Em formação

O que faria com que as bandas parecessem mais baixas em um gel de SDS-PAGE não reduzido?


Eu tenho um gel de proteína e estou comparando o gel reduzido com o não reduzido. No gel reduzido, tenho algumas bandas mais curtas, mas essas bandas aparecem com baixa intensidade. No gel não reduzido, estou vendo mais do produto mais curto? O que faria com que a proteína funcionasse "menor" nas condições não reduzidas?


O principal efeito da alteração do ambiente redox de uma proteína é a formação ou quebra de ligações dissulfeto. Sob condições suficientemente redutoras, nenhuma ponte dissulfeto estará presente, enquanto sob condições oxidantes sua proteína formará pontes dissulfeto se tiver a capacidade de fazê-lo.

As pontes dissulfeto podem alterar significativamente a estrutura terciária de uma proteína e alterar o comportamento da proteína em um gel dessa forma. Geralmente, as pontes dissulfeto devem tornar a proteína mais compacta e torná-la mais rápida em um gel.

Portanto, é plausível que sua banda mais rápida seja a proteína com pontes dissulfeto, que parecerá funcionar como uma proteína menor por ser mais compacta. A banda mais lenta então é a proteína sem pontes dissulfeto que podem adotar uma conformação mais estendida.

Presumo que você esteja falando sobre géis nativos aqui, já que os géis desnaturantes geralmente contêm DTT ou beta-mercaptoetanol no tampão de amostra para reduzir quaisquer ligações dissulfeto e evitar esse efeito por completo.


Guia de solução de problemas de enzimas de restrição

O guia a seguir pode ser usado para solucionar problemas de digestão por enzimas de restrição. Você também pode estar interessado em ler dicas adicionais para otimizar as reações de digestão.

Temos o prazer de anunciar que estamos no processo de troca de todos os buffers de reação para livres de BSA. A partir de abril de 2021, a NEB mudará nossos atuais buffers de reação contendo BSA (NEBuffer & trade 1.1, 2.1, 3.1 e CutSmart & reg Buffer) para buffers contendo albumina recombinante (rAlbumina) (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 e rCutSmart & trade Buffer). Prevemos que essa mudança pode levar até 6 meses para ser concluída. Sentimos que abandonar os produtos de origem animal é um passo na direção certa e podemos oferecer esse aprimoramento pelo mesmo preço. Encontre mais detalhes em www.neb.com/BSA-free.

Durante este período de transição, você pode receber produtos com BSA ou tampões contendo rAlbumina. NEB testou ambos rigorosamente e não viu nenhuma diferença no desempenho da enzima ao usar qualquer um dos tampões. Qualquer um dos tampões pode ser usado com sua enzima. Todo o conteúdo do site será alterado em abril para refletir as alterações, embora você possa não receber o novo buffer com seu produto imediatamente.

Vídeos

Problema de digestão de enzima de restrição: esfregaço de DNA em gel de agarose

Saiba mais sobre o que causa esse problema comum e como as enzimas do NEB são submetidas a controle de qualidade para evitar manchas de DNA.

Por que minha enzima de restrição não está cortando o DNA?

Não está obtendo o decote que você esperava? Deixe um cientista NEB ajudá-lo a solucionar sua reação.

Problema de digestão da enzima de restrição: muitas bandas de DNA

Você está encontrando bandas inesperadas em sua reação de digestão? Aqui estão algumas dicas para ajudá-lo a determinar a causa.

Protocolo de digestão de enzima de restrição: corte próximo ao final do DNA

Ao cortar próximo ao final de uma molécula de DNA, certifique-se de saber quantas bases adicionar às extremidades de seus primers de PCR.

TIME-SAVER e protocolo comercial para digestões de enzimas de restrição

Precisa de um protocolo para digerir rápida e completamente? Experimente este protocolo para enzimas qualificadas para economia de tempo e comércio da NEB.

Reduza a atividade da estrela com enzimas de restrição de alta fidelidade

NEB projetou enzimas HF & reg para eliminar a atividade estelar. Aprenda como e o que isso significa para seus resumos.

