Em formação

Quais são algumas das características gerais da cepa DH5 alfa?


Não consigo encontrar algumas fontes úteis, infelizmente.

Por favor, me fale sobre algumas características importantes do alfa DH5.

O que torna DH5 alfa adequado para a clonagem de genes?


Existem duas fontes possíveis: Uma é o artigo dos Laboratórios de Pesquisa Bethesda (referência 1), que cita alguns, a outra é o livro "DNA cloning: A Practice approach" (ver referência 2)., Que fica aqui no meu estante.

Considerando os dois juntos, a cepa DH5 alfa é derivada da cepa DH5 com a introdução de alguns recursos adicionais. O nome DH são as iniciais de Douglas Hanahan, que desenvolveu a linhagem. A cepa é fácil de transformar com alta eficiência.

Os novos recursos do DH5 alfa são as mutações recA e endA1:

  • A mutação endA1 inativa uma endonuclease intracelular que degrada o DNA do plasmídeo.
  • A mutação recA elimina a recombinação homóloga. Isso reduz a chance de deleções e multimerização de plasmídeo.

A cepa DH5 também possui as seguintes características:

  • A mutação hsdR17 elimina a endonuclease de restrição do sistema de modificação de restrição EcoKI, de modo que o DNA sem metilação EcoKI não será degradado. O DNA preparado a partir de cepas hsdR que são wt para hsdM será metilado e pode ser usado para transformar cepas K-12 wt de E. coli.
  • Δ (lacZ) M15 é o alelo aceptor alfa necessário para a triagem azul-branca com muitos vetores baseados em lacZ.

De especial interesse são as referências 3 e 4, que fornecem todos os detalhes que você deseja saber.


Referências:

  1. Laboratórios de Pesquisa Bethesda. 1986. Hospedeiro BRL pUC: células competentes DH5a de E. coli. Foco 8 (2): 9. O artigo está na página 13 deste jornal.
  2. Clonagem de DNA: uma abordagem prática. Glover, D. M. (ed.), 1985, Vol. 1, pág. 109, IRL Press, McLean, Virginia
  3. Escolhendo uma cepa de E.coli competente
  4. Genótipos de E. coli

Mutações: Significado, características e detecção | Genética

Neste artigo, discutiremos sobre: ​​- 1. Significado das mutações 2. Características das mutações 3. Classificação 4. Tipos 5. Agentes 6. Detecções 7. Método de deficiência nutricional 8. Mutações espontâneas 9. Aplicações de mutações na melhoria da cultura.

  1. Significado das Mutações
  2. Características das Mutações
  3. Classificação de mutações
  4. Tipos de mutações
  5. Agentes de Mutações
  6. Detecções de mutações
  7. Método de mutações para deficiência nutricional
  8. Mutações Espontâneas
  9. Aplicações de mutações na melhoria da cultura

1. Significado das mutações:

Mutação refere-se à mudança hereditária repentina no fenótipo de um indivíduo. No termo molecular, mutação é definida como a mudança permanente e relativamente rara no número ou sequência de nucleotídeos. A mutação foi descoberta pela primeira vez por Wright em 1791 em cordeiros machos que tinham pernas curtas.

Mais tarde, a mutação foi relatada por Hugo de Vries em 1900 em Oenothera, Morgan (1910) em Drosophila (mutante do olho branco) e vários outros em vários organismos. O termo mutação foi cunhado por de Vries.

2. Características das mutações:

As mutações têm vários traços característicos.

Algumas das características importantes das mutações são brevemente apresentadas a seguir:

eu. Natureza da Mudança:

Mutações são mudanças mais ou menos permanentes e hereditárias no fenótipo de um indivíduo. Tais mudanças ocorrem devido à alteração no número, tipo ou sequência de nucleotídeos do material genético, ou seja, DNA na maioria dos casos.

As mutações espontâneas ocorrem com uma frequência muito baixa. No entanto, a taxa de mutação pode ser aumentada muitas vezes pelo uso de mutagênicos físicos e químicos.

A frequência de mutação para um gene é calculada da seguinte forma:

Frequência de mutação genética = M / M + N

onde, M = número de indivíduos expressando mutação para um gene, e

N = número de indivíduos normais em uma população.

iii. Taxa de mutação:

A taxa de mutação varia de gene para gene. Alguns genes exibem alta taxa de mutação do que outros. Esses genes são conhecidos como genes mutáveis, por exemplo, olho branco em Drosophila. Em alguns genomas, alguns genes aumentam a taxa de mutação natural de outros genes. Esses genes são denominados genes mutadores.

O exemplo do gene mutador é o gene pontilhado no milho. Em alguns casos, alguns genes diminuem a frequência de mutações espontâneas de outros genes no mesmo genoma, que são chamados de genes anti-mutadores. Esse gene foi relatado em bactérias e bacteriófagos.

4. Direção da Mudança:

As mutações geralmente ocorrem do alelo dominante ao recessivo ou do tipo selvagem ao alelo mutante. No entanto, mutações reversas também são conhecidas, por exemplo, asa de entalhe e olho de barra em Drosophila.

As mutações geralmente são prejudiciais ao organismo. Em outras palavras, a maioria das mutações tem efeitos deletérios. Apenas cerca de 0,1% das mutações induzidas são úteis no melhoramento da cultura. Na maioria dos casos, os alelos mutantes têm efeitos pleiotrópicos. As mutações dão origem a vários alelos de um gene.

vi. Local de mutação:

Muton, que é uma subdivisão do gene, é o local da mutação. Um gene médio contém de 500 a 1000 locais mutacionais. Dentro de um gene, alguns locais são altamente mutáveis ​​do que outros. Geralmente, esses pontos são chamados de pontos de acesso. As mutações podem ocorrer em qualquer tecido de um organismo, isto é, somático ou gamético.

vii. Tipo de evento:

Mutações são eventos aleatórios. Podem ocorrer em qualquer gene (nuclear ou citoplasmático), em qualquer célula (somática ou reprodutiva) e em qualquer estágio de desenvolvimento de um indivíduo.

viii. Recorrência:

O mesmo tipo de mutação pode ocorrer repetidamente ou repetidamente em diferentes indivíduos da mesma população. Assim, as mutações são de natureza recorrente.

3. Classificação de mutações:

As mutações podem ser classificadas de várias maneiras. Uma breve classificação de mutações com base em:

(7) A visibilidade é apresentada na Tabela 14.1.

4. Tipos de mutantes:

O produto de uma mutação é conhecido como mutante. Pode ser um genótipo ou um indivíduo ou uma célula ou um polipeptídeo.

Existem quatro classes principais de mutantes identificáveis, a saber:

Estes são brevemente descritos abaixo:

eu. Morfológico:

Mutantes morfológicos referem-se à mudança na forma, isto é, forma, tamanho e cor. Esporos albinos em Neurospora, asas encaracoladas em Drosophila, ervilhas anãs, ovelhas de pernas curtas são alguns exemplos de mutantes morfológicos.

Nesta classe, o novo alelo é reconhecido por seu efeito mortal ou letal no organismo. Quando o alelo mutante é letal, todos os indivíduos portadores desse alelo morrerão, mas quando for semi-letal ou sub-vital, alguns dos indivíduos sobreviverão.

iii. Letal condicional:

Alguns alelos produzem um fenótipo mutante sob condições ambientais específicas. Esses mutantes são chamados de mutantes restritivos. Em outras condições, eles produzem fenótipo normal e são chamados de permissivos. Esses mutantes podem ser cultivados sob condições permissivas e, em seguida, ser transferidos para condições restritivas para avaliação.

4. Mutante Bioquímico:

Alguns mutantes são identificados pela perda de uma função bioquímica da célula. A célula pode assumir função normal, se o meio for suplementado com nutrientes apropriados. Por exemplo, auxotróficos de adenina podem ser cultivados apenas se a adenina for fornecida, enquanto o tipo selvagem não requer suplemento de adenina.

Mutágenos se referem a agentes físicos ou químicos que aumentam muito a frequência das mutações. Várias radiações e produtos químicos são usados ​​como mutagênicos. As radiações vêm sob mutagênicos físicos. Uma breve descrição de vários mutagênicos físicos e químicos é apresentada abaixo:

Mutagênicos Físicos:

Os mutagênicos físicos incluem vários tipos de radiações, viz. Raios X, raios gama, partículas alfa, partículas beta, nêutrons rápidos e térmicos (lentos) e raios ultravioleta (Tabela 14.2).

Uma breve descrição desses mutagênicos é apresentada a seguir:

Os raios X foram descobertos pela primeira vez por Roentgen em 1895. Os comprimentos de onda dos raios X variam de 10-11 a 10 -7. Eles são pouco ionizantes e altamente penetrantes. Eles são gerados em máquinas de raios-X. Os raios X podem quebrar cromossomos e produzir todos os tipos de mutações em nucleotídeos, viz., Adição, deleção, inversão, transposição, transições e trans-versões.

Essas mudanças são trazidas pela adição de oxigênio à desoxirribose, removendo o grupo amino ou hidroxila e formando peróxidos. Os raios X foram usados ​​pela primeira vez por Muller em 1927 para indução de mutações em Drosophila.

Nas plantas, Stadler em 1928 usou pela primeira vez os raios X para indução de mutações na cevada. Agora, os raios X são comumente usados ​​para indução de mutações em várias plantas de cultivo. Os raios X induzem mutações, formando radicais livres e íons.

Os raios gama são idênticos aos raios X na maioria das propriedades físicas e efeitos biológicos. Mas os raios gama têm comprimento de onda menor do que os raios X e são mais penetrantes do que os raios X. Eles são gerados a partir da decadência radioativa de alguns elementos como 14C, 60C, rádio etc.

Destes, o cobalto 60 é comumente usado para a produção de raios gama. Os raios gama causam mutações cromossômicas e genéticas, como os raios X, ao ejetar elétrons dos átomos dos tecidos pelos quais passam. Hoje em dia, os raios gama também são amplamente usados ​​para indução de mutações em várias plantas de cultivo.

iii. Partículas alfa:

Os raios alfa são compostos de partículas alfa. Eles são feitos de dois prótons e dois nêutrons e, portanto, têm carga positiva dupla. Eles são densamente ionizantes, mas menos penetrantes do que os raios beta e nêutrons. Partículas alfa são emitidas pelos isótopos de elementos mais pesados.

