Em formação

Como são medidas as propriedades fisiológicas das mitocôndrias?


esta é a minha primeira pergunta no BiologySE. Sou estudante de Física e Matemática atualmente fazendo um projeto de simulação de crescimento celular. Estou fazendo uma pesquisa bibliográfica e tenho uma pergunta sobre métodos experimentais de biologia celular.

Eu entendo que o potencial de membrana é uma medida da funcionalidade mitocondrial (maior potencial significa cadeia de transporte de elétrons mais eficiente). Além disso, o volume mitocondrial também é um indicador de eficiência mitocondrial (maior volume, maior área, mais locais para fazer o transporte de elétrons).

Gostaria de ter alguns pontos elucidados.

Em particular, o potencial e o volume da membrana mitocondrial podem ...

  • ser medido para uma única célula ou apenas em uma população?

  • ser medido de forma não destrutiva, deixando a célula viva?

  • ser medidos simultaneamente, ou experimentos medindo um necessariamente tornam o outro indisponível?

Estou pensando principalmente em em vitro experimentos, é claro.


Um método simples seria expressar uma proteína fluorescente na célula que se localiza especificamente na mitocôndria. mito-dsRed é uma proteína fluorescente vermelha que possui essa propriedade; pode ser expresso a partir de um plasmídeo.

Usando microscopia fluorescente e análise de imagem, você seria capaz de medir as propriedades geométricas das mitocôndrias. Isso também pode ser feito em um nível de célula única (usando microscópio confocal) e de forma não destrutiva. O volume pode ser medido pelo que é conhecido como empilhamento Z - uma técnica automatizada pela qual o microscópio tira vários instantâneos 2D em planos diferentes e os empilha para construir uma imagem 3D.

Você também pode implementar isso em células vivas; este método é chamado de imagem de células vivas.


Metabolismo

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metabolismo, a soma das reações químicas que ocorrem dentro de cada célula de um organismo vivo e que fornecem energia para os processos vitais e para a síntese de novo material orgânico.

Os organismos vivos são únicos no sentido de que podem extrair energia de seus ambientes e usá-la para realizar atividades como movimento, crescimento, desenvolvimento e reprodução. Mas como os organismos vivos - ou suas células - extraem energia de seus ambientes e como as células usam essa energia para sintetizar e montar os componentes dos quais as células são feitas?

As respostas a essas perguntas estão nas reações químicas mediadas por enzimas que ocorrem na matéria viva (metabolismo). Centenas de reações coordenadas de várias etapas, alimentadas por energia obtida de nutrientes e / ou energia solar, acabam por converter materiais prontamente disponíveis nas moléculas necessárias para o crescimento e a manutenção.

As propriedades físicas e químicas dos componentes dos seres vivos tratados neste artigo são encontradas nos artigos fotossíntese e proteína de lipídios e hormônios celulares de carboidratos.


Monitoramento de mudanças dinâmicas nos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose usando um sensor de cálcio codificado geneticamente

Mudanças dinâmicas na concentração de cálcio intracelular em resposta a vários estímulos regulam muitos processos celulares, como proliferação, diferenciação e apoptose (1). Durante a apoptose, o acúmulo de cálcio na mitocôndria promove a liberação de fatores pró-apoptóticos da mitocôndria para o citosol (2). É, portanto, de interesse medir diretamente o cálcio mitocondrial em células vivas in situ durante a apoptose. A imagem fluorescente de alta resolução de células carregadas com corantes indicadores de cálcio sintéticos raciométricos e não raciométricos de excitação dupla tem se mostrado uma ferramenta confiável e versátil para estudar vários aspectos da sinalização de cálcio intracelular. Medir os fluxos de cálcio citosólico usando essas técnicas é relativamente simples. No entanto, medir os níveis de cálcio intramitocondrial em células intactas usando indicadores de cálcio sintético, como rhod-2 e rhod-FF, é mais desafiador. Os indicadores sintéticos direcionados às mitocôndrias têm respostas embotadas a aumentos repetitivos no cálcio mitocondrial e interrompem a morfologia mitocondrial (3). Além disso, os indicadores sintéticos tendem a vazar das mitocôndrias ao longo de várias horas, o que os torna inadequados para experimentos de longo prazo. Assim, os indicadores de cálcio geneticamente codificados com base na proteína fluorescente verde (GFP) (4) ou aequorina (5) direcionados às mitocôndrias têm facilitado muito a medição da dinâmica do cálcio mitocondrial. Aqui, descrevemos um método simples para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial em resposta a diferentes estímulos. O método é baseado em microscopia de fluorescência de 'raciometric-pericam' que é seletivamente direcionada para mitocôndrias. Pericam raciométrico é um indicador de cálcio baseado na fusão de proteína fluorescente amarela circularmente permutada e calmodulina (4). A ligação do cálcio ao pericam raciométrico causa um deslocamento de seu pico de excitação de 415 nm para 494 nm, enquanto o espectro de emissão, que atinge o pico em torno de 515 nm, permanece inalterado. O pericam ratiométrico se liga a um único íon de cálcio com uma constante de dissociação in vitro de

1,7 μM (4). Essas propriedades do pericam raciométrico permitem a quantificação de mudanças rápidas e de longo prazo na concentração de cálcio mitocondrial. Além disso, descrevemos a adaptação desta metodologia a um microscópio de imagem de cálcio de campo amplo padrão com conjuntos de filtros comumente disponíveis. Usando dois agonistas distintos, o agonista purinérgico ATP e a droga indutora de apoptose estaurosporina, demonstramos que esse método é apropriado para monitorar alterações na concentração de cálcio mitocondrial com resolução temporal de segundos a horas. Além disso, também demonstramos que o pericam raciométrico também é útil para medir a fissão / fragmentação mitocondrial durante a apoptose. Assim, o pericam raciométrico é particularmente adequado para a medição contínua de longo prazo da dinâmica do cálcio mitocondrial durante a apoptose.