Protocolo padrão para digestões de enzimas de restrição

Deixe um dos especialistas em enzimas de restrição do NEB ajudá-lo a melhorar sua técnica e evitar erros comuns na configuração do resumo.

  • Verifique a sensibilidade de metilação da (s) enzima (s) para determinar se a enzima é bloqueada pela metilação da sequência de reconhecimento
  • Use o tampão recomendado fornecido com a enzima de restrição
  • Limpe o DNA para remover quaisquer contaminantes que possam inibir a enzima
  • Ao digerir um fragmento de PCR, certifique-se de ter pelo menos 6 nucleotídeos entre o local de reconhecimento e o final da molécula de DNA
  • Reduza o número de unidades
  • Adicione SDS (0,1 & ndash0,5%) ao tampão de carregamento para dissociar a enzima do DNA ou use corante de carregamento de gel, roxo (6X) (NEB # B7024)
  • Use um buffer de funcionamento novo e limpo
  • Use um gel de agarose fresco
  • Limpe o DNA (NEB # T1030)
  • Verifique a sensibilidade de metilação da (s) enzima (s) para determinar se a enzima é bloqueada pela metilação da sequência de reconhecimento
  • O DNA isolado de uma fonte bacteriana pode ser bloqueado por metilação Dam e Dcm
  • Se a enzima for inibida pela metilação Dam ou Dcm, faça crescer o plasmídeo em um dam- / dcm- cepa (NEB # C2925)
  • O DNA isolado de fonte eucariótica pode ser bloqueado por metilação CpG
  • As enzimas que têm baixa atividade em tampões contendo sal (NEBuffer r3.1) podem ser sensíveis ao sal, então limpe o DNA (NEB # T1030) antes da digestão
  • Os procedimentos de purificação de DNA que usam colunas de rotação podem resultar em altos níveis de sal, que inibem a atividade enzimática. 1 Para evitar isso, a solução de DNA não deve ser superior a 25% do volume total da reação.
  • Limpe o fragmento de PCR antes da digestão de restrição (NEB # T1030)
  • Use o tampão recomendado fornecido com a enzima de restrição
  • Use pelo menos 3 & ndash5 unidades de enzima por & caneca de DNA
  • Aumente o tempo de incubação
  • Algumas enzimas têm uma atividade mais baixa no DNA supercoliado. Aumente o número de unidades de enzima na reação.
  • Algumas enzimas podem exibir clivagem mais lenta em locais específicos. Aumente o tempo de incubação, 1 & ndash2 horas normalmente é suficiente.
  • Algumas enzimas requerem a presença de dois locais de reconhecimento para cortar com eficiência
  • Ensaie o DNA do substrato na presença de um DNA de controle. O DNA de controle não clivará se houver um inibidor presente. O DNA mini prep é particularmente suscetível a contaminantes.
  • Limpe o DNA com uma coluna de rotação (NEB # T1030) ou aumente o volume para diluir o contaminante
  • Reduza o número de unidades na reação
  • Adicione SDS (0,1 & ndash0,5%) ao tampão de carregamento para dissociar a enzima do substrato
  • Use o tampão recomendado fornecido com a enzima de restrição
  • Diminuir o número de unidades de enzima na reação
  • Certifique-se de que a quantidade de enzima adicionada não exceda 10% do volume total da reação. Isso garante que a concentração total de glicerol não exceda 5% v / v
  • Diminua o tempo de incubação. Usar o tempo mínimo de reação necessário para uma digestão completa ajudará a prevenir a atividade das estrelas.
  • Tente usar uma enzima de restrição de alta fidelidade (HF). As enzimas HF foram projetadas para reduzir a atividade estelar.
  • As enzimas que têm baixa atividade em tampões contendo sal (por exemplo, NEBuffer r3.1) podem ser sensíveis ao sal. Certifique-se de limpar o DNA (NEB # T1030) antes da digestão.
  • Os procedimentos de purificação de DNA que usam colunas de rotação podem resultar em altos níveis de sal, que inibem a atividade enzimática. 1 Para evitar isso, a solução de DNA não deve ser superior a 25% do volume total da reação.
  • Limpe o fragmento de PCR antes da digestão de restrição (NEB # T1030)
  • Use o tampão recomendado fornecido com a enzima de restrição
  • Use pelo menos 5 & ndash10 unidades de enzima por & caneca de DNA
  • Digerir o DNA por 1 & ndash2 horas