Eles têm carga positiva e, portanto, são retardados pela carga negativa dos tecidos, resultando em baixo poder de penetração. Partículas alfa levam à ionização e excitação, resultando em mutações cromossômicas.

4. Partículas beta:

Os raios beta são compostos de partículas beta. Eles são pouco ionizantes, mas mais penetrantes do que os raios alfa. Partículas beta são geradas a partir do decaimento radioativo de elementos mais pesados ​​como 3H, 32P, 35S etc. Elas são carregadas negativamente, portanto, sua ação é reduzida pela carga positiva dos tecidos. As partículas beta também agem por meio de ionização e excitação como partículas alfa e resultam em mutações cromossômicas e genéticas.

v. Nêutrons rápidos e térmicos:

Estas são partículas densamente ionizantes e altamente penetrantes. Uma vez que são partículas eletricamente neutras, sua ação não é retardada por partículas carregadas (negativas ou positivas) dos tecidos. Eles são gerados a partir da decomposição radioativa de elementos mais pesados ​​em reatores atômicos ou cíclotrons. Por causa da alta velocidade, essas partículas são chamadas de nêutrons rápidos.

Sua velocidade pode ser reduzida pelo uso de grafite ou água pesada para produzir nêutrons lentos ou nêutrons térmicos. Nêutrons rápidos e térmicos resultam em quebra cromossômica e mutação genética. Como são partículas pesadas, elas se movem em linha reta. Nêutrons rápidos e térmicos são usados ​​efetivamente para indução de mutações, especialmente em espécies de cultivo de reprodução assexuada.

vi. Raios ultravioleta:

Os raios ultravioleta são radiações não ionizantes, que são produzidas a partir de lâmpadas ou tubos de vapor de mercúrio. Eles também estão presentes na radiação solar. Os raios ultravioleta podem penetrar em uma ou duas camadas de células. Devido à baixa capacidade de penetração, eles são comumente usados ​​para a radiação de microorganismos como bactérias e vírus.

Em organismos superiores, seu uso é geralmente limitado à irradiação de pólen em plantas e ovos em Drosophila. Os raios ultravioleta também podem quebrar cromossomos. Eles têm dois efeitos químicos principais sobre as pirimidinas.

O primeiro efeito é a adição de uma molécula de água que enfraquece a ligação H com seu complemento de purina e permite a separação localizada das fitas de DNA. O segundo efeito é juntar pirimidinas para formar um dímero de pirimidina.

Esta dimerização pode produzir TT, CC, UU e dímeros de pirimidina mistos como o CT. A dimerização interfere na síntese de DNA e RNA. Dímeros entre cadeias reticulam cadeias de ácido nucleico, inibindo a separação e distribuição de cadeias.

Mutagênicos Químicos:

Existe uma longa lista de produtos químicos usados ​​como mutagênicos. O tratamento detalhado de tais produtos químicos está além do escopo desta discussão.

Os mutagênicos químicos podem ser divididos em quatro grupos, a saber:

Uma breve descrição de alguns produtos químicos comumente usados ​​desses grupos é apresentada a seguir.

uma. Agentes Alquilantes:

Este é o grupo mais poderoso de mutagênicos. Eles induzem mutações, especialmente transições e transversões, adicionando um grupo alquil (etil ou metil) em várias posições no DNA. A alquilação produz mutação ao alterar as ligações de hidrogênio de várias maneiras.

Os agentes alquilantes incluem etil metanossulfonato (EMS), metil metanossulfonato (MMS), etileno iminas (EI), mostarda de enxofre, mostarda de nitrogênio, etc.

Destes, os três primeiros são de uso comum. Como o efeito dos agentes alquilantes se assemelha ao das radiações ionizantes, eles também são conhecidos como produtos químicos radiomiméticos. Os agentes alquilantes podem causar várias deformações grandes e pequenas da estrutura de base, resultando em transições e transversões de pares de bases.

As conversões podem ocorrer porque uma purina foi tão reduzida em tamanho que pode aceitar outra purina como seu complemento, ou porque uma pirimidina foi tão aumentada em tamanho que pode aceitar outra pirimidina como seu complemento. Em ambos os casos, o diâmetro do par de bases mutante é próximo ao de um par de bases normal.

b. Analógicos de base:

Os análogos de base referem-se a compostos químicos que são muito semelhantes às bases do DNA. Esses produtos químicos às vezes são incorporados ao DNA no lugar da base normal durante a replicação. Assim, eles podem causar mutação por pareamento incorreto de bases. Um pareamento incorreto de bases resulta em transições ou transversões após a replicação do DNA. Os análogos de base mais comumente usados ​​são 5 bromo uracil (5BU) e 2 aminopurina (2AP).

5 bromo uracil é semelhante à timina, mas tem bromo na posição C5, enquanto a timina tem CH3 grupo na posição C5. A presença de bromo em 5BU aumenta sua mudança tautomérica da forma ceto para a forma enol. A forma cetônica é uma forma usual e mais estável, enquanto a forma enol é uma forma rara e menos estável ou de vida curta. A mudança tautomérica ocorre em todas as quatro bases do DNA, mas em uma frequência muito baixa.

A mudança ou deslocamento de átomos de hidrogênio de uma posição para outra em uma purina ou em uma base de pirimidina é conhecido como deslocamento tautomérico e tal processo é conhecido como tautomerização.

A base que é produzida como resultado da tautomerização é conhecida como forma tautomérica ou tautômero. Como resultado da tautomerização, o grupo amino (-NH2) de citosina e adenina é convertido no grupo imino (-NH). Da mesma forma, o grupo ceto (C = 0) da timina e guanina é alterado para o grupo enol (-OH).

5BU é semelhante à timina, portanto, emparelha com a adenina (no lugar da timina). Um tautômero de 5BU irá emparelhar com guanina em vez de adenina. Uma vez que a forma tautomérica tem vida curta, ela mudará para a forma cetônica no momento da replicação do DNA, que irá emparelhar com a adenina no lugar da guanina.

Desta forma, resulta em transições AT GC e GC - & gt AT. O mutagênico 2AP atua de maneira semelhante e causa transições AT & lt- & gt GC. Este é um análogo da adenina.

c. Tinturas de Acridina:

Os corantes de acridina são mutagênicos muito eficazes. Os corantes de acridina incluem pró-flavina, laranja de acridina, amarelo de acridina, acriflavina e brometo de etídio. Destes, pró-flavina e acriflavina são comumente usados ​​para indução de mutação. Os corantes de acridina são inseridos entre dois pares de bases de DNA e levam à adição ou deleção de um ou poucos pares de bases quando o DNA se replica (Fig. 14.1).

Assim, eles causam mutações frameshift e, por essa razão, os corantes de acridina também são conhecidos como mutagênicos frameshift. A proflavina é geralmente usada para indução de mutação em bacteriófagos e acriflavina em bactérias e organismos superiores.

d. Outros mutagênicos:

Outros mutagênicos químicos importantes são o ácido nitroso e a hidroxiamina. Seu papel na indução da mutação é brevemente descrito aqui. O ácido nitroso é um poderoso mutagênico que reage com os grupos amino C6 da citosina e da adenina. Ele substitui o grupo amino com oxigênio (+ a & # 8211 ligação H). Como resultado, a citosina atua como a timina e a adenina como a guanina.

Assim, as transversões de GC - & gt AT e AT - & gt GC são induzidas. A hidroxilamina é um mutagênico muito útil porque parece ser muito específico e produz apenas um tipo de alteração, a saber, a transição GC - & gt AT. Todos os mutagênicos químicos, exceto os análogos de base, são conhecidos como modificadores de DNA.

6. Detecção de mutação:

A detecção de mutações depende de seus tipos. As mutações morfológicas são detectadas pela mudança no fenótipo de um indivíduo ou pela mudança na razão de segregação em um cruzamento entre indivíduos normais (com marcador) e irradiados. As mutações moleculares são detectadas por uma mudança no nucleotídeo, e uma mutação bioquímica pode ser detectada pela alteração em uma reação bioquímica.

Os métodos de detecção de mutantes morfológicos foram desenvolvidos principalmente com Drosophila. Quatro métodos, viz., (1) método CIB, (2) método Muller & # 8217s 5, (3) método do cromossomo X ligado e (4) método de ameixa do lobo encaracolado são comumente usados ​​para detecção de mutações em Drosophila.

Uma breve descrição de cada método é apresentada a seguir:

Este método foi desenvolvido por Muller para detecção de mutações letais recessivas induzidas ligadas ao sexo em machos de Drosophila. Nessa técnica, C representa uma inversão paracêntrica em grande parte do cromossomo X que suprime o cruzamento na porção invertida. O I é um letal recessivo. Mulheres com gene letal podem sobreviver apenas em condição de heterozigose.

O B significa olho de barra que atua como um marcador e ajuda na identificação de moscas. O I e B são herdados juntos porque C não permite que ocorra cruzamento entre eles. Os machos com cromossomo CIB não sobrevivem por causa do efeito letal.

As etapas importantes deste método são as seguintes:

(a) É feito um cruzamento entre CIB fêmea e macho tratado com mutagênio. Em F1 metade dos homens com cromossomo X normal sobreviverá e os portadores do cromossomo CIB morrerão. Entre as mulheres, metade tem cromossomo CIB e metade cromossomo normal (Fig. 14.2). De F1, fêmeas com cromossomo CIB e machos com cromossomo normal são selecionados para posterior cruzamento.

(b) Agora um cruzamento é feito entre CIB feminino e masculino normal. Desta vez, a fêmea CIB tem um cromossomo CIB e um cromossomo tratado com mutagênio recebido do homem no cruzamento anterior.

Isso produzirá dois tipos de fêmeas, a saber, metade com cromossomo CIB e metade com cromossomo tratado com mutagênio (com fenótipo normal). Ambos os descendentes sobreviverão. No caso dos homens, metade com CIB morrerá e a outra metade terá cromossomo tratado com mutagênio.