Conteúdo

As mitocôndrias podem ter várias formas diferentes. [23] Uma mitocôndria contém membranas externa e interna compostas de bicamadas fosfolipídicas e proteínas. [17] As duas membranas têm propriedades diferentes. Devido a esta organização de membrana dupla, existem cinco partes distintas para uma mitocôndria:

  1. A membrana mitocondrial externa,
  2. O espaço intermembrana (o espaço entre as membranas externa e interna),
  3. A membrana mitocondrial interna,
  4. O espaço das cristas (formado por dobras da membrana interna), e
  5. A matriz (espaço dentro da membrana interna).

As mitocôndrias despojadas de sua membrana externa são chamadas de mitoplastos.

Membrana externa Editar

o membrana mitocondrial externa, que envolve toda a organela, tem 60 a 75 angstroms (Å) de espessura. Tem uma proporção de proteína para fosfolipídeo semelhante à da membrana celular (cerca de 1: 1 em peso). Ele contém um grande número de proteínas integrais de membrana chamadas porinas. A principal proteína de tráfego é o canal aniônico voltagem-dependente formador de poros (VDAC). O VDAC é o transportador primário de nucleotídeos, íons e metabólitos entre o citosol e o espaço intermembrana. [24] [25] É formado como um barril beta que se estende pela membrana externa, semelhante ao da membrana bacteriana gram-negativa. [26] Proteínas maiores podem entrar na mitocôndria se uma sequência de sinalização em seu N-terminal se ligar a uma grande proteína multissubunidade chamada translocase na membrana externa, que então as move ativamente através da membrana. [27] As pró-proteínas mitocondriais são importadas por meio de complexos de translocação especializados.

A membrana externa também contém enzimas envolvidas em atividades diversas, como o alongamento de ácidos graxos, a oxidação da epinefrina e a degradação do triptofano. Estas enzimas incluem monoamina oxidase, NADH-citocromo c-redutase insensível à rotenona, quinurenina hidroxilase e ácido graxo Co-A ligase. A ruptura da membrana externa permite que as proteínas no espaço intermembrana vazem para o citosol, levando à morte celular. [28] A membrana mitocondrial externa pode se associar à membrana do retículo endoplasmático (ER), em uma estrutura chamada MAM (membrana ER associada à mitocôndria). Isso é importante na sinalização de cálcio ER-mitocôndria e está envolvido na transferência de lipídios entre o ER e as mitocôndrias. [29] Fora da membrana externa, existem pequenas (diâmetro: 60Å) partículas chamadas subunidades de Parson.

Espaço intermembrana Editar

o espaço intermembranar mitocondrial é o espaço entre a membrana externa e a membrana interna. É também conhecido como espaço perimitocondrial. Como a membrana externa é livremente permeável a pequenas moléculas, as concentrações de pequenas moléculas, como íons e açúcares, no espaço intermembranar são as mesmas que no citosol. [17] No entanto, proteínas grandes devem ter uma sequência de sinalização específica para serem transportadas através da membrana externa, de forma que a composição proteica desse espaço seja diferente da composição proteica do citosol. Uma proteína que está localizada no espaço intermembranar dessa forma é o citocromo c. [28]

Membrana interna Editar

A membrana mitocondrial interna contém proteínas com três tipos de funções: [17]

  1. Aqueles que realizam as reações de cadeia redox de transporte de elétrons, que geram ATP na matriz
  2. Proteínas de transporte específicas que regulam a passagem de metabólitos para dentro e para fora da matriz mitocondrial

Ele contém mais de 151 polipeptídeos diferentes e tem uma proporção muito alta de proteína para fosfolipídeo (mais de 3: 1 em peso, que é cerca de 1 proteína para 15 fosfolipídeos). A membrana interna abriga cerca de 1/5 da proteína total de uma mitocôndria. [30] Além disso, a membrana interna é rica em um fosfolipídeo incomum, a cardiolipina. Este fosfolipídio foi originalmente descoberto em corações de vaca em 1942 e geralmente é característico das membranas plasmáticas mitocondriais e bacterianas. [31] A cardiolipina contém quatro ácidos graxos em vez de dois e pode ajudar a tornar a membrana interna impermeável. Ao contrário da membrana externa, a membrana interna não contém porinas e é altamente impermeável a todas as moléculas. Quase todos os íons e moléculas requerem transportadores de membrana especiais para entrar ou sair da matriz. As proteínas são transportadas para a matriz por meio do complexo translocase da membrana interna (TIM) ou por meio do OXA1L. [27] Além disso, há um potencial de membrana através da membrana interna, formado pela ação das enzimas da cadeia de transporte de elétrons. A fusão da membrana interna é mediada pela proteína da membrana interna OPA1. [32]

Cristae Edit

A membrana mitocondrial interna é compartimentada em numerosas dobras chamadas cristas, que expandem a área da superfície da membrana mitocondrial interna, aumentando sua capacidade de produzir ATP. Para mitocôndrias hepáticas típicas, a área da membrana interna é cerca de cinco vezes maior que a membrana externa. Essa proporção é variável e as mitocôndrias das células que têm maior demanda de ATP, como as células musculares, contêm ainda mais cristas. As mitocôndrias dentro da mesma célula podem ter densidade de crista substancialmente diferente, com aquelas que são necessárias para produzir mais energia tendo muito mais superfície de crista-membrana. [33] Essas dobras são cravejadas com pequenos corpos redondos conhecidos como F1 partículas ou oxissomos. [34]

Edição de matriz

A matriz é o espaço delimitado pela membrana interna. Ele contém cerca de 2/3 do total de proteínas em uma mitocôndria. [17] A matriz é importante na produção de ATP com o auxílio da ATP sintase contida na membrana interna. A matriz contém uma mistura altamente concentrada de centenas de enzimas, ribossomos mitocondriais especiais, tRNA e várias cópias do genoma do DNA mitocondrial. Das enzimas, as principais funções incluem a oxidação do piruvato e dos ácidos graxos e o ciclo do ácido cítrico. [17] As moléculas de DNA são empacotadas em nucleoides por proteínas, uma das quais é TFAM. [35]

Os papéis mais proeminentes das mitocôndrias são produzir a moeda de energia da célula, ATP (isto é, fosforilação de ADP), por meio da respiração e regular o metabolismo celular. [18] O conjunto central de reações envolvidas na produção de ATP é conhecido coletivamente como o ciclo do ácido cítrico ou ciclo de Krebs. No entanto, a mitocôndria tem muitas outras funções além da produção de ATP.

