Em formação

Medir a densidade óptica com / sem células de ressuspensão


Ao medir a absorbância com um leitor de placas, é necessário (ou melhor) ressuspender a cultura se a placa ficou parada por 1-2 dias?

Embora essa possa ser uma boa pergunta de física, estou mais interessado na técnica correta de ensaio biológico.

--

As duas opções são:

1) cultivar micróbios em uma placa dentro de uma incubadora estática e, em seguida, colocar a placa em um leitor de placas sem agitando o líquido

2) cultivar micróbios em uma placa dentro de uma incubadora estática e, em seguida, colocar a placa em um leitor de placas depois de agitando o líquido

Na opção 2, a agitação pode ser alcançada pipetando suavemente o líquido para cima e para baixo algumas vezes ...


Definitivamente (2). Aglomerados de células causarão muito ruído em suas medições de absorbância (dependendo se o feixe de luz atinge um aglomerado ou algum espaço vazio).

Não sei qual é o seu micróbio ou em que meio de crescimento você está testando, mas normalmente é muito importante manter a cultura bem misturada o tempo todo, não apenas durante a medição. Se suas células se acumulam no fundo, você não obterá a mesma aeração que obteria se elas estivessem bem misturadas, e o acesso a outros nutrientes também poderia ser potencialmente limitado. Geralmente, a condição mais controlada é manter uma boa mistura o tempo todo, mas certamente isso depende do organismo e do meio.


9.1: Como os micróbios crescem

  • Contribuição de OpenStax
  • Biologia Geral no OpenStax CNX
  • Defina o tempo de geração para o crescimento com base na fissão binária
  • Identificar e descrever as atividades de microrganismos que passam por fases típicas de fissão binária (divisão celular simples) em uma curva de crescimento
  • Explicar vários métodos de laboratório usados ​​para determinar contagens de células viáveis ​​e totais em populações em crescimento exponencial
  • Descreva exemplos de divisão celular que não envolve fissão binária, como brotamento ou fragmentação
  • Descreva a formação e as características dos biofilmes
  • Identifique os riscos à saúde associados aos biofilmes e como eles são tratados
  • Descreva o quorum sensing e seu papel na comunicação célula a célula e coordenação das atividades celulares

Clínico Caixa de foco: PARTE 1

Jeni, uma mulher grávida de 24 anos em seu segundo trimestre, visita uma clínica com queixas de febre alta, 38,9 graus Celsius (102 graus Celsius), fadiga e dores musculares e sinais e sintomas semelhantes aos da gripe estípica. Jeni se exercita regularmente e segue uma dieta nutritiva com ênfase em alimentos orgânicos, incluindo leite cru que ela compra em um mercado local de produtores rurais. Todas as vacinas dela estão em dia. No entanto, o médico que atende Jeni está preocupado e pede que uma amostra de sangue seja enviada para teste no laboratório de microbiologia.

Por que o profissional de saúde está preocupado com os sinais e sintomas de Jeni & rsquos?

O ciclo celular bacteriano envolve a formação de novas células por meio da replicação do DNA e da partição de componentes celulares em duas células-filhas. Em procariontes, a reprodução é sempre assexuada, embora ocorra uma extensa recombinação genética na forma de transferência horizontal de genes, como será explorado em outro capítulo. A maioria das bactérias tem um único cromossomo circular, no entanto, existem algumas exceções. Por exemplo, Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme, tem um cromossomo linear.

Fissão Binária

O mecanismo mais comum de replicação celular em bactérias é um processo denominado fissão binária, que é ilustrado na Figura ( PageIndex <1> ) :. Antes de se dividir, a célula cresce e aumenta seu número de componentes celulares. Em seguida, a replicação do DNA começa em um local no cromossomo circular denominado origem de replicação, onde o cromossomo está ligado à membrana celular interna. A replicação continua em direções opostas ao longo do cromossomo até que o terminal seja alcançado.

Figura ( PageIndex <1> ): (a) A micrografia eletrônica mostra duas células de Salmonella typhimurium após um evento de fissão binária. (b) A fissão binária em bactérias começa com a replicação do DNA à medida que a célula se alonga. Um septo de divisão se forma no centro da célula. Duas células-filhas de tamanho semelhante se formam e se separam, cada uma recebendo uma cópia do cromossomo original. (crédito a: modificação do trabalho pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças).

O centro da célula aumentada se contrai até que duas células-filhas sejam formadas, cada filho recebendo uma cópia completa do genoma parental e uma divisão do citoplasma (citocinese). Este processo de citocinese e divisão celular é dirigido por uma proteína chamada FtsZ. FtsZ se reúne em um anel Z na membrana citoplasmática (Figura ( PageIndex <2> )). O anel Z é ancorado por proteínas de ligação a FtsZ e define o plano de divisão entre as duas células filhas. Proteínas adicionais necessárias para a divisão celular são adicionadas ao anel Z para formar uma estrutura chamada divisomo. O divisomo é ativado para produzir uma parede celular de peptidoglicano e construir um septo que divide as duas células filhas. As células filhas são separadas pelo septo de divisão, onde todas as camadas externas das células (a parede celular e as membranas externas, se houver) devem ser remodeladas para completar a divisão. Por exemplo, sabemos que enzimas específicas quebram ligações entre os monômeros em peptidoglicanos e permitem a adição de novas subunidades ao longo do septo de divisão.

Figura ( PageIndex <2> ): as proteínas FtsZ se reúnem para formar um anel Z que é ancorado à membrana plasmática. O anel Z aperta o envelope celular para separar o citoplasma das novas células.

Qual é o nome da proteína que se monta em um anel Z para iniciar a citocinese e a divisão celular?

Tempo de Geração

Em organismos eucarióticos, o tempo de geração é o tempo entre os mesmos pontos do ciclo de vida em duas gerações sucessivas. Por exemplo, o tempo de geração típico para a população humana é de 25 anos. Esta definição não é prática para bactérias, que podem se reproduzir rapidamente ou permanecer dormentes por milhares de anos. Em procariontes (Bactérias e Archaea), o tempo de geração também é chamado de tempo de duplicação e é definido como o tempo que leva para a população dobrar em uma rodada de fissão binária. Os tempos de duplicação bacteriana variam enormemente. Enquanto que Escherichia coli pode dobrar em apenas 20 minutos em condições ideais de crescimento em laboratório, bactérias da mesma espécie podem precisar de vários dias para dobrar em ambientes especialmente hostis. A maioria dos patógenos cresce rapidamente, como E. coli, mas há exceções. Por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, tem um tempo de geração entre 15 e 20 horas. Por outro lado, M. leprae, que causa a doença de Hansen & rsquos (lepra), cresce muito mais lentamente, com um tempo de duplicação de 14 dias.

CÁLCULO DO NÚMERO DE CÉLULAS

É possível prever o número de células em uma população quando elas se dividem por fissão binária a uma taxa constante. Por exemplo, considere o que acontece se uma única célula se dividir a cada 30 minutos por 24 horas. O diagrama na Figura ( PageIndex <3> ) mostra o aumento no número de células para as três primeiras gerações.

O número de células aumenta exponencialmente e pode ser expresso como 2 n , Onde n é o número de gerações. Se as células se dividissem a cada 30 minutos, após 24 horas, 48 ​​divisões teriam ocorrido. Se aplicarmos a fórmula 2 n , Onde n for igual a 48, a única célula daria origem a 2 48 ou 281.474.976.710.656 células em 48 gerações (24 horas). Ao lidar com números tão grandes, é mais prático usar notação científica. Portanto, expressamos o número de células como 2,8 e vezes 10 14 células.

Em nosso exemplo, usamos uma célula como o número inicial de células. Para qualquer número de células iniciais, a fórmula é adaptada da seguinte forma:

Nn é o número de células em qualquer geração n, N0 é o número inicial de células, e n é o número de gerações.

Figura ( PageIndex <3> ): A célula parental se divide e dá origem a duas células filhas. Cada uma das células-filhas, por sua vez, se divide, dando um total de quatro células na segunda geração e oito células na terceira geração. Cada divisão dobra o número de células.

Com um tempo de duplicação de 30 minutos e um tamanho de população inicial de 1 & vezes 10 5 células, quantas células estarão presentes após 2 horas, presumindo que não haja morte celular?

A Curva de Crescimento

Os microrganismos cultivados em cultura fechada (também conhecida como cultura descontínua), na qual nenhum nutriente é adicionado e a maioria dos resíduos não é removida, seguem um padrão de crescimento reproduzível conhecido como curva de crescimento. Um exemplo de cultura em lote na natureza é um tanque no qual um pequeno número de células cresce em um ambiente fechado. A densidade da cultura é definida como o número de células por unidade de volume. Em um ambiente fechado, a densidade da cultura também é uma medida do número de células na população. As infecções do corpo nem sempre seguem a curva de crescimento, mas podem existir correlações dependendo do local e do tipo de infecção. Quando o número de células vivas é plotado em função do tempo, fases distintas podem ser observadas na curva (Figura ( PageIndex <4> )).

Figura ( PageIndex <4> ): A curva de crescimento de uma cultura bacteriana é representada pelo logaritmo do número de células vivas representadas em função do tempo. O gráfico pode ser dividido em quatro fases de acordo com a inclinação, cada uma delas correspondendo aos eventos na célula. As quatro fases são lag, log, estacionário e morte.

A Fase Lag

O início da curva de crescimento representa um pequeno número de células, referido como um inóculo, que são adicionadas a um meio de cultura fresco, um caldo nutricional que apoia o crescimento. A fase inicial da curva de crescimento é chamada de fase de latência, durante a qual as células se preparam para a próxima fase de crescimento. O número de células não muda durante a fase de latência, entretanto, as células crescem e são metabolicamente ativas, sintetizando proteínas necessárias para crescer no meio. Se alguma célula foi danificada ou recebeu choque durante a transferência para o novo meio, o reparo ocorre durante a fase de latência. A duração da fase de latência é determinada por muitos fatores, incluindo a espécie e a composição genética das células, a composição do meio e o tamanho do inóculo original.

A fase de registro

Na fase de crescimento logarítmico (log), às vezes chamada de fase de crescimento exponencial, as células estão se dividindo ativamente por fissão binária e seu número aumenta exponencialmente. Para qualquer espécie bacteriana, o tempo de geração sob condições específicas de crescimento (nutrientes, temperatura, pH e assim por diante) é determinado geneticamente e esse tempo de geração é chamado de taxa de crescimento intrínseca. Durante a fase de log, a relação entre o tempo e o número de células não é linear, mas exponencial, no entanto, a curva de crescimento é frequentemente traçada em um gráfico semilogarítmico, como mostrado na Figura ( PageIndex <5> ), que dá a aparência de uma relação linear.

Figura ( PageIndex <5> ): Ambos os gráficos ilustram o crescimento da população durante a fase log para uma amostra bacteriana com uma população inicial de uma célula e um tempo de duplicação de 1 hora. (a) Quando plotado em uma escala aritmética, a taxa de crescimento se assemelha a uma curva. (b) Quando plotado em uma escala semilogarítmica (significando que os valores no eixo y são logarítmicos), a taxa de crescimento parece linear.

As células na fase logarítmica apresentam taxa de crescimento constante e atividade metabólica uniforme. Por esse motivo, as células na fase logarítmica são utilizadas preferencialmente para aplicações industriais e trabalhos de pesquisa. A fase log também é o estágio em que as bactérias são mais suscetíveis à ação de desinfetantes e antibióticos comuns que afetam a síntese de proteínas, DNA e parede celular.