Se uma mutação letal foi induzida no cromossomo X tratado com mutagênio, a metade restante dos machos também morrerá, resultando na ausência de descendência masculina no cruzamento acima. Ausência de progênie masculina em F2 confirma a indução de mutação letal recessiva ligada ao sexo no homem de Drosophila tratado com mutagénio.

ii. Método Muller 5:

Este método também foi desenvolvido por Muller para detectar mutações ligadas ao sexo em Drosophila. Este método é uma versão aprimorada do método CIB. Este método difere do método CIB em dois aspectos importantes. Primeiro, este método utiliza o gene recessivo do damasco no lugar do letal recessivo no método CIB. Em segundo lugar, a fêmea é homozigótica para genes bar damasco, enquanto é heterozigótica para genes IB no método CIB.

Neste método, a mutação é detectada pela ausência de machos selvagens em F2 progênie. Este método consiste em seguir etapas importantes (Fig. 14.3).

uma. Uma fêmea de damasco em barra homozigótica é cruzada com um macho tratado com mutagênio. Em F1 obtemos dois tipos de progênie, viz., fêmeas heterozigotas em barra e machos em barra de damasco (Muller).

b. Estes F1 são interligados. Isso produz quatro tipos de indivíduos. Metade das mulheres são homozigotas de damasco em barra e a outra metade são heterozigotas em barra. Entre os machos, metade é damasco em barra (Muller 5) e metade deve ser normal. Se uma mutação letal for induzida, o macho normal estará ausente na progênie.

iii. Método X anexado:

Este método é usado para detectar mutações visíveis relacionadas ao sexo em Drosophila. Nesse método, uma fêmea na qual dois cromossomos X estão unidos ou ligados é usada para estudar a mutação (Fig. 14.4). Portanto, este método é conhecido como método X anexado. As fêmeas X anexadas (XXY) são cruzadas com machos tratados com mutagênio. Este cruzamento dá origem a superfemeas (XX-X), fêmea anexada (XXY), macho mutante (XY) e YY.

Os indivíduos YY morrem e as superfemininas também costumam morrer. O macho sobrevivente recebeu cromossomo X de macho tratado com mutagênio e cromossomo Y de fêmea X anexado. Uma vez que o cromossomo Y não tem alelo correspondente do cromossomo X, até mesmo mutações recessivas se expressarão em tal macho, que podem ser facilmente detectadas.

4. Método Curly Lobe-Plum:

Este método é usado para detecção de mutação em autossomos. Neste método, encaracolado refere-se a asas encaracoladas, lóbulo a olho lobulado e ameixa a ameixa ou olho castanho. Todos esses três genes são letais recessivos. Os genes Curly (CY) e lobed (L) estão localizados em um cromossomo e a ameixa (Pm) em outro cromossomo homólogo.

O cruzamento entre esses cromossomos não pode ocorrer devido à presença de inversão. Além disso, indivíduos homozigotos para CYL ou Pm não podem sobreviver devido ao efeito letal. Apenas os heterozigotos sobrevivem. Assim, este sistema também é conhecido como sistema letal equilibrado. Este método consiste nas seguintes etapas (Fig. 14.5).

uma. É feito um cruzamento entre fêmeas de ameixa de lobo crespo (CYL / Pm) e machos tratados com mutagênicos. Isso produz 50% da progênie como lobo crespo e 50% como ameixa.

b. Na segunda geração, o cruzamento é feito entre a fêmea de lobo encaracolado e o macho de ameixa de lobo encaracolado. Isso dará origem a indivíduos de lobo encaracolado ameixa, lobo encaracolado e ameixa na proporção de 1: 1: 1 e os encaracolados homozigotos morrerão devido ao efeito letal. Desta progênie, fêmeas e machos com lobo encaracolado são selecionados para acasalamento posterior.

c. Na terceira geração, um cruzamento é feito entre uma fêmea de lobo encaracolado carregando um autossomo tratado com mutagênio e um macho de lobo encaracolado que também carrega um autossomo tratado. Isso resulta na produção de 50% da progênie como lobo encaracolado, 25% do lobo encaracolado homozigoto que morre e 25% da progênie homozigótica para autossomos tratados.

Isso se expressará como mutação autossômica recessiva e constituirá um terço da progênie sobrevivente. Uma comparação de diferentes métodos de detecção de mutação em Drosophila é fornecida na Tabela 14.4.

Detecção de mutações em plantas:

Como afirmado anteriormente, as técnicas de detecção de mutações induzidas foram desenvolvidas principalmente em Drosophila. Nas plantas, tais técnicas não foram desenvolvidas de maneira adequada. Em plantas, dois métodos são usados ​​para a detecção de mutações, dependendo da visibilidade das mutações.

Esses métodos são descritos resumidamente a seguir:

eu. Detecção de mutações visíveis:

Mutações visíveis geralmente ocorrem em caracteres qualitativos ou oligogênicos. Essas mutações são detectadas com base no fenótipo alterado.

Essa técnica consiste nas seguintes etapas:

uma. As sementes são tratadas com um mutagênico. Para este propósito, uma variedade ou cepa melhorada é usada.

b. As sementes tratadas são cultivadas no campo experimental. Essas plantas são conhecidas como M1 plantas ou M1 geração. Estes M1 as plantas são autocruzadas para evitar cruzamentos. As sementes obtidas de M1 as plantas representam M2 geração de sementes.

c. As sementes obtidas de M1 as plantas são cultivadas para obter M2 plantas. Uma população suficientemente grande deve ser criada em M2 geração para obter fenótipos mutantes que geralmente ocorrem em baixa frequência.

d. É feita uma pesquisa para identificar ou detectar plantas que diferem da variedade parental. Essas plantas são isoladas e sua frequência estimada. Essas mutações são chamadas de macromutações.

No milho, um procedimento diferente é usado para a detecção de mutações visíveis. No milho, alguns estoques são homozigotos para vários genes recessivos e outros são homozigotos para vários genes dominantes. As sementes de linhagens homozigotas dominantes são tratadas com um mutagênico e M1 as plantas são cultivadas. Estes M1 as plantas são cruzadas com estoque recessivo homozigoto.

As plantas tratadas com mutagénios são utilizadas como fêmeas devido à presença de algum grau de esterilidade masculina nestas plantas como consequência do efeito mutagénico. O F1 a progênie desse cruzamento é cultivada e uma pesquisa é feita para detectar plantas com fenótipo recessivo para um gene específico. A presença de plantas com fenótipo recessivo para um gene confirma a indução da mutação.

ii. Detecção de mutação invisível:

Mutações invisíveis geralmente ocorrem em caracteres quantitativos ou poligênicos, como rendimento e conteúdo de proteína. A detecção de tais mutações requer medição quantitativa de tais caracteres. Para rendimentos, a variedade tratada e não tratada com mutagênio é cultivada em ensaios repetidos.

Se o rendimento dos tratamentos tratados e não tratados diferir significativamente, a presença de mutação é indicada. Da mesma forma, se o conteúdo de proteína do material tratado difere significativamente da variedade parental, isso indica que a mutação ocorreu. Essas mutações são chamadas de micro-mutações.

7. Método de mutações para deficiência nutricional:

Este método de detecção de mutações induzidas é usado em microrganismos como Neurospora. A cepa normal é tratada com um mutagênico e então cultivada em meio mínimo. Um meio mínimo contém açúcar, sal, ácidos inorgânicos, nitrogênio e vitamina biotina. A cepa normal de Neurospora cresce bem no meio mínimo, mas um mutante bioquímico não consegue crescer nesse meio.

Isso confirma a indução da mutação. Então, o meio mínimo é suplementado com certas vitaminas ou aminoácidos, um por um, e o crescimento é observado. O meio que resulta em crescimento normal de fungo tratado com mutagênio indica que o mutante não tem síntese daquela vitamina ou aminoácido particular, a adição do qual ao meio de cultura mínimo resultou no crescimento normal da cepa tratada.

8. Mutações espontâneas:

Mutações que ocorrem naturalmente são conhecidas como mutações espontâneas. Essas mutações são induzidas por mutagênicos químicos ou radiações que estão presentes no ambiente externo ao qual um organismo está exposto. A temperatura também afeta a frequência de mutações espontâneas. Um aumento de 10 ° C na temperatura leva a um aumento de cinco vezes na taxa de mutação em um organismo exposto a essa variação de temperatura.

A mudança drástica de temperatura em qualquer direção produz um efeito ainda maior na frequência de mutação. Condições ambientais externas de qualquer tipo, ou seja, extremamente altas ou baixas levam ao aumento da frequência de mutação.

O ambiente interno de um organismo também desempenha um papel importante na indução de mutações espontâneas. Por exemplo, rearranjos espontâneos de bases de DNA resultam em transições de pares de bases. Da mesma forma, erros no reparo ou replicação do DNA podem causar mutações espontâneas.

9. Aplicações de mutações na melhoria da cultura:

As mutações induzidas são úteis no melhoramento da cultura de cinco maneiras principais, a saber:

(1) Desenvolvimento de variedades melhoradas,

(2) Indução de esterilidade masculina,

(4) Criação de variabilidade genética, e

(5) Superando a auto-incompatibilidade.

Eles são brevemente discutidos abaixo:

eu. Desenvolvimento de variedades melhoradas:

Mais de 2.000 variedades melhoradas (algumas diretamente e outras pelo uso de mutantes na hibridização) foram desenvolvidas por meio de mutações induzidas em várias plantações em todo o mundo.

Na Índia, as mutações induzidas foram fundamentais no desenvolvimento de variedades melhoradas de trigo (NP 836, Sarbati Sonor & # 8217a, Pusa Lerma), cevada (RDB 1), arroz (Jagannath, IIT 48, NT 60), tomate, mamona (Aruna , Sobhagya), algodão (MCU 7, MCU 10, Indore 2), amendoim (TGI), cana-de-açúcar (Co 8152, 8153) e várias outras culturas.

Além do alto rendimento, as variedades têm sido desenvolvidas com melhor qualidade, precocidade, nanismo, resistência a doenças e baixo teor de toxinas em várias culturas.

A melhoria da qualidade foi alcançada para o teor de proteína em trigo e arroz, teor de óleo na mostarda e teor de açúcar na cana-de-açúcar. A precocidade foi alcançada na mamona (de 270 dias a 140 dias), arroz e soja. Variedades anãs foram desenvolvidas através do uso de genitores mutantes em trigo, arroz, sorgo e milheto.