1 Os kits Monarch (NEB # T1010, NEB # T1020 e NEB # T1030) usam colunas que foram projetadas para minimizar o transporte de sal para o DNA eluído, portanto, usá-las pode minimizar esse problema.


Qual é a diferença entre corrente constante, tensão constante e potência constante?

Como as condições do gel, tampão e amostra podem mudar durante as etapas de eletroforese, a maioria dos pacotes de energia modernos oferecem uma variedade de opções para manter a tensão constante, corrente constante (amperes) e potência constante (watts). Antes de ir para algumas configurações recomendadas, aqui está uma rápida atualização sobre os conceitos básicos de circuitos elétricos:

Voltagem (V) - a diferença nos potenciais elétricos entre duas cargas - é o parâmetro principal para definir a velocidade com que sua proteína se moverá através de um gel durante o SDS-PAGE. Se você pensar em eletricidade como uma torre de água, a voltagem é a pressão da água criada ao colocá-la em alguma altura. Quanto mais alta a voltagem, mais alta a “pressão” elétrica e mais rápido suas proteínas funcionarão.

A corrente (I) se refere ao fluxo de carga elétrica que passa por um ponto em um circuito. Usando a mesma analogia com a água acima, a corrente é a taxa com que a água flui através do tubo.

Potência (P) - geralmente definida como o trabalho realizado por unidade de tempo - é simplesmente igual à tensão multiplicada pela corrente, que pode ser escrita como tal:

Um parâmetro adicional a considerar é a resistência (R), que (como o nome indica) é uma medida de quão difícil é para a carga passar por um condutor. No Western blotting, a resistência é a medida de quão eficientemente os íons em seu tampão SDS-PAGE permitem que a carga “flua” através do gel.

A resistência está relacionada à tensão e corrente pela lei de Ohm:


Como obter bandas claras no Western Blot? Continuo recebendo proteínas entremeadas. Por favor ajude!

Olá a todos, estou aprendendo a fazer western blots agora e estou tentando solucionar o problema porque continuo recebendo borrões que se parecem com o que eu & # x27ve vinculado acima. As proteínas não parecem estar migrando para bandas claras. Acho que estou carregando muita proteína. Abaixo, listei algumas etapas / mais informações para que alguém possa me ajudar:

Eu faço meu próprio gel SDS-PAGE de acrilamida 10%, que sigo a receita muito de perto para empilhar e separar os géis. O gel de separação começa 1 cm abaixo do fundo de cada poço.

Quando eu misturo amostras de proteína com corante de proteína, eu as incubo a 95 graus C por 5 minutos em um banho seco.

Coloquei 120 microgramas de proteína em cada poço. Cada amostra também contém 5 microlitros de corante protéico.

Eu corro a eletroforese por 2 horas a 100 Volts constantes.

Durante a transferência, coloco minha membrana de nitrocelulose diretamente no gel, sem movê-lo, pois sei que as proteínas começam a borrar imediatamente quando a membrana e o gel entram em contato.

Eu bloqueio a membrana com 1 g de leite em pó em 20mL (solução bloqueadora a 5%) de TBS por 1 hora.


Várias bandas em Western Blots - causas e soluções

O ensaio Western blot fornece informações valiosas sobre uma proteína, incluindo abundância, a massa molecular aparente, modificações pós-tradução e variantes de splice. No entanto, a análise da proteína pode ser difícil se várias bandas aparecerem no blot. Ao lidar com várias bandas em Western blots, é importante determinar se elas são devido a artefatos técnicos ou se representam verdadeiras variantes da proteína de interesse. Este guia descreve várias causas de várias bandas devido a artefatos técnicos e como determinar se várias bandas representam verdadeiras variantes da proteína de interesse.