Fase Estacionária

À medida que o número de células aumenta durante a fase logarítmica, vários fatores contribuem para a desaceleração da taxa de crescimento. Os produtos residuais se acumulam e os nutrientes são gradualmente consumidos. Além disso, a depleção gradual de oxigênio começa a limitar o crescimento aeróbio das células. Esta combinação de condições desfavoráveis ​​desacelera e, finalmente, paralisa o crescimento populacional. O número total de células vivas atinge um patamar conhecido como fase estacionária (Figura ( PageIndex <4> )). Nesta fase, o número de novas células criadas pela divisão celular é agora equivalente ao número de células morrendo, portanto, a população total de células vivas está relativamente estagnada. A densidade da cultura em uma cultura estacionária é constante. A capacidade de suporte da cultura, ou densidade máxima da cultura, depende dos tipos de microrganismos na cultura e das condições específicas da cultura, no entanto, a capacidade de suporte é constante para um determinado organismo cultivado nas mesmas condições.

Durante a fase estacionária, as células mudam para um modo de metabolismo de sobrevivência. À medida que o crescimento desacelera, também diminui a síntese de peptidoglicanos, proteínas e ácidos nucléicos, portanto, as culturas estacionárias são menos suscetíveis a antibióticos que interrompem esses processos. Em bactérias capazes de produzir endosporos, muitas células sofrem esporulação durante a fase estacionária. Metabólitos secundários, incluindo antibióticos, são sintetizados na fase estacionária. Em certas bactérias patogênicas, a fase estacionária também está associada à expressão de fatores de virulência, produtos que contribuem para a capacidade de um micróbio sobreviver, se reproduzir e causar doenças em um organismo hospedeiro. Por exemplo, quorum sensing em Staphylococcus aureus inicia a produção de enzimas que podem quebrar o tecido humano e os restos celulares, abrindo caminho para que as bactérias se espalhem para novos tecidos onde os nutrientes são mais abundantes.

A Fase da Morte

À medida que um meio de cultura acumula resíduos tóxicos e os nutrientes se esgotam, as células morrem em números cada vez maiores. Logo, o número de células morrendo excede o número de células em divisão, levando a uma diminuição exponencial no número de células (Figura ( PageIndex <4> )). Esta é a fase da morte apropriadamente chamada, às vezes chamada de fase de declínio. Muitas células lisam e liberam nutrientes no meio, permitindo que as células sobreviventes mantenham a viabilidade e formem endosporos. Algumas células, chamadas de persistentes, são caracterizadas por uma taxa metabólica lenta. As células persistentes são clinicamente importantes porque estão associadas a certas infecções crônicas, como a tuberculose, que não respondem ao tratamento com antibióticos.

Sustentando o crescimento microbiano

O padrão de crescimento mostrado na Figura ( PageIndex <4> ) ocorre em um ambiente fechado, os nutrientes não são adicionados e os resíduos e as células mortas não são removidos. Em muitos casos, porém, é vantajoso manter as células na fase logarítmica de crescimento. Um exemplo são as indústrias que colhem produtos microbianos. Um quimiostato (Figura ( PageIndex <6> )) é usado para manter uma cultura contínua na qual os nutrientes são fornecidos em uma taxa constante. Uma quantidade controlada de ar é misturada para processos aeróbicos. A suspensão bacteriana é removida na mesma taxa que os nutrientes fluem para manter um ambiente de crescimento ideal.

Figura ( PageIndex <6> ): Um quimiostato é um recipiente de cultura equipado com uma abertura para adicionar nutrientes (ração) e uma saída para remover conteúdo (efluente), diluindo efetivamente resíduos tóxicos e células mortas. A adição e remoção de fluidos são ajustadas para manter a cultura na fase logarítmica de crescimento. Se bactérias aeróbicas são cultivadas, níveis adequados de oxigênio são mantidos.

  1. Durante qual fase o crescimento ocorre com a taxa mais rápida?
  2. Cite dois fatores que limitam o crescimento microbiano.

Medição do crescimento bacteriano

Estimar o número de células bacterianas em uma amostra, conhecido como contagem bacteriana, é uma tarefa comum realizada por microbiologistas. O número de bactérias em uma amostra clínica serve como uma indicação da extensão de uma infecção. O controle de qualidade de água potável, alimentos, medicamentos e até cosméticos depende de estimativas de contagens de bactérias para detectar contaminação e prevenir a propagação de doenças. Duas abordagens principais são usadas para medir o número de células. Os métodos diretos envolvem a contagem de células, enquanto os métodos indiretos dependem da medição da presença ou atividade celular, sem realmente contar células individuais. Os métodos diretos e indiretos têm vantagens e desvantagens para aplicações específicas.

Contagem direta de células

A contagem direta de células refere-se à contagem de células em uma cultura líquida ou colônias em uma placa. É uma forma direta de estimar quantos organismos estão presentes em uma amostra. Vamos examinar primeiro um método simples e rápido que requer apenas uma lâmina especializada e um microscópio composto.

A maneira mais simples de contar bactérias é chamada de contagem microscópica direta de células, que envolve a transferência de um volume conhecido de uma cultura para uma lâmina calibrada e a contagem das células em um microscópio óptico. A lâmina calibrada é chamada de câmara Petroff-Hausser (Figura ( PageIndex <7> )) e é semelhante a um hemocitômetro usado para contar os glóbulos vermelhos. A área central da câmara de contagem é gravada em quadrados de vários tamanhos. Uma amostra da suspensão de cultura é adicionada à câmara sob uma lamela que é colocada a uma altura específica da superfície da grade. É possível estimar a concentração de células na amostra original contando células individuais em vários quadrados e determinando o volume da amostra observada. A área dos quadrados e a altura em que a lamela é posicionada são especificadas para a câmara. A concentração deve ser corrigida para diluição se a amostra foi diluída antes da contagem.

Figura ( PageIndex <7> ): (a) Uma câmara Petroff-Hausser é uma lâmina especial projetada para contar as células bacterianas em um volume medido de uma amostra. Uma grade é gravada no slide para facilitar a precisão na contagem. (b) Este diagrama ilustra a grade de uma câmara de Petroff-Hausser, que é composta de quadrados de áreas conhecidas. A visualização ampliada mostra o quadrado dentro do qual as bactérias (glóbulos vermelhos) são contadas. Se a lamela estiver 0,2 mm acima da grade e o quadrado tiver uma área de 0,04 mm 2, o volume será 0,008 mm 3 ou 0,000008 mL. Como existem 10 células dentro do quadrado, a densidade das bactérias é de 10 células / 0,000008 mL, o que equivale a 1.250.000 células / mL. (crédito a: modificação da obra de Jeffrey M. Vinocur)

As células em vários pequenos quadrados devem ser contadas e a média tomada para obter uma medição confiável. As vantagens da câmara são que o método é fácil de usar, relativamente rápido e barato. Por outro lado, a câmara de contagem não funciona bem com culturas diluídas porque pode não haver células suficientes para contar.

Usar uma câmara de contagem não produz necessariamente uma contagem precisa do número de células vivas porque nem sempre é possível distinguir entre células vivas, células mortas e detritos do mesmo tamanho sob o microscópio. No entanto, técnicas de coloração por fluorescência recentemente desenvolvidas tornam possível distinguir bactérias viáveis ​​e mortas. Essas manchas de viabilidade (ou manchas vivas) se ligam aos ácidos nucléicos, mas as manchas primárias e secundárias diferem em sua capacidade de atravessar a membrana citoplasmática. A mancha primária, com fluorescência verde, pode penetrar nas membranas citoplasmáticas intactas, manchando as células vivas e mortas. A mancha secundária, que fica com uma fluorescência vermelha, pode manchar uma célula apenas se a membrana citoplasmática estiver consideravelmente danificada. Assim, as células vivas apresentam fluorescência verde porque absorvem apenas a mancha verde, enquanto as células mortas parecem vermelhas porque a mancha vermelha desloca a mancha verde em seus ácidos nucléicos (Figura ( PageIndex <8> )).

Figura ( PageIndex <8> ): A coloração por fluorescência pode ser usada para diferenciar entre células bacterianas viáveis ​​e mortas em uma amostra para fins de contagem. As células viáveis ​​são coradas de verde, enquanto as células mortas são coradas de vermelho. (crédito: modificação da obra de Panseri S, Cunha C, D & rsquoAlessandro T, Sandri M, Giavaresi G, Maracci M, Hung CT, Tampieri A)

Outra técnica usa um dispositivo de contagem eletrônica de células (contador Coulter) para detectar e contar as mudanças na resistência elétrica em uma solução salina. Um tubo de vidro com uma pequena abertura é imerso em uma solução eletrolítica. Um primeiro eletrodo é suspenso no tubo de vidro. Um segundo eletrodo está localizado fora do tubo. Conforme as células são puxadas através da pequena abertura no tubo de vidro, elas mudam brevemente a resistência medida entre os dois eletrodos e a mudança é registrada por um sensor eletrônico (Figura ( PageIndex <9> )) cada mudança de resistência representa uma célula . O método é rápido e preciso dentro de uma faixa de concentrações, no entanto, se a cultura for muito concentrada, mais de uma célula pode passar pela abertura a qualquer momento e distorcer os resultados. Este método também não diferencia entre células vivas e mortas.

As contagens diretas fornecem uma estimativa do número total de células em uma amostra. No entanto, em muitas situações, é importante saber o número de células vivas ou viáveis. A contagem de células vivas é necessária ao avaliar a extensão de uma infecção, a eficácia de compostos e medicamentos antimicrobianos ou a contaminação de alimentos e água.

Figura ( PageIndex <9> ): Um contador Coulter é um dispositivo eletrônico que conta células. Ele mede a mudança na resistência em uma solução eletrolítica que ocorre quando uma célula passa por uma pequena abertura na parede interna do recipiente. Um detector conta automaticamente o número de células que passam pela abertura. (crédito b: modificação do trabalho pelo National Institutes of Health)

  1. Por que você contaria o número de células em mais de um quadrado na câmara de Petroff-Hausser para estimar o número de células?
  2. No método de coloração de viabilidade, por que as células mortas aparecem vermelhas?

Contagem em placas

A contagem de placa viável, ou simplesmente contagem de placa, é uma contagem de células viáveis ​​ou vivas. É baseado no princípio de que as células viáveis ​​se replicam e dão origem a colônias visíveis quando incubadas em condições adequadas para o espécime. Os resultados são geralmente expressos como unidades formadoras de colônia por mililitro (CFU / mL) em vez de células por mililitro, porque mais de uma célula pode ter pousado no mesmo local para dar origem a uma única colônia. Além disso, amostras de bactérias que crescem em grupos ou cadeias são difíceis de dispersar e uma única colônia pode representar várias células. Algumas células são descritas como viáveis, mas não cultiváveis ​​e não formarão colônias em meio sólido. Por todas essas razões, a contagem de placas viável é considerada uma estimativa baixa do número real de células vivas. Essas limitações não diminuem a utilidade do método, que fornece estimativas do número de bactérias vivas.