Edição de conversão de energia

Um papel dominante para as mitocôndrias é a produção de ATP, conforme refletido pelo grande número de proteínas na membrana interna para essa tarefa. Isso é feito pela oxidação dos principais produtos da glicose: piruvato e NADH, que são produzidos no citosol. [18] Esse tipo de respiração celular, conhecido como respiração aeróbica, depende da presença de oxigênio, que fornece a maior parte da energia liberada. [36] Quando o oxigênio é limitado, os produtos glicolíticos são metabolizados por fermentação anaeróbica, um processo que é independente da mitocôndria. [18] A produção de ATP a partir de glicose e oxigênio tem um rendimento aproximadamente 13 vezes maior durante a respiração aeróbica em comparação com a fermentação. [37] As mitocôndrias de plantas também podem produzir uma quantidade limitada de ATP quebrando o açúcar produzido durante a fotossíntese ou sem oxigênio usando o nitrito de substrato alternativo. [38] O ATP atravessa a membrana interna com a ajuda de uma proteína específica e atravessa a membrana externa via porinas. [39] O ADP retorna pela mesma rota.

Piruvato e o ciclo do ácido cítrico Editar

As moléculas de piruvato produzidas pela glicólise são ativamente transportadas através da membrana mitocondrial interna e para a matriz, onde podem ser oxidadas e combinadas com a coenzima A para formar CO2, acetil-CoA e NADH, [18] ou podem ser carboxilados (por piruvato carboxilase) para formar oxaloacetato. Esta última reação "preenche" a quantidade de oxaloacetato no ciclo do ácido cítrico e é, portanto, uma reação anaplerótica, aumentando a capacidade do ciclo de metabolizar acetil-CoA quando as necessidades de energia do tecido (por exemplo, no músculo) são repentinamente aumentadas pela atividade. [40]

No ciclo do ácido cítrico, todos os intermediários (por exemplo, citrato, iso-citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato) são regenerados durante cada volta do ciclo. Adicionar mais de qualquer um desses intermediários à mitocôndria significa, portanto, que a quantidade adicional é retida dentro do ciclo, aumentando todos os outros intermediários à medida que um é convertido no outro. Portanto, a adição de qualquer um deles ao ciclo tem efeito anaplerótico e sua remoção tem efeito cataplerótico. Essas reações anapleróticas e catapleróticas irão, durante o curso do ciclo, aumentar ou diminuir a quantidade de oxaloacetato disponível para combinar com acetil-CoA para formar ácido cítrico. Isso, por sua vez, aumenta ou diminui a taxa de produção de ATP pela mitocôndria e, portanto, a disponibilidade de ATP para a célula. [40]

O acetil-CoA, por outro lado, derivado da oxidação do piruvato, ou da beta-oxidação dos ácidos graxos, é o único combustível a entrar no ciclo do ácido cítrico. A cada volta do ciclo, uma molécula de acetil-CoA é consumida para cada molécula de oxaloacetato presente na matriz mitocondrial e nunca é regenerada. É a oxidação da porção de acetato de acetil-CoA que produz CO2 e a água, com a energia assim liberada capturada na forma de ATP. [40]

No fígado, a carboxilação do piruvato citosólico em oxaloacetato intra-mitocondrial é uma etapa inicial na via gluconeogênica, que converte lactato e alanina desaminada em glicose, [18] [40] sob a influência de altos níveis de glucagon e / ou epinefrina no sangue. [40] Aqui, a adição de oxaloacetato à mitocôndria não tem um efeito anaplerótico líquido, pois outro intermediário do ciclo do ácido cítrico (malato) é imediatamente removido da mitocôndria para ser convertido em oxaloacetato citosólico, que é finalmente convertido em glicose, em um processo que é quase o reverso da glicólise. [40]

As enzimas do ciclo do ácido cítrico estão localizadas na matriz mitocondrial, com exceção da succinato desidrogenase, que está ligada à membrana mitocondrial interna como parte do Complexo II. [41] O ciclo do ácido cítrico oxida a acetil-CoA a dióxido de carbono e, no processo, produz cofatores reduzidos (três moléculas de NADH e uma molécula de FADH2) que são uma fonte de elétrons para a cadeia de transporte de elétrons e uma molécula de GTP (que é prontamente convertida em ATP). [18]

NADH e FADH2: a cadeia de transporte de elétrons Editar

Os elétrons do NADH e FADH2 são transferidos para o oxigênio (O2), uma molécula rica em energia, [36] e hidrogênio (prótons) em várias etapas através da cadeia de transporte de elétrons. NADH e FADH2 as moléculas são produzidas na matriz por meio do ciclo do ácido cítrico, mas também são produzidas no citoplasma pela glicólise. Equivalentes redutores do citoplasma podem ser importados através do sistema de transporte malato-aspartato de proteínas antiportadoras ou alimentar a cadeia de transporte de elétrons usando um transporte de fosfato de glicerol. [18] Complexos de proteínas na membrana interna (NADH desidrogenase (ubiquinona), citocromo c redutase e citocromo c oxidase) realizam a transferência e a liberação incremental de energia é usada para bombear prótons (H +) para o espaço intermembrana. Esse processo é eficiente, mas uma pequena porcentagem de elétrons pode reduzir prematuramente o oxigênio, formando espécies reativas de oxigênio, como o superóxido. [18] Isso pode causar estresse oxidativo na mitocôndria e pode contribuir para o declínio da função mitocondrial associado ao processo de envelhecimento. [42]

Conforme a concentração de prótons aumenta no espaço intermembrana, um forte gradiente eletroquímico é estabelecido através da membrana interna. Os prótons podem retornar à matriz através do complexo ATP sintase, e sua energia potencial é usada para sintetizar ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico (Peu) [18] Este processo é chamado de quimiosmose e foi descrito pela primeira vez por Peter Mitchell, [43] [44] que recebeu o Prêmio Nobel de Química de 1978 por seu trabalho. Mais tarde, parte do Prêmio Nobel de Química de 1997 foi concedido a Paul D. Boyer e John E. Walker por seu esclarecimento sobre o mecanismo de funcionamento da ATP sintase. [45]

