Em formação

Peptídeo Imunodominante


Alguém pode me explicar o conceito de peptídeo imunodominante em linguagem simples ?? Eu li o artigo wiki, mas não o entendi claramente. Por favor ajude!
(Não estudo biologia desde os últimos 8 anos e agora estou passando por isso porque preciso dela para minha pesquisa. Portanto, se alguém puder descrevê-la em uma linguagem simples, seria muito útil)


Se você tiver um antígeno (algo estranho ao sistema imunológico, por exemplo, um vírus ou bactéria), ele consiste em muitos epítopos diferentes (regiões imunogênicas), como mostrado na figura abaixo (da Wikipedia alemã, Antikörper significa anticorpos). Os antígenos são captados por células especiais do sistema imunológico e processados ​​para obter pequenos peptídeos:

Para produzir anticorpos altamente específicos, o corpo precisa passar por uma reação imunológica específica contra esses peptídeos. No início desta reação, os anticorpos geralmente têm uma afinidade bastante baixa (ligam-se apenas fracamente) contra o seu antígeno. Isso é alterado pela chamada maturação de afinidade, na qual os anticorpos são mutados para fazer uma variedade de novos anticorpos diferentes. Estes são então novamente "verificados" em relação ao antígeno e aqueles com maior afinidade são selecionados positivamente.

Assim, os anticorpos com uma forte ligação ao seu antígeno são favorecidos contra aqueles que têm uma ligação menos forte que pode levar à seleção de apenas alguns anticorpos, mesmo se um antígeno complexo que tem muitos peptídeos imunogênicos for usado. Isso é positivo na medida em que esses anticorpos são muito eficazes no direcionamento de uma resposta imune contra o vírus / bactéria, mas pode ser crítico se o patógeno tiver uma alta taxa de mutação, pois isso leva a um patógeno que não tem mais esse antígeno.


Trata-se de reconhecer os patógenos intracelulares. Cada célula com núcleo divide algumas de suas proteínas intracelulares em pequenos pedaços chamados oligopeptídeo (OP daqui em diante). Portanto, se houver um patógeno intracelular dentro de uma célula, sua proteína também será dividida. Depois disso, a célula seleciona os OPs que deseja exibir na superfície. Depois que uma OP é selecionada, a célula se liga a uma proteína chamada MHC1 e a envia para a superfície celular. Portanto, há muitos MHC1-OP diferentes na superfície de cada célula com núcleo. Um grupo de células imunológicas chamadas células T estão reconhecendo o MHC1 com seu receptor de células T (doravante TCR). O TCR tem uma parte constante e uma parte variável. A parte constante depende da espécie e da pessoa, ela reconhece o MHC1. A parte variável é aleatória, ela reconhece o OP. Cada célula T (não ativada) tem uma parte variável diferente no TCR em sua superfície, de modo que cada uma delas reconhece um conjunto diferente de OP. Se uma célula T tem uma forte ligação à OP de um patógeno intracelular (doravante IPOP), ela será ativada e destruirá a célula infectada com o patógeno. Se uma célula T tem apenas ligação fraca a um IPOP, ou reconhece um OP de uma própria célula inofensiva, então ela não será ativada e morrerá depois de um tempo, ou no segundo caso, pode se tornar uma célula reguladora , que previne doenças auto-imunes. Após a ativação, a célula T começa a proliferar, se divide muitas vezes e esses clones tentam modificar seu receptor para se ligar ainda mais forte ao IPOP selecionado, para que possam encontrar e destruir as células infectadas de forma ainda mais eficaz. Existe um mecanismo no sistema imunológico que impede a ativação de mais do que algumas células T com diferentes TCRs contra os IPOPs de um único patógeno. Assim, por exemplo, contra um único patógeno, haverá cerca de uma dúzia de diferentes linhas de células T, que reconhecem uma dúzia de IPOP. Esses IPOPs são os peptídeos imunodominantes. Claro. pode haver IPOPs que são específicos do patógeno, mas as células T que os reconhecem não estão ou menos ativam-se. Esses são os peptídeos subdominantes.

Você pode encontrar mais informações sobre imunodominância na wikipedia.


Resumo

A susceptibilidade à esclerose múltipla (MS) está associada a certos haplótipos MHC de classe II, em particular HLA-DR2. Duas cadeias DR β, DRB1 ∗ 1501 e DRB5 ∗ 0101, são co-expressas no haplótipo HLA-DR2, resultando na formação de dois heterodímeros funcionais de superfície celular, HLA-DR2a (DRA ∗ 0101, DRB5 ∗ 0101) e HLA- DR2b (DRA ∗ 0101, DRB1 ∗ 1501). Ambos os isotipos podem apresentar um peptídeo imunodominante da proteína básica da mielina (MBP 84–102) para células T específicas de MBP de pacientes com EM. Determinamos a estrutura cristalina do HLA-DR2a complexado com MBP 86-105 com resolução de 1,9 Å. Uma comparação desta estrutura com a do HLA-DR2b complexado com MBP 85-99, relatado anteriormente, revela que o registro do peptídeo é deslocado por três resíduos, de modo que o peptídeo MBP é ligado em conformações notavelmente diferentes pelas duas moléculas de MHC. Esta mudança no registro de ligação é atribuível a um grande bolso P1 em DR2a, que acomoda Phe92, em conjunto com um bolso P4 relativamente raso, que é ocupado por Ile95. Em DR2b, em contraste, a pequena bolsa P1 acomoda Val89, enquanto a bolsa P4 profunda é preenchida por Phe92. Em ambos os complexos, no entanto, a metade C-terminal do peptídeo está posicionada mais alto na fenda de ligação do que em outras estruturas de MHC de classe II / peptídeo. Como resultado da mudança de registro, diferentes cadeias laterais do peptídeo MBP são exibidas para interação com receptores de células T nos complexos DR2a e DR2b. Estes resultados demonstram que as moléculas de MHC podem impor diferentes alinhamentos e conformações no mesmo peptídeo ligado como consequência de diferenças topológicas em seus locais de ligação de peptídeo, criando assim epítopos de células T distintos.