Microbiologistas normalmente contam placas com 30 e ndash300 colônias. Amostras com poucas colônias (& lt30) não fornecem números estatisticamente confiáveis ​​e placas superlotadas (& gt300 colônias) tornam difícil contar com precisão as colônias individuais. Além disso, contagens nesta faixa minimizam a ocorrência de mais de uma célula bacteriana formando uma única colônia. Assim, o UFC calculado está mais próximo do verdadeiro número de bactérias vivas na população.

Existem duas abordagens comuns para inocular placas para contagens viáveis: os métodos de placa de vazamento e placa de espalhamento. Embora o procedimento final de inoculação seja diferente entre esses dois métodos, ambos começam com uma diluição em série da cultura.

Diluição em Série

A diluição em série de uma cultura é um primeiro passo importante antes de prosseguir para o método de placa de vazamento ou placa de espalhamento. O objetivo do processo de diluição em série é obter placas com UFC na faixa de 30 e ndash300, e o processo geralmente envolve várias diluições em múltiplos de 10 para simplificar o cálculo. O número de diluições em série é escolhido de acordo com uma estimativa preliminar da densidade da cultura. A Figura ( PageIndex <10> ) ilustra o método de diluição serial.

Figura ( PageIndex <10> ): A diluição em série envolve a diluição de um volume fixo de células misturado com a solução de diluição usando a diluição anterior como inóculo. O resultado é a diluição da cultura original por um fator de crescimento exponencial. (crédito: modificação do trabalho de & ldquoLeberechtc & rdquo / Wikimedia Commons)

Um volume fixo da cultura original, 1,0 mL, é adicionado e completamente misturado com a solução do primeiro tubo de diluição, que contém 9,0 mL de caldo estéril. Esta etapa representa um fator de diluição de 10, ou 1:10, em comparação com a cultura original. Desta primeira diluição, o mesmo volume, 1,0 mL, é retirado e misturado com um tubo novo de 9,0 mL da solução de diluição. O fator de diluição é agora de 1: 100 em comparação com a cultura original. Este processo continua até que uma série de diluições seja produzida que irá ajustar a concentração de células desejada para uma contagem precisa. De cada tubo, uma amostra é semeada em meio sólido usando o método da placa de vazamento (Figura ( PageIndex <11> )) ou o método da placa de propagação (Figura ( PageIndex <12> )). As placas são incubadas até o aparecimento de colônias. Geralmente, são preparadas duas a três placas para cada diluição e o número de colônias contadas em cada placa é calculado. Em todos os casos, a mistura completa das amostras com o meio de diluição (para garantir que a distribuição das células no tubo seja aleatória) é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis.

Figura ( PageIndex <11> ): No método de contagem de células em placa de vazamento, a amostra é misturada em ágar líquido aquecido (45 & ndash50 & degC) derramado em uma placa de Petri estéril e posteriormente misturada por agitação. Este processo é repetido para cada diluição em série preparada. As colônias resultantes são contadas e fornecem uma estimativa do número de células no volume original amostrado.

O fator de diluição é usado para calcular o número de células na cultura de células original. Em nosso exemplo, uma média de 50 colônias foi contada nas placas obtidas na diluição 1: 10.000. Como apenas 0,1 mL de suspensão foi pipetado na placa, o multiplicador necessário para reconstituir a concentração original é 10 e vezes 10.000. O número de CFU por mL é igual a 50 e vezes 100 e vezes 10.000 = 5.000.000. O número de bactérias na cultura é estimado em 5 milhões de células / mL. A contagem de colônias obtida na diluição de 1: 1000 foi de 389, bem abaixo dos 500 esperados para uma diferença de 10 vezes nas diluições. Isso destaca a questão da imprecisão quando as contagens de colônias são maiores que 300 e mais de uma célula bacteriana cresce em uma única colônia.

Figura ( PageIndex <12> ): No método de contagem de células em placa espalhada, a amostra é vertida em ágar sólido e, em seguida, espalhada usando um espalhador estéril. Este processo é repetido para cada diluição em série preparada. As colônias resultantes são contadas e fornecem uma estimativa do número de células nas amostras de volume original.

Uma amostra muito diluída e água potável, por exemplo, pode não conter organismos suficientes para usar qualquer um dos métodos de contagem em placa descritos. Nesses casos, a amostra original deve ser concentrada em vez de diluída antes do plaqueamento. Isso pode ser feito usando uma modificação da técnica de contagem de placas, chamada de técnica de filtração por membrana. Volumes conhecidos são filtrados a vácuo assepticamente através de uma membrana com um tamanho de poro pequeno o suficiente para capturar microorganismos. A membrana é transferida para uma placa de Petri contendo um meio de crescimento apropriado. As colônias são contadas após a incubação. O cálculo da densidade celular é feito dividindo a contagem de células pelo volume de líquido filtrado.

Assista a este vídeo para demonstrações de diluições em série e técnicas de espalhamento de placas.

O número mais provável

O número de microrganismos em amostras diluídas é geralmente muito baixo para ser detectado pelos métodos de contagem em placa descritos até agora. Para essas amostras, os microbiologistas usam rotineiramente o método do número mais provável (NMP), um procedimento estatístico para estimar o número de microrganismos viáveis ​​em uma amostra. Freqüentemente usado para amostras de água e alimentos, o método MPN avalia o crescimento detectável observando mudanças na turbidez ou cor devido à atividade metabólica.

Uma aplicação típica do método MPN é a estimativa do número de coliformes em uma amostra de água de lagoa. Os coliformes são bactérias bastonetes gram-negativas que fermentam a lactose. A presença de coliformes na água é considerada um sinal de contaminação por matéria fecal. Para o método ilustrado na Figura ( PageIndex <13> ), uma série de três diluições da amostra de água é testada inoculando cinco tubos de caldo de lactose com 10 mL de amostra, cinco tubos de caldo de lactose com 1 mL de amostra e cinco tubos de caldo de lactose com 0,1 mL de amostra. Os tubos de caldo de lactose contêm um indicador de pH que muda de cor de vermelho para amarelo quando a lactose é fermentada. Após a inoculação e incubação, os tubos são examinados para uma indicação de crescimento de coliformes por uma mudança de cor no meio de vermelho para amarelo. O primeiro conjunto de tubos (amostra de 10 mL) apresentou crescimento em todos os tubos o segundo conjunto de tubos (1 mL) apresentou crescimento em dois tubos de cinco no terceiro conjunto de tubos, nenhum crescimento é observado em nenhum dos tubos (Diluição de 0,1 mL). Os números 5, 2 e 0 são comparados com a Figura B1 no Apêndice B, que foi construída usando um modelo de probabilidade do procedimento de amostragem. Da nossa leitura da tabela, concluímos que 49 é o número mais provável de bactérias por 100 mL de água do lago.

Figura ( PageIndex <13> ): No método de número mais provável, conjuntos de cinco tubos de caldo de lactose são inoculados com três volumes diferentes de água do tanque: 10 mL, 1 mL e 0,1 mL. O crescimento bacteriano é avaliado por meio de uma mudança na cor do caldo de vermelho para amarelo à medida que a lactose é fermentada.

  1. O que é uma unidade formadora de colônia?
  2. Quais são os dois métodos freqüentemente usados ​​para estimar o número de bactérias em amostras de água?

Contagens indiretas de células

Além dos métodos diretos de contagem de células, outros métodos, baseados na detecção indireta da densidade celular, são comumente usados ​​para estimar e comparar as densidades celulares em uma cultura. A abordagem mais importante é medir a turbidez (nebulosidade) de uma amostra de bactérias em uma suspensão líquida. O instrumento de laboratório usado para medir a turbidez é chamado de espectrofotômetro (Figura ( PageIndex <14> )). Em um espectrofotômetro, um feixe de luz é transmitido através de uma suspensão bacteriana, a luz que passa pela suspensão é medida por um detector e a quantidade de luz que passa pela amostra e chega ao detector é convertida em porcentagem de transmissão ou um valor logarítmico chamado absorbância (densidade óptica). Conforme o número de bactérias em uma suspensão aumenta, a turbidez também aumenta e faz com que menos luz chegue ao detector. A diminuição da luz que passa pela amostra e chega ao detector está associada a uma diminuição na porcentagem de transmissão e aumento da absorbância medida pelo espectrofotômetro.

Medir a turbidez é um método rápido para estimar a densidade celular, desde que haja células suficientes em uma amostra para produzir turbidez. É possível correlacionar as leituras de turbidez com o número real de células, realizando uma contagem de placa viável de amostras retiradas de culturas com uma gama de valores de absorbância. Usando esses valores, uma curva de calibração é gerada traçando a turbidez como uma função da densidade celular. Uma vez que a curva de calibração foi produzida, ela pode ser usada para estimar as contagens de células para todas as amostras obtidas ou cultivadas em condições semelhantes e com densidades dentro da faixa de valores usados ​​para construir a curva.

Figura ( PageIndex <14> ): (a) Um espectrofotômetro é comumente usado para medir a turbidez de uma suspensão de células bacterianas como uma medida indireta da densidade celular. (b) Um espectrofotômetro funciona dividindo a luz branca de uma fonte em um espectro. O espectrofotômetro permite a escolha do comprimento de onda da luz a ser usado para a medição. A densidade óptica (turbidez) da amostra dependerá do comprimento de onda, portanto, uma vez que um comprimento de onda é escolhido, ele deve ser usado de forma consistente. A luz filtrada passa pela amostra (ou um controle apenas com meio) e a intensidade da luz é medida por um detector. A luz que passa para uma suspensão de bactérias é espalhada pelas células de tal forma que uma fração dela nunca chega ao detector. Esse espalhamento acontece em um grau muito menor no tubo de controle apenas com o meio. (crédito a: modificação do trabalho de Hwang HS, Kim MS crédito b & ldquotest tube photos & rdquo: modificação do trabalho de Suzanne Wakim)

Medir o peso seco de uma amostra de cultura é outro método indireto de avaliar a densidade da cultura sem medir diretamente as contagens de células. A suspensão de células utilizada para a pesagem deve ser concentrada por filtração ou centrifugação, lavada e, em seguida, seca antes das medições. O grau de secagem deve ser padronizado para levar em conta o conteúdo de água residual. Este método é especialmente útil para microrganismos filamentosos, que são difíceis de enumerar por contagem direta ou viável em placas.

Como vimos, os métodos para estimar o número de células viáveis ​​podem ser trabalhosos e demorados porque as células precisam ser cultivadas. Recentemente, foram desenvolvidas formas indiretas de medir células vivas que são rápidas e fáceis de implementar. Esses métodos medem a atividade celular acompanhando a produção de produtos metabólicos ou o desaparecimento de reagentes. A formação de trifosfato de adenosina (ATP), a biossíntese de proteínas e ácidos nucléicos e o consumo de oxigênio podem ser monitorados para estimar o número de células.

  1. Qual é o propósito de uma curva de calibração ao estimar a contagem de células a partir de medições de turbidez?
  2. Quais são os métodos indiretos mais recentes de contagem de células vivas?

Padrões alternativos de divisão celular

A fissão binária é o padrão mais comum de divisão celular em procariotos, mas não é o único. Outros mecanismos geralmente envolvem divisão assimétrica (como no brotamento) ou produção de esporos em filamentos aéreos.

