foi realizada em um instrumento DAKO autostainer Link 48. Para anti-TrxR e anti-p53, o kit de detecção Envision FLEX & # x000a0 + & # x000a0 foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Os cortes foram contrastados com hematoxilina, desidratados e montados. Os controles positivos foram incluídos em cada corrida de coloração e consistiam em tecido de tonsila (anti-p53 e anti-TrxR) e células A549 & # x000a0 (anti-TrxR). A pontuação foi realizada por dois observadores independentes, incluindo um patologista experiente. Para contabilizar a heterogeneidade de TrxR, um sistema de pontuação de imunorreatividade (IRS) foi aplicado.A intensidade da coloração foi designada como sem coloração (0), coloração fraca (+), moderada (++) e forte (+++) e a porcentagem de células tumorais positivas foram pontuadas de 1 a 4 (& # x0003c10%, 10 & # x0201350 %, 51 & # x0201380% e & # x0003e80% das células tumorais coradas). Posteriormente, o IRS geral foi calculado pela multiplicação desses dois parâmetros. Os casos foram agrupados em quatro categorias como TrxR negativo (0, IRS 0), leve (1, IRS 1 e # x020133), moderado (2, IRS 4 e # x020137) e forte (3, IRS 8 e # x0201312) positivo (Fig. 1C ) A acumulação de proteína p53 foi classificada como nula, tipo selvagem ou superexpressão aberrante (Suppl. Fig. 5).

Expressão do sistema Trx em pacientes com NSCLC. (UMA) Expressão dos genes da via da tioredoxina, tioredoxina (TXN), tioredoxina redutase 1 & # x020132 (TXNRD1-2) e peroxiredoxina 1-6 (PRDX1-6) representado como fragmentos por milhão de quilobases (FPKM). Os valores de FPKM foram extraídos da coorte LUAD do conjunto de dados de RNA-seq do atlas do genoma do câncer (TCGA) usando o Atlas de proteínas humanas. (B) Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrando a correlação de TXN, TXNRD1-2 e PRDX4 e 6 expressão gênica com a sobrevivência de pacientes LUAD. As curvas foram traçadas com base no melhor cut-off de expressão, ou seja, o valor FPKM que produz a diferença máxima em relação à sobrevivência usando o Human Protein Atlas. Número de pacientes LUAD com baixa ou alta expressão gênica foram incluídos entre colchetes. (C) Seções representativas de amostras de tumor NSCLC classificadas como expressão da proteína TrxR negativa (IRS0), fraca (IRS1), moderada (IRS2) e forte (IRS3) usando coloração imunohistoquímica. (D) Gráfico de pizza que representa a porcentagem de pacientes com NSCLC com IRS0 a IRS3 para a expressão da proteína TrxR. (E) Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para sobrevida global (OS) e sobrevida livre de progressão (PFS) com base no IRS da proteína TrxR. As cruzes significam eventos censurados onde a vida de um paciente terminou. A significância foi alcançada quando p & # x000a0 & # x0003c & # x000a00.05 determinado pela classificação do log. IRS: pontuação de imunorreatividade.

2.4. Banco de dados TCGA

Os valores de fragmento por quilobase milhão (FPKM) foram extraídos de 500 pacientes com adenocarcinoma pulmonar (coorte LUAD) do conjunto de dados TCGA RNA-seq usando o Human Protein Atlas [34,35]. As curvas de sobrevivência Kaplan-Meier foram traçadas com base no melhor corte de expressão, ou seja, o valor FPKM que produz a diferença máxima em relação à sobrevivência usando o Human Protein Atlas. Foi utilizado um ponto de corte de um valor de p log-rank & # x0003c 0,01.

2,5. Ensaio de citotoxicidade da Sulforhodamina B

Um ensaio colométrico de sulforodamina B (SRB) foi usado para medir a citotoxicidade induzida por tratamento de FA. A densidade ótima de semeadura de cada linha celular para cada tipo de placa foi determinada a fim de garantir o crescimento exponencial durante toda a duração do ensaio. As diferentes linhas celulares foram semeadas em placas de 96 poços, incubadas durante a noite e expostas a 0 & # x0201310 & # x000a0 & # x003bcM AF por 72 horas. As monocamadas celulares foram então fixadas com ácido tricloroacético a 10% durante 1 hora a 4 & # x000a0 & # x000b0C e coradas com 100 & # x000a0 & # x003bc L 0,1% SRB, como descrito anteriormente [36]. O IC50 O valor (isto é, concentrações de drogas que causam 50% de inibição do crescimento) para cada linha celular foi calculado usando WinNolin & # x000ae Software (Pharsight).