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Resultado da pesquisa: contribuição para o jornal ›Artigo› revisão por pares

T1 - Identificação de um peptídeo imunodominante de tenascina C citrulinada como principal alvo para autoanticorpos na artrite reumatóide

N1 - Informações de financiamento: Este trabalho foi financiado por doações da Arthritis Research UK, Kennedy Trust for Rheumatology Research e BT CURE.

N2 - Objetivos Investigamos se a tenascina C citrulinada (cTNC), uma proteína da matriz extracelular expressa em níveis elevados nas articulações de pacientes com artrite reumatoide (AR), é um alvo para os autoanticorpos na AR. Métodos Os locais citrulinados foram mapeados por espectrometria de massa no domínio globo semelhante ao fibrinogênio (FBG) de tenascina-C tratada com peptidilarginina desiminases (PAD) 2 e 4. Anticorpos para peptídeos cíclicos contendo locais citrulinados foram selecionados em soros de pacientes com AR por ELISA . A potencial reatividade cruzada com epítopos de anticorpo de proteína anticitrulinada (ACPA) bem estabelecidos foi testada por ensaios de inibição. A resposta de autoanticorpos a um peptídeo cTNC imunodominante foi então analisada em 101 soros pré-RA (mediana 7 anos antes do início) e duas grandes coortes independentes de RA. Resultados Nove resíduos de arginina dentro de FBG foram citrulinados por PAD2 e PAD4. Foram identificados dois peptídeos imunodominantes cTNC1 (VFLRRKNG-cit-ENFYQNW) e cTNC5 (EHSIQFAEMKL-cit-PSNF-cit-NLEG-cit-cit-KR). Anticorpos para ambos mostraram reatividade cruzada limitada com epítopos ACPA de α-enolase, vimentina e fibrinogênio, e nenhuma reatividade com peptídeos de fibrinogênio citrulinados compartilhando homologia de sequência com FBG. Os anticorpos cTNC5 foram detectados em 18% dos soros pré-AR e em 47% dos pacientes suecos de 1985 com AR e 51% de 287 pacientes norte-americanos com AR. A especificidade foi de 98% em comparação com 160 controles saudáveis ​​e 330 pacientes com osteoartrite. Conclusões Existem vários locais de citrulinação no domínio FBG da tenascina-C. Entre estes, um epítopo é reconhecido por autoanticorpos que são detectados anos antes do início da doença e que podem servir como um biomarcador útil para identificar pacientes ACPA-positivos com alta sensibilidade e especificidade na doença estabelecida.

AB - Objetivos Investigamos se a citrulinada tenascina-C (cTNC), uma proteína da matriz extracelular expressa em níveis elevados nas articulações de pacientes com artrite reumatoide (AR), é um alvo para os autoanticorpos na AR. Métodos Os locais citrulinados foram mapeados por espectrometria de massa no domínio globo semelhante ao fibrinogênio (FBG) de tenascina-C tratada com peptidilarginina desiminases (PAD) 2 e 4. Anticorpos para peptídeos cíclicos contendo locais citrulinados foram selecionados em soros de pacientes com AR por ELISA . A potencial reatividade cruzada com epítopos de anticorpo de proteína anticitrulinada (ACPA) bem estabelecidos foi testada por ensaios de inibição. A resposta de autoanticorpos a um peptídeo cTNC imunodominante foi então analisada em 101 soros pré-RA (mediana 7 anos antes do início) e duas grandes coortes independentes de RA. Resultados Nove resíduos de arginina dentro de FBG foram citrulinados por PAD2 e PAD4. Foram identificados dois peptídeos imunodominantes cTNC1 (VFLRRKNG-cit-ENFYQNW) e cTNC5 (EHSIQFAEMKL-cit-PSNF-cit-NLEG-cit-cit-KR). Os anticorpos para ambos mostraram reatividade cruzada limitada com epítopos ACPA de α-enolase, vimentina e fibrinogênio, e nenhuma reatividade com peptídeos de fibrinogênio citrulinados compartilhando homologia de sequência com FBG. Os anticorpos cTNC5 foram detectados em 18% dos soros pré-AR e em 47% dos pacientes suecos de 1985 com AR e 51% de 287 pacientes norte-americanos com AR. A especificidade foi de 98% em comparação com 160 controles saudáveis ​​e 330 pacientes com osteoartrite. Conclusões Existem vários locais de citrulinação no domínio FBG da tenascina-C. Entre estes, um epítopo é reconhecido por autoanticorpos que são detectados anos antes do início da doença e que podem servir como um biomarcador útil para identificar pacientes ACPA-positivos com alta sensibilidade e especificidade na doença estabelecida.


A ativação de células T pelo antígeno processado é igualmente bloqueada por peptídeos imunodominantes restritos a I-E e I-A

Recebeu o prêmio FRA273 da American Cancer Society Faculty Research.

Departamento de Bioquímica, Biologia Molecular e Biologia Celular, Northwestern University, Evanston, IL 60208, USASearch para mais artigos deste autor

Departamento de Bioquímica, Biologia Molecular e Biologia Celular, Northwestern University, Evanston

Departamento de Biologia Molecular e Patologia, Hospital Geral de Massachusetts, Boston

Departamento de Biologia Molecular e Patologia, Hospital Geral de Massachusetts, Boston

Departamento de Biologia Molecular e Patologia, Hospital Geral de Massachusetts, Boston

Departamento de Patologia, Harvard Medical School, Boston

Departamento de Bioquímica, Biologia Molecular e Biologia Celular, Northwestern University, Evanston

Departamento de Bioquímica, Biologia Molecular e Biologia Celular, Northwestern University, Evanston

Recebeu o prêmio FRA273 da American Cancer Society Faculty Research.

