Em formação

Qual é o papel da pirofosfatase na polimerização de RNA?


Em Molecular Cell Biology (8ª edição) há um fragmento no capítulo 5.2 que diz:

A energética da reação de polimerização favorece fortemente a adição de ribonucleotídeos à crescente cadeia de RNA porque a ligação de alta energia entre os fosfatos α e β dos monômeros rNTP é substituída pela ligação fosfodiéster de baixa energia entre os nucleotídeos. O equilíbrio para a reação é direcionado ainda mais para o alongamento da cadeia pela pirofosfatase, uma enzima que catalisa a clivagem do PPi liberado em duas moléculas de fosfato inorgânico.

Como a pirofosfatase torna a reação mais favorável? Torna "mais difícil" os trifosfatos se formarem novamente (agora você tem que anexar os fosfatos um por um, não dois de uma vez)? Nesse caso, um fosfato adicional não é tão ruim quanto dois? Para remover qualquer um deles, você precisa quebrar uma ligação (entre o primeiro fosfato e o segundo), e você tem uma enzima especializada para remover dois deles (a RNA polimerase). A formação de um difosfato (que precisa se formar para posteriormente formar o trifosfato) não é realmente pior? Ou talvez de alguma forma "reutilize" a energia armazenada na ligação entre os dois fosfatos restantes?

Desculpe se não usei o vocabulário adequado, sou novo em biologia.


Esta pergunta pode ser respondida por considerações de equilíbrio químico. Para qualquer reação química:

$$ ce {A + B <=> C + D} $$

É uma propriedade da natureza que a remoção do produto ($ C $ ou $ D $) da mistura de reação conduz a reação para a frente. Este é um exemplo do princípio de le Chatelier e pode ser explicado da seguinte forma:

Em uma mistura de reação contendo $ A $, $ B $, $ C $ e $ D $, a taxa de reação direta ($ A + B rightarrow C + D $) depende da frequência de colisão de $ A $ e $ B $ moléculas. Da mesma forma, a taxa de reação para trás ($ C + D rightarrow A + B $) depende da taxa de colisão de $ C $ e $ D $ moléculas. As frequências de colisão, por sua vez, aumentam com a concentração das espécies relevantes. Uma redução abrupta na concentração de $ C $ impede a reação para trás, enquanto deixa a reação para a frente inalterada. Assim, a reação direta começa a dominar.

A reação catalisada pela RNA polimerase é:

$$ ce {RNA + NTP <=> Mais longo RNA + PP_i} $$

Removendo $ text {PP} _i $ da mistura de reação, a pirofosfatase faz exatamente isso e conduz a reação em favor da polimerização do RNA. Observe que a hidrólise do pirofosfato é favorecida por causa da mudança negativa da energia livre associada a ela (graças a David por apontar isso).


Múltiplas facetas de H + -pirofosfatase e enzimas relacionadas

O pirofosfato (PPi) é gerado em reações biossintéticas como a síntese de UDP-glicose, substrato para a síntese de glicogênio em animais e celulose em plantas. Outras reações anabólicas, como a polimerização de DNA, RNA e ativação de aminoácidos para síntese de proteínas, também liberam PPi. Nas plantas,.