Resistência a doenças foi induzida em aveia para a ferrugem Victoria e ferrugem da coroa em trigo para ferrugem em cevada para míldio em amendoim para manchas foliares e ferrugem do colmo em cana-de-açúcar para podridão vermelha em maçã para míldio, etc. Variedades com baixo teor de toxinas foram desenvolvidas em semente de colza e mostarda para ácido erúsico e em Lathyrus sativa para conteúdo de neurotoxina.

ii. Indução da esterilidade masculina:

As mutações induzidas têm sido úteis na indução da esterilidade masculina em algumas plantas de cultivo. A esterilidade genética masculina foi induzida em trigo duro usando radiações. Os mutantes CMS foram induzidos em cevada, beterraba sacarina, milheto e algodão. O uso de linhas GMS e CMS ajuda a reduzir o custo da produção de sementes híbridas.

iii. Produção de Haploides:

O uso de pólens irradiados com raios X ajudou na produção de haplóides em muitas safras. A duplicação cromossômica desses haplóides resulta no desenvolvimento de linhagens consanguíneas que podem ser utilizadas no desenvolvimento de híbridos comerciais.

4. Criação de Variabilidade Genética:

As mutações induzidas são muito eficazes na criação de variabilidade genética para vários caracteres econômicos em plantas de cultivo. Mutações induzidas têm sido usadas para aumentar a gama de variabilidade genética em cevada, aveia, trigo e muitas outras culturas. Em culturas propagadas assexuadamente como a cana-de-açúcar e a batata, as mutações somáticas podem ser úteis, porque a planta mutante pode ser multiplicada como um clone.

v. Superando Auto-incompatibilidade:

A mutação do gene S por irradiação oferece uma solução para a produção de plantas autoférteis em espécies auto-incompatíveis. Isso foi bem-sucedido no caso de Prunusovium. Além dessa aplicação prática no melhoramento de culturas, as mutações induzidas são de interesse fundamental nos estudos genéticos.

As mutações induzidas também têm algumas limitações. A maioria das mutações é deletéria e indesejável. A identificação de micro-mutações, que são mais úteis para um melhorista de plantas, geralmente é muito difícil. Uma vez que as mutações são produzidas em uma frequência muito baixa, uma grande população de plantas deve ser rastreada para identificar e isolar os mutantes desejáveis.


Instalação de núcleo de purificação e expressão de proteínas

Transformação é o processo de obtenção do vetor recombinante de uma mistura de reação ou solução de vetor em E. coli células. Para permitir que as células absorvam o DNA do vetor circular, elas precisam ser tornadas competentes. O método para a preparação de células competentes depende do método de transformação usado e da eficiência de transformação necessária.

  • Para uma alta eficiência de transformação, usamos eletroporação e células competentes para eletroporação. Aqui está um protocolo para a preparação de eletrocompetentes E. coli.
  • Se uma eficiência inferior for suficiente, usamos a transformação por choque térmico e células quimicamente competentes. Aqui está um protocolo para a preparação de choque térmico competente E. coli
  • .

A escolha do E. coli a cepa hospedeira depende do objetivo da transformação.

  • A transformação de uma mistura de ligação deve ser feita em uma cepa de clonagem recA, como DH5a, NovaBlue ou XL1-Blue. Sempre use um controle negativo apenas com DNA vetorial.
  • Dependendo do histórico de não recombinantes (de uma mistura de ligação contendo apenas o vetor digerido), um número de transformantes (3-12) deve ser colhido e verificado quanto à presença do inserto correto por análise de restrição ou PCR de colônia.

Observação: Recomendamos o teste de PCR de colônia antes dos Minipreps de DNA, pois você pode obter o resultado para clones positivos enquanto as culturas inoculadas com as mesmas colônias estão incubando. Você prepara DNA apenas a partir de
1-2 dos clones positivos para PCR em vez de preparar a partir de todas as colônias inoculadas e usar digestão de restrição para o teste. Isso vai economizar tempo e dinheiro para as colunas de enzima de restrição e Miniprep, além disso, você pode filtrar mais colônias em paralelo.
(Se o seu PCR não funcionar por algum motivo, pelo menos você ainda tem suas colônias crescendo, portanto, você não perde nada enquanto espera que elas cresçam.)


Ag43 TEV Release System

O sistema de liberação PRISMO funciona utilizando o autotransportador Ag43 e a protease TEV. Os peptídeos SCI traduzidos são direcionados para a membrana periplasmática através da sequência de sinal pelB. Os peptídeos SCI são fundidos com um sítio de corte de protease TEV e são exibidos na superfície da célula através de autotransportadores Ag43 continuamente (com um promotor constitutivo). Juntamente com os análogos SCI, as proteases TEV também são exibidas na superfície da célula quando induzidas com arabinose, novamente através do autotransportador Ag43. Devido ao modelo de mosaico fluido da membrana celular, esses autotransportadores se movem e colidem uns com os outros na membrana celular. Se essas colisões estiverem na posição e ângulo corretos, as proteases TEV clivam os análogos SCI do autotransportador no local da protease TEV fundida, liberando-os no meio. Para testar o sistema de liberação, criamos uma construção que tem sfGFP em vez do SCI. Fomos então capazes de quantificar a liberação de proteína por meio de um espectrofotômetro M5 [6]. [6].


Discussão

O alto impacto de um evento de doença animal associado à liberação acidental de vírus de doenças animais de alta consequência exige a precaução de ter procedimentos para garantir a inativação completa de vírus e genomas virais + ssRNA. Nos estudos apresentados aqui, a fervura sozinha por cinco minutos demonstrou inativar o vírus da doença equina africana, vírus da peste suína africana, vírus da febre aftosa, vírus da doença de pele protuberante, parvovírus suíno, vírus da doença vesicular suína, exantema vesicular de suínos vírus, vírus da peste suína clássica e vírus da estomatite vesicular (Tabelas 4 e 5), e amostras alcalinas e tratadas com calor enriquecidas com FMDV e CSFV também demonstraram perda de infectividade do vírus in vitro (Tabela 4). O procedimento apresentado se baseia não apenas em condições alcalinas quentes (0,25 N NaOH e 65 ° C por 1 h) para a degradação de todo o RNA, presumivelmente em ribonucleotídeos livres com 5'-hidroxilas e 3'-fosfatos, mas também na etapa adicional de ebulição a 100 ° C por 10 min após o pH ter sido neutralizado para entre pH 7 e 8. Como mesmo algumas quebras no RNA genômico viral são susceptíveis de prevenir a reconstituição do vírus infeccioso, o padrão de perda completa de SCR detectável por rRT-PCR pode parecer uma avaliação excessivamente rigorosa para verificação do procedimento de tratamento de segurança do DNA. Reconhecidamente, o risco de infecção animal ou reconstituição acidental e liberação de um vírus de contaminantes de RNA de DNA purificado é extremamente baixo. Os exemplos publicados de vírus + ssRNA reconstituídos em animais são poucos e normalmente envolvem a injeção direta de RNA viral transcrito in vitro altamente purificado e abundante em um meio de transfecção celular, como a lipofectamina [19, 20]. In vitro, também usando métodos de transfecção de células, a recuperação do vírus a partir do RNA é mais comum, embora o RNA precise ser de alta qualidade, presumivelmente com poucas ou nenhuma quebra na codificação de proteínas ou nos elementos reguladores [19, 21, 22]. Espera-se que a medida rigorosa de degradação do RNA aqui empregada acrescente confiança na segurança do DNA exportado de laboratórios que trabalham com vírus de doenças animais altamente infecciosas de impacto econômico nacional e internacional, como o FMDV.

Espera-se também que o procedimento de tratamento alcalino e térmico melhore a qualidade do DNA em relação a outros métodos de tratamento de segurança de DNA, como o tratamento com RNAse A [23]. A este respeito, espera-se que o NaOH e o tratamento térmico forneçam uma degradação mais eficaz do RNA encapsulado por proteínas e / ou lipídios, bem como do RNA dentro de um duplex RNA: RNA ou RNA: DNA. De fato, tratamentos semelhantes com NaOH e calor foram considerados eficazes na remoção de RNA de preparações de cDNA usadas em análises de transcriptoma usando RT-PCR quantitativo ou microarrays [10, 11].


Mario Alberto Flores-Valdez e middot 30 de junho de 2017 e editor acadêmico middot

Eu apenas encorajo você a dar uma olhada nos comentários do revisor 2 e editar seu manuscrito para lidar com esses comentários (o que pode ser feito durante a produção).

Revisor 1 e 29 de junho de 2017

Relatórios básicos

Uma melhoria substancial no novo manuscrito foi feita

Design experimental

Uma melhoria substancial nas seções do método foi implementada pelos autores

Validade das descobertas

Com as modificações substanciais, o manuscrito está pronto para ser aceito

Comentários para o autor

Com as mudanças sugeridas e implementadas o manuscrito foi melhorado

Revisor 2 e 22 de junho de 2017

Relatórios básicos

O manuscrito de Zhaohui Wei et al relata uma nova cepa de Streptomyces flavogriseus. O fato de esta cepa ser capaz de produzir actinomicina D e holomicina a torna única entre as cepas de S. flavogriseus até então conhecidas. Além disso, a quantidade de actinomicina D produzida por esta cepa a torna uma boa candidata para uma futura produção da droga.
Os dados apresentados no artigo são consistentes e apóiam as conclusões. A estrutura do artigo está correta.
Com as modificações adicionadas, acho que o artigo está adequado para publicação.
Eu só tenho pequenos comentários:
- Resumo:
* Eu moveria a frase na linha 10 "O antimicrobiano ... método de difusão" antes de "Holomicina exibiu ..." na linha 14
* Eu moveria "A viabilidade celular ... Ensaio MTT" da linha 12 para a linha 16 antes de "Holomicina exibiu ... células de carcinoma"

- Materiais e métodos:
* linha 66: “… foi suspenso” deve ler “foi suspenso”
* Tenho algumas preocupações sobre alguma bibliografia apresentada. Por exemplo: a referência de células HepG2 deve ser Knowles et al., 1980, em vez de um artigo publicado no ano passado. Este é apenas um exemplo, mas infelizmente existem mais algumas das referências recém-introduzidas. O mesmo para DH5alpha, etc ...