Departamento de Bioquímica, Biologia Molecular e Biologia Celular, Northwestern University, Evanston, IL 60208, USASearch para mais artigos deste autor

Resumo

A resposta da célula T a uma proteína solúvel requer o processamento do antígeno nativo por uma célula apresentadora de antígeno (APC) para um peptídeo contendo um determinante antigênico, que é transportado e ligado à superfície da célula apresentadora de antígeno, onde é subsequentemente reconhecido pela célula T específica no contexto da molécula Ia apropriada. Investigando a resposta de um citocromo de pombo cespecífico, híbrido de célula T restrito a I-E k, que reconhece um determinante presente dentro de um fragmento C-terminal de 10 aminoácidos da proteína, foi previamente demonstrado que os peptídeos homólogos ao peptídeo do citocromo de pombo c, mas que não eram estimulantes, bloquearam a resposta das células T ao citocromo de pombo c conforme processado e apresentado pela APC. Neste relatório, a capacidade de uma série de quatorze peptídeos sobrepostos de 20 aminoácidos, representando todo o comprimento da nuclease estafilocócica (Nase), foi avaliada quanto à sua capacidade de bloquear a resposta de um citocromo de pombo cde células T específicas para células apresentadoras pulsadas com antígeno. Apenas três peptídeos Nase bloquearam o citocromo de pombo restrito a I-Ek cresposta específica de células T. Dois deles, Nase 61–80 e Nase 91–110, funcionam como antígenos de células T na resposta restrita a I-A d e I-A b à Nase. O terceiro peptídeo bloqueador, Nase 101-120, não demonstrou ser um antígeno de células T. Dois outros peptídeos, Nase 51-70 e Nase 81-100, que são reconhecidos por células T específicas de Nase no contexto de I-E k, não têm efeito sobre o citocromo restrito a I-E k cresposta específica de células T. Nenhum desses peptídeos bloqueia a resposta heteroclítica de maior afinidade do citocromo de pombo c-células T específicas para citocromo da traça da lagarta do tabaco c. Além disso, a resposta de uma célula T restrita a I-Ak à ovalbumina foi bloqueada pelo citocromo restrito a I-Ek c peptídeos de três espécies diferentes. Assim, os peptídeos sem homologia de sequência de aminoácidos primária óbvia, e que não são capazes de ser reconhecidos no contexto do mesmo Ia, competem entre si pelos locais no APC necessários para a apresentação do antígeno processado às células T. Esses resultados sugerem que há estruturas na superfície de APC, além de Ia, que são necessárias para a apresentação eficaz do antígeno após o processamento. Um candidato adequado para tal material de superfície celular é a proteína de ligação de peptídeo recentemente identificada, PBP72 / 74 (Lakey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 1987. 84: 1659).


A ativação de células T pelo antígeno processado é igualmente bloqueada por peptídeos imunodominantes restritos a I-E e I-A

A resposta da célula T a uma proteína solúvel requer o processamento do antígeno nativo por uma célula apresentadora de antígeno (APC) para um peptídeo contendo um determinante antigênico, que é transportado e ligado à superfície da célula apresentadora de antígeno, onde é subsequentemente reconhecido pela célula T específica no contexto da molécula Ia apropriada. Investigando a resposta de um híbrido de célula T restrito a I-Ek específico de citocromo C de pombo, que reconhece um determinante presente dentro de um fragmento C-terminal de 10 aminoácidos da proteína, foi previamente demonstrado que os peptídeos homólogos ao peptídeo de o citocromo c de pombo, mas que não foi estimulante, bloqueou a resposta das células T ao citocromo c de pombo processado e apresentado por APC. Neste relatório, a capacidade de uma série de quatorze peptídeos com sobreposição de 20 aminoácidos, representando todo o comprimento da nuclease estafilocócica (Nase), foi avaliada quanto à sua capacidade de bloquear a resposta de um híbrido de célula T específico de citocromo C de pombo ao antígeno - células de apresentação pulsadas. Apenas três peptídeos Nase bloquearam a resposta de células T específicas do citocromo C de pombo restrito a I-Ek. Dois deles, Nase 61-80 e Nase 91-110, funcionam como antígenos de células T na resposta restrita a I-Ad e I-Ab à Nase. O terceiro peptídeo bloqueador, Nase 101-120, não demonstrou ser um antígeno de células T. Dois outros peptídeos, Nase 51-70 e Nase 81-100, que são reconhecidos por células T específicas de Nase no contexto de I-Ek, não têm efeito na resposta de células T específicas de citocromo c restritas a I-Ek. Nenhum destes péptidos bloqueia a resposta heteroclítica de afinidade mais elevada das células T específicas do citocromo c de pombo ao citocromo c da traça do tabaco. Além disso, a resposta de uma célula T restrita a I-Ak à ovalbumina foi bloqueada pelos peptídeos citocromos c restritos a I-Ek de três espécies diferentes. Assim, os peptídeos sem homologia de sequência de aminoácidos primária óbvia, e que não são capazes de ser reconhecidos no contexto do mesmo Ia, competem entre si pelos locais no APC necessários para a apresentação do antígeno processado às células T. Esses resultados sugerem que existem estruturas na superfície de APC, além de Ia, que são necessárias para a apresentação eficaz do antígeno após o processamento. Um candidato adequado para um tal material de superfície celular é a proteína de ligação a péptidos recentemente identificada, PBP72 / 74 (Lakey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1987. 84: 1659).


Identificação de um epítopo de célula T CD8 atípico codificado por citomegalovírus murino ORF-M54 ganhando dominância após deleção das especificidades de células T CD8 antivirais imunodominantes

O controle da infecção por citomegalovírus murino (mCMV) é mediado principalmente por células T CD8, com quatro especificidades dominando em camundongos BALB / c. A deleção funcional dos respectivos epítopos imunodominantes (IDEs) no vírus mutante Δ4IDE revelou um controle ainda eficiente da infecção. Em um modelo murino de transplante de células hematopoiéticas e infecção com Δ4IDE, um ensaio de triagem de biblioteca de estrutura de leitura aberta (ORF) específico de mCMV indicou uma forte reatividade de células T CD8 contra o produto ORF-M54, o homólogo de mCMV essencial e altamente conservado do CMV humano DNA polimerase UL54, que é um conhecido indutor de proteção in vivo contra mCMV por imunização de DNA. Aplicando algoritmos de bioinformática para predição de epítopo de células T CD8, os peptídeos de pontuação máxima foram usados ​​para estimular células T CD8 isoladas ex vivo e para gerar linhas de células T citolíticas, mas esta abordagem falhou em identificar epítopo (s) M54. Como alternativa, uma biblioteca de peptídeos consistindo em 549 10-meros com um deslocamento de dois aminoácidos (aa), cobrindo a sequência aa completa da proteína M54, foi sintetizada e usada para a estimulação. Uma região de 12 aa provou englobar um epítopo. Um 'passeio de alanina' sobre este 12-mer antigênico e todos os 11-, 10- e 9-meros possíveis derivados dele revelaram resíduos aa críticos para antigenicidade, e truncamentos terminais identificaram o H-2D (d) apresentou 8-mer M5483- 90 como o epítopo ideal. Uma frequência aumentada das células T CD8 correspondentes na ausência dos 4 IDEs indicou imunodominação pelas células T CD8 específicas de IDE como um mecanismo pelo qual a geração de células T CD8 específicas de M54 é inibida após infecção com mCMV de tipo selvagem.