O pirofosfato (PPi) é gerado em reações biossintéticas como a síntese de UDP-glicose, substrato para a síntese de glicogênio em animais e celulose em plantas. Outras reações anabólicas, como a polimerização de DNA, RNA e ativação de aminoácidos para síntese de proteínas, também liberam PPi. Em plantas, as pirofosfatases de translocação de H + (H + -PPases) catalisam uma reação acoplada de hidrólise de PPi e transporte ativo de prótons através das membranas. Como primeira função, a hidrólise do PPi é importante para promover reações bioquímicas anabólicas. O PPi é hidrolisado e suas concentrações adequadas nos diferentes compartimentos celulares são mantidas por H + -PPases e outras organelas ou pirofosfatases do tipo solúvel localizadas no citosol. Como um segundo papel, a H + -PPase acidifica o lúmen vacuolar juntamente com a H + -ATPase vacuolar. Este papel é importante para energizar o transporte ativo de nutrientes e íons através da membrana vacuolar e também para fornecer condições ácidas essenciais para as atividades enzimáticas no vacúolo. Embora as propriedades bioquímicas dessas duas enzimas principais (H + -PPase e H + -ATPase) tenham sido dissecadas em relatórios anteriores, nosso conhecimento sobre sua contribuição para o crescimento e desenvolvimento das plantas in vivo em diferentes ambientes e em diferentes estágios de desenvolvimento e órgãos é fragmentário.
Portanto, é valioso ter uma visão geral do progresso e dos conceitos recentes sobre a relação entre PPi, H + -PPase, pirofosfatase de tipo solúvel e H + -ATPase vacuolar. O Tópico de Pesquisa "Múltiplas facetas da H + -pirofosfatase e enzimas relacionadas" visa lançar luz não apenas sobre as propriedades individuais e distintas de cada uma das enzimas acima, mas também sobre seus papéis cooperativos in vivo em organismos, órgãos, tecidos, células e níveis de organela. Esperamos que este tópico de pesquisa também represente uma plataforma para comunicar e discutir os mecanismos e princípios subjacentes pelos quais essas bombas de prótons contribuem para o desenvolvimento da planta e processos adaptativos. Aceitamos artigos que forneçam uma visão, mas não se limitem aos seguintes aspectos: - Bioquímica. - Biologia molecular. - Fisiologia. - Eletrofisiologia. - Resposta ao estresse e resistência. - Biologia Celular. - Desenvolvimento. Portanto, este Tópico de Pesquisa visa reunir submissões de classe mundial, incluindo Pesquisa Original, Revisões, Mini Revisões, Métodos, comentários e Perspectiva e Opinião que comunicam avanços sobre as enzimas acima, não apenas em organismos modelo, mas em uma ampla gama de espécies de plantas .

Nota importante: Todas as contribuições para este Tópico de Pesquisa devem estar dentro do escopo da seção e do periódico ao qual são enviadas, conforme definido em suas declarações de missão. A Frontiers reserva-se o direito de orientar um manuscrito fora do escopo para uma seção ou periódico mais adequado em qualquer estágio da revisão por pares.


Grupos de metal de transição 7 e 8

5.1.8.2.4 Pirofosfatase inorgânica

Pirofosfatases inorgânicas (PP euase) são encontrados em quase todas as células vivas, onde catalisam a hidrólise de P2O7 4− em fosfato. Todos conhecidos PPeuases requerem um íon metálico divalente para a catálise, o Mg 2+ geralmente tem a atividade mais alta. Estruturas cristalinas das enzimas ativadas por Mg 2+ de vários organismos, Sulfolobus acidocaldarius, 644 S. cerevisiae 645–647 e E. coli 648–650 foram determinados com Mn 2+ ligado ao sítio ativo e esses estudos estruturais foram revisados. 651 A estrutura do sítio ativo formada por -15 resíduos de aminoácidos e os três ou quatro íons metálicos são altamente conservados nessas diferentes enzimas. Os ligantes para os íons metálicos nessas estruturas são as cadeias laterais de aspartato e glutamato, moléculas de água e oxigênios de fosfato.

Em 1998, o conhecido Bacillus subtilis A pirofosfatase inorgânica foi caracterizada e verificou-se ter uma atividade muito maior do que as enzimas acima, ter uma sequência de aminoácidos completamente diferente, não ser inibida por F - e ser ativada por Mn 2+. 652–656 Desde então, esta forma da enzima foi reconhecida como estando presente em muitas outras espécies bacterianas. Estruturas cristalinas das enzimas de Streptococcus mutans 657 e de Streptococcus gordonii 658 foram determinados. A geometria do site ativo é mostrada na Figura 26. A preferência por Mn 2+ sobre Mg 2+ é explicada pelos ligantes de histidina.

Figura 26. Esquema da esfera de coordenação Mn 2+ em pirofosfatase inorgânica de manganês.


Um modelo simplificado para a via de RNAi

Um modelo simplificado para a via do RNAi é baseado em duas etapas, cada uma envolvendo a enzima ribonuclease. Na primeira etapa, o RNA desencadeador (transcrito primário de dsRNA ou miRNA) é processado em um RNA de interferência curto (siRNA) pelas enzimas RNase II Dicer e Drosha. Na segunda etapa, os siRNAs são carregados no complexo efetor do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O siRNA é desenrolado durante a montagem RISC e o RNA de fita simples hibridiza com o mRNA alvo. O silenciamento do gene é o resultado da degradação nucleolítica do mRNA direcionado pela enzima RNase H Argonaute (Slicer). Se o duplex de siRNA / mRNA contém incompatibilidades, o mRNA não é clivado. Em vez disso, o silenciamento do gene é resultado da inibição da tradução.


