Em formação

Perguntas sobre transformação em células bacterianas


Em primeiro lugar, na transformação, o DNA doador se alinha com as bases complementares no DNA receptor.

Agora, um alinhamento "perfeito" do DNA do doador (desculpe se minhas terminologias estiverem incorretas) significaria que uma réplica exata do fragmento de DNA do doador já existe no DNA do receptor. Se for esse o caso, nenhuma recombinação genética ocorrerá, mas a recombinação genética é observada, esta é a parte em que fico confuso.

Se o fragmento de DNA está se alinhando com o DNA do doador e causando uma recombinação genética, então obviamente o fragmento de DNA do doador deve conter alguma variação do DNA do receptor. Isso significaria que o alinhamento do fragmento de DNA não é perfeito e nem todas as bases no fragmento de DNA podem formar pares de bases complementares com o DNA receptor. (Novamente, desculpe pelo uso de terminologia inadequada, pois sou um novo aluno que acabou de iniciar um curso introdutório relacionado à microbiologia).

Agora o problema é -

  1. Não deveria ser energeticamente desfavorável para o fragmento de DNA doador substituir o DNA original porque o original deveria ser capaz de formar pares de bases complementares com a totalidade do DNA receptor, enquanto o DNA doador pode fazer isso apenas com uma parte do receptor DNA.

    Depois de pensar sobre isso, pensei em uma suposição para explicar isso. A proteína RecA envolvida na transformação está de alguma forma forçando esse processo a acontecer. A coisa é como? Não tenho nenhum conhecimento de química de enzimas e não consigo entender como isso pode acontecer? Então, essa suposição está correta? Em caso afirmativo, há algum material de referência explicando como a proteína RecA poderia estar fazendo isso?

  2. Isso me leva ao segundo problema. Este DNA recém-criado agora deve ter muitas irregularidades, como elas são corrigidas?

    Depois de pensar um pouco, cheguei à conclusão de que, como as proteínas RecA estão envolvidas no reparo do DNA, a proteína RecA simplesmente corrige as irregularidades. Esta linha de pensamento está correta?

Resumindo, presumi que uma proteína RecA está fazendo com que um fragmento de DNA que não pode formar pares de bases complementares com a totalidade do DNA receptor seja aceito no DNA receptor, após o que as irregularidades que surgem também são corrigidas por RecA. Esta linha de pensamento está correta?


Transformação bacteriana e células competentes e ndashA breve introdução

A transformação bacteriana é um processo natural no qual as células absorvem DNA estranho do ambiente em baixa frequência. Após a transformação, as células podem expressar a informação genética adquirida, que pode servir como uma fonte de diversidade genética e, potencialmente, fornecer benefícios para o hospedeiro (por exemplo, resistência a antibióticos). Com o advento da clonagem molecular na década de 1970, o processo de transformação foi explorado e aprimorado para introduzir DNA de plasmídeo recombinante em cepas bacterianas que se tornaram "competentes" ou mais permeáveis ​​para a absorção de DNA.

Nesta página


Transformação

Transformação é o absorção de material genético do meio ambiente por células bacterianas. Na natureza, esse material genético geralmente vem de bactérias lisadas adjacentes e pode incluir DNA de plasmídeo ou DNA fragmentado liberado no meio ambiente. Vários fatores promovem a transformação natural em diferentes bactérias, como a fase de crescimento das células (Baltrus e Guillemin, 2006) ou a presença de substâncias específicas (Meibom et al., 2005).

Embora nem todas as bactérias sejam naturalmente competentes para absorver DNA, elas podem se tornar competentes por meio da manipulação química em laboratório. Isso geralmente é feito usando cloreto de cálcio, que permeabiliza a membrana celular para que a bactéria possa facilmente absorver o plasmídeo de interesse. Os cientistas também podem usar a eletroporação, a aplicação de uma carga elétrica nas células, para aumentar a permeabilidade da membrana celular e, assim, a eficiência da transformação. Confira o blog da Addgene para saber como fazer suas próprias células competentes e nossa página de protocolos para saber mais sobre a transformação bacteriana no laboratório.

Gole! Embora as bactérias não "comam" exatamente plasmídeos como mostrado nesta história em quadrinhos, quando uma bactéria absorve um plasmídeo, os genes no plasmídeo podem dar a eles diferentes fenótipos. Por exemplo, este plasmídeo codifica um gene de proteína verde fluorescente que torna a bactéria verde fluorescente. Quadrinhos de Maya Kostman.


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Introdução

As bactérias (também conhecidas como procariontes) são os organismos mais antigos da Terra. Eles são mais conhecidos como flagelos que causam doenças mortais. No entanto, o que foi descoberto recentemente é que as bactérias também dão vida. Grandes comunidades de bactérias vivem dentro e sobre organismos superiores (como você) em conjuntos chamados microbiomas. Os microbiomas são cruciais para a saúde humana, animal e vegetal porque as bactérias do microbioma abastecem seus hospedeiros maiores com substâncias vitais. Os cientistas agora pensam que a vida multicelular na Terra co-evoluiu com as bactérias e que as vidas dos humanos e das bactérias estão intimamente ligadas.