Várias bandas causadas por artefatos técnicos

Artefatos técnicos podem causar o aparecimento de bandas com pesos moleculares maiores ou menores do que a proteína real. Os tipos de bandas observados podem ajudar a determinar a causa do artefato.

Bandas de peso molecular inferior e superior

Concentração de anticorpo primário ou secundário muito alta

Se a concentração do anticorpo primário ou secundário for muito alta, o anticorpo pode ligar-se não especificamente a proteínas diferentes da proteína de interesse. A ligação não específica pode ocorrer com qualquer proteína, portanto, bandas de peso molecular superior e inferior podem ser observadas.

Titular anticorpo

Para determinar se altas concentrações de anticorpos estão resultando em várias bandas, titule os anticorpos. Ambos os anticorpos podem ser titulados simultaneamente usando um dot blot em um tabuleiro de damas.

Sem controle de anticorpo primário

Para determinar rapidamente se o anticorpo primário é responsável pela produção de várias bandas no blot, execute todo o procedimento de Western blot, mas omita o anticorpo primário. Se várias bandas ainda forem observadas, o anticorpo secundário é responsável pelos artefatos.

Quantidade excessiva de lisado carregado no gel

Se muito lisado for carregado em um gel, os anticorpos podem se ligar de forma não específica a proteínas de abundância excessiva, resultando em várias bandas.

Diminuir a quantidade de lisado usado

Para determinar a quantidade apropriada de lisado para carregar no gel, carregue diluições decrescentes de lisado no gel.

Aumentar lavagens

Se a proteína de interesse não for muito abundante, pode ser necessário carregar grandes quantidades de proteína para detectá-la. Para diminuir a ligação não específica a proteínas de maior abundância, aumente o número e a duração das lavagens.

O anticorpo está "sujo"

Os soros policlonais ou anticorpos não purificados também podem conter anticorpos menos abundantes que se ligam a proteínas celulares comuns abundantes.

Use anticorpo purificado por afinidade

Quando possível, compre anticorpos purificados por afinidade. Alternativamente, os anti-soros policlonais podem ser purificados por afinidade usando Proteína A, G ou L imobilizada para purificar moléculas de IgG ou o antígeno imobilizado pode ser usado para purificar anticorpos específicos para o antígeno. Kits comerciais estão disponíveis para purificação por afinidade de anticorpos.

Bandas de menor peso molecular

Degradação da proteína alvo

Múltiplas bandas de baixo peso molecular geralmente surgem do manuseio inadequado dos lisados ​​/ amostras antes da análise e podem ser indicativas de degradação da amostra.

Inibidores de protease

Para diminuir a degradação de proteínas por proteases celulares, inclua inibidores de protease na solução de lise usada para a preparação da amostra.

Mantenha as amostras frias

Mantenha as amostras em gelo durante a preparação e durante todas as manipulações para limitar a atividade da protease.

Limite de congelamento / descongelamento

Aliquotar as amostras em vários tubos e congelar / descongelar cada tubo apenas 1-2 vezes para limitar a degradação induzida por mudanças de temperatura.

Bandas de maior peso molecular

Bandas de peso molecular mais alto por si só também podem ser devidas a artefatos técnicos.

A proteína alvo pode formar multímeros

Os multímeros de proteína não resolvidos podem resultar em bandas de peso molecular que são maiores do que o peso molecular previsto da proteína alvo.

Ferva em tampão SDS-PAGE por 10 minutos

Para reduzir as proteínas completamente, ferva a amostra em tampão SDS-PAGE contendo um agente desnaturante, como ditiotreitol ou β-mercaptoetanol, por 10 minutos, em vez dos 5 minutos usuais.

Compare o gel redutor com o não redutor

Para determinar se a proteína de interesse está formando multímeros, prepare as amostras em condições redutoras e não redutoras antes de carregar no gel.