Doença auto-imune

Tak W. Mak, Mary E. Saunders, em The Immune Response, 2006

V. ESPALHAMENTO DE EPITOPE

A “propagação do epítopo” foi brevemente discutida nos Capítulos 26 e 27. Este termo é usado para descrever o fenômeno no qual o sistema imunológico parece expandir sua resposta (não importa como desencadeada) além dos epítopos imunodominantes reconhecidos pela primeira vez por células T e B para incluir novos epítopos crípticos, não reativos cruzados que são reconhecidos só muito mais tarde. O aparecimento de respostas a esses epítopos posteriores fundamenta a progressão da AID e caracteriza sua fase crônica. A teoria é que as ações de células anti-selfefectoras e citocinas sobre células ou antígenos próprios portadores dos epítopos imunodominantes originais podem ter efeitos além da primeira resposta anti-self aguda. Esta primeira resposta é geralmente autolimitada e não leva à AID clínica. No entanto, as ações efetoras desencadeadas durante esta resposta ao epítopo original podem interromper a estrutura celular ou a conformação da proteína para expor antígenos próprios inteiramente novos ( espalhamento de epítopo intermolecular) ou novos epítopos em autoantígenos existentes (espalhamento de epítopo intramolecular) Esses epítopos teriam sido previamente sequestrados totalmente do sistema imunológico, ou processados ​​em quantidades insuficientes para ativar as células T, de modo que os linfócitos que os reconhecem não seriam deletados durante o estabelecimento da tolerância central ou anergizados na periferia. Após a exposição, as moléculas contendo os epítopos crípticos tornam-se disponíveis pela primeira vez, ou em quantidades aumentadas, para absorção pelas DCs. Além disso, o dano ao tecido da resposta autorreativa original pode resultar na liberação de sinais de estresse que podem induzir a maturação das DC. Dentro desse meio inflamatório, os linfócitos T e B autorreativos dirigidos contra epítopos das proteínas recém-expostas tornam-se ativados e expandem o ataque autorreativo para tecidos próprios adicionais onde essas proteínas são expressas. Pode então haver virtualmente nenhum limite para a duração da resposta auto-imune, porque novos epítopos crípticos seriam continuamente revelados à medida que a destruição do tecido prosseguisse. Além disso, os linfócitos autorreativos podem gerar células de memória para todos os epítopos, iniciais e crípticos. Essas células de memória ficariam à espreita e poderiam ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos surtos subsequentes da doença.

Evidências para apoiar a importância da propagação de epítopos na AID foram obtidas a partir de vários modelos de camundongos. Em camundongos NOD, o dano inicial às ilhotas pancreáticas surge de um ataque autoimune ao GAD. No entanto, à medida que a doença progride, os linfócitos dirigidos contra as proteínas das células das ilhotas β, como a insulina e a carboxipeptidase H, são ativados. Se, em vez de uma resposta imune, a tolerância é induzida a GAD em camundongos NOD, os animais não desenvolvem diabetes e nenhuma resposta contra antígenos crípticos é subsequentemente montada. Da mesma forma, em camundongos suscetíveis à indução de EAE, as respostas anti-autoimunes montadas contra uma série de epítopos ocorrem em uma sequência reproduzível que pode ser atribuída à propagação do epítopo. Essas respostas não podem ocorrer até que o ataque inicial à MBP tenha sido sustentado, isto é, até que os epítopos crípticos sejam expostos pelo dano inicial do tecido. Na verdade, a fase tardia da doença EAE nestes animais é comprovadamente devida à propagação do epítopo.

Exemplos comprovados de disseminação de epítopos em humanos são poucos. No PG, a formação de bolhas na boca quase sempre precede a formação de bolhas na pele, e as bolhas na boca estão associadas à presença de autoanticorpos direcionados contra a proteína desmogleína-3. Somente após os ataques à desmogleína-3 exporem epítopos na proteína relacionada desmogleína-1 é que os autoanticorpos direcionados contra esta última proteína são produzidos e a formação de bolhas na pele começa. Esta cadeia de eventos constitui um exemplo de propagação de epítopos intermoleculares. O PF fornece um exemplo de disseminação de epítopo intramolecular. Pacientes com FP (que apresentam bolhas na pele, mas não na boca) exibem apenas anticorpos anti-desmogleína-1. Antes do início dos sinais clínicos da doença, os pacientes predispostos a PF produzem autoanticorpos anti-desmogleína que são direcionados contra um epítopo no terminal C da proteína desmogleína-1. Com o início da doença clínica, autoanticorpos direcionados contra epítopos no terminal N da proteína desmogleína-1 podem ser encontrados no soro. Especula-se que a resposta subclínica contra os epítopos C-terminais expõe os epítopos N-terminais e invoca a produção de anticorpos que formam bolhas na pele. A disseminação do epítopo também foi invocada para explicar a ativação de linfócitos policlonais evidente no LES. Por exemplo, múltiplos clones de células T e B reativos a diferentes epítopos de snRNP podem ser encontrados em diferentes estágios da progressão de AID em pacientes com LES. Um fenômeno semelhante ocorre durante o desenvolvimento de doenças semelhantes ao LES em MRL / lpr camundongos.