-Resultados:
* Linha 189: “… em três extratos brutos…”. Por favor, mencione o nome dos 3 meios de comunicação.
* Ensaio de atividade antimicrobiana: Os autores devem afirmar que a actinomicina D purificada tem um desempenho igual ao comercial em termos de atividade antimicrobiana. Isso fortaleceria seus resultados.
* Material e métodos das novas figuras suplementares devem ser adicionados.

Design experimental

Validade das descobertas

Os autores responderam a todas as perguntas do revisor de maneira adequada.

Comentários para o autor

O estudo é interessante e fornece informações úteis. Acho que o manuscrito melhorou consideravelmente.


Em geral

Características

Manipulando informação

  1. Verifique todos os recipientes para vazamento ou quebra.
  2. Remova as células congeladas da embalagem de gelo seco e imediatamente coloque as células a uma temperatura abaixo de -130 ° C, de preferência em vapor de nitrogênio líquido, até que estejam prontas para uso.
  • 10% de soro fetal bovino (FBS ATCC 30-2020)
  • Insulina 10 & microg / ml
  • Transferrina 5,5 & microg / ml
  • 5 ng / ml de selênio
  • 40 ng / ml de dexametasona

Este meio é formulado para uso com 5% de CO2 na atmosfera do ar. Temperatura

Procedimento de manuseio Para garantir o mais alto nível de viabilidade, descongele o frasco e inicie a cultura o mais rápido possível após o recebimento. Se na chegada, o armazenamento contínuo da cultura congelada for necessário, ela deve ser armazenada em fase de vapor de nitrogênio líquido e não a -70 ° C. O armazenamento a -70 e degC resultará na perda de viabilidade.

  1. Descongele o frasco por agitação suave em banho-maria a 37 ° C. Para reduzir a possibilidade de contaminação, mantenha o O-ring e a tampa fora da água. O descongelamento deve ser rápido (aproximadamente 2 minutos).
  2. Remova o frasco do banho-maria assim que o conteúdo descongelar e descontamine por imersão ou pulverização com etanol 70%. Todas as operações a partir deste ponto devem ser realizadas sob condições estritamente assépticas.
  3. Transfira o conteúdo do frasco para um tubo de centrífuga contendo 9,0 mL de meio de cultura completo e gire a aproximadamente 125 x g por 5 a 7 minutos.
  4. Ressuspenda o pellet celular com o meio completo recomendado (consulte as informações do lote específico para a proporção de diluição recomendada da cultura) e dispense em um frasco de cultura de 25 cm 2 ou 75 cm 2. É importante evitar a alcalinidade excessiva do meio durante a recuperação das células. Sugere-se que, antes da adição do conteúdo do frasco, o recipiente de cultura contendo o meio de crescimento completo seja colocado na incubadora por pelo menos 15 minutos para permitir que o meio atinja seu pH normal (7,0 a 7,6).
  5. Incubar a cultura a 37 & degC em uma incubadora adequada. A 5% CO2 em atmosfera de ar é recomendado se usar o meio descrito nesta ficha do produto.
  1. Remova e descarte o meio de cultura.
  2. Enxágue rapidamente a camada de células com solução 0,25% (p / v) de Tripsina-EDTA 0,53 mM para remover todos os vestígios de soro que contém inibidor de tripsina.
  3. Adicione 2,0 a 3,0 ml de solução de Tripsina-EDTA ao frasco e observe as células sob um microscópio invertido até que a camada celular esteja dispersa (geralmente em 5 a 15 minutos).
    Observação: Para evitar aglomeração, não agite as células batendo ou sacudindo o frasco enquanto espera que as células se desprendam. As células que são difíceis de separar podem ser colocadas a 37 ° C para facilitar a dispersão.
  4. Adicionar 6,0 a 8,0 ml de meio de crescimento completo e aspirar as células pipetando suavemente.
  5. Adicione alíquotas apropriadas da suspensão de células para novos recipientes de cultura.
  6. Incubar as culturas a 37 & degC.

Especificações de controle de qualidade

História

Isenção de responsabilidade legal

O produto é fornecido 'COMO ESTÁ' e a viabilidade dos produtos ATCC & reg é garantida por 30 dias a partir da data de envio, desde que o cliente tenha armazenado e manuseado o produto de acordo com as informações incluídas na folha de informações do produto, site e Certificado de análise. Para culturas vivas, a ATCC lista a formulação de mídia e os reagentes que foram considerados eficazes para o produto. Embora outros meios e reagentes não especificados também possam produzir resultados satisfatórios, uma alteração nos protocolos recomendados pela ATCC e / ou pelo depositante pode afetar a recuperação, o crescimento e / ou a função do produto. Se uma formulação de meio ou reagente alternativo for usado, a garantia da ATCC para viabilidade não é mais válida. Exceto conforme expressamente estabelecido neste documento, nenhuma outra garantia de qualquer tipo é fornecida, expressa ou implícita, incluindo, mas não se limitando a, quaisquer garantias implícitas de comercialização, adequação a uma finalidade específica, fabricação de acordo com os padrões cGMP, tipicidade, segurança, precisão e / ou não violação.

Este produto destina-se apenas ao uso em pesquisas laboratoriais. Não se destina a qualquer uso terapêutico animal ou humano, nem para consumo humano ou animal, nem para uso diagnóstico. Qualquer uso comercial proposto é proibido sem uma licença da ATCC.

Embora a ATCC envide esforços razoáveis ​​para incluir informações precisas e atualizadas neste folheto do produto, a ATCC não oferece nenhuma garantia ou representação quanto à sua precisão. As citações da literatura científica e patentes são fornecidas apenas para fins informativos. A ATCC não garante que tais informações tenham sido confirmadas como precisas ou completas e o cliente é o único responsável por confirmar a exatidão e integridade de tais informações.

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Perguntas de revisão

Qual a função da maioria dos hormônios produzidos pela hipófise anterior?

A. regular o crescimento
B. regular o ciclo do sono
C. regular a produção de outros hormônios
D. regular o volume sanguíneo e a pressão arterial

Qual é a função do hormônio eritropoietina?

A. estimula a produção de glóbulos vermelhos
B. estimula o crescimento muscular
C. causa a resposta de luta ou fuga
D. causa a produção de testosterona

Quais glândulas endócrinas estão associadas aos rins?

A. glândulas tireóide
B. glândulas pituitárias
Glândulas supra-renais C.
D. gonads


Célula de combustível microbiana miniaturizada (mMFC)

As células de combustível microbianas tradicionais são volumosas e ineficientes. Eles são caros e menos propensos a serem usados ​​em escala industrial. Estamos totalmente cientes desse problema, então tivemos a ideia de uma célula a combustível microbiana miniaturizada (mMFC).

De acordo com nossa revisão de literatura, o interesse por projetos de mMFC tem aumentado nas últimas décadas. Vários modelos foram construídos e provaram ser muito bem-sucedidos [1, 2, 3]. Por exemplo, Shogo Inoue e colegas demonstraram que o MFC pode ser tão pequeno quanto o tamanho de uma moeda americana de um centavo (Figura 2) [1]. Mesmo que o volume de seus MFCs seja menor que 50 uL, a corrente produzida é aumentada consideravelmente, que até 12 mW / 100 〖mm〗 ^ 3 foi registrado, independentemente das modificações nos MFCs e nas bactérias. Na Figura 2, quatro projetos de MFC que são diferentes por materiais de construção e volumes de câmara foram comparados [2]. Não há dúvida de que os mMFCs podem ter um desempenho melhor. Eles produziram densidades de potência cerca de 300 vezes maiores do que os modelos maiores.

Recentemente, encontramos a equipe de Bielefeld que compartilha o mesmo interesse e paixão pelo MFC como uma fonte potencial de energia verde. Entramos em contato e sabemos que eles também trabalham no complexo mtrCAB, então imediatamente vemos isso como uma oportunidade de colaboração. Pedimos a eles que nos ajudem a construir o MFC miniaturizado (Figura 3), pois eles têm instalações e materiais para construção. Agradecemos a eles por sua generosidade e desejamos sucesso em seu projeto iGEM.

O MFC que nos enviaram tem 2 câmaras, que por sua vez são divididas pelo cátodo e pelo ânodo. Cada câmara tem 2,3 cm de comprimento, 2,3 cm de largura e 1,5 cm de altura. O volume de cada câmara é de 7,9 cm3. O volume de todo o MFC é de 15,8 cm3.

Instruções completas de montagem de célula de combustível microbiana por Bielefeld aqui


Segurança

Felizmente, nossa universidade nos permitiu entrar no laboratório este ano, de junho a outubro, apesar da pandemia de COVID-19. TU Delft acompanhou ativamente as notícias e seguiu as instruções das autoridades de saúde, o Instituto Nacional de Saúde Pública e Meio Ambiente (RIVM). Seguimos essas instruções cuidadosamente.

  • A equipe seguiu medidas de segurança estritas para prevenir a propagação do vírus COVID-19. Éramos vigilantes com a manutenção da higiene pessoal, lavando as mãos com frequência e de maneira adequada, tossindo e espirrando no cotovelo e usando lenços de papel.
  • De acordo com as diretrizes do RIVM (Instituto Nacional Holandês para Saúde Pública e Meio Ambiente), não íamos para a universidade se tivéssemos sintomas relacionados ao COVID-19 ou se tivéssemos entrado em contato com alguém com teste positivo.
  • A TU Delft tomou várias medidas adicionais de limpeza, incluindo, mas não se limitando a, limpeza frequente de locais de trabalho, banheiros, salas de reuniões e máquinas de café. Eles também nos forneceram materiais de limpeza, como etanol 70% e gel para as mãos, para tornar nosso trabalho o mais seguro possível.
  • A fim de manter a ocupação de nossos prédios e laboratórios o mais baixa possível, todos os projetos dos alunos foram realizados fora do campus. Tínhamos permissão para trabalhar no laboratório com no máximo 4 pessoas, mantendo uma distância de 1,5m em todos os momentos.
  • Durante os meses de verão, tínhamos permissão para usar uma grande sala de aula como um "escritório", embora trabalhar em casa continuasse sendo a norma. Ao longo do projeto sempre fizemos um grande esforço para manter uma distância segura, ao mesmo tempo em que tentamos fazer o nosso trabalho da melhor maneira possível

A parte wetlab de nosso projeto foi realizada na área ML-1, que está situada no departamento de Bionanociência de nossa Faculdade de Ciências Aplicadas no campus da Delft University of Technology. O ML-1 é considerado o nível de biossegurança mais baixo, correspondendo ao BSL-1. Depois de passar nos testes obrigatórios de ML1, fomos autorizados a entrar e trabalhar em dois laboratórios. Trabalhamos em um laboratório ML-1 normal e em um laboratório ML-1 destinado apenas a bacteriófagos (figura 1).