Determinando se várias bandas são cientificamente relevantes

Várias bandas que são cientificamente relevantes podem ser observadas durante a análise de Western blot. Bandas de peso molecular mais alto são vistas quando as proteínas se tornam ligadas a modificadores, enquanto bandas de peso molecular mais baixo são observadas quando as proteínas são processadas.

Determine se as bandas são especificamente reconhecidas pelo anticorpo

Um dos critérios para determinar se várias bandas são devidas a artefatos técnicos ou são cientificamente relevantes é determinar se as bandas são especificamente reconhecidas pelo anticorpo primário. Isso pode ser conseguido usando amostras de controle e / ou inibindo especificamente a interação do anticorpo com a proteína.

Amostras de controle

Inclua controles no gel que contenham ou não tenham a proteína de interesse. Por exemplo, inclua linhas celulares que são idênticas em todos os aspectos, exceto na expressão da proteína para identificar bandas que aparecem devido a interações não específicas.

Peptídeos de bloqueio

Quando disponíveis, os peptídeos de bloqueio (aqueles que correspondem ao epítopo reconhecido pelo anticorpo) podem ser usados ​​para determinar quais bandas são especificamente reconhecidas pelo anticorpo. Pré-incubar o anticorpo primário com concentrações crescentes de peptídeos de bloqueio antes da incubação do blot com o anticorpo. O peptídeo bloqueador impedirá a interação do anticorpo com a proteína alvo e a banda “desaparecerá” no blot.

Bandas de peso molecular mais alto

Bandas de peso molecular mais alto são freqüentemente vistas quando a proteína-alvo é modificada pós-tradução. Acetilação, metilação, miristoilação, fosforilação, glicosilação e ubiquitinação são modificações que aumentam o peso molecular de uma proteína. Várias técnicas podem ser usadas para determinar se uma proteína é modificada pós-tradução.

Software de análise de proteínas

Use um software de análise de proteínas para prever os tipos de modificações que uma proteína pode adquirir pós-tradução. Use o software para prever o peso molecular da proteína com e sem modificações.

Anticorpos específicos para modificação

Estão disponíveis anticorpos primários comercialmente disponíveis que reconhecem modificações pós-tradução específicas (por exemplo, anticorpos específicos para fosforilação de tirosina). Esses anticorpos podem ser usados ​​para confirmar modificações pós-tradução. Para usar esses anticorpos, imunoprecipite a proteína de interesse usando o anticorpo primário específico da proteína. Execute a fração imunoprecipitada em um gel e, em seguida, execute um Western blot usando o anticorpo primário específico da modificação.

Tratamentos químicos para remover modificações

Proteínas e extratos de proteínas podem ser tratados com produtos químicos que irão remover modificações (por exemplo, PNGase F é usado para remover glicosilações). A remoção completa de todas as modificações deve resultar em uma única banda do peso molecular previsto na análise de Western blot. Ao tratar com produtos químicos para remover modificadores, é importante incluir também amostras não tratadas no mesmo gel para observar as mudanças no padrão de bandas.

Bandas de baixo peso molecular

Bandas de peso molecular mais baixo podem ser observadas se formas adicionais da proteína de interesse são geradas por meio de splicing alternativo ou clivagem da proteína pós-tradução. Software de análise de RNA e proteína pode ser usado para prever esses eventos, no entanto, essas modificações terão que ser determinadas empiricamente para cada proteína.

Variantes de emenda

O splicing alternativo de um mRNA pode gerar vários produtos de proteína. Se o epítopo que o anticorpo reconhece é compartilhado entre as proteínas, então várias bandas serão observadas.

A proteína é clivada

Bandas de baixo peso molecular podem ser observadas se a proteína for clivada pós-tradução. Os anticorpos policlonais podem reconhecer várias bandas de baixo peso molecular devido à sua capacidade de reconhecer vários epítopos. Os anticorpos monoclonais reconhecerão apenas uma banda do (s) produto (s) de clivagem.