Mas como podem as bactérias, que são 500 vezes menores que uma célula humana, nos matar ou, ao contrário, nos dar vida? Passei minha vida me perguntando como essas minúsculas criaturas conseguiram controlar o destino de organismos absurdamente maiores. O que os cientistas descobriram é que as bactérias têm poder em números e que possuem habilidades de comunicação sofisticadas que, antes, eram consideradas impossíveis para organismos tão pequenos e “primitivos”. Nesta narrativa, tentarei convencê-lo de que as bactérias podem “falar” umas com as outras, que são multilíngues, que atuam juntas em grupos coordenados e que essas capacidades dão às bactérias seu incrível poder.

As bactérias se comunicam umas com as outras - não com palavras, mas com produtos químicos. As bactérias liberam essas moléculas químicas (chamadas de autoindutores) em seu ambiente e, em seguida, usam o acúmulo dessas moléculas de sinalização para fazer um censo do número de células. Quando um número crítico de células é atingido, as bactérias reconhecem que estão em um grupo e se comportam como uma equipe coordenada exibindo novos comportamentos.

No filme de lapso de tempo mostrado aqui (Vídeo 1), uma espécie bacteriana específica (normalmente que vive no oceano) está crescendo em uma placa em um laboratório. Quando as células bacterianas atingem um número crítico, elas começam a produzir luz azul, um processo denominado "bioluminescência". A liberação de moléculas químicas chamadas autoindutores (normalmente invisíveis, mas retratados no desenho) faz com que as bactérias ativem a produção de luz. Este processo é chamado de “detecção de quorum”. Na Jornada para a descoberta, aprenderemos como os cientistas descobriram o sensor de quorum e como eles descobriram os autoindutores e seus “receptores” de interação que estão por trás desse fenômeno.

Vídeo 1 Crescimento de células de bactérias e detecção de quorum. O filme de lapso de tempo cobre um período de 5 horas. O campo de visão é de 0,2 milímetros. A animação mostra a produção de moléculas autoindutoras que fazem com que as bactérias se tornem bioluminescentes em alta densidade.

O sensor de quorum permite que as bactérias realizem coletivamente tarefas que não teriam sucesso se uma única bactéria agisse sozinha (Figura 1). Além da bioluminescência mostrada no filme, o quorum sensing controla a produção de toxinas que são cruciais para as bactérias causarem doenças. O sensor de quorum controla a formação de biofilme. Biofilmes são comunidades de células bacterianas aderidas a superfícies e uma forma predominante de vida bacteriana na Terra. Os biofilmes ajudam muitas bactérias a agir como patógenos e causar doenças. Biofilmes também são críticos para comportamentos bacterianos benéficos, como simbiose, bem como em aplicações industriais, como purificação de águas residuais e biorremediação. O sensor de quorum controla a competência, que é o processo que permite às bactérias adquirir DNA de outras células. A competência permite que as bactérias diversifiquem seus genomas e foi espetacularmente explorada para fazer com que as bactérias abrigassem genes estranhos na indústria de biotecnologia.

Figura 1 O sensor de quorum controla muitos comportamentos bacterianos em baixa e alta densidade celular.

As bactérias usam vários autoindutores de detecção de quorum para comunicação em ambientes complexos compostos de muitas espécies bacterianas, que é a situação normal em seu intestino, boca, pele e outros ambientes. Eles decodificam essas combinações químicas para distinguir o eu dos outros e, pensamos, ao fazer isso, eles distinguem o amigo do inimigo em potencial. Essa capacidade permite que as bactérias formem equipes com os membros corretos e prestativos da equipe e evitem ser enganadas por bactérias inimigas na vizinhança que podem estar tentando se aproveitar delas. Conhecer a si mesmo dos outros é crucial em toda a biologia.

Na Visão Geral do Conhecimento, discutirei como o sensor de quorum funciona por meio de um processo chamado transdução de sinal, que é acionado por moléculas autoindutoras que se ligam a receptores (proteínas detectoras específicas), o que subsequentemente leva a um grande número de genes sendo ativados ou desativados. Somente compreendendo profundamente como as bactérias se comunicam e os tipos de comportamento controlados pelo sensor de quorum, os cientistas podem pensar em maneiras astutas de mexer no processo e, ao fazer isso, inventar aplicativos de manipulação de sensor de quorum que terão sucesso. Na seção Fronteiras, fornecerei alguns exemplos de como os cientistas estão usando sua compreensão do sensor de quorum para melhorar a agricultura e combater doenças.