Edição de produção de calor

Sob certas condições, os prótons podem entrar novamente na matriz mitocondrial sem contribuir para a síntese de ATP. Este processo é conhecido como vazamento de prótons ou desacoplamento mitocondrial e é devido à difusão facilitada de prótons na matriz. O processo resulta na energia potencial não aproveitada do gradiente eletroquímico de prótons sendo liberada como calor. [18] O processo é mediado por um canal de prótons chamado termogenina, ou UCP1.[46] A termogenina é encontrada principalmente no tecido adiposo marrom, ou gordura marrom, e é responsável pela termogênese sem tremores. O tecido adiposo marrom é encontrado em mamíferos e atinge seus níveis mais elevados no início da vida e em animais em hibernação. Em humanos, o tecido adiposo marrom está presente no nascimento e diminui com a idade. [46]

Armazenamento de íons de cálcio Editar

As concentrações de cálcio livre na célula podem regular uma série de reações e são importantes para a transdução de sinal na célula. As mitocôndrias podem armazenar temporariamente o cálcio, um processo que contribui para a homeostase do cálcio na célula. [47] [48] Sua capacidade de absorver cálcio rapidamente para liberação posterior os torna bons "tampões citosólicos" para o cálcio. [49] [50] [51] O retículo endoplasmático (RE) é o local de armazenamento mais significativo de cálcio, [52] e há uma interação significativa entre a mitocôndria e o RE em relação ao cálcio. [53] O cálcio é absorvido pela matriz pelo uniporter de cálcio mitocondrial na membrana mitocondrial interna. [54] É impulsionado principalmente pelo potencial de membrana mitocondrial. [48] ​​A liberação desse cálcio de volta para o interior da célula pode ocorrer por meio de uma proteína de troca sódio-cálcio ou por meio de vias de "liberação de cálcio induzida pelo cálcio". [54] Isso pode iniciar picos de cálcio ou ondas de cálcio com grandes alterações no potencial de membrana. Eles podem ativar uma série de proteínas do sistema de segundos mensageiros que podem coordenar processos como a liberação de neurotransmissores nas células nervosas e a liberação de hormônios nas células endócrinas. [55]

O influxo de Ca 2+ para a matriz mitocondrial foi recentemente implicado como um mecanismo para regular a bioenergética respiratória, permitindo que o potencial eletroquímico através da membrana "pulsasse" transitoriamente de dominado por ΔΨ para dominado por pH, facilitando a redução do estresse oxidativo. [56] Em neurônios, aumentos concomitantes no cálcio citosólico e mitocondrial agem para sincronizar a atividade neuronal com o metabolismo energético mitocondrial. Os níveis de cálcio da matriz mitocondrial podem atingir dezenas de níveis micromolares, necessários para a ativação da isocitrato desidrogenase, uma das principais enzimas regulatórias do ciclo de Krebs. [57]

Regulação da proliferação celular Editar

A relação entre a proliferação celular e as mitocôndrias foi investigada. As células tumorais requerem amplo ATP para sintetizar compostos bioativos, como lipídios, proteínas e nucleotídeos para rápida proliferação. [58] A maior parte do ATP nas células tumorais é gerada por meio da via de fosforilação oxidativa (OxPhos). [59] A interferência com OxPhos causa a interrupção do ciclo celular, sugerindo que as mitocôndrias desempenham um papel na proliferação celular. [59] A produção de ATP mitocondrial também é vital para a divisão e diferenciação celular na infecção [60], além das funções básicas da célula, incluindo a regulação do volume celular, concentração de soluto e arquitetura celular. [61] [62] [63] Os níveis de ATP diferem em vários estágios do ciclo celular, sugerindo que há uma relação entre a abundância de ATP e a capacidade da célula de entrar em um novo ciclo celular. [64] O papel do ATP nas funções básicas da célula torna o ciclo celular sensível às mudanças na disponibilidade de ATP derivado da mitocôndria. [64] A variação nos níveis de ATP em diferentes estágios do ciclo celular apóia a hipótese de que as mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação do ciclo celular. [64] Embora os mecanismos específicos entre as mitocôndrias e a regulação do ciclo celular não sejam bem compreendidos, estudos mostraram que os pontos de verificação do ciclo celular de baixa energia monitoram a capacidade energética antes de se comprometer com outra rodada de divisão celular. [9]

Funções adicionais Editar

As mitocôndrias desempenham um papel central em muitas outras tarefas metabólicas, como:

  • Sinalização por meio de espécies reativas de oxigênio mitocondrial [65]
  • Regulação do potencial de membrana [18] - morte celular programada [66]
  • Sinalização de cálcio (incluindo apoptose evocada por cálcio) [67]
  • Regulação do metabolismo celular [9]
  • Certas reações de síntese de heme [68](ver também: porfirina) síntese. [49]
  • Sinalização hormonal [69] As mitocôndrias são sensíveis e responsivas aos hormônios, em parte pela ação dos receptores de estrogênio mitocondriais (mtERs). Esses receptores foram encontrados em vários tecidos e tipos de células, incluindo cérebro [70] e coração [71]
  • Sinalização imunológica [72]
  • As mitocôndrias neuronais também contribuem para o controle de qualidade celular ao relatar o estado neuronal em relação à microglia por meio de junções somáticas especializadas. [73]

Algumas funções mitocondriais são realizadas apenas em tipos específicos de células. Por exemplo, as mitocôndrias nas células do fígado contêm enzimas que permitem desintoxicar a amônia, um produto residual do metabolismo das proteínas. Uma mutação nos genes que regulam qualquer uma dessas funções pode resultar em doenças mitocondriais.