Alguns cientistas especulam que, além de exacerbar a AID, a disseminação do epítopo às vezes pode controlá-la. Se um epítopo exposto como resultado do ataque autoimune induz preferencialmente uma resposta Th2 (em vez de Th1), a inflamação pode ser regulada negativamente. Com a diminuição da inflamação deve ocorrer redução do dano ao tecido, diminuição da ativação de APCs e redução da exposição de novos epítopos. Esse processo pode contribuir para a resolução da resposta autoimune original sem provocar qualquer outra patologia. Este cenário pode ser responsável pelo fato de que alguns AID que aparecem de forma aguda (como GBS) desaparecem por conta própria em um subconjunto de pacientes.


Introdução

A imunodominância é um fenômeno bem estabelecido pelo qual alguns peptídeos específicos são selecionados como epítopos representativos de um determinado antígeno de proteína para o sistema imunológico. Uma resposta restrita a um antígeno pode ser necessária para manter o grande número de células T de memória dentro de uma faixa estreita que pode ser acomodada pelos linfonodos, já que uma parte das células T de memória é mantida ao longo da vida 1. Muitos estudos têm como objetivo compreender os mecanismos de seleção de epítopos e imunodominância, uma série de hipóteses relacionadas às características estruturais dos antígenos 2,3,4, sensibilidade às proteases 5,6, afinidade do epítopo para o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II 7, T - freqüência do precursor da célula 8 e afinidade do receptor da célula T para o peptídeo / MHCII 9 foram considerados. Esses estudos sugerem que os mecanismos desenvolvidos para a seleção dos epítopos dominantes são bastante complexos. A apresentação de antígenos às células T CD4 + por células apresentadoras de antígenos (APCs) começa pela captação de antígenos exógenos e seu processamento que envolve a transferência através de uma série de compartimentos endossômicos contendo ambiente desnaturante adequado, chaperonas acessórias e catepsinas 10. A molécula MHCII recentemente sintetizada se associa à cadeia invariante de classe II (Ii), que a direciona para compartimentos endossômicos especializados (MIIC), onde o Ii é proteolisado até que apenas um fragmento conhecido como o peptídeo de cadeia invariante associado à classe II (CLIP) permaneça ligado em a fenda de ligação do peptídeo MHCII. O deslocamento eficiente do CLIP do sulco do MHC requer a molécula acessória HLA-DM em humanos ou H2-M em camundongos (DM) 11. O DM funciona induzindo mudanças conformacionais em complexos MHCII / peptídeo resultando na liberação do peptídeo ligado induzindo um MHCII 12 receptivo a peptídeo. Um MHCII receptivo a peptídeos pode rapidamente amostrar um grande conjunto de peptídeos derivados de proteínas adquiridas exogenamente e o DM ajuda a moldar a seleção de epítopos. O detalhe molecular das interações entre DM e MHCII sugere um papel crítico para DM na seleção de epítopos imunodominantes 13. No entanto, essa função não foi totalmente avaliada. É importante ressaltar que não há consenso sobre quando os epítopos imunodominantes são selecionados. Não está claro em que estágio durante este processo o DM exerce sua função.

A questão é se os epítopos são primeiro cortados pelas enzimas de processamento de antígenos e depois capturados, ou se os epítopos se ligam ao MHCII como proteínas de comprimento total ou fragmentos grandes e são então processados. Diferentes catepsinas e o microambiente adequado para apoiar suas funções são fornecidos no MIIC 14. Vários estudos usando inibidores de protease em combinação com camundongos Tg deficientes em protease revelaram que várias enzimas, incluindo catepsinas (Cat) S, L e F podem contribuir para o processamento de antígenos e a remoção de CLIP 15. A asparaginil endopeptidase (AEP), presente nos compartimentos endossômicos tardios, é necessária para a clivagem e ativação das catepsinas 16, embora um papel para geração, bem como destruição de epítopos antigênicos por AEP também tenham sido relatados 17.

Para abordar diretamente questões específicas sobre as etapas de processamento de antígenos e a seleção de epítopos imunodominantes, desenvolvemos um sistema reducionista de processamento de antígenos para moléculas MHCII que incorpora componentes definidos e prediz com precisão epítopos imunodominantes de antígenos proteicos 18. O sistema inclui HLA-DR (DR), CatB, CatH e CatS purificados solúveis que processam antígenos de proteína em peptídeos e DM. A espectrometria de massa é usada para sequenciar os picos exclusivos derivados de cada proteína. Os epítopos candidatos são verificados quanto à precisão em camundongos transgênicos DR e humanos 18. Devido à composição molecular definida, este sistema se presta a elucidar as etapas envolvidas no processamento do antígeno e os papéis que os componentes individuais desempenham na seleção do epítopo. Neste estudo, abordamos os determinantes da imunodominância. Nós relatamos que epítopos imunodominantes de diferentes fontes antigênicas são selecionados com base em sua abundância relativa que depende da sensibilidade diferencial às catepsinas ou da resistência à dissociação mediada por DM.


Uma base estrutural para o reconhecimento do receptor de células T humanas imunodominantes

A resposta das células T CD8 + anti-influenza em adultos HLA-A2-positivos é quase exclusivamente direcionada aos resíduos 58-66 da proteína da matriz do vírus (MP (58-66)). Vβ17Vα10.2 Receptores de células T (TCRs) contendo uma sequência conservada de arginina-serina-serina na região determinante de complementaridade 3 (CDR3) do Vβ segmento dominar esta resposta. Para investigar a base molecular da seleção imunodominante em uma população não consanguínea, determinamos a estrutura cristalina de Vβ17Vα10,2 em complexo com MP (58–66) –HLA-A2 com uma resolução de 1,4 Å. Mostramos que, enquanto o TCR normalmente se encaixa em uma cadeia lateral exposta do peptídeo, nesta estrutura MP (58-66) expõe apenas os átomos da cadeia principal. Esta orientação distinta de Vβ17Vα10.2, que é quase ortogonal ao sulco de ligação de peptídeo de HLA-A2, facilita a inserção da arginina conservada em Vβ CDR3 em um entalhe na superfície do MP (58–66) –HLA-A2. Este modo de ligação até então desconhecido é a base da resposta das células T imunodominantes.