2.6. Western blotting

As células foram semeadas em 2,3 x 10 6 & # x000a0cells em frascos T175. No dia seguinte, as células foram tratadas com 1 & # x000a0 & # x003bcM AF, 5 & # x000a0 & # x003bcM AF ou 0,06% DMSO durante 24 horas. Este lote de células foi usado em diferentes configurações ao longo deste estudo. Para as experiências baseadas em proteínas, as células foram lisadas em tampão de lise (10 & # x000a0mM TrisHCl, 400 & # x000a0mM NaCl, 1 & # x000a0mM EDTA, 0,1% NP40 e inibidor de protease). Após a centrifugação (10 & # x000a0min, 13 & # x000a0000 & # x000a0rpm, 4 & # x000a0 & # x000b0C), os lisados ​​clarificados contendo as proteínas isoladas foram colhidos e mantidos a & # x0221280 & # x000a0 & # x000b0C. As concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de proteína Pierce BCA, de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar os níveis de proteína de linha de base, as células foram coletadas após a subcultura e lisadas como descrito acima. Western blot foi realizado conforme descrito anteriormente [37]. O bloqueio, a incubação do anticorpo primário e secundário foram realizados usando o sistema de detecção de proteína SNAP id 2.0, de acordo com as instruções do fabricante. As membranas foram incubadas com os seguintes anticorpos: fator 2 relacionado ao eritroide 2 anti-fator nuclear (NRF2, 1: 2000), anti-p53 (1: 1000), anti-glutationa peroxidase 4 (GPX4, 1: 2000), anti-soluto membro 11 da família de transportadores 7 (SLC7A11, 1: 1000), anti-TrxR1 (1: 2000), anti-heme oxigenase-1 (HMOX1, 1: 1000), anti-Trx (1: 2000), coquetel de estresse anti-oxidativo (catalase, superóxido dismutase 1 (SOD1), Trx e actina de músculo liso, 1: 350) e anti - & # x003b2-actina (1: 2500, controle interno). Foram usados ​​anticorpos secundários marcados com fluorescência anti-coelho de cabra (1: 10 e # x000a0000) ou anti-camundongo de cabra (1: 10 e # x000a0000). A detecção fluorescente foi realizada usando o sistema de imagem Odyssey (Li-Cor). O software Image Studio Lite (Li-Cor) foi usado para realizar a quantificação de pixels das imagens. A normalização intra-execução contra o controle de actina interno foi realizada para cada amostra. A normalização interreplicada para cada proteína de interesse foi realizada com base no sinal normalizado de actina médio para cada blot.

2.7. ROS

As células foram semeadas em placas de 96 poços, incubadas durante a noite e expostas a 2 & # x000a0 & # x003bcM AF ou veículo (tampão fosfato salino, PBS). Imediatamente após o tratamento, 2,5 & # x000a0 & # x003bcM CellROX Green reagente foi adicionado às células. Posteriormente, a placa foi transferida para a temperatura e CO2-controlled IncuCyte ZOOM (ampliação de 10X, Essen BioScience). O ROS foi monitorado ao longo do tempo por fotos tiradas a cada quatro horas para limitar a fototoxicidade. Para análise, a unidade verde média calibrada (GCU) foi plotada para cada linha de células após 16 horas por pelo menos três repetições.

2.8. Ensaio de atividade da tiorredoxina redutase

O lote de lisados ​​de proteína tratada com veículo e AF foi usado para medir a atividade de TrxR usando o Kit de Ensaio Colorimétrico de Redutase de Tioredoxina, de acordo com os protocolos do fabricante. A absorvância foi registrada em 405 & # x000a0nm com um leitor de absorvância de microplaca iMARK & # x000ae (Bio-Rad) durante os 15 minutos iniciais da reação. A atividade TrxR foi calculada usando a fórmula fornecida pelo protocolo, em que as medições de fundo foram subtraídas de todos os valores. Uma quantidade igual de proteína foi carregada para cada condição, conforme determinado pelo kit de proteína Pierce BCA.