Mitocôndrias (e estruturas relacionadas) são encontradas em todos os eucariotos (exceto dois - o Oxymonad Monocercomonoides e Henneguya salminicola) [5] [6] [7] [74] Embora comumente representados como estruturas semelhantes a feijão, eles formam uma rede altamente dinâmica na maioria das células, onde sofrem constantemente fissão e fusão. A população de todas as mitocôndrias de uma determinada célula constitui o condriomo. [75] As mitocôndrias variam em número e localização de acordo com o tipo de célula. Uma única mitocôndria é freqüentemente encontrada em organismos unicelulares, enquanto as células hepáticas humanas têm cerca de 1000–2000 mitocôndrias por célula, perfazendo 1/5 do volume celular. [17] O conteúdo mitocondrial de células semelhantes pode variar substancialmente em tamanho e potencial de membrana, [76] com diferenças decorrentes de fontes, incluindo partição desigual nas divisões celulares, levando a diferenças extrínsecas nos níveis de ATP e processos celulares a jusante. [77] As mitocôndrias podem ser encontradas aninhadas entre as miofibrilas musculares ou enroladas ao redor do flagelo do esperma. [17] Freqüentemente, eles formam uma rede complexa de ramificação 3D dentro da célula com o citoesqueleto. A associação com o citoesqueleto determina a forma mitocondrial, que também pode afetar a função: [78] diferentes estruturas da rede mitocondrial podem proporcionar à população uma variedade de vantagens ou desvantagens físicas, químicas e de sinalização. [79] As mitocôndrias nas células são sempre distribuídas ao longo dos microtúbulos e a distribuição dessas organelas também está correlacionada com o retículo endoplasmático. [80] Evidências recentes sugerem que a vimentina, um dos componentes do citoesqueleto, também é crítica para a associação com o citoesqueleto. [81]

Membrana ER associada à mitocôndria (MAM) Editar

A membrana ER associada à mitocôndria (MAM) é outro elemento estrutural que é cada vez mais reconhecido por seu papel crítico na fisiologia e homeostase celular. Uma vez considerados um obstáculo técnico nas técnicas de fracionamento celular, os supostos contaminantes da vesícula ER que invariavelmente apareciam na fração mitocondrial foram reidentificados como estruturas membranosas derivadas do MAM - a interface entre as mitocôndrias e o ER. [82] O acoplamento físico entre essas duas organelas já havia sido observado em micrografias eletrônicas e, mais recentemente, sondado com microscopia de fluorescência. [82] Tais estudos estimam que no MAM, que pode compreender até 20% da membrana mitocondrial externa, o RE e as mitocôndrias são separados por meros 10-25 nm e mantidos juntos por complexos de tethering de proteínas. [82] [29] [83]

O MAM purificado do fracionamento subcelular é enriquecido em enzimas envolvidas na troca de fosfolipídios, além de canais associados à sinalização de Ca 2+. [82] [83] Essas dicas de um papel proeminente para o MAM na regulação dos estoques de lipídios celulares e transdução de sinal foram confirmadas, com implicações significativas para fenômenos celulares associados à mitocôndria, conforme discutido abaixo. O MAM não apenas forneceu insights sobre a base mecanística subjacente a processos fisiológicos como a apoptose intrínseca e a propagação da sinalização de cálcio, mas também favorece uma visão mais refinada das mitocôndrias. Embora muitas vezes visto como 'potências' isoladas e estáticas, sequestradas para o metabolismo celular por meio de um evento endossimbiótico antigo, a evolução do MAM ressalta a extensão em que as mitocôndrias foram integradas na fisiologia celular geral, com acoplamento físico e funcional íntimo ao sistema endomembrana.

Edição de transferência de fosfolipídios

O MAM é enriquecido em enzimas envolvidas na biossíntese de lipídeos, como a fosfatidilserina sintase na face ER e a fosfatidilserina descarboxilase na face mitocondrial. [84] [85] Como as mitocôndrias são organelas dinâmicas em eventos de fissão e fusão constantemente, elas requerem um suprimento constante e bem regulado de fosfolipídios para a integridade da membrana. [86] [87] Mas as mitocôndrias não são apenas um destino para os fosfolipídios dos quais terminam a síntese, em vez disso, esta organela também desempenha um papel no tráfego interorganela de intermediários e produtos das vias biossintéticas de fosfolipídios, metabolismo de ceramida e colesterol e glicosfingolipídios anabolismo. [85] [87]

Essa capacidade de tráfego depende do MAM, que demonstrou facilitar a transferência de intermediários lipídicos entre as organelas. [84] Em contraste com o mecanismo vesicular padrão de transferência de lipídios, as evidências indicam que a proximidade física do RE e das membranas mitocondriais no MAM permite a inversão de lipídios entre bicamadas opostas. Apesar deste mecanismo incomum e aparentemente desfavorável energeticamente, tal transporte não requer ATP. [87] Em vez disso, na levedura, mostrou-se dependente de uma estrutura de tethering multiproteína denominada estrutura de encontro ER-mitocôndria, ou ERMES, embora não esteja claro se esta estrutura medeia diretamente a transferência de lipídios ou é necessária para manter as membranas em proximidade suficientemente próxima para diminuir a barreira de energia para a inversão de lipídios. [87] [88]

O MAM também pode fazer parte da via secretora, além de seu papel no tráfico intracelular de lipídios. Em particular, o MAM parece ser um destino intermediário entre o ER rugoso e o Golgi na via que leva à lipoproteína de densidade muito baixa, ou VLDL, montagem e secreção. [85] [89] O MAM, portanto, serve como um centro metabólico e de tráfego crítico no metabolismo lipídico.

Sinalização de cálcio Editar

Um papel crítico para o ER na sinalização do cálcio foi reconhecido antes que tal papel para as mitocôndrias fosse amplamente aceito, em parte porque a baixa afinidade dos canais de Ca 2+ localizados na membrana mitocondrial externa parecia contradizer a suposta responsividade desta organela às mudanças intracelulares Fluxo de Ca 2+. [82] [52] Mas a presença do MAM resolve esta aparente contradição: a estreita associação física entre as duas organelas resulta em microdomínios de Ca 2+ em pontos de contato que facilitam a transmissão eficiente de Ca 2+ do RE para a mitocôndria. [82] A transmissão ocorre em resposta aos chamados "sopros de Ca 2+" gerados por agrupamento espontâneo e ativação de IP3R, um canal de Ca 2+ da membrana ER canônica. [82] [29]