Em algumas cianobactérias, muitos nucleoides podem se acumular em uma célula redonda aumentada ou ao longo de um filamento, levando à geração de muitas células novas de uma só vez. As novas células geralmente se separam do filamento pai e flutuam em um processo denominado fragmentação (Figura ( PageIndex <15> )). A fragmentação é comumente observada nos Actinomicetos, um grupo de bactérias anaeróbias gram-positivas comumente encontradas no solo. Outro exemplo curioso de divisão celular em procariotos, que lembra nascidos vivos em animais, é exibido pela bactéria gigante Epulopiscium. Várias células-filhas crescem totalmente na célula-mãe, que eventualmente se desintegra, liberando as novas células para o ambiente. Outras espécies podem formar uma extensão longa e estreita em um pólo em um processo denominado brotamento. A ponta da extensão incha e forma uma célula menor, o botão que eventualmente se desprende da célula-mãe. O brotamento é mais comum em leveduras (Figura ( PageIndex <15> )), mas também é observado em bactérias de prótese e algumas cianobactérias.

Figura ( PageIndex <15> ): (a) Cianobactérias filamentosas, como as ilustradas aqui, replicam-se por fragmentação. (b) Nesta micrografia eletrônica, células da bactéria Gemmata obscuriglobus estão brotando. A célula maior é a célula-mãe. As etiquetas indicam os nucleoides (N) e o envelope nuclear ainda em formação (NE) da célula filha. (crédito a: modificação da obra de CSIRO crédito b: modificação da obra de Kuo-Chang Lee, Rick I Webb e John A Fuerst)

As bactérias do solo Actinomyces crescem em longos filamentos divididos por septos, semelhantes aos micélios vistos em fungos, resultando em células longas com múltiplos nucleoides. Sinais ambientais, provavelmente relacionados à baixa disponibilidade de nutrientes, levam à formação de filamentos aéreos. Dentro desses filamentos aéreos, células alongadas se dividem simultaneamente. As novas células, que contêm um único nucleóide, se desenvolvem em esporos que dão origem a novas colônias.

Identifique pelo menos uma diferença entre fragmentação e brotamento.

Biofilmes

Na natureza, os microrganismos crescem principalmente em biofilmes, ecossistemas complexos e dinâmicos que se formam em uma variedade de superfícies ambientais, de condutos industriais e dutos de tratamento de água a rochas em leitos de rios. Biofilmes não se restringem a substratos de superfície sólida, no entanto. Quase qualquer superfície em um ambiente líquido contendo alguns nutrientes mínimos acabará por desenvolver um biofilme. Esteiras microbianas que flutuam na água, por exemplo, são biofilmes que contêm grandes populações de microrganismos fotossintéticos. Biofilmes encontrados na boca humana podem conter centenas de espécies bacterianas. Independentemente do ambiente onde ocorrem, os biofilmes não são coleções aleatórias de microrganismos, mas sim comunidades altamente estruturadas que fornecem uma vantagem seletiva aos seus microrganismos constituintes.

Estrutura do Biofilme

As observações usando microscopia confocal mostraram que as condições ambientais influenciam a estrutura geral dos biofilmes. Biofilmes filamentosos chamados streamers se formam em água que flui rapidamente, como riachos de água doce, redemoinhos e células de fluxo de laboratório especialmente projetadas que replicam as condições de crescimento em fluidos de movimento rápido. Os streamers são ancorados ao substrato por um & ldquohead & rdquo e o & ldquotail & rdquo flutua rio abaixo na corrente. Em água parada ou lenta, os biofilmes assumem principalmente a forma de cogumelo. A estrutura dos biofilmes também pode mudar com outras condições ambientais, como a disponibilidade de nutrientes.

Observações detalhadas de biofilmes sob laser confocal e microscópios eletrônicos de varredura revelam aglomerados de microorganismos embutidos em uma matriz intercalada com canais de água abertos. A matriz extracelular consiste em substâncias poliméricas extracelulares (EPS) secretadas pelos organismos no biofilme. A matriz extracelular representa uma grande fração do biofilme, respondendo por 50% e 90% da massa seca total. As propriedades do EPS variam de acordo com os organismos residentes e as condições ambientais.

EPS é um gel hidratado composto principalmente de polissacarídeos e contendo outras macromoléculas, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos. Ele desempenha um papel fundamental na manutenção da integridade e função do biofilme. Os canais no EPS permitem a movimentação de nutrientes, resíduos e gases por todo o biofilme. Isso mantém as células hidratadas, evitando a dessecação. EPS também protege organismos no biofilme da predação por outros micróbios ou células (por exemplo, protozoários, glóbulos brancos no corpo humano).

Formação de Biofilme

As células microbianas de livre flutuação que vivem em um ambiente aquático são chamadas de células planctônicas. A formação de um biofilme envolve essencialmente a fixação de células planctônicas a um substrato, onde se tornam sésseis (aderidas a uma superfície). Isso ocorre em etapas, conforme ilustrado na Figura ( PageIndex <16> ). O primeiro estágio envolve a fixação de células planctônicas a uma superfície revestida com um filme condicionador de matéria orgânica. Nesse ponto, a fixação ao substrato é reversível, mas à medida que as células expressam novos fenótipos que facilitam a formação de EPS, elas passam de um estilo de vida planctônico para um séssil. O biofilme desenvolve estruturas características, incluindo uma matriz extensa e canais de água. Apêndices como fímbrias, pili e flagelos interagem com o EPS, e a microscopia e a análise genética sugerem que tais estruturas são necessárias para o estabelecimento de um biofilme maduro. No último estágio do ciclo de vida do biofilme, as células na periferia do biofilme revertem para um estilo de vida planctônico, desprendendo o biofilme maduro para colonizar novos locais. Este estágio é conhecido como dispersão.

Figura ( PageIndex <16> ): Estágios na formação e ciclo de vida de um biofilme. (crédito: modificação do trabalho por Public Library of Science e American Society for Microbiology)

Dentro de um biofilme, diferentes espécies de microrganismos estabelecem colaborações metabólicas nas quais o produto residual de um organismo se torna o nutriente para outro. Por exemplo, microrganismos aeróbios consomem oxigênio, criando regiões anaeróbicas que promovem o crescimento de anaeróbios. Isso ocorre em muitas infecções polimicrobianas que envolvem patógenos aeróbios e anaeróbios.

O mecanismo pelo qual as células em um biofilme coordenam suas atividades em resposta a estímulos ambientais é denominado quorum sensing. O sensor de quorum & mdash que pode ocorrer entre células de diferentes espécies dentro de um biofilme & mdashenables microorganismos para detectar sua densidade celular através da liberação e ligação de pequenas moléculas difusíveis chamadas autoindutores. Quando a população de células atinge um limite crítico (um quorum), esses autoindutores iniciam uma cascata de reações que ativam genes associados a funções celulares que são benéficas apenas quando a população atinge uma densidade crítica. Por exemplo, em alguns patógenos, a síntese de fatores de virulência só começa quando células suficientes estão presentes para dominar as defesas imunológicas do hospedeiro. Embora principalmente estudado em populações bacterianas, o quorum sensing ocorre entre bactérias e eucariotos e entre células eucariotas, como o fungo Candida albicans, um membro comum da microbiota humana que pode causar infecções em indivíduos imunocomprometidos.

As moléculas de sinalização no sensor de quorum pertencem a duas classes principais. As bactérias Gram-negativas se comunicam principalmente usando lactonas de homoserina N-aciladas, enquanto as bactérias Gram-positivas usam principalmente pequenos peptídeos (Figura ( PageIndex <17> )). Em todos os casos, a primeira etapa na detecção de quorum consiste na ligação do autoindutor ao seu receptor específico somente quando um limiar de concentração de moléculas sinalizadoras é atingido. Uma vez que a ligação ao receptor ocorre, uma cascata de eventos de sinalização leva a mudanças na expressão do gene. O resultado é a ativação de respostas biológicas ligadas ao quorum sensing, notadamente um aumento na produção das próprias moléculas sinalizadoras, daí o termo autoindutor.

Figura ( PageIndex <17> ): Peptídeos curtos em bactérias gram-positivas e homoserina lactonas N-acetiladas em bactérias gram-negativas agem como autoindutores no quorum sensing e medeiam a resposta coordenada das células bacterianas. A cadeia lateral R da homoserina lactona N-acetilada é específica para as espécies de bactérias gram-negativas. Algumas lactonas homosserinas secretadas são reconhecidas por mais de uma espécie.

Biofilmes e saúde humana

O corpo humano abriga muitos tipos de biofilmes, alguns benéficos e outros prejudiciais. Por exemplo, as camadas de microbiota normal que revestem a mucosa intestinal e respiratória desempenham um papel na prevenção de infecções por patógenos. No entanto, outros biofilmes no corpo podem ter um efeito prejudicial à saúde. Por exemplo, a placa que se forma nos dentes é um biofilme que pode contribuir para doenças dentais e periodontais. Biofilmes também podem se formar em feridas, às vezes causando infecções graves que podem se espalhar. A bactéria Pseudomonas aeruginosa frequentemente coloniza biofilmes nas vias aéreas de pacientes com fibrose cística, causando infecções crônicas e às vezes fatais dos pulmões. Biofilmes também podem se formar em dispositivos médicos usados ​​dentro ou sobre o corpo, causando infecções em pacientes com cateteres internos, articulações artificiais ou lentes de contato.

Patógenos embutidos em biofilmes exibem maior resistência a antibióticos do que seus homólogos flutuantes. Várias hipóteses foram propostas para explicar o porquê. As células nas camadas profundas de um biofilme são metabolicamente inativas e podem ser menos suscetíveis à ação de antibióticos que interrompem as atividades metabólicas. O EPS também pode retardar a difusão de antibióticos e anti-sépticos, impedindo-os de atingir as células nas camadas mais profundas do biofilme. Alterações fenotípicas também podem contribuir para o aumento da resistência exibida por células bacterianas em biofilmes. Por exemplo, o aumento da produção de bombas de efluxo, proteínas embutidas na membrana que expelem ativamente os antibióticos para fora das células bacterianas, demonstrou ser um importante mecanismo de resistência aos antibióticos entre as bactérias associadas ao biofilme. Finalmente, os biofilmes fornecem um ambiente ideal para a troca de DNA extracromossômico, que geralmente inclui genes que conferem resistência a antibióticos.

  1. De que é composta a matriz de um biofilme?
  2. Qual é o papel do quorum sensing em um biofilme?

Introdução

Experimentos abrangentes e bem replicados são fundamentais para a ciência rigorosa, mas os humanos só podem realizar um determinado número de ações simultaneamente. Uma solução possível é a automação, que tem sido amplamente implementada em biotecnologia (Sparkes et al, Appleton 2010 et al, 2017 Freemont, 2019) para facilitar as tarefas de rotina envolvidas no sequenciamento de DNA (Meldrum, 2000), síntese química (Ley et al, 2015), descoberta de drogas (Schneider, 2018) e biologia molecular (Smanski et al, 2014). Em princípio, robôs programáveis ​​de forma flexível podem permitir diversos experimentos que requerem condições e replicar números além das capacidades dos pesquisadores humanos em uma variedade de disciplinas (Vasilev et al, 2011 Hans et al, 2018 Keller et al, 2019). No entanto, o software existente para robôs de manipulação de líquidos & # x02010 concentra-se estreitamente na automação de protocolos projetados para pipetas manuais, enquanto linguagens de fundição como Antha e laboratórios remotos como Emerald Cloud se concentram em automatizar fluxos de trabalho em vez de expandir os limites experimentais. Como tal, mesmo laboratórios com infraestruturas de alta & # x02010 throughput bem & # x02010 estabelecidas lutam para utilizar todo o potencial de seus robôs, impedindo muitos experimentos complexos que requerem programação flexível (Appleton et al, 2017).