2.9. Quantificação do nível de glutationa

O lote de células tratadas com veículo e AF foi usado para determinar as concentrações celulares de glutationa (GSH), quantificadas usando o kit de ensaio GSH / GSSG-Glo & # x02122, de acordo com os protocolos do fabricante. Portanto, uma quantidade igual de células (7500 & # x000a0 células / poço) foi adicionada a uma placa branca de 96 poços na presença de reagente de lise GSH. A intensidade luminescente foi medida usando um leitor de placas VICTOR & # x02122 (PerkinElmer), que foi proporcional à quantidade de GSH.

2,10. Isolamento de RNA

O mesmo lote de células tratadas com veículo e AF foi coletado e sedimentado para isolar o RNA total usando o Mini Kit RNA Plus, de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi verificada usando o kit Qubit RNA BR Assay no Qubit 4 Fluorometer (ThermoFisher). A qualidade das amostras de RNA foi determinada usando o Fragment Analyzer Automated CE System (Agilent, kit de análise de RNA de sensibilidade padrão DNF-471) com o kit de análise de fragmento NGS de alta sensibilidade. Nenhuma amostra teve que ser excluída com base na baixa quantidade ou qualidade.

2,11. 3 & # x02019 sequenciamento de mRNA e processamento de dados

As amostras de RNA foram amplificadas usando o QuantSeq 3 & # x02032 mRNA-Seq Library Prep Kit FWD para Illumina, seguindo o protocolo do fabricante para fragmentos longos. O kit PCR Add-On para Illumina (Lexogen GmbH, 020,96) foi incorporado a fim de determinar o número ideal de ciclos de PCR. Após análise quantitativa (Qubit dsDNA HS Assay Kit) e análise qualitativa, as bibliotecas de cDNA resultantes foram agrupadas equimolarmente. O sequenciamento foi realizado em um NextSeq 500 (Illumina) usando um NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 ciclos). A análise de sequenciamento de RNA foi iniciada usando a plataforma BlueBee (www.bluebee.com). Primeiro, os quatro arquivos FASTQ por amostra foram mesclados usando o pipeline & # x0201cBluebee FASTQ merging (entrada: arquivos) 1.2.0 & # x0201d. Em seguida, os arquivos FASTQ mesclados foram cortados, as leituras foram mapeadas para o genoma humano de referência build 38 e um controle de qualidade foi realizado usando o pipeline & # x0201cFWD Human (GRCh38.77) Lexogen QuantSeq 2.2.3 & # x0201d. Em seguida, a análise de expressão diferencial foi realizada em R com o pacote DESeq2 v1.28.1 [38]. Os perfis do transcriptoma foram analisados ​​funcionalmente usando a análise do núcleo da engenhosidade (IPA) [39]. Um corte de alteração de dobra de 0,5 e valor de corte de p de 0,05 foi usado para as três linhas de células. Em seguida, a análise do núcleo de cada linha celular foi submetida à análise de comparação com base em -log (valor p) e pontuação z de ativação. Os valores da razão de log de expressão foram extraídos dos genes afetados nas vias mais bem classificadas e apresentados em um mapa de calor. A Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) foi realizada em dados de sequenciamento de RNA normalizados usando o pacote de software GSEA [40], desenvolvido pelo Broad Institute (Maltham). GSEA foi realizada com o banco de dados de conjunto de genes gerado computacionalmente que representa genes envolvidos na transição epitelial-mesenquimal (EMT, nome padrão: Hallmark_epithelial_mesenchymal_transition, nome sistemático: M5930, banco de dados Molecular Signature Database v7.1) [41]. Conjuntos de genes com uma taxa de descoberta falsa (FDR) & # x02264 0,05 e valor p & # x02264 0,05 foram considerados.