O destino desses puffs - em particular, se eles permanecem restritos a locais isolados ou integrados em ondas de Ca 2+ para propagação por toda a célula - é determinado em grande parte pela dinâmica do MAM. Embora a recaptação de Ca 2+ pelo ER (concomitante com a sua liberação) module a intensidade das baforadas, isolando assim as mitocôndrias até um certo grau da alta exposição ao Ca 2+, o MAM costuma servir como um firewall que essencialmente protege as baforadas de Ca 2+ agindo como um sumidouro no qual os íons livres liberados no citosol podem ser canalizados. [82] [90] [91] Esse tunelamento de Ca 2+ ocorre por meio do receptor de Ca 2+ de baixa afinidade VDAC1, que recentemente foi mostrado ser fisicamente amarrado aos aglomerados IP3R na membrana ER e enriquecido no MAM. [82] [29] [92] A capacidade da mitocôndria de servir como um sumidouro de Ca 2+ é resultado do gradiente eletroquímico gerado durante a fosforilação oxidativa, que torna o tunelamento do cátion um processo exergônico. [92] O influxo normal e leve de cálcio do citosol para a matriz mitocondrial causa despolarização transitória que é corrigida pelo bombeamento de prótons.

Mas a transmissão de Ca 2+ não é unidirecional, mas sim uma via de mão dupla. [52] As propriedades da bomba de Ca 2+ SERCA e do canal IP3R presente na membrana ER facilitam a regulação de feedback coordenada pela função MAM. Em particular, a depuração de Ca 2+ pelo MAM permite a padronização espaço-temporal da sinalização de Ca 2+ porque o Ca 2+ altera a atividade IP3R de uma maneira bifásica. [82] A SERCA é igualmente afetada pelo feedback mitocondrial: a absorção de Ca 2+ pelo MAM estimula a produção de ATP, fornecendo energia que permite a SERCA recarregar o ER com Ca 2+ para o efluxo contínuo de Ca 2+ no MAM. [90] [92] Assim, o MAM não é um buffer passivo para puffs de Ca 2+, em vez disso, ajuda a modular a sinalização de Ca 2+ por meio de circuitos de feedback que afetam a dinâmica do ER.

A regulação da liberação de Ca 2+ no MAM é especialmente crítica porque apenas uma determinada janela de captação de Ca 2+ mantém a mitocôndria e, conseqüentemente, a célula, na homeostase. A sinalização de Ca 2+ intraorganela suficiente é necessária para estimular o metabolismo, ativando as enzimas desidrogenase críticas para o fluxo através do ciclo do ácido cítrico. [93] [94] No entanto, uma vez que a sinalização de Ca 2+ na mitocôndria ultrapassa um certo limiar, ela estimula a via intrínseca da apoptose em parte pelo colapso do potencial da membrana mitocondrial necessária para o metabolismo. [82] Estudos que examinam o papel de fatores pró e antiapoptóticos apóiam este modelo, por exemplo, o fator antiapoptótico Bcl-2 demonstrou interagir com IP3Rs para reduzir o enchimento de Ca 2+ do ER, levando a efluxo reduzido no MAM e evitando o colapso dos potenciais estímulos pós-apoptóticos da membrana mitocondrial. [82] Dada a necessidade de tal regulação fina da sinalização de Ca 2+, talvez não seja surpreendente que o Ca 2+ mitocondrial desregulado tenha sido implicado em várias doenças neurodegenerativas, enquanto o catálogo de supressores de tumor inclui alguns que são enriquecidos no MAM. [92]

Base molecular para edição de tethering

Avanços recentes na identificação das amarras entre as membranas mitocondrial e ER sugerem que a função de andaime dos elementos moleculares envolvidos é secundária a outras funções não estruturais. Em levedura, ERMES, um complexo multiproteico de ER- e proteínas de membrana residentes mitocondriais, é necessário para a transferência de lipídios no MAM e exemplifica este princípio. Um de seus componentes, por exemplo, também é um constituinte do complexo proteico necessário para a inserção das proteínas do barril beta transmembrana na bicamada lipídica. [87] No entanto, um homólogo do complexo ERMES ainda não foi identificado em células de mamíferos. Outras proteínas implicadas no andaime também têm funções independentes do tethering estrutural no MAM, por exemplo, mitofusinas residentes em ER e mitocondriais residentes formam heterocomplexos que regulam o número de locais de contato entre organelas, embora as mitofusinas tenham sido identificadas pela primeira vez por seu papel na fissão e eventos de fusão entre mitocôndrias individuais. [82] A proteína relacionada à glicose 75 (grp75) é outra proteína de função dupla. Além do pool de matriz de grp75, uma parte serve como um chaperone que liga fisicamente os canais de Ca 2+ mitocondrial e ER VDAC e IP3R para uma transmissão eficiente de Ca 2+ no MAM. [82] [29] Outra corrente potencial é o Sigma-1R, um receptor não opioide cuja estabilização do IP3R residente no ER pode preservar a comunicação no MAM durante a resposta ao estresse metabólico. [95] [96]

Edição de perspectiva

O MAM é um centro de sinalização, metabólico e de tráfego crítico na célula que permite a integração do ER e da fisiologia mitocondrial. O acoplamento entre essas organelas não é simplesmente estrutural, mas também funcional e crítico para a fisiologia e homeostase celular em geral. O MAM, portanto, oferece uma perspectiva sobre as mitocôndrias que diverge da visão tradicional dessa organela como uma unidade estática e isolada, apropriada pela sua capacidade metabólica pela célula. [97] Em vez disso, esta interface mitocondrial-ER enfatiza a integração das mitocôndrias, o produto de um evento endossimbiótico, em diversos processos celulares. Recentemente, também foi demonstrado que as mitocôndrias e os MAM-s em neurônios são ancorados em locais de comunicação intercelular especializados (as chamadas junções somáticas). Os processos microgliais monitoram e protegem as funções neuronais nesses locais, e os MAM-s devem ter um papel importante neste tipo de controle de qualidade celular. [73]

Existem duas hipóteses sobre a origem das mitocôndrias: endossimbiótica e autógena. A hipótese endossimbiótica sugere que as mitocôndrias eram originalmente células procarióticas, capazes de implementar mecanismos oxidativos que não eram possíveis para as células eucarióticas, elas se tornaram endossimbiontes que vivem dentro do eucariota. [98] Na hipótese autógena, as mitocôndrias nasceram separando uma porção do DNA do núcleo da célula eucariótica no momento da divergência com os procariotos, esta porção do DNA teria sido envolvida por membranas, que não poderiam ser cruzadas por proteínas . Como as mitocôndrias têm muitas características em comum com as bactérias, a hipótese endossimbiótica é mais amplamente aceita. [98] [99]