A bioautomação fica para trás no campo de avanço da manufatura, onde se espera que os robôs sejam flexíveis, responsivos a novas situações e interativos com humanos ou sistemas de gerenciamento remoto quando surgem situações ambíguas ou erros (Appleton et al, 2017). Uma limitação importante é a falta de um ecossistema de software abrangente, adequadamente abstrato e acessível (B & # x000e4r et al, 2012 Linshiz et al, 2014 Walsh et al, 2019). Embora a bioinformática esteja cada vez mais aberta & # x02010 com recursos (Cavalheiro et al, 2004 galo et al, 2009), a bioautomação demorou a adotar práticas-chave, como modularidade, controle de versão e programação assíncrona. Para permitir a experimentação flexível de alto & # x02010 throughput, desenvolvemos o Pyhamilton, um pacote Python que facilita operações de alto & # x02010 throughput dentro do laboratório, com protocolos que podem ser facilmente compartilhados e modificados. Além disso, o Pyhamilton permite que robôs de manuseio de líquidos executem métodos anteriormente inimagináveis ​​e cada vez mais impressionantes. Com este pacote, os usuários podem executar simulações de robôs para solucionar problemas e planejar experimentos, agendar processos experimentais, implementar tratamento de erros para solução de problemas rápida e facilmente integrar robôs com equipamentos externos.


Protocolo

1. Preparação de substratos de placa de ensaio multifenótipo (MAP), meio basal, meio de pré-crescimento e tampão

Faça 50 ml de estoques de substrato de 1,0 - 1,25%.

Dissolva 1,0-1,25% (p / v) de substrato sólido em água estéril (aqueça se necessário). Filtrar e esterilizar as soluções com uma unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m e armazenar os estoques em temperatura ambiente. Exemplos de substratos usados ​​nestes experimentos são fornecidos em mesa 2.

Faça 250 ml de meio basal 3x para todas as classes de substrato (carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo). O meio basal 22 à base de MOPS (3-morfolinopropano-1-sulfonato) contém o seguinte: 1x MOPS (MOPS 40 mM + Tricina 10 mM), glicerol * 0,4%, NH 9,5 mM4Cl *, NaSO 0,25 mM4*, MgSO 1,0 mM4*, 1,32 mM K2HPO4*, KCl 10 mM, 0,5 & # x000b5M CaCl2, NaCl 5 mM, FeCl 6 & # x000b5M3, e 0,1% (w / v) L-arabinose ** (Tabelas 1 e 2) Nota: * Esses compostos não estão incluídos dependendo do meio basal. Por exemplo, 0,4% de glicerol não é usado no meio basal de carbono e no meio basal de enxofre 1,0 mM MgSO4 é substituído por 1,0 mM de MgCl2. ** L-arabinose é específica para indução do vetor promotor pBAD, pEMB11, que foi transformado em um ara - E. coli Cepa K-12 (BW 27784) 23.

Adicione cada componente da mídia basal a um frasco estéril e traga a solução ao volume. Misture bem. Com uma unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m, filtrar e esterilizar cada meio basal em um frasco estéril.

Faça 500 ml de meio de pré-crescimento MOPS. O meio de pré-crescimento com base em MOPS 22 contém o seguinte: 1x MOPS (MOPS 40 mM + Tricina 10 mM), 0,4% de glicerol, NH 9,5 mM4Cl, NaSO 0,25 mM4, MgSO 1,0 mM4, 1,32 mM K2HPO4, KCl 10 mM, 0,5 & # x000b5M CaCl2, NaCl 5 mM e FeCl 6 & # x000b5M3.

Adicione cada componente do meio de pré-crescimento a um frasco estéril e leve ao volume. Filtrar e esterilizar com uma unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m e, em seguida, adicionar ampicilina a uma concentração final de 100 & # x000b5g / ml. Solução de loja a 4 & # x000b0C.

Faça 500 ml de placas de ágar Luria-Bertani (LB) 0,5x. Em um frasco estéril, adicione os componentes LB para fazer uma concentração de 0,5x (1,25 g de extrato de levedura, 2,5 g de NaCl, 2,5 g de triptona, 7,5 g de ágar). Misture bem e autoclave para esterilizar.

Resfrie o ágar e, em seguida, adicione 100 & # x000b5g / ml de antibiótico ampicilina com mistura. Derramar

25 ml de ágar em placas de Petri, deixe endurecer e armazenar a 4 & # x000b0C até que seja necessário.

Faça 250 ml de Tris 10 mM (pH 7,4) mais MgSO 10 mM4 solução de buffer. Filtrar e esterilizar com uma unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m e armazenar a solução em temperatura ambiente.

2. Preparação de suspensão de células bacterianas

Prepare colônias frescas. De um estoque congelado de glicerol a 12,5%, placa fresca E. coli clones em 0,5x LB agar contendo 100 & # x000b5g / ml de ampicilina. Incubar a 37 & # x000b0C por 24 horas.

Pipete 3 ml de meio de pré-crescimento contendo 100 & # x000b5g / ml de ampicilina para tubos de cultura. Para cada clone, use triplicados biológicos.

Inocular as colônias independentes da seção 2.1 em tubos de cultura preparados. Incubar a 37 & # x000b0C com agitação por 22 horas.

Pellet e lavar as células bacterianas:

Transfira as culturas O / N para tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Pellet células por centrifugação em velocidade máxima (16.900 x g) por 2 min em uma microcentrífuga. Decantar o sobrenadante e lavar as células por ressuspensão em 500 & # x000b5l de Tris 10 mM / MgSO 10 mM4 amortecedor. Repetir.

Re-sedimentar as células, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de Tris 10 mM / MgSO 10 mM4 amortecedor.

Meça a densidade celular e concentre as células (se necessário):

Diluir as células da seção 2.3.3 10 vezes no Tris 10 mM / MgSO 10 mM4 tampão e transferir esta diluição para uma cubeta. Medir a densidade óptica (OD600 nm) desta diluição e registro.

Concentre as células para atingir a concentração final de 0,07 (OD600 nm) nos MAPs (as células serão diluídas 15 vezes quando forem adicionadas aos MAPs, portanto, as células precisam estar em uma concentração inicial de OD600 nm = 1,05). Transfira a suspensão de células concentradas para um reservatório e guarde (na temperatura ambiente) até a etapa 3.5 da preparação dos MAPs.

3. Preparação de placas de ensaio multifenótipo (MAPs)

Rotular MAPs. Rotular placas de microtitulação de 96 poços estéreis com um E. coli número de identificação do clone e tipo de esquema MAP.

Alíquota de água estéril em MAPs. Transfira assepticamente água estéril para um reservatório de líquido. Pipete 60 & # x000b5l em cada poço da placa de microtitulação usando uma pipeta multicanal.

Alíquota da mídia basal em MAPs. Transfira assepticamente 3x a mídia basal para um reservatório de líquido. Pipete 50 & # x000b5l em cada poço da placa de microtitulação usando uma pipeta multicanal. Repita as etapas 3.2 e 3.3 para cada meio basal usado no esquema de MAP.

Alíquotas de substratos em MAPs. Transfira 30 & # x000b5l de cada substrato para o poço apropriado dos MAPs.

Adicione suspensão bacteriana aos MAPs. Transferir 10 & # x000b5l de células bacterianas da seção 2.4.2 para cada poço do MAP usando uma pipeta multicanal. Troque as pontas antes de reintroduzir a pipeta no estoque de cultura.

Cubra os MAPs com filme adesivo. Cubra cada placa com um único filme de placa adesiva. Pressione firmemente o filme sobre as cavidades da placa e ao longo das bordas para criar uma vedação uniforme e firme. Remova o excesso de filme das bordas da placa de microtitulação com uma lâmina de barbear estéril.

Meça a densidade óptica de MAPs:

Coloque os MAPs preparados na manga & # x0201cInput & # x0201d de um leitor de placa espectrofotômetro de múltiplas placas. Abra o software do leitor de placas e crie um protocolo que mede a absorbância (OD600 nm) a cada 30 minutos, por um total de 32 horas, com 60 segundos de agitação entre as leituras.

Defina a temperatura no aparelho para 37 & # x000b0C. Inicie o protocolo assim que os MAPs estiverem equilibrados para definir a temperatura.

Após 32 horas, remova os MAPs da manga & # x0201cOutput & # x0201d do leitor de placas. Rotule cada arquivo de texto de dados para incluir: o E. coli número de identificação do clone, data em que o MAP foi executado e o tipo de esquema do MAP.

4. Processamento e Parametrização de Placas de Ensaio Multifenótipo (MAPs)

Avalie as curvas de crescimento usando um processo de controle de qualidade automatizado, por exemplo., PMAnalyzer 24.

Verifique se as curvas de crescimento têm OD600 nm & # x0003c 0,20 nas primeiras 2 horas. Não use absorbância no ponto de tempo inicial (t0) no filtro devido a artefatos de condensação, que normalmente se resolvem em t1 (30 minutos).

Remova as curvas de crescimento que violam o filtro QA. Salve as informações da curva (nome da amostra, número do poço e OD600 nm valores) em um arquivo de saída separado para referência futura. Continue com a análise se a curva de crescimento passar no filtro QA.

Calcule as curvas de crescimento medianas. Usando dados replicados, por poço, calcule a curva de crescimento mediana tomando a densidade óptica mediana (OD600 nm) valor em cada momento. Registre as curvas de crescimento médio resultantes em um arquivo de saída separado para uso futuro.

Calcule o modelo logístico de melhor ajuste para cada curva de crescimento usando uma adaptação da equação proposta por Zwietering 25. A equação logística inclui três parâmetros que descrevem o crescimento bacteriano: o tempo de latência, & # x003bb (hr), a taxa máxima de crescimento, & # x000b5max (OD600 nm 100 -1), e o rendimento final de biomassa, & # x003b1 (OD600 nm) Usar dados no tempo = 30 min (y1) como o valor inicial devido a artefatos de condensação.

Calcule a taxa máxima de crescimento usando uma pesquisa direta. Registre a maior taxa de alteração em um intervalo de 90 minutos dentro dos dados. & # x0200b

Estime o rendimento final de biomassa procurando o valor assintótico superior da maior média móvel ao longo de uma janela de 90 min. Especificamente, defina como a assíntota da curva de crescimento.

Usando o & # x000b5max e valores A de 4.3.1 e 4.3.2, encontre o valor & # x003bb tentando todos os valores & # x003bb:

Use cada valor & # x003bb para calcular a soma do erro quadrático (SSE). Use o SSE mais baixo é o SSE (& # x003bbS):

5. Análise de fenótipo de MAPs

Calcule o nível de crescimento (GL) para cada curva de crescimento para avaliar o crescimento geral por clone por substrato. Defina GL como a média harmônica dos valores ajustados logísticos deslocados:

Atribua um fenótipo a cada curva de crescimento com base nos valores de GL. Aqui, os quatro fenótipos usados ​​são: crescimento esperado, nenhum crescimento, ganho de função e perda de função.