Princípios físicos e biologia existente revelam papéis para compartimentos sem membrana contendo RNA na química de origens da vida

Esta Perspectiva enfoca o RNA em compartimentos biológicos e não biológicos resultantes da separação de fase líquido-líquido (LLPS), com ênfase nas origens da vida. Em células existentes, condensados ​​líquidos intracelulares, muitos dos quais são ricos em RNAs e proteínas intrinsecamente desordenadas, fornecem regulação espacial de interações biomoleculares que podem resultar em expressão gênica alterada. Dada a diversidade de moléculas biogênicas e abiogênicas que sofrem LLPS, tais compartimentos sem membranas também podem ter desempenhado papéis importantes em químicas prebióticas relevantes para as origens da vida. A hipótese do RNA World postula que o RNA pode ter servido tanto como portador de informação genética quanto como catalisador durante a origem da vida. Por causa de sua estrutura polianiônica, o RNA pode sofrer LLPS por coacervação complexa na presença de policatiões. A separação de fases pode fornecer um mecanismo para concentrar monômeros para a síntese de RNA e particionar seletivamente RNAs mais longos com funções enzimáticas, conduzindo assim a evolução prebiótica. Apresentamos vários tipos de LLPS que podem levar à compartimentação e discutir os papéis potenciais na polimerização não enzimática mediada por modelo de RNA e outras biomoléculas relacionadas, funções de ribozimas e aptâmeros e benefícios ou penalidades conferidos pela desmistura líquida. Concluímos que minúsculas gotículas de líquido podem ter concentrado biomoléculas preciosas e atuado como biorreatores no mundo do RNA.

Bonecos

Separação de fases na biologia existente ...

Separação de fases na biologia existente (esquerda) e química pré-biótica (direita). Regiões de baixa complexidade ...

Separação de fase não associativa e associativa. ...

Separação de fases não associativa e associativa. Na separação de fases não associativa, soluções ricas em dois ...

Estruturas de moléculas discutidas em ...

Estruturas de moléculas discutidas nesta perspectiva que estão envolvidas na fase associativa ...

Coacervatos concentram monômeros e polímeros ...

Coacervatos concentram monômeros e polímeros A) (esquerda) A centrifugação separa a fase condensada do ...

Múltiplos mecanismos para particionamento de RNA ...

Múltiplos mecanismos de partição de RNA dentro de compartimentos sem membrana (A) A proteína Ddx4 condensa-se diferencialmente ...

Catálise de ribozima em fase não associativa ...

Catálise de ribozima em sistema separado de fase não associativa e partição de Mg 2+ em associativa ...

Ajuste molecular e ambiental de ...

A sintonia molecular e ambiental de coacervatos (A) e (B) enzima Fosfatase aumenta o ...

Contribuições potenciais de componentes de coacervato ...

Contribuições potenciais dos componentes coacervados para a catálise e evolução prebiótica. (A) Vários catalisadores ...


Conteúdo

A pirofosfatase solúvel termoestável foi isolada do extremófilo Thermococcus litoralis. A estrutura tridimensional foi determinada usando cristalografia de raios-X, e verificou-se que consistia em duas alfa-hélices, bem como uma folha beta fechada antiparalela. A forma de pirofosfatase inorgânica isolada de Thermococcus litoralis foi encontrado para conter um total de 174 resíduos de aminoácidos e ter uma organização oligomérica hexamérica (Imagem 1). [10]

Os humanos possuem dois genes que codificam a pirofosfatase, PPA1 e PPA2. [11] PPA1 foi atribuído a um locus gênico no cromossomo humano 10, [12] e PPA2 ao cromossomo 4. [13]

Embora o mecanismo preciso de catálise via pirofosfatase inorgânica na maioria dos organismos permaneça incerto, estudos de mutagênese dirigida ao local em Escherichia coli permitiram a análise do sítio ativo da enzima e a identificação dos principais aminoácidos. Em particular, esta análise revelou 17 resíduos que podem ser de importância funcional na catálise. [14]