Antes de iniciar nossos experimentos, todos os membros da equipe (wetlab) passaram nos testes de segurança obrigatórios sobre:

  • Segurança geral da Faculdade de Ciências Aplicadas
  • Segurança geral do laboratório
  • Segurança biológica ML-1
  • Segurança do laser para usuários de laser

Abaixo você encontra um resumo das regras que os funcionários e alunos da TU Delft devem seguir para garantir um ambiente de trabalho seguro:

  • Em caso de emergência ou um pequeno acidente, devemos ligar para o número de alarme interno. Devemos explicar quem somos, onde estamos e qual é a emergência. O centro de emergência da TU Delft enviará a equipe interna de resposta a emergências (Bedrijfshulpverlening, BHV). Se necessário, o centro de emergência da TU Delft entrará em contato com os serviços de emergência externos.
  • No caso de o alarme disparar, devemos primeiro pensar na nossa própria segurança. Devemos proteger nossa estação de trabalho e deixar o prédio o mais rápido possível, pegando a saída (de emergência) mais próxima. Se possível, devemos alertar os colegas e ajudar as pessoas com deficiência. Temos que ir ao ponto de montagem / controle mais próximo. No ponto de montagem / controle, temos que esperar as instruções da equipe interna de resposta a emergências (Bedrijfshulpverlening, BHV).
  • Quando vemos gás, fumaça ou fogo, devemos primeiro pensar em nossa própria segurança. Temos que pressionar o botão vermelho do alarme de incêndio. Se nos sentirmos confiantes, podemos extinguir pequenos incêndios. Se possível, devemos alertar os colegas e ajudar as pessoas com deficiência. Temos que ir ao ponto de montagem / controle mais próximo. No ponto de montagem / controle, aguarde as instruções da equipe interna de resposta a emergências (Bedrijfshulpverlening, BHV).
  • Devemos sempre relatar incidentes, acidentes, quase acidentes e situações inseguras ao consultor de Saúde, Segurança e Meio Ambiente do corpo docente.

Além de concluir os testes de segurança, também recebemos treinamento de laboratório sobre como operar com segurança a maioria das técnicas utilizadas em experimentos básicos. Acordamos regras sobre como trabalhar com segurança em nosso laboratório para minimizar riscos potenciais para o pessoal do laboratório e para o meio ambiente. Também aprendemos como descartar diferentes tipos de resíduos e como minimizar o risco de contaminação. Para trabalhar no laboratório especial de bacteriófagos, recebemos um treinamento separado, pois medidas extras de segurança são necessárias para conter os fagos e evitar a contaminação. Aprendemos como limpar superfícies contaminadas por fagos de maneira adequada e como realizar experimentos com fagos de maneira correta.
Além de trabalhar com segurança, também nos certificamos de projetar experimentos que pudéssemos realizar com segurança. Redigimos um relatório de segurança para avaliar os riscos de nossos experimentos, incluindo: detalhes experimentais, projetos, segurança em relação ao COVID-19 e informações de segurança biológica. Este relatório de segurança foi aprovado por Susanne Hage, coordenadora do wetlab do departamento de Bionanociência da TU Delft, e Marinka Almering, Oficial de Biossegurança da Faculdade de Ciências Aplicadas da TU Delft. Quando fizemos ajustes em nosso projeto, atualizamos a proposta e a aprovamos antes de iniciar os novos experimentos.

Design Experimental Seguro

Nível ML-1

Projetamos todos os nossos experimentos para cumprir o nível de segurança ML-1. A classificação de microrganismos ou toxinas pode diferir entre países ou regiões, seguimos a legislação da TU Delft. Antes de trabalhar no laboratório, verificamos se todos os organismos, vetores e partes estão de acordo com o nível ML-1 e a lei holandesa.

Microorganismos

Para cumprir o nosso laboratório ML-1, certificamo-nos de que todos os nossos microrganismos eram ML-1. Nós costumavamos E. coli BL21 (DE3) e E. coli DH5 alfa como nossos organismos de chassi. Além disso, usamos E. coli BL21 (DE3) como um hospedeiro para nossos experimentos de engenharia de fago. Decidimos trabalhar com o bacteriófago T7, pois também é classificado como ML-1. Realizamos experimentos de fago exclusivamente em um laboratório de bacteriófago separado para prevenir E. coli infecção (Figura 1).

Inserções

Fizemos questão de expressar inserções seguras. A toxina Cry7Ca1 é específica para insetos e pode ser usada em um laboratório ML-1 sem aceitação separada do departamento de OGM.
Também expressamos YmdB (inibidor de RNAse II), Mini-III (cliva o shRNA), 4-hidroxibenzoato descarboxilase (degrada o fenol) (para obter mais informações, consulte o Projeto) Todas essas moléculas não eram tóxicas e foram classificadas como ML-1. Não foi relatado que todas essas moléculas sejam prejudiciais aos seres humanos.

Vetores

Para a nossa pesquisa, utilizamos diferentes vetores backbones: pKD46, G322 - pUC57 - OriLR - deGFP, pTWIST_bsdBCCD_CO, pSB1C3_BPUL_GA, pTWIST_Cry, pBbB7a - GFP, pBbA2k - RFP, pBbE8c - RFP, pCas9-CR4, pKDsgRNA-P15. Alguns desses plasmídeos foram gentilmente cedidos por outros laboratórios do departamento de BN e alguns foram encomendados via Addgene. Os regulamentos do contrato de transferência de material (MTA) foram seguidos de acordo com as regras.

Produtos químicos

Usamos vários produtos químicos perigosos, incluindo brometo de etídio, 2X Laemmli Sample Buffer e SYBR ™ Safe. Trabalhamos apenas com esses produtos químicos em baixas concentrações e apenas trabalhamos com essas toxinas na área designada. Esta área foi marcada com fita especial, e concordamos em todos os trabalhos com luvas nessa área essas luvas eram coloridas de forma diferente em comparação com o estoque geral. Além disso, nenhum equipamento contaminado saiu desta área.

Seguro por Design

A segurança é um dos nossos requisitos de design importantes. PHOCUS é um biopesticida à base de bacteriófago direcionado usado para controlar a crise de gafanhotos do deserto. Nosso objetivo é matar os gafanhotos produzindo moléculas tóxicas em seus intestinos. Essas moléculas serão produzidas pelas bactérias intestinais após a infecção com nosso bacteriófago projetado. As toxinas que queremos produzir são a toxina Cry7Ca1 específica do gafanhoto e os RNAs em gancho de cabelo curto (shRNAs) que têm como alvo os genes essenciais dos gafanhotos (para obter mais informações, consulte Design).
Enquanto trabalhamos em nosso projeto, aprendemos que em biologia nada é 100% seguro. Portanto, decidimos nos concentrar na identificação de riscos potenciais e ter medidas de gestão de risco adequadas em vigor para reduzi-los a um grau aceitável (figura 1).

Figura 1. Visão geral das medidas Safe-By-Design para o projeto do PHOCUS.

Fazemos uso de fagos para entrega de toxinas. Esses são vírus que podem infectar apenas bactérias [1]. Uma preocupação de segurança identificada é que nossos bacteriófagos projetados podem ser perigosos para os humanos. No entanto, aprendemos que esse risco é insignificante porque:

  • Os fagos não são capazes de infectar células humanas. Embora possam entrar no corpo humano, as reações alérgicas não são comuns em humanos [2, 3, S. Hagens, entrevista pessoal].
  • A estabilidade do fago em certas condições varia para os diferentes fagos [4]. Para o nosso projeto, é importante escolher um fago que seja estável no pH do intestino da alfarroba do deserto, que é pH 7-8 [J. Vanden Broeck, entrevista pessoal]. Um fago que é estável neste pH não tem probabilidade de sobreviver no pH do estômago humano (pH 1-2) [5].
  • Se os fagos sobrevivem ao pH do estômago humano, não é provável que afetem a microbiota intestinal humana [S. Hagens, entrevista pessoal]. No entanto, mais pesquisas sobre o efeito exato dos fagos líticos na microbiota intestinal precisam ser feitas [6,7].

Uma preocupação adicional de segurança é que nossos fagos podem ser perigosos para animais e / ou insetos. A pesquisa analisou a influência dos fagos na microbiota animal, mas esse impacto ainda não é bem compreendido [8]. Em relação aos insetos, pesquisas têm sido feitas sobre o efeito da administração oral de fagos por moscas e abelhas [9, 10]. Isso pareceu surtir pouco efeito. Em suma, mais pesquisas sobre o efeito que os fagos têm sobre a microbiota de animais e insetos devem ser feitas (ver Ensaios de campo).

Outra preocupação de segurança é a persistência de nossos fagos projetados na natureza após serem liberados. No entanto, a chance de nossos fagos persistirem por um longo tempo é baixa, pois:

  • Os fagos são instáveis ​​quando expostos a níveis persistentes de UV [J.B. Jones, entrevista pessoal, 11]. Assim, fora do intestino do gafanhoto, os fagos não persistem por muito tempo.
  • A estabilidade do fago varia com a temperatura [4]. O risco de persistência na natureza pode ser reduzido escolhendo um fago que seja predominantemente estável em temperaturas corporais de gafanhotos de 25-31 graus Celsius [12].

Para testar a estabilidade de PHOCUS dentro do gafanhoto e a instabilidade fora dele, determinamos quais dados precisam ser coletados para serem admissíveis em testes de campo (ver Testes de campo).