2,12 Imunocitoquímica

As células foram semeadas em uma placa de 96 poços preta & # x003bcClear e depois tratadas com 1 & # x000a0 & # x003bcM e 2 & # x000a0 & # x003bcM AF por 24 horas. As culturas foram fixadas em paraformaldeído 2% (PFA) por 20 minutos em temperatura ambiente (TA). Culturas fixas foram permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 em PBS (0,1 & # x000a0M, pH 7,4) por 8 minutos, seguido por uma hora de incubação com os anticorpos primários contra estresse de replicação fosfo-RPA32 (pRPA32, 1: 1000), DNA danos gama-H2AX (& # x003b3H2AX, 1: 1000) e p53 (7F5, 1: 1600) à temperatura ambiente em 50% de FBS em PBS. Após lavagem com PBS, os anticorpos secundários GAR-Cy3 (1: 400), GAM-488 (1: 1000), Alexa Fluor 488 (1: 400) foram adicionados durante uma hora à temperatura ambiente aos respectivos anticorpos primários. Finalmente, o DAPI foi aplicado às culturas por 20 minutos a uma concentração de 5 & # x000a0 & # x003bcg / mL. As imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência Nikon Ti usando uma lente seca 20x (abertura numérica 0,75). Por poço, 16 quadros foram adquiridos em três canais (395, 470 e 555 & # x000a0mm excitação). O processamento de imagens foi realizado em Fiji, uma versão empacotada do freeware ImageJ [42]. O número de pontos pRPA32 e & # x003b3H2AX foi quantificado usando um pipeline de análise de imagem que foi descrito antes (Cellblocks.ijm) [43]. Em resumo, a análise detecta regiões de interesse (ROIs) correspondentes aos núcleos completos no campo de visão e, subsequentemente, detecta pontos nucleares por marcador de interesse e mede sua intensidade e características morfológicas. A quantificação de p53 foi baseada na medição de intensidades de sinal dentro das ROIs nucleares no canal maker. A análise de dados downstream foi realizada no R studio.

2,13. Análise das vias de morte celular

NucLight Red transduzido isogênico NCI & # x02013H1299 & # x000a0 painel de células foi semeado em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, as células foram pré-incubadas com os inibidores da via de morte celular desejados por 1 hora (5 & # x000a0mM n-acetil-cisteína (NAC), 1 & # x000a0 & # x003bcM ferrostatina-1 (Fer1), 100 & # x000a0 & # x003bcM alfa-tocoferol (& # x003b1 Toco), 10 & # x000a0 & # x003bcM Z-VAD-FMK e 10 & # x000a0 & # x003bcM necrostatina-s1 (Nec1s)) ou 4 horas (100 & # x000a0 & # x003bcM Deferoxamina, DFO & #) e então tratado com 2 x000a # x003bcM AF na presença do Reagente IncuCyte Cytotox Green (50 & # x000a0nM) ou Reagente de Apoptose Caspase-3/7 Green (2,5 & # x000a0 & # x003bcM). Posteriormente, a placa foi transferida para a temperatura e CO2-controlado IncuCyte ZOOM por 72 horas. A morte celular foi monitorada por fotos (aumento de 10X) tiradas a cada 24 horas para limitar a fototoxicidade. Para análise, contagem de objeto verde (1 / mm 2), contagem de objeto vermelho (1 / mm 2), contagem de objeto sobreposto verde-vermelho (1 / mm 2) e Caspase-3/7 Verde GCU x & # x003bcm 2 / imagem foram determinados com o analisador básico IncuCyte. A porcentagem de morte celular e células positivas para Caspase-3/7 foi calculada com a fórmula: G r e n o b j e c t c o u n t R e d o b j e c t c o u n t + G r e n o b j e c t c t c o u n t & # x02212 O v e r l a p p i n g o b j e c t c o u n t + G r e n o b j e c t c t c o u n t & # x02212 O v e r l a p p i n g o b j e c t c 017.

2,14. Peroxidação lipídica

Lípido celular ROS foi medido usando o Image-iT & # x02122 Lipid Peroxidation Kit, de acordo com as instruções do fabricante. Portanto, o painel de células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0cell foram tratados com 2 & # x000a0 & # x003bcM AF por 48 horas ou o controle positivo (hidroperóxido de cumeno) por 2 horas. Posteriormente, 10 & # x000a0 & # x003bcM do corante C11-BODIPY foi adicionado à cultura e incubado por 30 minutos a 37 & # x000a0 & # x000b0C. A aquisição foi realizada em um CytoFLEX (BD) e o software FlowJo v10.1 (TreeStar) foi usado para calcular as relações C11-BODIPY vermelho sobre sinais verdes de intensidade média de fluorescência (MFI).