Exame NS 5 Biologia

II: Esta afirmação está incorreta porque a insulina não interage diretamente com a glicose na corrente sanguínea em vez disso, ela atua para reduzir os níveis de glicose no sangue, promovendo a absorção de glicose pelas células.

B: RN II está incorreto e RN III está correto.

I. A insulina é produzida pelas células beta do pâncreas.

II. A insulina atua diretamente sobre a glicose no sangue.

III. A insulina é um hormônio peptídico.

A glicose é a principal fonte de combustível do corpo na maioria das circunstâncias, portanto, a regulação dos níveis de glicose no sangue é extremamente importante na manutenção da função metabólica geral. Os dois principais hormônios associados à regulação da glicose são a insulina e o glucagon.

A insulina é um hormônio peptídico liberado pelas células beta do pâncreas em resposta aos níveis elevados de glicose no sangue. Sua função básica é reduzir os níveis de glicose no sangue, promovendo o transporte de glicose para as células por meio de receptores de insulina, que ativam os transportadores de glicose ligados à membrana. A glicose transportada para a célula pode ser usada imediatamente através da glicólise, alternativamente, as células musculares e hepáticas podem armazenar a glicose como glicogênio e os adipócitos (células de gordura) podem mobilizar ácidos graxos para armazenar subprodutos a jusante do metabolismo da glicose na forma de triglicerídeos. A insulina regula positivamente todos esses processos, bem como a síntese de proteínas.

O glucagon é um hormônio peptídico liberado pelas células alfa do pâncreas e seu mecanismo e função são essencialmente o oposto da insulina. O glucagon é liberado em resposta aos baixos níveis de glicose e tem o efeito de aumentar os níveis de glicose no sangue, promovendo a glicogenólise e a gliconeogênese nas células do fígado.


Solução de problemas: fundo alto

Aumente a concentração do reagente de bloqueio (por exemplo, de 5 a 7%).

Aumente o tempo de bloqueio e / ou temperatura.

Adicione Tween 20 ao buffer de bloqueio.

Incluir reagente de bloqueio e Tween 20 no tampão de diluição do anticorpo primário.

Lavagem inadequada
Membrana seca
Ligação não específica de anticorpo secundário

Realize um experimento de controle apenas com anticorpo secundário (omita a etapa de incubação primária).

Use um anticorpo secundário pré-adsorvido com reatividade cruzada reduzida para espécies indesejadas.

Para detecção de proteína fosforilada, não use tampões à base de leite, como leite desnatado ou tampão de caseína. (Leite e caseína são ricos em fosfoproteínas.)

Exposição do filme muito longa / reagente de detecção muito sensível
Fundo alto (bandas não específicas)
A abundância da proteína alvo é inferior ao limite de ligação não específica

Carregue mais proteína por poço em SDS-PAGE.

Enriquecer proteínas de baixa abundância por imunoprecipitação, fracionamento, etc.

Degradação da amostra

Prepare novos lisados ​​a cada vez

Use a amostra recém-preparada mantida em gelo até a adição do tampão de amostra e aquecimento imediato a 95 ° C por 5–10 minutos.

Os extratos de tecido tendem a produzir bandas mais inespecíficas e produtos de degradação. Use extratos de tecido frescos, sonicados e clarificados.

Sempre inclua inibidores de protease (e inibidores de fosfatase para a detecção de alvos fosforilados).

Certifique-se de que a amostra não se degrada.

Interferência de outras isoformas

Verifique a presença de isoformas conhecidas na literatura ou em uniprot.org.

Use um anticorpo específico da isoforma.

Separação SDS-PAGE ineficiente

Altere a porcentagem do gel para se adequar ao MW da proteína alvo.

Géis de Tris-Glicina de porcentagem mais baixa devem ser usados ​​para proteínas maiores, ou use géis e tampões à base de Tris-acetato. (Veja a página 12 para nossas receitas de gel SDS-PAGE). •

Géis de Tris-Glicina de maior porcentagem (até 15%) devem ser usados ​​para proteínas menores (& lt20 kDa) ou use géis de Tris-Tricina.