Uma mitocôndria contém DNA, que é organizado como várias cópias de um único cromossomo, geralmente circular. Esse cromossomo mitocondrial contém genes para proteínas redox, como os da cadeia respiratória. A hipótese do CoRR propõe que esta co-localização é necessária para a regulação redox. O genoma mitocondrial codifica alguns RNAs de ribossomos e os 22 tRNAs necessários para a tradução de mRNAs em proteínas. A estrutura circular também é encontrada em procariontes. A protomitocôndria provavelmente estava intimamente relacionada com Rickettsia. [100] [101] No entanto, a relação exata do ancestral da mitocôndria com a alfaproteobactéria e se a mitocôndria foi formada ao mesmo tempo ou após o núcleo permanece controversa. [102] Por exemplo, foi sugerido que o clado de bactérias SAR11 compartilha um ancestral comum relativamente recente com as mitocôndrias, [103] enquanto as análises filogenômicas indicam que as mitocôndrias evoluíram de uma linhagem de proteobactérias que está intimamente relacionada a ou um membro de alfaproteobactérias . [104] [105]

Subgrupos Ib, II, IIIa, IIIb, IV e V

Os ribossomos codificados pelo DNA mitocondrial são semelhantes aos das bactérias em tamanho e estrutura. [107] Eles se parecem muito com o ribossomo 70S bacteriano e não com os ribossomos citoplasmáticos 80S, que são codificados pelo DNA nuclear.

A relação endossimbiótica das mitocôndrias com suas células hospedeiras foi popularizada por Lynn Margulis.[108] A hipótese endossimbiótica sugere que as mitocôndrias descendem de bactérias que de alguma forma sobreviveram à endocitose por outra célula e foram incorporadas ao citoplasma. A capacidade dessas bactérias de conduzir a respiração nas células hospedeiras que dependiam da glicólise e da fermentação teria proporcionado uma vantagem evolutiva considerável. Essa relação simbiótica provavelmente se desenvolveu de 1,7 a 2 bilhões de anos atrás. [109] [110] Alguns grupos de eucariotos unicelulares têm apenas mitocôndrias vestigiais ou estruturas derivadas: os microsporidianos, metamônadas e archamoebas. [111] Esses grupos aparecem como os eucariotos mais primitivos em árvores filogenéticas construídas usando informações de rRNA, o que uma vez sugeriu que eles apareceram antes da origem das mitocôndrias. No entanto, agora se sabe que isso é um artefato de atração de ramos longos - eles são grupos derivados e retêm genes ou organelas derivados de mitocôndrias (por exemplo, mitossomas e hidrogenossomas). [4] Hidrogenossomos, mitossomos e organelas relacionadas, conforme encontrados em alguns loricíferos (por exemplo, Spinoloricus) [112] [113] e mixozoários (por exemplo, Henneguya zschokkei) são classificados juntos como MROs, organelas relacionadas à mitocôndria. [114] [115]

Monocercomonoides parecem ter perdido suas mitocôndrias completamente e pelo menos algumas das funções mitocondriais parecem ser realizadas por proteínas citoplasmáticas agora. [116]

As mitocôndrias contêm seu próprio genoma. o humano O genoma mitocondrial é uma molécula de DNA circular de cerca de 16 quilobases. [117] Ele codifica 37 genes: 13 para subunidades de complexos respiratórios I, III, IV e V, 22 para tRNA mitocondrial (para os 20 aminoácidos padrão, mais um gene extra para leucina e serina) e 2 para rRNA. [117] Uma mitocôndria pode conter de duas a dez cópias de seu DNA. [118]

Como nos procariontes, há uma proporção muito alta de DNA codificador e ausência de repetições. Os genes mitocondriais são transcritos como transcritos multigênicos, que são clivados e poliadenilados para produzir mRNAs maduros. A maioria das proteínas necessárias para a função mitocondrial são codificadas por genes no núcleo da célula e as proteínas correspondentes são importadas para a mitocôndria. [119] O número exato de genes codificados pelo núcleo e pelo genoma mitocondrial difere entre as espécies. A maioria dos genomas mitocondriais são circulares. [120] Em geral, o DNA mitocondrial carece de íntrons, como é o caso no genoma mitocondrial humano [119], no entanto, os íntrons foram observados em algum DNA mitocondrial eucariótico, [121] como o de levedura [122] e protistas, [ 123] incluindo Dictyostelium discoideum. [124] Entre as regiões codificadoras de proteínas, tRNAs estão presentes. Os genes do tRNA mitocondrial têm sequências diferentes dos tRNAs nucleares, mas semelhantes aos tRNAs mitocondriais foram encontrados nos cromossomos nucleares com alta similaridade de sequência. [125]

Em animais, o genoma mitocondrial é tipicamente um único cromossomo circular com aproximadamente 16 kb de comprimento e 37 genes. Os genes, embora altamente conservados, podem variar em localização. Curiosamente, esse padrão não é encontrado no piolho do corpo humano (Pediculus humanus) Em vez disso, esse genoma mitocondrial é organizado em 18 cromossomos minicirculares, cada um dos quais com 3-4 kb de comprimento e com um a três genes. [126] Esse padrão também é encontrado em outros piolhos sugadores, mas não em piolhos mastigadores. Foi demonstrado que a recombinação ocorre entre os minicromossomos.

Editar código genético alternativo

Exceções ao código genético padrão nas mitocôndrias [17]
Organismo Codon Padrão Mitocôndria
Mamíferos AGA, AGG Arginina Códon de parada
Invertebrados AGA, AGG Arginina Serine
Fungi CUA Leucina Treonina
Tudo acima AUA Isoleucina Metionina
UGA Códon de parada Triptofano

Embora ligeiras variações no código genético padrão tenham sido previstas anteriormente, [127] nenhuma foi descoberta até 1979, quando pesquisadores que estudavam genes mitocondriais humanos determinaram que usavam um código alternativo. [128] No entanto, as mitocôndrias de muitos outros eucariotos, incluindo a maioria das plantas, usam o código padrão. [129] Muitas pequenas variantes foram descobertas desde então, [130] incluindo vários códigos mitocondriais alternativos. [131] Além disso, os códons AUA, AUC e AUU são todos códons de início permitidos.