Determine os fenótipos comparando o crescimento em todos os clones em um substrato específico em termos de desvios padrão da média. Use esta estatística e um limite mínimo de crescimento para designar o fenótipo apresentado pela curva de crescimento (Figura 1A, B). Figura 1C fornece exemplos de atribuição de fenótipo.

Defina o crescimento como GL & # x02265 0,4 (Figura 1A, B) Definir ganho de função (Figura 1C, verde) como tendo um GL & # x0003e dois desvios padrão acima da média e uma média & # x0003e o limite de crescimento. Perda de função (Figura 1C, vermelho) é definido como tendo um GL & # x0003c dois desvios padrão abaixo da média e uma média & # x0003e o limite de crescimento.

Crie representações visuais do conjunto de dados com base em fenótipos e curvas de crescimento.

Veja a dinâmica de crescimento retratando o OD600 nm valores como cor para comparar rapidamente as curvas de crescimento entre vários clones (Figura 2).

Veja as distribuições fenotípicas entre todos os clones com base nas condições de crescimento (Figura 3).

6. Construindo o Aparelho de Cultura Contínua

Construção da porta do reator (Figura 4A, B)Faça três furos de 1/4 pol., Espaçados de 3/4 pol. Entre eles, na tampa do reator de cultura contínua.

Para porta & # x003b1: aparafuse um suporte de painel tipo rosca luer fêmea em uma farpa de 1/16 pol. Da parte inferior da tampa com a farpa apontando para cima, para fora da tampa. Fixe a ponta com uma contraporca de 1/4 pol. Para montagem em painel.

Para porta & # x003b2: aparafuse uma montagem em painel tipo rosca luer fêmea em uma farpa de 1/16 pol. Com a farpa apontando para cima, para fora da tampa. Fixe a ponta com uma contraporca de 1/4 pol. Para montagem em painel.

Para porta & # x003b3: aparafuse uma montagem em painel tipo rosca luer fêmea em uma farpa de 1/16 pol. Da parte inferior da tampa de forma que a farpa fique apontando para cima, para fora da tampa. Fixe a barbela com a porca de bloqueio de montagem em painel de 1/4 pol. Parafuse um luer macho com anel de travamento integral em uma mangueira de diâmetro interno de 1/8 pol. No encaixe espigão na parte interna da tampa.

Para a porta de saída: faça um orifício de 5/16 pol. Na marca de 75 ml do reator de cultura contínua. Corte 3/4 pol. Da extremidade da porca do encaixe farpado da antepara de 1/4 pol. Aparafuse o encaixe da antepara farpado de 1/4 pol. (A gaxeta está do lado de fora da garrafa e a porca está do lado de dentro, Figura 4B).

Construção de porta de mamadeira (Figura 4C) Faça dois orifícios de 1/4 pol. Espaçados de 1 pol. Na tampa do biberão.

Para a porta & # x003b4: aparafuse uma montagem em painel tipo rosca luer fêmea em uma farpa de 1/8 pol. Com a farpa apontando para cima, para fora da tampa. Fixe a ponta com uma contraporca de 1/4 pol. Para montagem em painel.

Para a porta & # x003b5: aparafuse uma montagem em painel tipo rosca luer fêmea em uma farpa de 1/16 pol. Com a farpa apontando para cima, para fora da tampa. Fixe a ponta com uma contraporca de 1/4 pol. Para montagem em painel.

Parafuse um luer macho com anel de travamento integral na mangueira de diâmetro interno de 1/8 pol. Ao encaixe espigão, na parte interna da tampa.

Tubos de alimentação e extensões de tubos:

Corte dois pedaços de tubo de 1 pol. (Diâmetro externo (OD) de 1/8 pol. X diâmetro interno (ID) de 1/16 pol.). Coloque as peças nas portas & # x003b1 e & # x003b3 do reator de cultura contínua feito na seção 5.2.

Corte um único pedaço de tubo de 1 pol. (1/4 pol. OD x 1/8 pol. ID). Coloque a peça na porta & # x00392 do reator de cultura contínua.

Corte um único pedaço de tubo de 3,5 pol. (1/8 pol. OD x 1/16 pol. ID). Encaixe esta peça no interior da porta & # x003b3, no luer macho com anel de travamento integral para mangueira de diâmetro largo de 1/8 pol. A porta & # x003b3 é a porta de amostragem do reator de cultura contínua.

Corte um único pedaço de tubo de 1 pol. (1/4 pol. OD x 1/8 pol. ID). Encaixe esta peça na porta & # x003b4 do biberão.

Corte um único pedaço de tubo de 11 pol. (1/16 pol. OD x 1/8 pol. ID). Encaixe esta peça na parte interna da porta & # x003b5 da mamadeira, no luer macho com anel de travamento integral para mangueira de diâmetro largo de 1/8 pol.

Corte dois pedaços de tubo de 18 pol. (1/8 pol. OD x 1/16 pol. ID). Encaixe uma peça na porta & # x003b5 do biberão. Salve a outra peça para a seção 7.

7. Executando Culturas Contínuas para Metabolômica

Autoclave os materiais secos por 30 min. Certifique-se de embrulhar a tampa do biberão feita na secção 5 em folha de alumínio. Mantenha o tubo conectado reto.

Envolva a tampa do reator de cultura contínua, feita na seção 5, em folha de alumínio. Mantenha o tubo conectado reto. Enrole a tubulação de 18 pol. Cortada na seção 6.3.5 e o menor adaptador de tubulação da bomba peristáltica em folha de alumínio. Mantenha a tubulação reta. Autoclave por 30 min.

Faça 2 L de caldo LB 0,5x. Na mamadeira, faça 0,5x LB de caldo. Cubra o biberão com papel alumínio. Autoclave por 1 hora.

Faça 70 ml de caldo LB 0,5x. Despeje o caldo no reator de cultura contínua. Coloque uma barra de agitação no reator de cultura contínua. Cubra o reator com papel alumínio e autoclave por 30 min.

De um estoque congelado de glicerol a 12,5%, placa fresca E. coli clones em 0,5x LB agar contendo 100 & # x000b5g / ml de ampicilina. Incubar a 37 & # x000b0C por 24 horas.

Inocular uma única colônia em 3 ml de caldo LB 0,5x contendo 100 & # x000b5g / ml de ampicilina. Para cada clone, use triplicados biológicos. Incubar a 37 & # x000b0C com agitação por 22 horas.

Conecte as partes.

Coloque todos os materiais autoclavados em um gabinete de segurança biológica e acenda a luz ultravioleta enquanto a mídia esfria. Assim que a mídia esfriar, adicione 0,1% de L-arabinose e 100 & # x000b5g / ml de ampicilina a todo o caldo LB 0,5x.

Desembrulhe a tampa do reator de cultura contínua e rosqueie no reator. Evite tocar no tubo de amostragem. Abra a tampa do biberão e enrosque-a no biberão. Evite tocar no tubo de amostragem.

Mantenha o tubo de 18 pol. Conectado à porta & # x003b5 estéril. Desembrulhe a tubulação de 18 pol. E o adaptador da tubulação da bomba peristáltica.

Encaixe uma extremidade livre da tubulação de 18 pol. Em uma extremidade do adaptador da tubulação da bomba peristáltica. Encaixe a outra extremidade do adaptador da tubulação da bomba peristáltica na tubulação de 18 pol. Conectada à porta & # x003b5 da tampa do biberão.

Aparafuse unidades de filtro de 0,22 & # x000b5m nas portas & # x003b2 e & # x003b4 do reator de cultura contínua. Aparafuse uma unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m no adaptador da porta & # x003b1. Para a unidade de filtro de 0,22 & # x000b5m, encaixe a extremidade livre do tubo de 18 pol.

Comece a cultura contínua.

Na capela de biossegurança, inocule o reator de cultura contínua com 100 & # x000b5l de cultura O / N feita na seção 7.2.1.1.

Feche o sistema antes de mover a cultura contínua para uma incubadora 37 & # x000b0C. Na incubadora, tem uma placa de agitação magnética e uma mini bomba peristáltica configurada.

Encaixe o adaptador de tubulação da bomba peristáltica na bomba peristáltica. O tubo do biberão começa no lado & # x0201cIn & # x0201d e o tubo que conduz ao reator começa no lado & # x0201cOut & # x0201d.

Defina a bomba peristáltica para: & # x0201cFAST & # x0201d. Inicie a bomba peristáltica mudando para & # x0201cFORWARD & # x0201d. Verifique se a mídia começa a fluir pela tubulação.

Coloque o reator na placa de agitação magnética e comece a misturar. O reator de cultura contínua deve se equilibrar por 24 horas antes da amostragem.

Amostragem da cultura contínua. Enrosque uma seringa luer lok de 5 ml na porta & # x003b3 e retire 4,5 ml de cultura.

Use 500 & # x000b5l da cultura para medir a densidade (OD600 nm) Diluir as células para fazer culturas de 4 x 1 ml em OD600 nm = 0.35.

Alíquotas de culturas diluídas em tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Repita a amostragem a cada 12 horas por 4 dias.

Prepare amostras para GC-TOFMS:

Pellet células por centrifugação em velocidade máxima (16.900 x g) por 2 min. Decantar o sobrenadante. Lave as células com 500 & # x000b5l de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Repita esta etapa.

Decantar o sobrenadante uma última vez e, em seguida, submergir os tubos de microcentrífuga com células peletizadas em nitrogênio líquido até que pare de borbulhar. Armazene as amostras em freezer -80 & # x000b0C.

8. Execução de culturas em lote de passagem em série para metabolômica

Preparando a suspensão de células bacterianas. De um estoque congelado de glicerol a 12,5%, placa fresca E. coli clones em 0,5x LB agar contendo 100 & # x000b5g / mlampicilina. Incubar a 37 & # x000b0C por 24 horas.

Inocular as colônias individuais em 3 ml de caldo LB 0,5x contendo 100 & # x000b5g / mlampicilina. Use triplicados biológicos para cada clone.

Culturas em lote de passagem em série.

Subcultura O / N de 8.1.1 por meio de uma diluição de 500 vezes em 3 ml de caldo LB contendo 50 & # x000b5g / ml de ampicilina e 0,1% de L-arabinose. A subcultura deve ter um OD600 nm & # x0003c 0,005. Incubar a 37 & # x000b0C com agitação.

Verifique a densidade óptica (OD600 nm) às 2 e 2,5 horas. Cultive células para atingir OD600 nm = 0.35.

Subcultura por meio de uma diluição de 500 vezes em 3 ml de caldo LB contendo 50 & # x000b5g / ml de ampicilina e 0,1% de L-arabinose. A subcultura deve ter um OD600 nm & # x0003c 0,005.

Verifique a densidade óptica (OD600 nm) às 2 e 2,5 horas. Faça crescer as células para atingir a DO600 nm = 0.35.

Amostragem de culturas em lote de passagem em série.

Usando uma pinça estéril, coloque um filtro de membrana de 0,22 & # x000b5m no topo de um coletor de filtro. Alíquota de 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no papel de filtro e, em seguida, ligue a bomba de vácuo.

Repita a adição de 1 ml de PBS. Transfira 1 ml da subcultura da seção 8.2.3 para o papel de filtro. A partir daqui, mova-se rapidamente para colocar as amostras em nitrogênio líquido imediatamente. Conclua em 1 min.

Alíquota de 1 ml de PBS em papel de filtro para lavar a amostra. Lave rapidamente sem derramar a amostra nas laterais do papel de filtro. Repetir.