Métodos

Material do paciente

Amostras de sangue periférico de pacientes com COVID-19 e HDs foram coletadas de acordo com a Declaração de Helsinque após aprovação pelos comitês de revisão institucional (Comitê de Ética da Área Vasta Emilia Romagna, protocolo número 177/2020, 10 de março de 2020, e alterações subsequentes) . Cada participante deu consentimento informado. Todos os pacientes COVID-19 foram testados positivos para SARS-CoV-2 usando transcriptase reversa PCR de um teste de esfregaço do trato respiratório superior (nariz / garganta) em laboratórios credenciados. Os pacientes foram divididos em grupos com base no status da doença COVID-19 durante a coleta de amostras de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde 54. As amostras foram coletadas da seguinte forma: durante a hospitalização / doença aguda para pacientes COVID-19 com doença moderada, grave ou crítica, 3 meses pós-teste de PCR positivo para pacientes COVID-19 assintomáticos, antes de novembro de 2019 para HDs e 4-5 meses após alta hospitalar, e com teste de PCR SARS-CoV-2 negativo, para pacientes convalescentes que se recuperaram de doença COVID-19 grave ou crítica (Tabela 1 e Tabela Suplementar 1). O sangue periférico foi coletado em tubos de ácido etilenodiaminotetracético após o isolamento subsequente de PBMCs usando centrifugação de densidade Ficoll-Paque de acordo com o protocolo padrão. PBMCs foram suspensos em soro fetal bovino (FBS, Sigma, F7524) com dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, D4540, 10% v / v) e armazenados em nitrogênio líquido.

Tipagem HLA

PBMCs isolados de pacientes COVID-19 foram descongelados e lavados com RPMI 1640 (Life Technologies, 21875-034) suplementado com FBS (Sigma, F7524, 10% v / v), penicilina-estreptomicina (Life Technologies, 15140-122, 1% v / v) e nuclease de benzonase (Merck-Millipore, 70746-4, 2500 U / mL), ressuspensa e incubada a 37 ° C por 30 min. Para as amostras de HD, o DNA foi isolado diretamente do sangue total. PBMCs foram contados e até 1.000.000 de células foram divididas em alíquotas para subsequente isolamento de DNA. O DNA foi isolado usando o DNeasy Blood & amp Tissue Kit (Qiagen, 69506) de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). A tipagem HLA foi feita usando sequenciamento de última geração de acordo com o protocolo do fabricante (GenDx).

Epítopos SARS-CoV-2

Todo o proteoma SARS-CoV-2 obtido da UniProt (Proteome ID: UP000464024) foi considerado para prever epítopos SARS-CoV-2 usando a versão R (v.3.6.3) e data.table (v.12.6). List of selected SARS-CoV-2- epitopes is provided in Supplementary Data 1. Potential SARS-CoV-2 epitopes were first selected based on a predicted NetChop-3.1 24 proteasomal processing score >0.5, followed by a final selection step based on the highest predicted binding affinity to major histocompatibility complex (MHC) according to NetMHCpan-4.0 25 . In addition, SARS-CoV-2 epitopes that were predicted to be most immunogenic by the science community were included for analysis 34,55,56,57 . Predicted 9-11mer epitopes from the following ORFs of the SARS-CoV-2 proteome were included in the final analysis: ORF 1ab, 3a, 6, 7a, 7b, 8, 9b, 10, 14, envelope, membrane, nucleoprotein, and spike protein. Fifty SARS-CoV-2 epitope–HLA combinations were selected for each of the top 10 most prevalent HLA alleles in Italy, which resulted in a total of 438 unique peptides that were synthesized by the Chemical Biology group, Leiden University Medical Centre. Predicted scores for proteasomal processing (NetChop-3.1) and binding affinity (NetMHCpan-4.0) of the 50 selected and 18 CD8 T cell-recognized epitopes for each allele are shown in Supplementary Fig. 6. The COVID-19 CoV Genomics tool (v.1.6.0, data cut-off: 28-01-2021) 28 , enabled by the GISAID initiative, was used to determine whether CD8 T cell-recognized epitopes were located in positions of the SARS-CoV-2 proteome with a high level of SNVs.

Generation of ultraviolet (UV)-cleavable pHLA monomers

The UV-cleavable peptides were synthesized in house by the Chemical Biology group, Leiden University Medical Centre. Recombinant HLA-A*01:01, A*02:01, A*03:01, A*11:01, A*24:02, B*07:02, B*08:01, B*15:01, B*18:01, and B*51:01 heavy chains and human beta-2 microglobulin (B2M) were produced in Escherichia coli and isolated from resulting inclusion bodies 58 . HLA-A and B heavy chains were refolded in the presence of B2M and UV-cleavable peptides (Supplementary Table 4) followed by gel filtration, biotinylation, and final purification by high-performance liquid chromatography 59 .

Generation of fluorescent pHLA multimers

MHC complexes were loaded with the selected SARS-CoV-2 peptides via UV-induced ligand exchange 60,61 . In brief, pHLA complexes with UV-sensitive peptide were subjected to 254/366 nM UV light for 1 h at 4 °C in the presence of a rescue peptide. Fourteen fluorochrome–streptavidin reagents (Supplementary Table 5) were conjugated to pHLA monomers (100 μg/mL). For each pHLA monomer, conjugation was performed with 2 fluorochrome–streptavidin reagents resulting in dual fluorescent color codes for up to 75 epitopes. Subsequently, milk (Sigma, LP0031, 1% w/v) was added to block and capture unspecific peptide-binding residues, and fluorescently labeled pHLA multimers were incubated for 30 min on ice. Finally, D-biotin (Sigma, B4501, 26.3 mM) and NaN3 (0.02% w/v) in phosphate-buffered saline (PBS) was added to block residual binding sites.