Eu espero que você continue lendo. Meu sonho é que este texto faça você se sentir como se estivesse olhando por cima do meu ombro, sobre os ombros de três importantes cientistas que vieram antes de mim e sobre os ombros da mais nova geração de cientistas em nossas aventuras. Espero que você entenda e sinta como nos sentimos ao fazer nossos experimentos, interpretar (e mal interpretar) nossos resultados, trilhar caminhos errados e também percorrer caminhos de sucesso, pois fizemos nossas descobertas mostrando que as bactérias podem "falar" com cada um de outros.


Experimento de Griffith

Experimento de Griffith, [1] relatado em 1928 por Frederick Griffith, [2] foi o primeiro experimento sugerindo que as bactérias são capazes de transferir informações genéticas por meio de um processo conhecido como transformação. [3] [4] As descobertas de Griffith foram seguidas por pesquisas no final dos anos 1930 e início dos anos 40 que isolaram o DNA como o material que comunicou essa informação genética.

A pneumonia foi uma causa séria de morte na esteira da pandemia de influenza espanhola pós-Primeira Guerra Mundial, e Griffith estava estudando a possibilidade de criar uma vacina. Griffith usou duas cepas de pneumococo (Streptococcus pneumoniae) bactérias que infectam camundongos - uma cepa do tipo III-S (lisa), que era virulenta, e uma cepa do tipo II-R (rugosa), que não era virulenta. A cepa III-S sintetizou uma cápsula de polissacarídeo que se protegeu do sistema imunológico do hospedeiro, resultando na morte do hospedeiro, enquanto a cepa II-R não tinha essa cápsula protetora e foi derrotada pelo sistema imunológico do hospedeiro. Um bacteriologista alemão, Fred Neufeld, descobriu os três tipos de pneumococo (Tipos I, II e III) e descobriu a reação quellung para identificá-los em vitro. [5] Até o experimento de Griffith, os bacteriologistas acreditavam que os tipos eram fixos e imutáveis, de uma geração para outra.

Neste experimento, as bactérias da cepa III-S foram mortas pelo calor e seus restos foram adicionados às bactérias da cepa II-R. Embora nenhum dos dois sozinho tenha prejudicado os camundongos, a combinação foi capaz de matar seu hospedeiro. Griffith também foi capaz de isolar as cepas vivas II-R e III-S vivas de pneumococo do sangue desses camundongos mortos. Griffith concluiu que o tipo II-R havia sido "transformado" na cepa III-S letal por um "princípio de transformação" que de alguma forma fazia parte da cepa III-S de bactérias mortas.

Hoje, sabemos que o "princípio transformador" que Griffith observou foi o DNA da bactéria da cepa III-s. Enquanto as bactérias foram mortas, o DNA sobreviveu ao processo de aquecimento e foi absorvido pela cepa de bactérias II-R. O DNA da cepa III-S contém os genes que formam a cápsula polissacarídica protetora lisa. Equipada com esse gene, a antiga cepa de bactérias II-R agora estava protegida do sistema imunológico do hospedeiro e podia matá-lo. A natureza exata do princípio de transformação (DNA) foi verificada nos experimentos feitos por Avery, McLeod e McCarty e por Hershey e Chase.


The Embryo Project Encyclopedia

Em 1951 e 1952, Alfred Hershey e Martha Chase conduziram uma série de experimentos no Carnegie Institute of Washington em Cold Spring Harbor, Nova York, que os genes verificados eram feitos de ácido desoxirribonucléico, ou DNA. Hershey e Chase realizaram seus experimentos, mais tarde chamados de experimentos Hershey-Chase, em vírus que infectam bactérias, também chamados de bacteriófagos. Os experimentos seguiram décadas de ceticismo dos cientistas sobre se o material genético era composto de proteína ou DNA. O experimento Hershey-Chase mais conhecido, chamado de experimento Waring Blender, forneceu evidências concretas de que os genes eram feitos de DNA. Os experimentos de Hershey-Chase resolveram o antigo debate sobre a composição dos genes, permitindo aos cientistas investigar os mecanismos moleculares pelos quais os genes funcionam nos organismos.

No início do século XX, os cientistas debatiam se os genes eram feitos de DNA ou proteína. Os genes controlam como os organismos crescem e se desenvolvem e são a base material para a capacidade dos organismos de herdar características como a cor dos olhos ou do pelo de seus pais. Em 1900, os cientistas identificaram a composição química completa, ou blocos de construção, do DNA. Eles também verificaram que todas as células continham DNA, embora a função do DNA permanecesse ambígua. Até a década de 1940, alguns cientistas aceitavam a ideia de que os genes não eram feitos de DNA. Em vez disso, esses cientistas apoiaram a ideia de que o DNA era uma molécula que mantinha a estrutura celular. Os cientistas apoiaram essa ideia em parte por causa de uma hipótese chamada hipótese dos tetranucleotídeos. Phoebus Levene, pesquisador do Rockefeller Institute for Medical Research em New York City, New York, propôs a hipótese de tetranucleotídeo para DNA em 1933. De acordo com Levene e outros proponentes da hipótese, o DNA consistia em conjuntos repetidos de quatro blocos de construção diferentes, chamados de nucleotídeos. Alguns cientistas concluíram que uma sequência repetitiva de nucleotídeos no DNA limitava o potencial de variabilidade. Esses cientistas consideraram a variabilidade necessária para o DNA funcionar como material genético. Em outras palavras, os genes precisavam ter a capacidade de variação suficiente para explicar as diferentes características que os cientistas observam nos organismos. Por outro lado, os cientistas descobriram que as proteínas tinham muito mais blocos de construção e, portanto, mais arranjos possíveis do que o DNA. A partir disso, alguns cientistas afirmaram que os genes devem ter sido feitos de proteína, não de DNA.