Usando uma pinça esterilizada, coloque o filtro em um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, dobrando cuidadosamente o filtro. Mergulhe o tubo de microcentrífuga em nitrogênio líquido até que pare de borbulhar. Armazene a amostra em um freezer -80 & # x000b0C.

9. Análise de metabólitos e # x00026 Processamento

Envie 3 amostras por clone em gelo seco para uma instalação central de metabolômica para processamento de amostra, análise e normalização de GC-TOFMS.

Para cada amostra, determine a média, a mediana, o desvio padrão e o coeficiente de variação entre os metabólitos, usando dados replicados.

Para análise estatística, codifique manualmente um pipeline de QA usando declarações condicionais e execuções repetitivas 26 para remover metabólitos que não seguem as condições definidas.

Para a Condição 1, remova os metabólitos nos quais mais de 2 amostras têm abundância zero. Remova os padrões internos dos perfis metabolômicos.

Para a condição 2, remova os metabólitos que não são encontrados nas células de interesse. Aqui, remova os seguintes metabólitos: acetato de indol 3, ácido diidroabiético, ácido nonadecanóico, ácido salicílico, salicilaldeído, colesterol, fenol, 1-monoestearina, octadecanol, 1-monopalmitina, dodecano, dodecanol, 1-hexadecanol, 5-metoxitriptamina, 5-metoxitriptamina , ácido pentadecanóico, ácido fosfórico, ácido pelargônico, ácido palmítico, ácido cáprico, hidroxilamina, ácido esteárico, ácido mirístico, maleimida, levoglucosano e ácido 4-hidroxibutírico.

Para a Condição 3, remova os metabólitos cujo coeficiente de variação é maior que 1.

Capture os efeitos da metabolômica global observando as abundâncias relativas dos metabólitos.

Crie uma representação visual da abundância média de metabólito por clone para cada metabólito (Figura 6).

Identifique valores discrepantes observando as frequências de pares clone-metabólito.

Calcule a pontuação Z para cada valor médio de cada metabólito em um clone. Calcule os escores z usando a seguinte equação:

[7] & # x0200bNota: Termo XMC representa o nível de abundância de um metabólito específico para um clone específico. Termo & # x000b5C representa a média de todos os clones de um metabólito específico. Termo & # x003c3C é o desvio padrão associado.

Crie uma representação visual dos dados em que os outliers são destacados (dados não fornecidos).


Conteúdo

Lei de Bouguer-Lambert Editar

As raízes do termo absorbância estão no lei de Bouguer (Lei Bouguer-Lambert). Conforme a luz se move através de uma mídia, ela se torna mais fraca à medida que está sendo "extinta". Bouguer reconheceu que essa extinção (agora frequentemente chamada de atenuação) não era linear com a distância percorrida pelo meio, mas relacionada pelo que agora chamamos de função exponencial. Se I 0 < displaystyle I_ <0>> é a intensidade da luz no início da viagem e I s < displaystyle I_> é a intensidade da luz detectada após o percurso de uma distância d < displaystyle d>, a fração transmitida, T < displaystyle T>, é dada por: T = I s I 0 = exp (- μ d) < displaystyle T = < frac <>>>> = exp (- mu d)>, onde μ < displaystyle mu> é chamado de constante de atenuação (um termo usado em vários campos onde um sinal é transmitido através de um meio) ou coeficiente. A quantidade de luz transmitida está diminuindo exponencialmente com a distância. Tomando o logaritmo napieriano (natural) da equação acima, obtemos: - l n (T) = l n I 0 I s = μ d < displaystyle -ln (T) = ln < frac ><>>> = mu d>. Para espalhar mídia, a constante é frequentemente dividida em duas partes, μ = μ s + μ a < displaystyle mu = mu _+ mu _>, separando-o em um coeficiente de dispersão, μ s < displaystyle mu _>, e um coeficiente de absorção, μ a < displaystyle mu _>, [3] obtendo: - ln (T) = ln I 0 I s = (μ s + μ a) d < displaystyle -ln (T) = ln < frac ><>>> = ( mu _+ mu _) d>.

Lei da cerveja com amostras não dispersas Editar

Em uma mídia homogênea, como uma solução, não há dispersão. Para este caso, pesquisado extensivamente por August Beer, a concentração das espécies absorventes segue a mesma resposta linear que o comprimento do caminho. Além disso, as contribuições das espécies individuais de absorção são aditivas. Esta é uma situação muito favorável e torna a absorbância como uma métrica de absorção muito preferível à fração de absorção (absortância). Este é o caso para o qual o termo "absorbância" foi usado pela primeira vez.

Absorbância para amostras de espalhamento Editar

Mesmo que esta função de absorbância seja muito útil com amostras de espalhamento, a função não tem as mesmas características desejáveis ​​que tem para amostras de não espalhamento. Existe, no entanto, uma propriedade chamada potência de absorção que pode ser estimada para essas amostras. O poder de absorção de uma única espessura de unidade de material que constitui uma amostra de dispersão é o mesmo que a absorvância da mesma espessura do material na ausência de dispersão. [5]

Edição Óptica

Na ótica, absorbância ou absorbância decádica é o logaritmo comum da proporção de incidentes para transmitido poder radiante através de um material, e absorbância espectral ou absorbância decádica espectral é o logaritmo comum da razão de incidentes para transmitido potência radiante espectral através de um material. A absorvância é adimensional e, em particular, não é um comprimento, embora seja uma função monotonicamente crescente do comprimento do caminho e se aproxima de zero quando o comprimento do caminho se aproxima de zero. O uso do termo "densidade óptica" para absorbância é desencorajado.

Absorção de um material Editar

o absorbância de um material, denotado UMA, é dado por [1]

A absorvância é uma quantidade adimensional. No entanto, o unidade de absorbância ou AU é comumente usado em espectroscopia ultravioleta-visível e suas aplicações de cromatografia líquida de alto desempenho, muitas vezes em unidades derivadas, como a unidade de mili-absorbância (mAU) ou unidade de mili-absorbância-minutos (mAU × min), uma unidade de absorbância integrada sobre Tempo. [6]

A absorvância está relacionada à profundidade óptica por

Onde τ é a profundidade óptica.

Editar absorbância espectral

Absorvância espectral em frequência e absorbância espectral em comprimento de onda de um material, denotado UMAν e UMAλ respectivamente, são dados por [1]

Φe, ν t é o fluxo espectral radiante em frequência transmitido por esse material, Φe, ν i é o fluxo radiante espectral em frequência recebido por esse material, Tν é a transmitância espectral em frequência desse material, Φe, λ t é o fluxo radiante espectral em comprimento de onda transmitido por esse material, Φe, λ i é o fluxo radiante espectral em comprimento de onda recebido por esse material, Tλ é a transmitância espectral em comprimento de onda desse material.

A absorbância espectral está relacionada à profundidade óptica espectral por

τν é a profundidade óptica espectral em frequência, τλ é a profundidade óptica espectral em comprimento de onda.

Embora a absorbância seja apropriadamente sem unidade, às vezes é relatada em "unidades de absorbância", ou AU. Muitas pessoas, incluindo pesquisadores científicos, declaram erroneamente os resultados de experimentos de medição de absorbância em termos dessas unidades inventadas. [7]

Edição de Atenuação

Absorbância é um número que mede o atenuação da energia radiante transmitida em um material. A atenuação pode ser causada pelo processo físico de "absorção", mas também reflexão, espalhamento e outros processos físicos. A absorção de um material é aproximadamente igual à sua atenuância [ esclarecimento necessário ] quando a absorvância é muito menor do que 1 e a emitância desse material (não deve ser confundida com a saída ou emissividade radiante) é muito menor do que a absorvância. De fato,

Φe t é a energia radiante transmitida por esse material, Φe att é o poder radiante atenuado por esse material, Φe i é o poder radiante recebido por esse material, Φe e é a energia radiante emitida por esse material,

T = Φe t / Φe i é a transmitância desse material, ATT = Φe att / Φe eu sou o atenuância desse material, E = Φe e / Φe i é a emissividade desse material,

e de acordo com a lei Beer-Lambert, T = 10 −A, então

Coeficiente de atenuação Editar

A absorção de um material também está relacionada à sua coeficiente de atenuação decádica por

eu é a espessura do material através do qual a luz viaja, uma(z) é o coeficiente de atenuação decádica desse material em z.

Se uma(z) é uniforme ao longo do caminho, a atenuação é considerada um atenuação linear, e a relação se torna

Às vezes, a relação é dada usando o coeficiente de atenuação molar do material, que é o seu coeficiente de atenuação dividido pela sua concentração molar:

ε é o coeficiente de atenuação molar desse material, c(z) é a concentração molar desse material em z.

Se c(z) é uniforme ao longo do caminho, a relação torna-se

O uso do termo "absortividade molar" para coeficiente de atenuação molar é desencorajado. [1]

Medições logarítmicas vs. diretamente proporcionais Editar

A quantidade de luz transmitida através de um material diminui exponencialmente à medida que viaja através do material, de acordo com a lei de Beer-Lambert (A = (ε) (l)). Uma vez que a absorbância de uma amostra é medida como um logaritmo, ela é diretamente proporcional à espessura da amostra e à concentração do material absorvente na amostra. Algumas outras medidas relacionadas à absorção, como a transmitância, são medidas como uma razão simples, de modo que variam exponencialmente com a espessura e a concentração do material.

Absorbância: −log10e t / Φe eu ) Transmitância: Φe t / Φe eu
0 1
0.1 0.79
0.25 0.56
0.5 0.32
0.75 0.18
0.9 0.13
1 0.1
2 0.01
3 0.001

Faixa de medição do instrumento Editar

Qualquer instrumento de medição real tem uma faixa limitada sobre a qual pode medir a absorbância com precisão. Um instrumento deve ser calibrado e verificado em relação a padrões conhecidos para que as leituras sejam confiáveis. Muitos instrumentos se tornarão não lineares (falham em seguir a lei de Beer-Lambert) começando em aproximadamente 2 UA (

1% de transmissão). Também é difícil medir com precisão valores de absorbância muito pequenos (abaixo de 10-4) com instrumentos disponíveis comercialmente para análise química. Nesses casos, técnicas de absorção baseadas em laser podem ser usadas, uma vez que demonstraram limites de detecção que substituem aqueles obtidos por instrumentos convencionais não baseados em laser em muitas ordens de magnitude (as detecções foram demonstradas até 5 × 10 - 13).A melhor precisão teórica para a maioria dos instrumentos não baseados em laser disponíveis no mercado é alcançada na faixa próxima a 1 UA. O comprimento do caminho ou concentração deve então, quando possível, ser ajustado para alcançar leituras próximas a esta faixa.

Método de medição Editar

Normalmente, a absorbância de uma substância dissolvida é medida usando espectroscopia de absorção. Isso envolve direcionar uma luz por meio de uma solução e registrar a quantidade de luz e os comprimentos de onda transmitidos a um detector. Usando essas informações, os comprimentos de onda que foram absorvidos podem ser determinados. [8] Primeiro, as medições em um "branco" são feitas usando apenas o solvente para fins de referência. Isso é feito para que a absorbância do solvente seja conhecida, e então qualquer mudança na absorbância ao medir a solução inteira é feita apenas pelo soluto de interesse. Em seguida, são feitas medições da solução. O fluxo radiante espectral transmitido que passa pela amostra da solução é medido e comparado com o fluxo radiante espectral incidente. Como afirmado acima, a absorbância espectral em um determinado comprimento de onda é

O espectro de absorbância é traçado em um gráfico de absorbância vs. comprimento de onda. [9]

Um espectrofotômetro UV-Vis fará tudo isso automaticamente. Para usar esta máquina, as soluções são colocadas em uma pequena cubeta e inseridas no suporte. A máquina é controlada por computador e, uma vez "apagada", exibe automaticamente a absorbância traçada em função do comprimento de onda. Obter o espectro de absorbância de uma solução é útil para determinar a concentração dessa solução usando a lei de Beer-Lambert e é usado em HPLC.