2,15. Análise de DAMPs relacionados a ICD

As células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0 foram semeadas e tratadas com 2 & # x000a0 & # x003bcM AF, mas a análise dos marcadores relacionados ao CDI ocorreu em diferentes pontos de tempo. (i) Após 24 horas de tratamento em meio de cultura de células suplementado com FBS inativado por calor, o sobrenadante foi coletado. No sobrenadante recém-coletado, os níveis de ATP extracelular (nmol) foram avaliados com o sistema de ensaio de ATP ENLITEN & # x000ae, de acordo com o protocolo do fabricante. O sinal bioluminescente foi medido usando um leitor de placas VICTOR & # x02122 (PerkinElmer). (ii) Após 48 horas de tratamento, as células foram colhidas e incubadas com 5% de soro de cabra normal. Após a lavagem, as células foram coradas para a expressão de ecto-calreticulina (CALR) usando um anticorpo CALR anti-humano conugado com AF488 (1: 100). Antes da análise, as células foram coradas com Anexina V APC e iodeto de propídio (PI) para distinguir entre células apoptóticas precoces e necróticas. Detritos celulares e células necróticas (PI +) foram excluídos da análise. O controle de isotipo (IgG de coelho, 1: 100) foi incluído para corrigir a coloração inespecífica. Os dados de citometria de fluxo foram adquiridos em um instrumento BD Accuri & # x02122 C6 (BD Biosciences) e analisados ​​usando o software FlowJo v10.1 (TreeStar). (iii) Para determinar a liberação da caixa de grupo 1 de alta mobilidade (HMGB1, ng / mL), o sobrenadante foi coletado após 48 horas de tratamento de AF, centrifugado e armazenado a & # x0221280 & # x000a0 & # x000b0C. Um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) foi realizado, de acordo com o protocolo do fabricante, e a absorção foi medida usando um leitor de placas iMARK & # x02122 (Bio-Rad).

2.16. Em vitro geração de DCs derivadas de monócitos humanos

Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas por separação em gradiente LymphoPrep (Sanbio) de camadas leucocitárias de doadores saudáveis ​​(Red Cross Flanders Blood Service, Bélgica). Em seguida, os monócitos foram isolados desses PBMCs usando microesferas CD14, de acordo com o protocolo do fabricante com pureza & # x0003e90% após o isolamento. As células CD14 + foram semeadas a uma densidade de 1,25 & # x020131,35 x 10 6 & # x000a0cells / mL em RPMI suplementado com 2,5% de albumina humana, 800 U / mL de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos e 50 & # x000a0ng / mL de interleucina ( IL) -4 no dia 0, conforme descrito anteriormente [44]. DCs imaturos foram colhidos no dia cinco.

2,17. Status de maturação de CDs

Depois de em vitro geração de DCs, células isogênicas NCI & # x02013H1299 & # x000a0 foram semeadas em placas de 6 poços no dia quatro e incubadas durante a noite. No dia cinco, as células tumorais foram tratadas com 2 & # x000a0 & # x003bcM de AF por seis horas. Posteriormente, as DCs imaturas foram marcadas com 2 & # x000a0 & # x003bcM de corante citoplasmático violeta-fluorescente CellTracker Violet BMQC a uma concentração de 10 6 & # x000a0 células por mL e colocadas em co-cultura em uma razão efetor (E) para alvo (T) de 1: 1 (E: T). Após 48 horas em co-cultura, o sobrenadante foi armazenado em & # x0221220 & # x000a0 & # x000b0C para análise futura e DCs foram imediatamente usados ​​para detecção de citometria de fluxo de marcadores de maturação de DC no dia sete. A ligação de anti-CD86 PECy7 (1:25) e complexos anti-principais de histocompatibilidade de classe II (MHC-II) FITC (1:50) foi medida no violeta & # x000a0 + & # x000a0viável (Live / Dead Near IR +, 1: 50) População DC. Para cada marcador, um controle de isotipo foi usado para subtrair sinais específicos. Os resultados são representados como & # x00394MFI = coloração MFI tratada & # x02013 MFI isotype tratada coloração MFI não tratada & # x02013 MFI isotype não tratado e como a percentagem de DCs duplamente positivos para MHC-II e CD86. A aquisição foi realizada em um FACSAria II (BD Biosciences) e a análise de dados foi realizada usando o software FlowJo v10.1 (TreeStar).