Os experimentos de Hershey-Chase não foram os primeiros estudos a se opor à teoria prevalecente no início dos anos 1900 de que o material genético era composto de proteínas. Em 1944, quase uma década antes do trabalho de Hershey e Chase, os cientistas publicaram evidências sólidas de que os genes eram feitos de DNA em vez de proteína. A partir de 1935, Oswald Avery, outro pesquisador do Rockefeller Institute, com seus associados de pesquisa Colin MacLeod e Maclyn McCarty, realizaram experimentos que mostraram que o DNA facilitou um fenômeno genético em bactérias chamado transformação bacteriana. A transformação bacteriana é o processo pelo qual uma bactéria pode obter e usar novo material genético de seu ambiente. Durante a transformação bacteriana, uma bactéria não causadora de doenças pode se transformar em bactérias causadoras de doenças se a bactéria não causadora de doenças for exposta a uma bactéria causadora de doenças. A transformação pode ocorrer mesmo se a cepa causadora da doença estiver morta, o que implica que a transformação bacteriana ocorre quando a bactéria não causadora da doença herda o material genético da bactéria causadora da doença. Avery e seus colegas descobriram que o fator herdado que causou a transformação bacteriana continha DNA. No entanto, o grupo de Avery não descartou a possibilidade de que algum componente não DNA em sua amostra tenha causado a transformação bacteriana, ao invés do próprio DNA. Por isso, muitos cientistas mantiveram a ideia de que as proteínas devem governar o fenômeno genético da transformação bacteriana.

A partir de 1951, Alfred Hershey e Martha Chase conduziram uma série de experimentos, mais tarde chamados de experimentos Hershey-Chase, que verificaram as descobertas de Avery e seus colegas. Hershey foi um pesquisador que estudou vírus na Carnegie Institution of Washington em Cold Spring Harbor, Nova York. Ele estudou vírus que infectam bactérias, também chamados de bacteriófagos ou fagos. Chase se tornou o técnico de pesquisa da Hershey em 1950.

Em seus experimentos, Hershey e Chase analisaram o que acontecia quando os fagos infectavam bactérias. Na década de 1950, os cientistas tinham evidências de como os fagos infectavam as bactérias. Eles descobriram que quando os fagos infectam uma bactéria hospedeira, os fagos primeiro se ligam ao exterior da bactéria. Então, um pedaço do fago entra na bactéria e subsequentemente se replica dentro da célula. Depois de muitas replicações, o fago faz com que a bactéria lise ou estourasse, matando assim a bactéria hospedeira. Os cientistas classificaram a peça replicante como material genético. Os cientistas também descobriram que os fagos continham duas classes de moléculas biológicas: DNA e proteína. Hershey e Chase procuraram determinar se o fragmento de replicação dos fagos que entrou na bactéria durante a infecção, as partes genéticas, eram apenas DNA.

Para realizar seus experimentos, Hershey e Chase utilizaram uma técnica chamada rotulagem de isótopos radioativos. Os elementos químicos podem existir em diferentes formas estruturais chamadas isótopos. Os isótopos do mesmo elemento são quase idênticos, mas os cientistas podem distingui-los por meios experimentais. Uma maneira de diferenciar os elementos químicos com diferentes isótopos é analisando sua radiação. Alguns isótopos são menos estáveis ​​do que outros e emitem sinais radioativos que os cientistas podem detectar. Hershey e Chase marcaram os fagos incorporando isótopos radioativos de fósforo e enxofre nesses fagos. Eles permitiram que alguns fagos se replicassem infectando bactérias, especificamente Escherichia coli, ou E. Coli, que os cientistas cresceram em enxofre radioativo. Os pesquisadores permitem que outros fagos infectem e se repliquem em E. Coli que os cientistas cresceram em fósforo radioativo. O DNA contém fósforo, mas não enxofre, enquanto a proteína contém enxofre, mas não fósforo. Portanto, quando Hershey e Chase marcaram fagos com isótopos radioativos desses elementos, eles colocaram marcadores separados e distinguíveis na proteína e nas partes de DNA dos fagos.