Alguns filtros, principalmente o vidro de soldagem, são classificados pelo número de tonalidade (SN), que é 7/3 vezes a absorbância mais um: [10]

Por exemplo, se o filtro tiver 0,1% de transmitância (0,001 transmitância, que é 3 unidades de absorvância), seu número de tonalidade seria 8.


Usando um espectrofotômetro para determinar o crescimento de algas?

Estou tentando determinar o efeito do fertilizante no crescimento de algas na água do lago. Quero usar um espectrofotômetro para obter dados quantitativos de quantas algas acabam crescendo. Eu continuo descobrindo que você PODE usar espectrofotometria para determinar a concentração, mas não consigo descobrir COMO fazer isso. Sei que tem algo a ver com a absorção da corofila A, mas estou completamente confuso quanto ao que realmente faço. Qualquer orientação de como posso fazer isso, ou se vai funcionar, seria muito apreciada!

Se você conhece as moléculas das algas, pode consultar seus espectros de absorção, clorofila a, como referência. Você usa o fotômetro para medir a extinção de luz em comparação com uma referência (geralmente a solução simples sem nada nela), você pode medir a concentração de clorofila de acordo com a lei das cervejas de Lamert: E (Extinção) = ε (coeficiente de extinção) * d (espessura da solução pela qual você está passando a luz) * c (concentração). por exemplo. o coeficiente para clorofila a é 88,15 em 100% de acetona ou 87,67 em 90% de acetona. O problema com o seu plano, a meu ver, é que há muitas moléculas que irão absorver luz nas algas vivas. Acho que se você isolar a clorofila a (ou qualquer outra molécula especificamente absorvente) anteriormente, poderá obter resultados abrangentes .

Só para esclarecer, o que é importante não é o valor real da extinção medida, mas a extinção medida depois em comparação com aquela que você mediu para o pré-crescimento de algas.

Pense em como a espectrofotometria usa luz para determinar a concentração de um determinado produto químico. Como o comprimento de onda se relaciona com o analito? Quais propriedades da luz permitem que você identifique um produto químico em solução? O que a absorbância indica depois que você executa a análise? Que equação você pode usar para traçar sua curva padrão? Seu livro de química deve ter informações sobre a teoria por trás da espectrofotometria, então você deve lê-lo. Talvez também procure alguns protocolos para ter uma ideia de como funciona o processo - a EPA tem muitos protocolos bons para analitos comuns que estão disponíveis publicamente. Em seguida, converse com seu professor para obter ajuda com o uso real do instrumento. Não sei como o seu funciona, mas na minha universidade, tivemos que obter uma & quotlicença de driver & # x27s & quot para usar qualquer um dos equipamentos mais caros, o que exigia aulas e um teste de um TA.

Você também pode descobrir que é mais fácil olhar para a clorofila usando um instrumento diferente. Pude ver sua ideia trabalhando com um espectrofotômetro UV-visual (UV-vis) ou um espectrômetro de massa de cromatógrafo a gás (GCMS). Com UV-vis, você vai precisar extrair a clorofila e isolá-la antes de poder analisá-la, e isso pode exigir reagentes caros ou perigosos, etapas demoradas e dor de cabeça quando algo inevitavelmente dá errado e você tem que refazer tudo. Com um GCMS, você não precisa se preocupar com outras porcarias em seu solvente e já deve haver um programa para examinar a clorofila.


Visão geral da conversa

Dr. Malte Paulsen dá uma introdução à citometria de fluxo com uma excelente explicação dos princípios básicos que regem a técnica. Ele explica como o fluxo de fluido é usado para focar uma amostra em um feixe de laser. A luz do laser é espalhada pelas células na amostra e o grau de dispersão fornece informações sobre a densidade óptica da célula e outras características. Na citometria de fluxo convencional, os lasers são usados ​​principalmente para excitar anticorpos fluorescentes ligados a tipos específicos de células. Um detector com diferentes filtros permite que comprimentos de onda específicos sejam dissecados da fluorescência geral. Esse sinal pode então ser exibido de forma a fornecer o máximo de informações sobre o tipo de célula de interesse.


Desenvolvimento de um método de alto rendimento para avaliar o impacto de compostos inibidores de hidrolisados ​​lignocelulósicos no crescimento de Zymomonas mobilis

Superar os efeitos da toxicidade do hidrolisado em relação aos etanologenos é uma barreira técnica fundamental no processo de conversão bioquímica de matérias-primas de biomassa em etanol. Apesar de sua importância, a complexidade dos fenômenos de toxicidade do hidrolisado e a falta de estudos sistemáticos, análises e ferramentas em torno deste assunto têm bloqueado um entendimento completo das relações envolvendo compostos tóxicos em hidrolisados ​​e seus efeitos no crescimento e fermentação do etanologeno. Neste estudo, desenvolvemos um ensaio de crescimento biológico quantitativo de alto rendimento usando um turbidômetro automatizado para obter cinética inibitória detalhada para compostos individuais presentes no hidrolisado de biomassa lignocelulósica. Informações sobre o tempo de latência prolongado e as densidades celulares finais também podem ser obtidas. Os efeitos do furfural, hidroximetilfurfural (HMF), acetato e etanol na taxa de crescimento e densidades celulares finais de Zymomonas mobilis 8b na glicose são apresentados. Este método também se mostrou útil em estudos de toxicidade do próprio hidrolisado, apesar da natureza altamente colorida desse material. Usando essa abordagem, podemos gerar perfis inibitórios abrangentes com muitos compostos individuais e desenvolver modelos que preveem e examinam os efeitos tóxicos na mistura complexa de hidrolisados, levando ao desenvolvimento de processos de pré-tratamento e condicionamento aprimorados, bem como de organismos de fermentação.


Múltiplas medições ópticas revelam a ativação de uma única célula sem agente de contraste

Nicolas Pavillon (Professor Assistente), Nicholas I. Smith (Professor Associado, Centro de Pesquisa Immunology Frontier, Universidade de Osaka) e colaboradores desenvolveram uma plataforma de microscopia multimodal sem rótulo que permite o estudo não invasivo de preparações celulares sem a necessidade de quaisquer produtos químicos adicionais ou agente de contraste. Os parâmetros extraídos dessas medidas, juntamente com algoritmos de máquina, permitem o estudo de processos celulares finos, como a ativação de células de macrófagos após exposição a lipopolissacarídeo (LPS). Os autores demonstram que a ativação, bem como a inibição parcial da ativação, podem ser observadas em nível de célula única por meio da caracterização fenotípica e molecular puramente por meios ópticos não invasivos.

As medições ópticas sem etiqueta tornaram-se populares graças à sua capacidade de observar amostras de forma não invasiva. Técnicas como microscopia de fase quantitativa ou espectroscopia Raman, conforme utilizadas neste estudo, têm sido amplamente utilizadas nos últimos anos para caracterizar espécimes e identificar células de diferentes origens. No entanto, a especificidade dessas abordagens geralmente só permite a discriminação dos tipos de células. O grupo mostra neste estudo que processos finos, como ativação de macrófagos dentro de populações de células idênticas, também são possíveis.


Bem quando você pensou que tudo fazia sentido & # 8230

Uma palavra de advertência, porém, uma vez que a DO de uma amostra depende do tamanho e da forma das partículas nela, diferentes linhas de células podem ter relações completamente diferentes entre a DO e células / mL. Isso significa que uma calibração separada será necessária para cada tipo de célula que você usar, o que é tedioso, mas melhor do que registrar números arbitrários e sem sentido em seu livro de laboratório.

Isso te ajudou? Então, por favor, compartilhe com sua rede.

17 comentários

Eu sou um novato em microbiologia, por favor, deixe-me deixar claro sobre a relação entre od e número de células enquanto estou trabalhando com levedura, então qual deve ser o od correto da cultura durante a noite para obter um bom número de colônias em uma placa , minha segunda pergunta é o que deveria ser da cultura se devemos fazer a transformação, por favor elabore isto

Muito bem, isso é muito informativo e claro para mim.

oh ótimo!
Portanto, fazer células competentes, que vários protocolos mencionam, não deve crescer além de OD600 = 0,4 é um trabalho bastante complicado.

Artigo muito impressionante. Sou novato em microbiologia e gostaria de pedir a calibração para medição de OD600. Os resultados da calibração variam entre os diferentes estágios de crescimento? (por exemplo. O valor de CFU / ml na fase de latência ou log será diferente quando o valor OD600 for ajustado para o mesmo?) Obrigado.

sim, vai ser diferente, porque na fase estacionária algumas células já estarão mortas, como está escrito no artigo. Assim, o OD600 será maior, mas o CFU será menor.

Isso significa que amostras semelhantes darão valores de OD completamente diferentes em especificações diferentes devido às especificações terem lâmpadas diferentes, ou mesmo na mesma especificação ao longo do tempo, pois a intensidade do feixe diminui com a idade da lâmpada.

OD600 é certamente um valor de merda que não deveria ser usado / publicado da maneira que está, mas sua explicação de por que é assim está completamente incorreta. Não tem nada a ver com o bulbo / monocromador / etc & # 8211 para isso, há um valor em branco que deve ser obtido e uma calibração interna que garante uma resposta linear em relação à luz que entra. Uma vez que esses dois são feitos, todos os espectrofotômetros darão a mesma leitura para amostras * absorventes *. Mas o que medimos com OD600 não é absorbância, é espalhamento!

Portanto, aqui está uma explicação correta: OD600 como uma medida de concentração celular depende do espalhamento da luz & # 8211 alguma luz é & # 8220perdida & # 8221 porque a luz espalhada agora viaja em todas as direções. Então, o que chega ao fotomultiplicador tem dois componentes: A1 + A2 onde A1 é a quantidade de luz que não foi espalhada (função da concentração de células) e A2 é alguma proporção da luz espalhada que ainda entrou (luz espalhada vinda de uma fenda no suporte da cubeta há aproximadamente um cone de luz). É A2 que é variável de especificação para especificação, uma vez que depende da geometria da especificação: tamanhos da fenda no suporte da cubeta e fotomultiplicador, e também a distância da cubeta para o fotomultiplicador (quanto mais próximo, mais luz dispersa ser registrado por engano como não espalhado, diminuindo assim o valor de OD600).

Mas sim, é claro, quando for importante, deve-se usar a curva de calibração & # 8211 não apenas OD600 não é uma função linear da concentração celular, mas células diferentes se espalham de maneira diferente. (Por exemplo, células com corpos de inclusão parecem se espalhar consideravelmente mais cepas / espécies diferentes podem se espalhar de forma diferente, etc).


Assista o vídeo: Strikkegøy episode 11: Hestetømmer, strikkesnorer, i-cord og diverse prosjekter (Novembro 2021).