Os fagos dependem dos processos metabólicos da célula hospedeira para permitir a replicação viral. Eles são conhecidos por seguirem dois ciclos de vida possíveis, o ciclo lítico e o ciclo lisogênico [13]. Um fago lítico (virulento) não integra seu material genético ao de seu hospedeiro [13]. Enquanto o ciclo de vida de um fago lisogênico (temperado) consiste no genoma viral, referido como o profago, sendo inserido no genoma do hospedeiro [14]. O PHOCUS usará um fago lítico, por vários motivos:

  • Isso irá minimizar os riscos de transferência horizontal de genes e / ou transdução mediada por fago [15]. Caso contrário, isto poderia dar uma vantagem a certas bactérias, e. resistência a antibióticos e, assim, perturbar o ecossistema [16]. Dado que nosso projeto se concentra em fagos líticos, a transdução generalizada é relevante. A transdução generalizada envolve a integração de informações genéticas aleatórias do cromossomo hospedeiro no fago. Este evento raro ocorre durante a replicação do fago com uma taxa de prevalência de 1 em 11.000 fagos, pouco antes de o viróide ser encerrado dentro do capsídeo do fago [18].
  • O ciclo lítico termina com a lise celular e, portanto, a morte celular, reduzindo a chance de criação de um novo OGM.
  • Devido às propriedades do ciclo lítico, os fagos que alcançam suas bactérias-alvo se propagam rapidamente. Isso levará a grandes aumentos na quantidade de toxina e shRNA produzidos. Quando a bactéria do hospedeiro explode, a toxina Cry7Ca1, shRNA e proteínas associadas ao RNAi são efetivamente secretadas, negando a questão de exportar os compostos produzidos para fora do hospedeiro. Como os compostos são liberados nas proximidades da parede intestinal, eles podem facilmente atingir seu alvo. Concentrações mais altas de toxina Cry7Ca1 e shRNA na parede intestinal estão correlacionadas a uma taxa de mortalidade mais rápida, tornando assim o PHOCUS mais eficaz.

Nós projetamos fagos para substituir genes não essenciais por um gene que codifica a toxina Cry7Ca1 ou shRNA. Os riscos envolvidos com a propagação de fagos modificados dependem do tipo de fago e do tipo de modificação genética. Existem diferentes preocupações, além da transferência horizontal de genes mencionada anteriormente:

  • Disseminação de fago no meio ambiente: Os fagos projetados com uma gama de hospedeiros expandida têm uma mudança significativamente aumentada para se espalhar no ambiente [18]. Decidimos usar um coquetel de fago, pois não havia uma única espécie de bactéria sempre presente no intestino do gafanhoto. Com o uso desse coquetel, espalhamos vários fagos diferentes, enquanto todos eles separadamente têm uma chance de se propagar. Aumentando a chance total de propagação. Portanto, optamos por criar fagos com uma gama de hospedeiros naturalmente estreita, de modo que a chance de propagação de nosso coquetel de fagos modificado fora do gafanhoto seja reduzida.
  • Produção de proteínas prejudiciais: uma vez que os fagos podem ser projetados para expressar todos os tipos de proteínas, os riscos envolvidos com o uso de fagos projetados dependem fortemente do tipo de modificação. Optamos explicitamente por não inserir sequências prejudiciais ao meio ambiente, humanos ou outros animais.
  • Persistência da mutação aplicada na natureza: Para examinar a estabilidade da mutação em fagos manipulados, a presença da mutação pode ser determinada ao longo de várias gerações de fagos, conforme descrito por Nobrega et al. [19]. Em suma, o fago modificado pode ser propagado em seu hospedeiro por várias gerações e a presença da mutação pode ser confirmada por PCR após cada geração. Se nossa inserção for extremamente estável, nossa mutação pode se espalhar por meio de populações genéticas.

Toxinas de cristal inseticida (Cry) de Bacillus thuringiensis (Bt) estão sendo usados ​​para o controle biológico de pragas em todo o mundo, seja por meio de formulações de spray baseadas em preparações de esporo-cristal, seja pela introdução de seus genes (proteína Cry ou um fragmento ativo dela) em plantações transgênicas. [20, 21]. Em nosso projeto, nos concentramos na toxina Cry Cry7Ca1 identificada no B. thuringiensis cepa BTH-13 que foi descrita como eficaz contra gafanhotos da espécie Locusta migratoria manilensis, perfurando o revestimento do intestino [22, 23].
Em relação à segurança, optamos por usar o Cry7Ca1 por diversos motivos:

  • As toxinas Cry são altamente específicas para seus insetos-alvo e, portanto, matam um número limitado de espécies [24]. Foi relatado que Cry7Ca1 tem baixa ou nenhuma toxicidade para Lepidoptera, Coleoptera e Diptera [22].
  • A especificidade das toxinas Cry é fornecida pelo ambiente do intestino médio do inseto, que promove a ativação da toxina a partir da protoxina e pela ligação da toxina Cry apenas às membranas intestinais que exibem os receptores correspondentes adequados [25].
  • Os humanos não têm as mesmas condições intestinais nem os mesmos receptores dos insetos. A toxina Cry deve passar por nós sem nenhum efeito, sendo ingerida como qualquer outra proteína ao ingerir alimentos [26].
  • Essas proteínas demonstraram se decompor em sistemas digestivos simulados de humanos [25]. Para o teste de alérgeno, testamos adicionalmente a sequência da toxina Cry, usando o protocolo da equipe do Baltimore iGEM de 2017, que voltou como não alergênico [28].

Nossa abordagem de RNA de interferência (RNAi) depende da pequena maquinaria de processamento de RNA interferente (siRNA). Escolhemos usar a abordagem RNAi porque:

  • Os siRNAs precisam de complementaridade de sequência de 100% ao RNA mensageiro direcionado (mRNA) para clivá-los [29], garantindo especificidade extra. A especificidade é muito importante, pois qualquer célula eucariótica possuindo maquinaria RNAi ativa é suscetível ao silenciamento com nossos shRNAs.
  • Podemos garantir a especificidade escolhendo o alvo certo para o RNA em gancho de cabelo (shRNA). Como os fagos serão pulverizados no ambiente, outras espécies podem ser expostas aos nossos shRNAs. O shRNA produzido tem que ser rastreado para potenciais alvos fora do alcance para prevenir o silenciamento de genes fortuito em espécies coexistentes em ou enxames de gafanhotos próximos, bem como humanos e animais, através do uso de bancos de dados transcriptômicos. Ao escolher o nosso alvo, devemos garantir a escolha de alvos específicos, a fim de evitar o surgimento de fenótipos indesejados, ou seja, desgregarização [30] ou aumento da ingestão de alimentos [31, 32].

Para que nosso biopesticida funcione, bacteriófagos que visam especificamente as bactérias presentes no intestino de gafanhoto devem ser escolhidos como um vetor de entrega. Embora o intestino do gafanhoto não seja dominado por uma única espécie bacteriana, o gafanhoto do deserto mantém uma população constante de Enterobacter gênero [33]. Para garantir a produção de toxinas suficiente, o biopesticida consiste em um coquetel de fagos direcionados a uma variedade de bactérias do Enterobacter gênero. Infelizmente, bactérias do Enterobacter o gênero não é necessariamente específico apenas para o intestino do gafanhoto. Apesar de Enterobacter gênero não é um membro central geograficamente conservado do microbioma humano, existem certas populações humanas que mostram a presença de Enterobacter em seu microbioma [34]. Portanto, existe a possibilidade de que nosso biopesticida possa infectar e matar o Enterobacter bactérias de certos humanos ou outros organismos, ao mesmo tempo que produzem a toxina específica do gafanhoto.

No entanto, esses riscos são pequenos porque:

  • Em humanos, é improvável que a morte não intencional de espécies bacterianas por fagos tenha consequências negativas para a saúde humana, devido à forte pressão de seleção para bactérias não patogênicas [S. Hagens, entrevista pessoal].
  • Para os humanos, a primeira linha de defesa contra os fagos é o baixo pH no estômago, pois a maioria dos fagos é sensível a condições ácidas. [35].
  • Os riscos para outros organismos também são limitados. Não apenas humanos, mas também outros organismos que contêm Enterobacter em seu intestino [O. Lavy, entrevista pessoal] pode estar potencialmente em risco. No entanto, as toxinas produzidas são altamente específicas para os gafanhotos e não devem prejudicar esses organismos. No entanto, para garantir que nosso biopesticida seja seguro para outros animais, mais estudos de dados metagenômicos devem ser realizados em diferentes microbiomas intestinais.

O encapsulamento é um meio pelo qual o ambiente de uma única molécula pode ser rigorosamente controlado [36]. Existem vários tipos de encapsulamento, por exemplo, lipossomas e microcápsulas poliméricas, como alginatos [37].

  • O encapsulamento pode atuar como uma barreira física para prevenir infecções fora do alvo. o Enterobacter O gênero é conhecido por estimular o crescimento das plantas, visto que estão envolvidos na fixação de nitrogênio, solubilização de fósforo no solo e produção de antibióticos [38]. Uma barreira física é necessária para nossos fagos, independentemente da natureza da engenharia que estamos executando, para evitar desequilíbrios ecológicos na vegetação sobre a qual o fago é pulverizado.

Um método claro de encapsulamento que atenda aos nossos requisitos de projeto é difícil de encontrar à primeira vista. Mais pesquisas sobre o encapsulamento de nossos bacteriófagos devem ser feitas.

Quando expostos a pesticidas, gafanhotos com características fenotípicas diferentes têm chances diferentes de sobrevivência. Os genes que resultam em uma maior chance de sobrevivência têm maior probabilidade de serem passados ​​para a prole. Se isso ocorrer por períodos mais longos, os gafanhotos resistentes a pesticidas podem se tornar dominantes em uma população. Temos que prevenir a resistência para que nosso pesticida permaneça eficaz. As características acima mencionadas incluem:

Resistência Cry7Ca1

A toxina Cry7Ca1 se liga a receptores no intestino de gafanhoto e faz buracos no revestimento do intestino. Alguns gafanhotos podem ter leves alterações genéticas, causando mudanças no receptor Cry7Ca1, resultando em ligação ineficiente ou mesmo nenhuma. Gafanhotos com essa característica provavelmente a passarão para seus descendentes. A probabilidade de que isso aconteça é difícil de estimar. No entanto, o risco de que o gafanhoto do deserto se torne resistente a Cry7Ca1 é aumentado por:

  • Alta exposição de gafanhotos a Cry7Ca1 [39].
  • Reprodução rápida, resultando em muitas gerações [39, 40].