Presença de modificações pós-traducionais
  • Conheça a proteína de interesse, os tamanhos das bandas podem mudar devido à glicosilação, fosforilação, maturação do precursor, etc.
Falta de controles

Embora a omissão de amostras de controle de um Western blot não seja uma causa de bandas não específicas, sua inclusão pode dizer por que você pode vê-las em sua membrana. Os controles que você pode incluir são:

Controles positivos:

Controles negativos:

Anterior

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Otimize seu experimento com nossos protocolos específicos de produto para WB, IHC, IP, IF e FC. Você pode pesquisar por número de catálogo ou nome de anticorpo.

Protocolos padrão também estão disponíveis

Proteintech América do Norte (HQ)

Aviso importante para o cliente em relação ao surto Covid-19

A Proteintech está empenhada em garantir que sua pesquisa continue durante a situação COVID-19. Entendemos que grande parte de sua pesquisa é extremamente importante para a saúde da comunidade. Como um fabricante original de todo o seu catálogo de anticorpos e proteínas, estamos aqui para apoiá-lo. A Proteintech possui cinco locais em todo o mundo com estoque total de estoque disponível para entrega no dia seguinte. Por este motivo, não prevemos quaisquer problemas com a nossa cadeia de abastecimento e os pedidos recebidos continuarão a ser processados ​​normalmente até novo aviso.

Além disso, esperamos que você e sua família, amigos e colegas permaneçam bem e em segurança. Manteremos um monitoramento próximo da situação e atualizaremos nossos esforços de acordo.


Protocolo

1. Preparação do Gel

Pesar a massa apropriada de agarose em um frasco Erlenmeyer. Os géis de agarose são preparados usando uma solução percentual p / v. A concentração de agarose em um gel dependerá do tamanho dos fragmentos de DNA a serem separados, com a maioria dos géis variando entre 0,5% -2%. O volume do tampão não deve ser maior que 1/3 da capacidade do frasco.

Adicione tampão de corrida ao frasco contendo agarose. Gire para misturar. Os tampões de execução de gel mais comuns são TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) e TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM).

Derreta a mistura de agarose / tampão. Isso é mais comumente feito aquecendo em um micro-ondas, mas também pode ser feito em uma chama de Bunsen. Em intervalos de 30 s, remova o frasco e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose esteja completamente dissolvida.

Adicionar brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 0,5 & # x003bcg / ml. Alternativamente, o gel também pode ser corado após eletroforese em tampão de corrida contendo 0,5 & # x003bcg / ml EtBr por 15-30 min, seguido de descoloração em tampão de corrida por um período de tempo igual.

Observação: EtBr é um carcinógeno suspeito e deve ser descartado de forma adequada de acordo com os regulamentos da instituição. Luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo EtBr. Corantes alternativos para a coloração de DNA estão disponíveis, porém o EtBr continua sendo o mais popular devido à sua sensibilidade e custo.

Deixe a agarose esfriar na bancada ou por incubação em banho-maria 65 & # x000b0C. Caso contrário, a bandeja de gel ficará deformada.

Coloque a bandeja de gel no aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se também colar as bordas abertas de uma bandeja de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado no molde de gel para criar os poços.

Despeje a agarose fundida no molde de gel. Deixe a agarose ficar à temperatura ambiente. Retire o pente e coloque o gel na caixa de gel. Alternativamente, o gel também pode ser embrulhado em filme plástico e armazenado a 4 & # x000b0C até o uso (Figura 1).

2. Configuração do aparelho de gel e separação de fragmentos de DNA

Adicione corante de carga para as amostras de DNA a serem separadas (Figura 2) O corante de carregamento de gel é tipicamente feito na concentração de 6X (0,25% de azul de bromfenol, 0,25% de xileno cianol, 30% de glicerol). Carregar corante ajuda a rastrear a distância percorrida por sua amostra de DNA e também permite que a amostra afunde no gel.