2,18. Perfil de secreção de citocinas e quimiocinas

Um ensaio eletroquimioluminescente multiplex em um SECTOR3000 (MesoScale Discovery) foi usado para a detecção de IL-6, fator de necrose tumoral (TNF) - & # x003b1 e fator de crescimento transformador (TGF) - & # x003b2, conforme descrito anteriormente [45]. Padrões e amostras (sobrenadante coletado de NCI & # x02013H1299: co-culturas DC) foram medidos em duplicata e o ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A análise de dados foi realizada usando o software MSD Discovery workbench 4.0.

2,19. Isolamento e estimulação de células NK

PBMCs criopreservados foram descongelados e incubados durante a noite em meio RPMI completo com 5 & # x000a0 & # x003bcL DNase. Posteriormente, as células NK primárias foram isoladas negativamente de PBMCs usando um kit de isolamento NK para seleção negativa, de acordo com as instruções do fabricante. A pureza das células NK foi medida usando anti-CD3 FITC (1:20) e anti-CD56 PE (1:20) e estava acima de 90%.As células NK foram divididas em duas porções iguais: uma para estimular com 10 & # x000a0ng / mL de IL-15 humana recombinante, enquanto a outra porção não foi estimulada. Ambas as condições foram incubadas durante a noite a 37 & # x000a0 & # x000b0C e 5% de CO2.

2,20. Ensaio de citotoxicidade mediada por células NK

NucLight Red transduzido isogênico NCI & # x02013H1299 & # x000a0cells foram semeados em uma placa de 96 poços. Após a incubação durante a noite, as condições apropriadas foram pré-incubadas com 50 & # x000a0 & # x003bcM Z-VAD-FMK por 1 hora e depois tratadas com uma dose não tóxica de 0,55 & # x000a0 & # x003bcM AF na presença do reagente IncuCyte Cytotox Green (50 & # x000a0nM) ou Reagente de Apoptose Verde Caspase-3/7 (2,5 & # x000a0 & # x003bcM). Após 24 horas, as células alvo iniciadas com AF foram co-cultivadas com células NK efetoras (não) estimuladas a uma razão E: T de 5: 1. As células tumorais incubadas sem células NK serviram como controle. A placa foi então transferida para a temperatura e CO2- controlado IncuCyte ZOOM por 48 horas. A morte celular foi monitorada por fotos tiradas a cada 24 horas para limitar a fototoxicidade. Para análise, contagem de objeto verde (1 / mm 2), contagem de objeto vermelho (1 / mm 2), contagem de objeto sobreposto verde-vermelho (1 / mm 2) e Caspase-3/7 Verde GCU x & # x003bcm 2 / imagem foram determinados com o analisador IncuCyte ZOOM. As células NK foram filtradas com base no tamanho. A porcentagem de morte de células tumorais foi calculada com a fórmula: G r e n o b j e c t c o u n t R e d o b j e c t c o u n t + G r e n o b j e c t c o u n t & # x02212 O v e r l a p p i n g o b j e c t c o u n t & # x02217 10017.