O primeiro experimento Hershey-Chase teve como objetivo confirmar as descobertas experimentais anteriores de que os componentes do DNA e da proteína dos fagos eram separáveis. Em 1950, Thomas Anderson, da Universidade da Pensilvânia, na Filadélfia, Pensilvânia, mostrou que os fagos consistiam em uma casca de proteína, ou revestimento, com DNA dentro da casca. Anderson descobriu que os fagos podiam liberar seu DNA e deixar para trás o que ele chamou de fantasma de proteína. Hershey e Chase replicaram os resultados experimentais de Anderson usando seu método de marcação de isótopos radioativos. Hershey e Chase foram capazes de separar os fagos em proteínas fantasmas contendo enxofre radioativo e DNA contendo fósforo radioativo. Eles descobriram que os fantasmas da proteína sulfurosa radioativa podiam se ligar às membranas bacterianas, enquanto o DNA do fósforo radioativo não. Hershey e Chase também testaram se as enzimas, moléculas que facilitam as reações químicas nas células, podem degradar o DNA. Eles descobriram que as enzimas não degradam o DNA dos fagos intactos, mas degradam o DNA dos fagos separados. Esses resultados indicaram que nos fagos intactos, o revestimento de proteína envolveu o DNA e protegeu o DNA da degradação.

Em outro experimento Hershey-Chase, Hershey e Chase mostraram que quando certos fagos infectavam E. Coli, os fagos injetaram seu DNA na bactéria hospedeira. Em 1951, Roger Herriot, da Universidade Johns Hopkins em Baltimore, Maryland, demonstrou que, depois que os fagos infectaram as bactérias, seus fantasmas protéicos permaneceram ligados ao exterior das células bacterianas enquanto seu DNA era liberado em outro lugar. Hershey e Chase tiveram como objetivo mostrar para onde o DNA do fago foi quando saiu do revestimento de proteína e entrou na bactéria. Os pesquisadores permitiram que fagos marcados com fósforo radioativo se ligassem às membranas celulares bacterianas em uma solução líquida e infectassem as bactérias. Usando uma centrífuga, Hershey e Chase giraram rapidamente as amostras para separar as células bacterianas da solução circundante. Após a centrifugação, eles descobriram que a maior parte do fósforo radioativo foi detectado nas células, e não na solução circundante, o que significa que o DNA do fago deve ter entrado nas células quando os fagos infectaram a bactéria.

O experimento Hershey-Chase mais conhecido foi o experimento final, também chamado de experimento Waring Blender, por meio do qual Hershey e Chase mostraram que os fagos apenas injetavam seu DNA na bactéria hospedeira e que o DNA servia como elemento genético replicador dos fagos. No experimento anterior, Hershey e Chase encontraram evidências de que os fagos injetaram seu DNA nas bactérias hospedeiras. No experimento Waring Blender, os cientistas descobriram que os fagos não injetaram nenhuma parte de seus revestimentos de proteína na bactéria hospedeira e os revestimentos de proteína permaneceram fora da bactéria, aderidos às membranas bacterianas. Para o experimento, Hershey e Chase prepararam duas amostras de E. Coli. Eles infectaram uma amostra com fagos marcados com fósforo radioativo e a outra amostra com fagos marcados com enxofre radioativo. Em seguida, eles mexeram cada amostra em um Waring Blender, que era um liquidificador convencional de cozinha. Eles usaram um liquidificador porque as centrífugas giravam muito rápido e destruiriam as células bacterianas. As forças de cisalhamento do liquidificador removeram as partículas de fago que aderiram às membranas bacterianas, mas preservaram a integridade das células e a maior parte do material fágico que entrou na célula. Na amostra marcada com fósforo que marcou o DNA, mas não a proteína, o liquidificador removeu quarenta por cento das partículas marcadas. Na amostra marcada com enxofre que marcou a proteína, mas não o DNA, o liquidificador removeu oitenta por cento das partículas marcadas. Esses resultados indicaram que o liquidificador removeu muito mais partes da proteína do fago do que partes do DNA, sugerindo que a proteína provavelmente permaneceu aderida ao exterior da célula durante a infecção. Como a proteína permaneceu fora da célula, não poderia ser o material genético em replicação.

O Waring Blender removeu apenas oitenta por cento do fago marcado com enxofre radioativo, então Hershey e Chase não puderam ser responsáveis ​​por vinte por cento do material de proteína do fago. Para mostrar que os vinte por cento ausentes da proteína do fago não entraram nas células bacterianas e se replicaram, os pesquisadores infectaram E. Coli com fago marcado com enxofre radioativo novamente, de modo que apenas as partes da proteína do fago foram marcadas. Eles prepararam duas amostras. Para uma amostra, Hershey e Chase agitaram as células no liquidificador para remover as partículas de fago aderidas à membrana bacteriana externa. Após agitação, eles permitiram que os fagos causassem a lise das células, liberando fagos recém-replicados. Para a segunda amostra, Hershey e Chase não agitaram as células no liquidificador e mediram os fagos replicados resultantes após a lise das células bacterianas. Na amostra agitada no liquidificador, menos de um por cento dos fagos replicados continham o marcador de enxofre radioativo. No entanto, na amostra que Hershey e Chase não mexeram no liquidificador, quase dez por cento dos fagos continham o rótulo de enxofre radioativo. O liquidificador mantém qualquer material fágico que entrou na célula bacteriana. Se a proteína fosse material genético que entrava na célula e se replicava, então Hershey e Chase teriam encontrado mais proteína rotulada com enxofre na amostra que mexeram com o liquidificador. A amostra que eles não mexeram tinha mais proteína rotulada com enxofre porque as camadas de proteína permaneceram do lado de fora da célula. Hershey e Chase concluíram que a proteína não era material genético e que o DNA era material genético.