Flow cytometry assays

For the pHLA multimer assay and the phenotypic characterization, PBMC samples were thawed and washed with RPMI 1640 (Life Technologies, 21875-034) supplemented with human serum (Sigma, H3667, 10% v/v), penicillin–streptomycin (Life Technologies, 15140-122, 1% v/v), and benzonase nuclease (Merck-Millipore, 70746-4, 2500 U/mL) resuspended and incubated at 37 °C for 30 min before staining. Antigen-specific CD8 T cells were stained for 15 min at 37 °C with pHLA multimers (Supplementary Table 6) encoding unique dual fluorescent code combinations for up to 75 epitopes. Subsequently, cells were stained for 20 min on ice with antibodies (Supplementary Table 6). LIVE/DEAD Fixable IR Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, L10199) staining was performed for 20 min on ice either during antibody staining (pHLA multimer assay, 1/200) or for 10 min on ice after antibody staining (phenotypic characterization, 1/400). Individual staining was performed in the presence of Brilliant Staining Buffer Plus (BD, 563794) according to the manufacturer’s protocol (BD), and samples were washed twice before acquisition.

Analysis of SARS-CoV-2-specific CD8 T cell responses

The following gating strategy shown in Supplementary Fig. 1 was applied to identify CD8 + T cells: (i) selection of live (IRDye low-dim) single-cell lymphocytes [forward scatter (FSC)-W/H low, side scatter (SSC)-W/H low, FSC/SSC-A], (ii) selection of anti-CD8 + and “dump” (anti-CD4, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19) negative cells. Antigen-specific CD8 T cell responses that were positive for only two and none of the other fluorescent pHLA multimers were identified using Boolean gating. Full gating strategy is shown. A minimum of 1000 CD8 T cells was required for further analysis. Cut-off values for the definition of positive antigen-specific CD8 T cell responses were ≥5 events and ≥0.005% of total CD8 T cells. To avoid experimental bias, analysis was carried out without prior knowledge about clinical patient characteristics, and to reduce researcher bias caused by manual gating, only positive responses that were confirmed by three independent researchers were defined as real. Data were analyzed using either the BD FACSDiva (v.8.0.1) or the FlowJo (v.10.6.2/10.7) software. To monitor the reproducibility of the assay system, reference samples with up to 10 CD8 T cell responses present at varying frequencies were included in each analysis.

Peptide stimulation assay

PBMCs were thawed, washed, and incubated at 37 °C for 30 min or at 4 °C for 60 min (if cells were simultaneously used for single-cell RNA sequencing) in RPMI 1640 (Life Technologies, 21875-034) supplemented with human serum (Sigma, H3667, 10% v/v), penicillin–streptomycin (Life Technologies, 15140-122, 1% v/v), and benzonase nuclease (Merck-Millipore, 2500 U/mL). After washing, equal amounts of PBMCs (≥1 × 10 5 cells per condition) were cultured for 12 h at 37 °C in the presence of GolgiPlug (BD, 555029, 1/1000) and either the TTDPDFLGRY peptide (2 μg/mL) or equimolar amounts of DMSO (negative control). Phorbol 12-myristate 13-acetate (50 ng/mL) and Ionomycin (1 μg/mL) were used as technical control. Cells were washed and stained for 20 min on ice with surface marker antibodies (Supplementary Table 6). After washing, cells were stained for 10 min on ice with the LIVE/DEAD Fixable IR Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, L10119, 1/400). Subsequently, cells were washed, fixed, and permeabilized using the Foxp3 Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, 00-5523-00) according to the manufacturer’s protocol. Intracellular cytokines were stained for 20 min on ice with antibodies (Supplementary Table 6). Cells were washed twice before acquisition. The following gating strategy shown in Supplementary Fig. 3a–c was applied to identify CD8 + T cells using FlowJo (v.10.6.2/10.7): (i) selection of live (IRDye low-dim) single-cell lymphocytes [FSC-W/H low, SSC-W/H low, FSC/SSC-A], (ii) selection of anti-CD8 + and “dump” (anti-CD4, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19) negative cells. For the final analysis, acquired CD8 T cell counts of the DMSO control were normalized to the SARS-CoV-2 peptide condition. To quantify the frequency of TNF + , IFNγ + , IL-2 + , and IL-17 + CD8 + cells, gates were set based on the DMSO control. Cut-off values for the definition of cytokine-producing CD8 T cell responses stimulated with the cognate SARS-CoV-2 peptide were ≥5 events and a ≥2-fold difference in the magnitude of TNF + , IFNγ + , IL-2 + , or IL-17 + CD8 + cells compared to the DMSO control.

Flow cytometer settings

All samples were analyzed on the BD FACSymphony A5. The following 21-color instrument settings were used on the BD FACSymphony A5: blue laser (488 nm at 200 mW): FITC, 530/30BP, 505LP BB630, 600LP, 610/20BP BB700, 710/50BP, LP685 BB790, 750LP, 780/60BP. Red laser (637 nm at 140 mW): APC, 670/30BP, APC-R700, 690LP, 630/45BP, IRDye and APC-H7, 750LP, 780/60BP. Violet laser (405 nm at 100 mW): BV421, 420LP, 431/28BP BV480, 455LP, 470/20BP BV605, 565LP, 605/40BP BV650, 635LP, 661/11BP BV711, 711/85, 685 BV750, 735LP, 750/30BP, BV786, 780/60BP, 750LP. UV laser (355 nm at 75 mW): BUV395, 379/28BP, BUV496, 515/30BP, 450LP BUV563, 550LP, 580/20BP BUV615, 600LP, 615/20BP BUV661, 630LP, 670/25BP BUV737, 735/44BP, 770LP BUV805, 770LP, 819/44BP. Yellow-green laser (561 nm at 150 mW): PE, 586/15BP PE Dazzle-594, 600LP, 610/20BP PerCP-eF710, 710/50BP, 685LP PE-Cy7, 750LP, 780/60BP. Appropriate compensation controls were included in each analysis.

Análise estatística

Differences in the magnitude of identified CD8 T cell responses (stratified based on antigen source or recognized epitope) or the expression of inhibitory receptors between CD8 + and pHLA + cells were assessed using non-parametric Mann–Whitney você teste. Phenotypic changes of SARS-CoV-2-specific CD8 T cells during acute COVID-19 disease and convalescence were assessed using Wilcoxon matched-pairs signed-rank test. Differences were considered significant if P & lt 0,05. Only significant P values are displayed. Data cut-off for all analyses was 4 January 2021. Statistical analysis was performed using Excel (v.16.36) and PRISM 8 (v.8.4.0).