2,21. Dependência de GZMA e ativação de células NK

As células NCI & # x02013H1299 & # x000a0 foram semeadas em placas de 24 poços, incubadas durante a noite e tratadas com 0,55 & # x000a0 & # x003bcM AF. As células NK foram isoladas e estimuladas conforme descrito anteriormente. Após 24 horas de tratamento, as células tumorais iniciadas com AF foram co-cultivadas com as células NK (não) estimuladas a uma proporção de 5: 1 & # x000a0E: T. Anticorpos anti-CD107a-FITC (1:50) foram adicionados após 30 minutos de co-cultura. Monensina (1: 1000) foi adicionada após 30 minutos adicionais e a co-cultura continuou por mais 4 horas para aumentar a coloração de citocina intracelular. Após a lavagem, as células foram coradas com os seguintes anticorpos: anti-CD45 APC-Cy7 (1:50), anti-CD3 PE-Cy7 (1: 100), anti-CD56 PE-CF594 (1:25), anti-CD69 PerCP-Cy5.5 (1: 100) e Live / Dead Fixable Aqua (1:50) por 30 minutos a 4 & # x000a0 & # x000b0C. Posteriormente, as co-culturas foram fixadas, permeabilizadas e coradas para citocinas intracelulares usando anti-GZMA PE (1:25) e anti-interferon & # x003b3 (IFN & # x003b3) APC (1: 12,5) usando o conjunto de tampão FOXP3 Fix / Perm , de acordo com as instruções do fabricante. A aquisição foi realizada em um FACSAria II (BD BioSciences). A porcentagem de células NK positivas para um determinado marcador foi calculada usando a ferramenta de subtração de histograma overton no software FlowJo v10.1 (TreeStar), subtraindo o histograma de controle (por exemplo, células NK) do histograma de amostra (por exemplo, AF & # x000a0 + & # x000a0NK células em co-cultura).

2,22. Estatisticas

Todos os experimentos foram executados pelo menos três vezes. Todos os cálculos estatísticos foram conduzidos usando SPSS versão 26, salvo indicação em contrário, e a significância para todas as estatísticas foi alcançada se p & # x000a0 & # x02264 & # x000a00.05. O software Prism 8.2.1 (GraphPad) foi usado para comparação de dados e representações gráficas de dados. As associações entre os parâmetros clínico-patológicos e os níveis de expressão da proteína TrxR ou Trx foram investigadas por análise & # x003c7 2 para variáveis ​​categóricas. As diferenças na sobrevida geral (OS) e na sobrevida livre de progressão (PFS) entre os grupos de pacientes foram determinadas pela análise de Kaplan-Meier. Um modelo multivariado de risco proporcional de Cox foi ajustado para identificar marcadores prognósticos independentes, apresentados como uma razão de risco (HR) e seu intervalo de confiança de 95% (IC). O não paramétrico Mann-Whitney você teste foi usado para comparar as médias entre dois grupos (não tratado vs. tratado com FA). Para comparar as médias entre os diferentes grupos de tratamento (por exemplo, morte mediada por células NK), a significância estatística foi determinada por uma ANOVA de uma via, seguida pelo teste post hoc de Tukey. Os coeficientes de correlação de Spearman foram calculados para investigar a correlação entre as diferentes proteínas relacionadas com antioxidantes, AF IC50 valores e níveis de proteína p53 em diferentes linhas de células NSCLC e PDAC. A análise dos pontos & # x003b3 H2AX e pRPA32 foi realizada usando modelos lineares mistos, após o que a significância foi determinada usando comparações múltiplas de médias com contrastes de Tukey.


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Palavras-chave: CRISPR-Cas9, trigo duro, edição multiplex, sistema de processamento de tRNA, ATI, livre de GM, NCWS, alergias ao trigo

Citação: Camerlengo F, Frittelli A, Sparks C, Doherty A, Martignago D, Larr & # x000E9 C, Lupi R, Sestili F e Masci S (2020) CRISPR-Cas9 Edição Multiplex dos Genes Inibidores de & # x003B1-Amilase / Tripsina para Reduz as proteínas alérgicas no trigo duro. Frente. Sustentar. Food Syst. 4: 104. doi: 10.3389 / fsufs.2020.00104

Recebido: 23 de março de 2020 Aceito: 11 de junho de 2020
Publicado: 31 de julho de 2020.

Jitendra Paul Khurana, Universidade de Delhi, Índia

Ravinder K. Goyal, Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC), Canadá
Mark Paul Running, University of Louisville, Estados Unidos

Copyright & # x000A9 2020 Camerlengo, Frittelli, Sparks, Doherty, Martignago, Larr & # x000E9, Lupi, Sestili e Masci. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). É permitida a utilização, distribuição ou reprodução em outros fóruns, desde que o (s) autor (es) original (is) e o (s) titular (es) dos direitos autorais sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitida a utilização, distribuição ou reprodução em desacordo com estes termos.

& # x02020 Endereço atual: Damiano Martignago, Departamento de Biociências, Universidade de Milão, Milão, Itália


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