Programe a fonte de alimentação para a tensão desejada (1-5 V / cm entre os eletrodos).

Adicione tampão de corrida suficiente para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo tampão de corrida usado para preparar o gel.

Conecte os terminais da caixa de gel à fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e verifique se a caixa de gel e a fonte de alimentação estão funcionando.

Remova a tampa. Carregue lenta e cuidadosamente a (s) amostra (s) de DNA no gel (Fig. 3) Um marcador de tamanho de DNA apropriado deve sempre ser carregado junto com as amostras experimentais.

Recoloque a tampa da caixa de gel. O cátodo (fios pretos) deve estar mais próximo dos poços do que o ânodo (fios vermelhos). Verifique novamente se os eletrodos estão conectados nas ranhuras corretas da fonte de alimentação.

Ligue a energia. Execute o gel até que o corante tenha migrado para uma distância apropriada.

3. Observando fragmentos de DNA separados

Quando a eletroforese for concluída, desligue a fonte de alimentação e remova a tampa da caixa de gel.

Remova o gel da caixa de gel. Drene o excesso de tampão da superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em toalhas de papel para absorver qualquer tampão de corrida extra.

Remova o gel da bandeja de gel e exponha o gel à luz ultravioleta. Isso é mais comumente feito usando um sistema de documentação de gel (Fig. 4) As bandas de DNA devem aparecer como bandas fluorescentes laranja. Tire uma foto do gel (Fig. 5).

Elimine adequadamente o gel e o tampão de corrida de acordo com os regulamentos da instituição.

4. Resultados representativos

Figura 5 representa um resultado típico após eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são visíveis como bandas claramente definidas. O padrão ou escada de DNA deve ser separado a um grau que permita a determinação útil dos tamanhos das bandas de amostra. No exemplo mostrado, fragmentos de DNA de 765 pb, 880 pb e 1022 pb são separados em um gel de agarose a 1,5% junto com uma escada de DNA de 2 log.

Figura 1. Um gel de agarose solidificado após a remoção do pente.

Figura 2. Um estudante adicionando corante de carga em suas amostras de DNA.

Figura 3. Um aluno carregando a amostra de DNA em um poço do gel.

Figura 4. Um exemplo de sistema de documentação de gel.

Figura 5. Uma imagem de uma pós-eletroforese em gel. EtBr foi adicionado ao gel antes da eletroforese para uma concentração final de 0,5 & # x003bcg / ml, seguido por separação a 100 V durante 1 hora. O gel foi exposto à luz ultravioleta e a foto tirada com um sistema de documentação de gel.


Quando as proteínas são separadas por eletroforese através de uma matriz de gel, proteínas menores migram mais rápido devido à menor resistência da matriz de gel. Outras influências na taxa de migração através da matriz do gel incluem a estrutura e a carga das proteínas.

Em SDS-PAGE, o uso de dodecil sulfato de sódio (SDS, também conhecido como lauril sulfato de sódio) e gel de poliacrilamida elimina amplamente a influência da estrutura e da carga, e as proteínas são separadas apenas com base no comprimento da cadeia polipeptídica.

O SDS é um detergente com um forte efeito desnaturante de proteínas e se liga ao esqueleto da proteína em uma razão molar constante. Na presença de SDS e um agente redutor que cliva ligações dissulfeto críticas para o dobramento adequado, as proteínas se desdobram em cadeias lineares com carga negativa proporcional ao comprimento da cadeia polipeptídica.

A acrilamida polimerizada (poliacrilamida) forma uma matriz semelhante a uma malha adequada para a separação de proteínas de tamanho típico. A força do gel permite um fácil manuseio. A eletroforese em gel de poliacrilamida de proteínas tratadas com SDS permite que os pesquisadores separem as proteínas com base em seu comprimento de uma maneira fácil, barata e relativamente precisa.


Assista o vídeo: SDS PAGE- Gel Poliacrilamida. Procedimiento (Dezembro 2021).