Outras pesquisas sugerem que o estado de protonação de Asp67 é responsável por modular a reversibilidade da reação em Escherichia coli. O grupo funcional carboxilato deste resíduo demonstrou executar um ataque nucleofílico no substrato de pirofosfato quando quatro íons de magnésio estão presentes. A coordenação direta com esses quatro íons de magnésio e as interações de ligações de hidrogênio com Arg43, Lys29 e Lys142 (todos os resíduos carregados positivamente) demonstraram ancorar o substrato ao sítio ativo. Os quatro íons magnésio também são sugeridos como envolvidos na estabilização do estado de transição da bipirâmide trigonal, o que diminui a barreira energética para o ataque nucleofílico mencionado. [14]

Vários estudos também identificaram substratos adicionais que podem atuar como efetores alostéricos. Em particular, a ligação do pirofosfato (PPi) ao local efetor da pirofosfatase inorgânica aumenta sua taxa de hidrólise no local ativo. [15] O ATP também demonstrou funcionar como um ativador alostérico em Escherichia coli, [16] enquanto o fluoreto demonstrou inibir a hidrólise do pirofosfato na levedura. [17]

A hidrólise do pirofosfato inorgânico (PPi) em dois íons fosfato é utilizada em muitas vias bioquímicas para tornar as reações efetivamente irreversíveis. [18] Este processo é altamente exergônico (responsável por aproximadamente uma mudança de -19kJ na energia livre) e, portanto, aumenta muito a favorabilidade energética do sistema de reação quando acoplado a uma reação tipicamente menos favorável. [19]

A pirofosfatase inorgânica catalisa essa reação de hidrólise nas etapas iniciais da degradação lipídica, um exemplo proeminente desse fenômeno. Ao promover a rápida hidrólise do pirofosfato (PPi), a pirofosfatase inorgânica fornece a força motriz para a ativação dos ácidos graxos destinados à oxidação beta. [19]

Antes que os ácidos graxos possam sofrer degradação para atender às necessidades metabólicas de um organismo, eles devem primeiro ser ativados por meio de uma ligação tioéster à coenzima A. Este processo é catalisado pela enzima acil CoA sintetase e ocorre na membrana mitocondrial externa. Esta ativação é realizada em duas etapas reativas: (1) o ácido graxo reage com uma molécula de ATP para formar um adenilato de acila e pirofosfato (PPi) ligados à enzima, e (2) o grupo sulfidrila de CoA ataca o adenilato de acila, formando acil CoA e uma molécula de AMP. Cada uma dessas duas etapas é reversível em condições biológicas, exceto pela hidrólise adicional do PPi pela pirofosfatase inorgânica. [19] Esta hidrólise acoplada fornece a força motriz para a reação geral de ativação direta e serve como uma fonte de fosfato inorgânico usado em outros processos biológicos.

O exame das formas procarióticas e eucarióticas da pirofosfatase inorgânica solúvel (sPPase, Pfam PF00719) mostrou que elas diferem significativamente na sequência de aminoácidos, número de resíduos e organização oligomérica. Apesar dos diferentes componentes estruturais, trabalhos recentes sugeriram um grande grau de conservação evolutiva da estrutura do sítio ativo, bem como do mecanismo de reação, com base em dados cinéticos. [20] A análise de aproximadamente um milhão de sequências genéticas retiradas de organismos no Mar dos Sargaços identificou uma sequência de 57 resíduos dentro das regiões que codificam para pirofosfatase inorgânica de bombeamento de prótons (H + -PPase) que parece ser altamente conservada, esta região consistia principalmente de quatro primeiros resíduos de aminoácidos Gly, Ala, Val e Asp, sugerindo uma origem evolutivamente antiga para a proteína. [21]


Resumo

Nós examinamos as atividades da enzima de capeamento de RNA da proteína do núcleo menor do vírus da língua azul (BTV), VP4. A proteína BTV VP4 recombinante foi purificada até a homogeneidade de cultura de células de inseto infectadas com um baculovírus VP4 de BTV sorotipo 10. Nós demonstramos que a proteína purificada, e VP4 encapsidada em partículas semelhantes ao núcleo, reagem com GTP e se ligam covalentemente a GMP através da uma ligação fosfoamida, uma característica da enzima guanililtransferase. VP4 também catalisa uma reação de troca GTP-PPi indicando que a proteína é a guanililtransferase do vírus. Além disso, o VP4 possui uma atividade de RNA 5'-trifosfatase que catalisa a primeira etapa na sequência de capeamento de RNA. Além disso, foi identificada uma atividade de pirofosfatase inorgânica que pode auxiliar a atividade de transcrição dentro do vírus, removendo o pirofosfato inorgânico que é um inibidor da reação de polimerização. Finalmente, a evidência direta da atividade de capeamento de VP4 foi obtida pela demonstração em vitro transferência de GMP para o final 5 ′ de em vitro transcritos de ssRNA de BTV sintetizados para formar uma estrutura cap.