O risco de que isso ocorra é reduzido em:

  • O risco de que isso ocorra é reduzido em:
  • Baixa frequência inicial de características fenotípicas que favorecem a sobrevivência [41].
Resistência a RNAi

Existem três cenários diferentes em que o gafanhoto do deserto evolui para se tornar uma resistência ao RNAi [42]:

  • A maquinaria de RNAi do gafanhoto do deserto é prejudicada devido a mutações [42]. No entanto, um sistema de RNAi imposto diminui as chances de sobrevivência em um enxame devido à suscetibilidade ao vírus e, portanto, não é provável que essa mutação se propague pela população.
  • A sequência alvo no gafanhoto do deserto é mutada a ponto de seu mRNA não ser mais suficientemente homólogo aos siRNAs do shRNA [42]. Caso isso acontecesse, seria fácil mudar para outra sequência alvo de um gene essencial.
  • O gafanhoto do deserto pode obter mutações que diminuem a estabilidade do shRNA no intestino ou a captação do shRNA na hemolinfa [42]. Nenhuma estimativa pode ser fornecida sobre a magnitude desse risco.
Prevenindo resistência

Dois métodos estão sendo aplicados para mitigar o risco de o gafanhoto do deserto se tornar resistente ao PHOCUS:

  • Dois modos de ação diferentes: Existe uma chance de que um gafanhoto do deserto seja resistente a um dos dois métodos. A chance de um gafanhoto do deserto ser menos suscetível a Cry7Ca1 e RNAi ao mesmo tempo, no entanto, é insignificante.
  • Monitoramento: Quando o PHOCUS é aplicado, os genomas do gafanhoto do deserto devem ser monitorados para avaliar se uma variação genética particular se torna mais prevalente na população [41]. Nesse caso, uma estratégia, como pulverizar taticamente PHOCUS em áreas específicas ou desenvolver uma nova toxina com um modo de ação diferente, deve ser planejada.

As bactérias desenvolvem resistência a fagos usando muitos mecanismos [43]. Se a bactéria alvo for resistente ao PHOCUS, as toxinas não são produzidas para exterminar os gafanhotos. Usamos especificamente fagos líticos para lisar todas as bactérias alvo para limitar o desenvolvimento de resistência. Ainda assim, estudamos as chances de desenvolvimento de resistência e chegamos a dois cenários em que poderia ocorrer resistência a fagos:

  • O primeiro cenário consiste em bactérias desenvolvendo resistência a PHOCUS, começando com uma população bacteriana não resistente. Com base em nosso modelo matemático, que estuda o desenvolvimento de bactérias resistentes, fica claro que nosso bacteriófago infectaria e mataria todo o Enterobacter população em algumas horas - o que impede a bactéria de desenvolver resistência ao PHOCUS.
  • O segundo cenário consiste na existência de uma cepa resistente no intestino da gafanhoto. Com base no conselho do Dr. Steven Hagens, optamos por usar um coquetel de fagos que têm como alvo diferentes receptores da mesma bactéria para tratar de problemas relacionados a bactérias resistentes. Isso garante a suscetibilidade para nossas bactérias-alvo.

Para reduzir os riscos relacionados à propagação de OGM na natureza devido à liberação do bacteriófago modificado, uma estratégia é limitar sua propagação no meio ambiente [44]. A quantidade de fagos projetados no ambiente diminuirá naturalmente ao longo do tempo, tornando desnecessárias medidas de biocontenção adicionais como:

  • PHOCUS perde a competição com o fago de tipo selvagem pelo hospedeiro devido à redução da aptidão. A sobrevivência de PHOCUS depende de uma vantagem seletiva sobre o tipo selvagem. No entanto, as inserções não conferem uma vantagem seletiva ao PHOCUS.
  • As inserções genéticas serão perdidas com o tempo e o fago retornará à sua sequência de tipo selvagem. Isso se deve ao fato de que os transgenes freqüentemente têm um efeito deletério, uma conseqüência geral de interromper o tipo selvagem [45]. Esperamos que a aptidão relativa diminua e hipotetizamos que isso resultará na exclusão de nossa inserção, como costuma ser o caso para inserções em genomas de vírus [46].
  • Os bacteriófagos são geralmente instáveis ​​quando expostos a altas temperaturas e altas doses de radiação UV. Diferentes fatores ambientais podem influenciar a estabilidade dos bacteriófagos [4]. Os bacteriófagos têm dificuldade em persistir nas superfícies das folhas devido à inativação por radiação UV [47, J.B. Jones, entrevista pessoal].
  • A natureza lítica do bacteriófago projetado. Um bacteriófago é dependente do crescimento de seus respectivos hospedeiros para proliferar, eles são autolimitados [48, 49]. Isso significa que se uma grande quantidade de fagos for liberada, seus respectivos hospedeiros serão erradicados localmente. Limitando a capacidade de propagação e proliferação.

Teste de campo

Durante entrevistas com especialistas na área de, entre outros, biologia de fagos e toxicologia, potenciais preocupações de segurança foram mapeadas e discutidas. Para resolver essas questões, estratégias de mitigação de risco foram desenvolvidas e experimentos de laboratório foram projetados para testar a segurança do PHOCUS. Percebemos que, para que o PHOCUS seja usado no mundo real, ele primeiro precisa passar por testes de campo. Para ser admissível para esses testes em larga escala, mais testes de segurança devem ser feitos. Portanto, investigamos quais dados deveriam ser coletados e elaboramos os experimentos de acordo, além de estudar a legislação correspondente.

De nossa entrevista com a Dra. Cecile van der Vlugt, avaliadora de risco sênior do Instituto Nacional Holandês de Saúde Pública e Meio Ambiente, aprendemos que, embora a legislação possa estar ausente ou não permissiva, a melhor abordagem para superar a legislação não conforme é realizar uma avaliação de risco de PHOCUS. Provavelmente temos que cumprir três tipos de regulamentos:

  • Regulamentos de OGM: Antes de levar um OGM para o meio ambiente, é necessário fazer uma avaliação de risco para outros organismos no meio ambiente, por exemplo, precisamos provar que o fago não se propagará indefinidamente na natureza.
  • Regulamentações sobre inseticidas: Todo inseticida precisa passar por regulamentos antes de ser aplicado. Respondendo a perguntas como o quão específico é? Persiste no meio ambiente?
  • Regulamentações alimentares: Isso também se aplica a PHOCUS, pois é um inseticida "vivo". Os reguladores examinarão os efeitos da toxina / patogênicos da modificação feita no fago e como ela pode ser transmitida a outros organismos.

Existem muitos riscos diferentes associados à implementação do PHOCUS, para os quais os dados devem ser coletados em escala de laboratório. Desta forma, podemos provar as afirmações teóricas que fizemos anteriormente, ou seja, que PHOCUS é seguro para os humanos. Para mover o PHOCUS além do laboratório, muitos experimentos devem ser realizados para testar o seu:

  • Toxicidade para organismos não-alvo (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Patogenicidade para organismos não-alvo (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Estabilidade e potencial de acumulação (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Singularidade da sequência direcionada (RNAi)
  • Potencial fluxo gênico de inserção (fago GM)
  • Especificidade para gafanhotos (CryCa1, RNAi)

Deve-se notar que nossa percepção do que é aceitável está sempre mudando. Portanto, a lista deve ser repetida e alterada após discussões contínuas com avaliadores de risco e gerentes. Isso é extremamente relevante em relação ao nosso projeto, pois temos um aplicativo novo e, portanto, pode haver riscos potencialmente não identificados que podem surgir ao longo do tempo.

Após a conclusão da avaliação de risco em escala de laboratório e aceitação pelas autoridades responsáveis, o PHOCUS pode passar para os testes de campo. Aqui, O PHOCUS estará sujeito a diferentes testes em um ambiente externo, ou seja, uma avaliação de risco ambiental (ERA) [50]. Os experimentos realizados podem ser a variante externa dos realizados no laboratório. Esses dados precisam ser gerados novamente, pois o ambiente real é muito mais complexo e pode levar a diferentes interações. As especificações de quais dados exatamente precisam ser coletados permanecem imprecisas. Principalmente porque nossa abordagem é nova e as autoridades responsáveis ​​ainda não elaboraram a legislação relacionada. Eles provavelmente farão isso usando uma abordagem caso a caso, conforme recomendado por estudiosos [52, 53]. Ainda, provavelmente permanecerá comparável às ERAs existentes para regulamentações de OGM, pesticidas e alimentos, por exemplo. a ERA para plantas GM na Austrália, que examina a "toxicidade, alergenicidade, perfil nutricional, características agronômicas, aumento da carga de doenças, disseminação e persistência do OGM, fluxo gênico etc." [53]. Outras diretrizes para o uso de agentes de controle biológico estão disponíveis [54]. Embora a crítica da ERA contemporânea sobre OGM, que usa toxinas Cry em plantas transgênicas, também seja apresentada [55], fica claro que os especialistas em avaliação de risco não concordam sobre a melhor abordagem. Além disso, diferentes países também têm procedimentos diferentes. Portanto, é essencial compreender que não há uma forma definida pela qual o PHOCUS obterá aprovação em todos os países, e seus regulamentos devem ser avaliados em estreita colaboração com as autoridades responsáveis ​​dos países afetados.

Depois que as avaliações de risco forem realizadas, é importante submeter esses resultados ao Grupo de Árbitros de Pesticidas (PRG). Este é um grupo independente de especialistas científicos em pesticidas. Eles avaliam os dados enviados e criam uma lista de pesticidas que consideram aceitáveis. Esta lista é especificada para o uso pretendido. A FAO aconselha os países sobre quais pesticidas usar. Eles só compram e aconselham pesticidas que foram selecionados pelo PRG. Por último, todos os países têm sua própria liberdade legislativa, portanto, o PHOCUS ainda precisaria ser admitido em cada país individualmente.


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