Ao contrário dos experimentos de Avery sobre transformações bacterianas, os experimentos de Hershey-Chase foram mais ampla e imediatamente aceitos entre os cientistas. Os experimentos de Hershey-Chase acabaram principalmente com as suspeitas dos cientistas de que os genes eram feitos de proteínas, e não de DNA. No entanto, historiadores questionaram a conclusividade dos experimentos Hershey-Chase. Em todos os experimentos do Waring Blender, algumas proteínas e material de DNA permaneceram sem explicação. Mesmo no experimento final, quando Hershey e Chase permitiram que as células bacterianas se lisassem após mexer no liquidificador, os cientistas ainda recuperaram uma pequena quantidade de proteína, o que implica que alguma proteína entrou nas células durante a infecção. Além disso, a quantidade de proteína contaminante nos experimentos Hershey-Chase excedeu a quantidade de proteína contaminante que o grupo de Avery encontrou em seus experimentos.

Os historiadores da ciência estudaram por que os cientistas aceitaram mais prontamente os experimentos de Hershey-Chase do que os experimentos de Avery. O historiador da ciência Frederic Lawrence Holmes escreve que os cientistas aceitaram mais prontamente os resultados dos experimentos de Hershey-Chase porque Hershey se comunicou diretamente com cientistas céticos. Hershey enviou cartas a seus colegas nas quais detalhava as descobertas experimentais dos experimentos Hershey-Chase. Outro historiador da ciência, Michel Morange, escreve que os experimentos de Hershey-Chase foram realizados em uma época em que os cientistas estavam prontos para aceitar que o material genético poderia ser DNA. O grupo de Avery conduziu seus experimentos quando a hipótese do tetranucleotídeo era popular e poucos cientistas sustentaram que os genes continham DNA. De acordo com Morange, como Hershey e Chase conduziram seus experimentos anos depois, os cientistas reuniram mais evidências experimentais e estavam dispostos a considerar seriamente que os genes continham DNA.

Em 1953, James Watson e Francis Crick, dois cientistas da Universidade de Cambridge em Cambridge, Inglaterra, modelaram a estrutura tridimensional do DNA e demonstraram como o DNA pode funcionar como material genético. Em 1969, Hershey compartilhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina com dois outros cientistas, Max Delbrück e Salvador Luria, em parte por seu trabalho nos experimentos Hershey-Chase.


Transformação bacteriana: o método de choque térmico

Transformação é o processo que ocorre quando uma célula ingere DNA estranho de seu ambiente. A transformação pode ocorrer na natureza em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, a transformação é reproduzida artificialmente em laboratório por meio da criação de poros nas membranas celulares bacterianas. As células bacterianas que são capazes de absorver DNA do ambiente são chamadas de células competentes. No laboratório, as células bacterianas podem ser tornadas competentes e o DNA subsequentemente introduzido por um procedimento denominado método de choque térmico.

A transformação por choque térmico usa um ambiente rico em cálcio fornecido pelo cloreto de cálcio para neutralizar a repulsão eletrostática entre o DNA do plasmídeo e a membrana celular bacteriana. Um aumento repentino na temperatura cria poros na membrana plasmática da bactéria e permite que o DNA do plasmídeo entre na célula bacteriana. Este vídeo segue um procedimento passo a passo sobre como criar bactérias quimicamente competentes, realizar a transformação por choque térmico, aplicar placas nas bactérias transformadas e calcular a eficiência da transformação.

Procedimento

A transformação bacteriana é um método amplamente utilizado onde o DNA estranho é introduzido em uma bactéria, que pode então amplificar ou clonar o DNA. As células que têm a capacidade de absorver esse DNA prontamente são chamadas de células competentes. Embora a transformação ocorra naturalmente em muitos tipos de bactérias, os cientistas encontraram maneiras de induzir e aumentar artificialmente a competência de uma célula bacteriana. Neste vídeo, falaremos sobre uma dessas formas, a transformação por choque térmico.

Antes de falarmos sobre a técnica de choque térmico, vamos primeiro discutir o tipo de DNA mais comumente usado na transformação bacteriana: o plasmídeo. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de fita dupla que pode reduzir seu tamanho por superenrolamento, de modo que pode facilmente passar pelos poros de uma membrana celular.