Resumo

A hipótese do “mundo do RNA” propõe que no início da evolução da vida, antes do surgimento do DNA ou da proteína, o RNA era responsável tanto por codificar a informação genética quanto por catalisar reações bioquímicas. Os ribo-organismos que vivem no mundo do RNA teriam replicado seus genomas de RNA usando uma ribozima de RNA polimerase. Os esforços para fornecer suporte experimental para a hipótese do mundo do RNA têm se concentrado na produção de tal polimerase, e em vitro os métodos de evolução levaram ao isolamento de uma ribozima de polimerase que catalisa a extensão do primer que é precisa e geral, mas lenta. Para entender a reação desta ribozima, desenvolvemos um método de medição da processabilidade da polimerase que é particularmente útil no caso de uma polimerase ineficiente. Este método permitiu demonstrar que a ribozima da polimerase, apesar de sua ineficiência, é parcialmente processiva. É atualmente limitado por uma baixa afinidade para o duplex de primer-template, mas uma vez que liga com sucesso o duplex de primer-template no alinhamento produtivo, catalisa uma reação de extensão que é tão rápida que pode ocorrer várias vezes durante o curto período de um único evento de ligação. Esse achado contribui para o entendimento de uma das atividades mais sofisticadas ainda a serem geradas de novo no laboratório e esclarece os parâmetros a serem almejados para otimização posterior.


Modificação de RNA

Meemanage D. De Zoysa, Yi-Tao Yu, em The Enzymes, 2017

5.3 O Sistema de Levedura

No S. cerevisiae U2 snRNA, existem três pseudouridinas no BSRR. Ψ35 e Ψ44 são modificados pelas enzimas protéicas autônomas Pus7p e Pus1p, respectivamente. O terceiro local, Ψ42, é modificado por snR81, uma caixa H / ACA RNP Ψ42 é o único local de modificação guiada por RNA no snRNA U2 de levedura [18,19,56]. A identificação de três enzimas responsáveis ​​pela pseudouridilação em três sítios no U2 snRNA possibilitou a realização de uma análise genética para dissecar a função da pseudouridilação de U2 no splicing do pré-mRNA de leveduras. Os experimentos mostraram que a remoção de pseudouridinas, individualmente ou em combinação, resultou em defeitos de splicing (em várias extensões), que, por sua vez, levou a defeitos de crescimento [9,65].


Aptâmeros de RNA inibitórios da oligomerização de Tau e seus papéis neuroprotetores contra o estresse proteotóxico

Tau é uma proteína citosólica que atua na montagem e estabilização de redes de microtúbulos axonais. Sua oligomerização pode ser a etapa limitante da taxa de formação de agregados insolúveis, que é uma marca neuropatológica da doença de Alzheimer (DA) e de várias outras tauopatias. Evidências recentes indicam que os oligômeros de tau solúveis são as espécies tóxicas para a patologia mediada por tau durante a progressão da DA. Aqui, descrevemos novos aptâmeros de RNA que têm como alvo tau humana e foram identificados por meio de um processo de seleção in vitro. Esses aptâmeros inibiram significativamente a propensão de oligomerização da tau tanto in vitro quanto em modelos de células em cultura de tauopatia, sem afetar a meia-vida da tau. As células modelo de tauopatia tratadas com os aptâmeros foram menos sensibilizadas ao estresse proteotóxico induzido pela superexpressão de tau. Além disso, os aptâmeros de tau aliviaram significativamente a neurotoxicidade mediada por oligômero tau sintético e a perda da coluna dendrítica em neurônios primários do hipocampo. Assim, nosso estudo demonstra que retardar a montagem da tau com aptâmeros de RNA é uma estratégia eficaz para proteger as células sob vários estresses neurodegenerativos originados da oligomerização patogênica da tau.

Palavras-chave: Doença de Alzheimer SELEX agregação aptâmero inibição neurotoxicidade oligomerização tauopatia tau.


Assista o vídeo: Replicação do DNA (Janeiro 2022).