Single-cell RNA and TCR sequencing

PBMCs were thawed, washed, and incubated for 60 min on ice in cold RPMI 1640 (Life Technologies, 21875-034) supplemented with human serum (Sigma, H3667, 10% v/v), penicillin–streptomycin (Life Technologies, 15140-122, 1% v/v), and benzonase nuclease (Merck-Millipore, 70746-4, 2500 U/mL). TotalSeq TM -streptavidin oligo barcoded reagents (Supplementary Table 5) were conjugated to pHLA monomers (100 μg/mL) as described above and used to stain SARS-CoV-2-specific CD8 T cells for 30 min on ice (Supplementary Table 6). Subsequently cells were stained for 20 min on ice with antibodies (Supplementary Table 6) and LIVE/DEAD Fixable IR Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, L10119, 1/200). Stained cells from individual patients were pooled and washed before sorting on the FACSAria Fusion. The following gating strategy shown in Supplementary Fig. 4a was applied to identify and sort CD8 + cells into PBS supplemented with bovine serum albumin (0.04% w/v) at 4 °C: (i) selection of live (IRDye low-dim) single-cell lymphocytes [FSC-W/H low, SSC-W/H low, FSC/SSC-A], (ii) selection of anti-CD8 + positive and “dump” (anti-CD4, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19) negative cells.

The single-cell suspension was split into two samples that were successively loaded onto a Chromium Single Cell Chip (10× Genomics) according to the manufacturer’s protocol for co-encapsulation with barcoded Gel Beads at a capture rate of

1000 individual cells per sample. The following 10× Genomics kits were used to produce the Gel Bead-In Emulsions (GEMs) and the resulting sequence libraries (Gene expression library, Feature Barcode library, TCR library) according to the manufacturer’s protocol: For batch I, Chromium Next GEM Single Cell 5’ Library and Gel Bead Kit v1.1 (10× Genomics, PN-1000167), Chromium Next Gem Single Cell V(D)J Reagent Kit v1.1 (10× Genomics, PN-1000165), Chromium Single Cell 5’ Library Construction Kit (10× Genomics, PN-1000020), Chromium Single Cell 5’ Feature Barcode Library Kit (10× Genomics, PN1000080), and Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit (10× Genomics, PN-100127). For batch II, Chromium Next GEM Single Cell 5’ Kit v2 (10× Genomics, PN-1000265), Chromium Next GEM Single Cell 5’ Reagent Kits v2 (Dual Index) (10× Genomics, PN-2000263), Library Construction Kit (10× Genomics, PN-1000190), 5’ Feature Barcode Kit (10× Genomics, PN-1000256), and Chromium Next GEM Chip K Single Cell Kit (10× Genomics, PN-1000287). The 3 libraries were combined in relative fractions of 0.785, 0.085, and 0.130 in order to generate sufficient reads per cell for each type of library. The final library pool was sequenced on a NextSeq Mid Flowcell, with 150 cycle chemistry kit in paired-end fashion 26-8-130 bp (batch I) or 26-10-10-130 bp (batch II). Full-length TCR V(D)J segments were enriched from amplified cDNA from 5’ libraries via PCR amplification using: for batch I, the Chromium Single-Cell V(D)J Enrichment Kit (10× Genomics, PN-1000005), or for batch II, the Chromium Single Cell Human TCR Amplification Kit (10× Genomics, PN-1000252) according to the manufacturer’s protocol (10× Genomics).

Single-cell RNA and TCR sequencing data analysis

The Cell Ranger Software Suite (v.3.1.0) was used to perform sample de-multiplexing, barcode processing, and single-cell 5’ unique molecular identifier (UMI) counting. Single-cell RNA-sequencing data analysis was performed with Scanpy (v.1.5.1) 62 . Data were analyzed with Python (v.3.7.6) 63 , pandas (v.1.0.1) 64 and NumPy (v.1.18.1) 65 were used for data manipulation, and Seaborn (v.0.10.0) 66 and Matplotlib (v.3.1.3) 67 were used for plotting. The single-cell transcriptome and TCR sequencing data were analyzed separately for batch I (n = 5, COVID-087, -096, -117, -143, and -153) and batch II (n = 1, COVID-131) to avoid the batch effect introduced by the use of the different Chromium Single Cell Chip. The following criteria were applied to each cell in batch I and batch II: gene count between 200 and 2500, mitochondrial gene percentage <0.25, and ribosomal gene percentage >0.2. Data were then normalized to depth 10,000, and ln(1 + x) was calculated. After filtering and normalization, the number of counts per cell and percentage of mitochondrial genes were regressed out from the data using scanpy.pp.regress_out. Data were subsequently scaled with scanpy.pp.scale using default parameters. Principal component analysis was computed on highly variable genes. A neighborhood graph of observations was computed with 50 principal components and n_neighbors = 10. UMAP plots were plotted using scaled data. Louvain clustering was performed with scanpy.tl.louvain with default parameters. Marker genes were found using scanpy.tl.rank_genes_groups on the non-scaled data (use_raw = True) with t teste. Differentially expressed genes were filtered based on a minimum ln fold change of >1 or <−1 and Benjamini–Hochberg false discovery rate value of <0.05. Differentially expressed genes that were upregulated or downregulated were used for gene ontology analysis using DAVID Bioinformatics Resources (v.6.8) (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) using default settings. TCR sequences for each single T cell were assembled by Cell Ranger vdj pipeline (v.3.1.0), leading to the identification of CDR3 sequences and the re-arranged TCR gene. TCR repertoire analysis was performed with Scirpy (v.0.3) 68 . TCR diversity and TCR clonal size were estimated using scirpy.tl.alpha_diversity and ir.pl.clonal_expansion (performing the normalization), respectively. V(D)J gene usage was estimated with scirpy.pl.vdj_usage. Abundance of particular TRB V segments was estimated with scirpy.pl.group_abundance, performing the normalization.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


Assista o vídeo: Immunodominant Epitopes Identified on the LPSfrom Different Enterobacteria Using Phage Display (Novembro 2021).