Um plasmídeo contém algumas regiões importantes que valem a pena mencionar. Os plasmídeos comercialmente disponíveis contêm um sítio de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas reconhecidas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição, que clivam o DNA. Fragmentos de DNA de interesse do pesquisador podem ser inseridos no sítio de clonagem múltipla quando o plasmídeo e o fragmento de DNA são cortados com as mesmas endonucleases.

Os plasmídeos também contêm uma Origem de Replicação, ou ORI, que fornece informações à célula sobre onde a replicação do plasmídeo deve começar.

Além da origem de replicação e do local de clonagem múltipla, a maioria dos plasmídeos incluirá um gene de resistência a antibióticos. Este gene confere resistência a antibióticos a todas as células que contêm o plasmídeo, permitindo que essas células sobrevivam em meios contendo antibióticos.

Agora que discutimos os plasmídeos, vamos falar sobre as células nas quais eles serão introduzidos: as células competentes. O tipo de bactéria mais comumente usado na pesquisa e transformação de biologia molecular é a E. coli, que também habita o intestino grosso. As células normalmente se tornam competentes por meio da exposição a um ambiente rico em cálcio.

As cargas positivas dos íons de cálcio neutralizam as cargas negativas do plasmídeo e da parede celular bacteriana, dissipando a repulsão eletrostática e enfraquecendo a parede celular.

By exposing cells to a sudden increase in temperature, or heat shock, a pressure difference between the outside and the inside of the cell is created, that induces the formation of pores, through which supercoiled plasmid DNA can enter. After returning the cells to a more normal temperature, the cell wall will self-heal.

Once cells have taken up the plasmid, they will be able to grow on agar plates laced with antibiotic.

Before starting heat shock transformation, clean the work area and make sure all equipment is sterilized.

Ensure that you have enough media and agar prepared, which provide the nutrition to the bacteria you will make competent. Also be sure to sterilize all solutions via autoclaving. Allow liquid media to cool to room temperature before use and let the agar cool to 50-55ⶬ, the temperature at which antibiotic can be added and plates poured. Allow plates to cool to room temperature to solidify.

When working with bacteria, one should always use aseptic technique to maintain sterility. Aseptic technique typically involves the use of a Bunsen burner to sterilize instruments and reagents and create a convection current – which keeps airborne contaminants out of the workspace.

Immediately before the heat shock reaction, pre-warm your media to room temperature and antibiotic-containing LB agar plates to 37°C. Also make sure that your water bath is at 42°C.

Next, thaw chemically competent cells on ice.

Add, 1-5uL of 1ng/μL cold plasmid to the bacterial cells, mix gently, and return the cell and plasmid mixture to ice for 30 minutes.

When time is up, heat shock the cell and plasmid mixture by placing it in a water bath at 42ⶬ for 30 seconds.

Immediately after taking the tube out of the water bath put it on ice and add 450μL of media. Place it in a shaking incubator for 37°C for 1 hour at over 225 rpm so that the cells can recover.

Using proper aseptic technique, add 20-200uL bacteria to an LB agar plate and spread the medium around with a bacterial spreader. Incubate the plates overnight at 37ⶬ upside down to prevent exposure of bacteria to condensation.

The next day, the bacteria that have taken in the plasmid form colonies.

Next, count the colonies to calculate the transformation efficiency, which is the number of successful transformants divided by the total amount of DNA plated.

Now, colonies can be selected for further experimentation.

Prior to being made competent the bacteria used in transformation are stored in the freezer. They must be thawed on ice, spread on an agar plate – without antibiotics, and allowed grow overnight at 37ⶬ.

Using aseptic technique, select a bacterial colony from the agar plate and grow it up in a large 500 ml culture overnight at 37ⶬ in a shaking incubator – an instrument, which prevents sedimentation of the bacteria and even dispersal of nutrients in the media.

While the cells are growing make 0.1 molar calcium chloride and 0.1 molar calcium chloride plus 15% glycerol solutions, autoclave, and let cool.

Absorbance measurements are used to determine whether or not the bacteria are in their mid-log phase of growth, which means they will readily take up DNA. Once cells have reached this phase, place them on ice and keep them there throughout the procedure.

Next, separate the bacterial cells into two large centrifuge tubes and spin at 4°C. Pour off supernatant and resuspend in about 100 ml 0.1 molar of cold calcium chloride. Then, incubate cells on ice for 30 minutes. This step is repeated at least once more. Cycles of spinning and resuspending cells are often referred to as washing your cells.

After the final wash, resuspend cells in a cold 50mL 0.1 molar calcium chloride plus 15% glycerol solution. These cells are now chemically competent.

Distribute 50μL of bacteria into multiple microfuge tubes and store at -80ⶬ until ready for heat shock.

Many applications and variations of bacterial transformation exist.

In addition to heat shock, eletroporation is another common technique for transformation. As it’s name implies electroporation involves using electricity to make pores in the bacterial cell membrane through which DNA can pass.

With respect to screening for transformed bacteria, plasmids often contain a gene encoding the enzyme beta-galactosidase to aid with screening. When the substrate for this enzyme is included in agar plates, bacteria that have been transformed with plasmids containing an insert yield white colonies, while those that do not, yield blue colonies. This method is referred to as blue and white screening.

In most transformation experiments the goal is to get rapidly dividing bacteria to make large quantities of your plasmid, which includes your target gene. Following bacterial transformation, the next step is to grow up large quantities of the bacteria in antibiotic-containing liquid medium and perform plasmid purification, which, as it’s name suggests, involves purifying the plasmids from bacteria. Many commercial kits are available for this purpose.

Sometimes the goal of transformation is to have bacteria generate large amounts of protein encoded by the plasmid. Here you see bacterial cells being homogenized and lysed before a technique called affinity purification can be performed to isolate the target protein. After purifying large amounts of the protein it can then be crystallized and structure of the particular protein of interest can be identified.

You&rsquove just watched JoVE Introduction to Heat Shock Transformations. In this video we reviewed: what heat shock transformation is and how it works, the principal behind it and how to successful transform bacteria. Obrigado por assistir!


Questions regarding transformation in bacterial cells - Biology

Griffith's Transformation Experiment

Pneumococcus bacteria include two strains, a virulent S strain with a Smooth glycoprotein coat that kills mice (left), and a non-virulent R Rough strain that does not (middle). Heating destroys the virulence of S (right).

In the critical experiment, Frederick Griffith (1928) mixed heat-killed S com viver R and injected the combination into mice: the mouse died.The dead mouse's tissues were found to contain live bacteria with smooth coats gostar S. These bacteria were subsequently able to kill other mice, and continued to do so after several generations in culture.

Griffith concluded that algo in the heat-killed S bacteria 'transformed' the hereditary properties of the R bactérias. The nature of this 'princípio transformador' was unknown.

HOMEWORK . Suppose the combination of heat-killed S e viver R killed the primeiro generation of mice, but não the second or subsequent generations. What would you conclude about transformation?


The wonders of lacZΔ E. coli

The process of colony selection can be simplified by choosing a vector and E. coli strain that are compatible with blue/white colony screening. E. coli strains are described as having a lacZΔ when they carry a mutation that deletes part of the β-galactosidase (lacZ) gene. The remaining portion of the gene is called the ω-fragment. By using a plasmid that contains the deleted portion, or α-fragment, the function of the β-galactosidase gene can be restored once the plasmid has been incorporated into the bacterium. For blue/white colony screening, the plasmids have a multiple cloning region within the coding sequence of the α-fragment. When a sequence is inserted into this cloning region, the reading frame is disrupted, and a non-functional α-fragment is produced. This fragment is incapable of α-complementation. Growing the transformed bacteria on a plate containing 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) will allow you to distinguish between bacterial colonies formed from cells that contain plasmid with insert from those containing plasmid without insert. Any colony containing the plasmid (and therefore the functioning β-galactosidase gene) will turn blue, a result of the β-galactosidase activity. This is called α-complementation. Those colonies containing plasmids with an insert can be differentiated from those without an insert by the color of the colony (white versus blue). The insert disrupted the β-galactosidase gene, and therefore these colonies remain white. Colonies that did not pick up any plasmid at all will also appear as white colonies however, most plasmids contain an antibiotic resistance gene that can be used for selection (see below).

There are a number of strains including JM109, DH5α and XL-1 Blue that have the necessary deletions and can be used for blue/white colony screening. However, the mechanism for blue/white screening is slightly different for JM109 and XL-Blue. Both of these strains also have a second mutation, lacl q , which increases production of the lacl repressor that stops transcription from the lac operon , and thus production of the α-fragment, until a substrate is present. The substrate, the non-cleavable lactose analog, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), relieves the repression of the lac operon and allows transcription to occur. These strains will need to be grown on medium containing IPTG as well as X-gal.

Occasionally, colonies will appear pale blue, not white. As long as you see colonies on your plate that are darker blue, try picking some of the pale blue colonies, chances are good that they have the constructed plasmid that contains your DNA fragment.

In addition to the β-galactosidase marker, most cloning plasmids will also contain a gene that confers resistance to an antibiotic such as ampicillin. Using Ampicillin (or other appropriate antibiotic) in your growth medium should prevent bacteria that did not take up the plasmid during the transformation from growing. This way you can be fairly confident that the white colonies you see on your screening plate contain plasmid with insert.

And of course it is always a good idea to run controls with your cloning experiment. A plasmid-only control should give you a plate of blue colonies, and this will let you know that your transformation worked. To make sure that the antibiotic in your selective medium is effective, plate some untransformed cells. Few, if any, colonies should be observed on this plate.

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Looking for a quick and easy way to count colonies on agar plates? Download the Promega Colony Counter app. Take a picture of a plate, and the colonies are automatically counted within seconds. Results can be quickly refined by marking additional colonies and masking reflections.


Assista o vídeo: Conjugação, Transdução e Transformação - recombinação gênica e variação genética em Bactérias (Janeiro 2022).