Algumas dessas diferenças devem ser consideradas como pseudo-alterações no código genético devido ao fenômeno da edição de RNA, que é comum nas mitocôndrias. Em plantas superiores, pensava-se que CGG codificava para triptofano e não arginina, no entanto, o códon no RNA processado foi descoberto ser o códon UGG, consistente com o código genético padrão para triptofano. [132] Digno de nota, o código genético mitocondrial do artrópode sofreu evolução paralela dentro de um filo, com alguns organismos traduzindo exclusivamente AGG em lisina. [133]

Edição de replicação e herança

As mitocôndrias se dividem por fissão binária, semelhante às bactérias. [134] O regulamento desta divisão difere entre eucariotos. Em muitos eucariotos unicelulares, seu crescimento e divisão estão ligados ao ciclo celular. Por exemplo, uma única mitocôndria pode se dividir em sincronia com o núcleo. Este processo de divisão e segregação deve ser rigidamente controlado para que cada célula filha receba pelo menos uma mitocôndria. Em outros eucariotos (em mamíferos, por exemplo), as mitocôndrias podem replicar seu DNA e se dividir principalmente em resposta às necessidades de energia da célula, em vez de em fase com o ciclo celular. Quando as necessidades de energia de uma célula são altas, as mitocôndrias crescem e se dividem. Quando o uso de energia é baixo, as mitocôndrias são destruídas ou se tornam inativas. Em tais exemplos, as mitocôndrias são aparentemente distribuídas aleatoriamente às células filhas durante a divisão do citoplasma. A dinâmica mitocondrial, o equilíbrio entre a fusão e a fissão mitocondrial, é um fator importante nas patologias associadas a várias doenças. [135]

A hipótese da fissão binária mitocondrial tem se baseado na visualização por microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM). A resolução da microscopia de fluorescência (

200 nm) é insuficiente para distinguir detalhes estruturais, como membrana mitocondrial dupla na divisão mitocondrial ou mesmo para distinguir mitocôndrias individuais quando várias estão próximas. TEM convencional também tem algumas limitações técnicas [ que? ] na verificação da divisão mitocondrial. A tomografia crioeletrônica foi recentemente usada para visualizar a divisão mitocondrial em células intactas hidratadas congeladas. Ele revelou que as mitocôndrias se dividem por brotamento. [136]

Os genes mitocondriais de um indivíduo são herdados apenas da mãe, com raras exceções. [137] Em humanos, quando um óvulo é fertilizado por um espermatozóide, as mitocôndrias e, portanto, o DNA mitocondrial, geralmente vêm apenas do óvulo. As mitocôndrias do esperma entram no óvulo, mas não contribuem com informações genéticas para o embrião. [138] Em vez disso, as mitocôndrias paternas são marcadas com ubiquitina para selecioná-las para posterior destruição dentro do embrião. [139] A célula-ovo contém relativamente poucas mitocôndrias, mas essas mitocôndrias se dividem para preencher as células do organismo adulto. Este modo é visto na maioria dos organismos, incluindo a maioria dos animais. No entanto, as mitocôndrias em algumas espécies às vezes podem ser herdadas pelo pai. Esta é a norma entre certas plantas coníferas, embora não em pinheiros e teixos. [140] Para Mytilids, a herança paterna ocorre apenas em machos da espécie. [141] [142] [143] Foi sugerido que ela ocorre em um nível muito baixo em humanos. [144]

A herança uniparental leva a poucas oportunidades de recombinação genética entre diferentes linhagens de mitocôndria, embora uma única mitocôndria possa conter de 2 a 10 cópias de seu DNA. [118] A recombinação que ocorre mantém a integridade genética ao invés de manter a diversidade. No entanto, existem estudos que mostram evidências de recombinação no DNA mitocondrial. É claro que as enzimas necessárias para a recombinação estão presentes em células de mamíferos. [145] Além disso, as evidências sugerem que as mitocôndrias animais podem sofrer recombinação. [146] Os dados são mais controversos em humanos, embora existam evidências indiretas de recombinação. [147] [148]

Pode-se esperar que entidades que passam por herança uniparental e com pouca ou nenhuma recombinação estejam sujeitas à catraca de Muller, o acúmulo de mutações deletérias até que a funcionalidade seja perdida. Populações animais de mitocôndrias evitam esse acúmulo por meio de um processo de desenvolvimento conhecido como gargalo do mtDNA. O gargalo explora processos estocásticos na célula para aumentar a variabilidade célula a célula na carga mutante à medida que um organismo se desenvolve: uma única célula-ovo com alguma proporção de mtDNA mutante, portanto, produz um embrião onde células diferentes têm cargas mutantes diferentes. A seleção em nível de célula pode então agir para remover essas células com mais mtDNA mutante, levando a uma estabilização ou redução na carga de mutante entre as gerações. O mecanismo subjacente ao gargalo é debatido, [149] [150] [151] com um metastudo experimental e matemático recente fornecendo evidências para uma combinação de partição aleatória de mtDNAs em divisões celulares e turnover aleatório de moléculas de mtDNA dentro da célula. [152]

Reparo de DNA Editar

As mitocôndrias podem reparar danos oxidativos ao DNA por mecanismos análogos aos que ocorrem no núcleo da célula. As proteínas empregadas no reparo do mtDNA são codificadas por genes nucleares e são translocadas para a mitocôndria. As vias de reparo de DNA em mitocôndrias de mamíferos incluem reparo de excisão de base, reparo de quebra de fita dupla, reversão direta e reparo de incompatibilidade. [153] [154] Além disso, os danos ao DNA podem ser contornados, em vez de reparados, pela síntese por translesão.

Dos vários processos de reparo de DNA em mitocôndrias, a via de reparo por excisão de bases tem sido mais amplamente estudada. [154] O reparo da excisão de base é realizado por uma sequência de etapas catalisadas enzimáticas que incluem o reconhecimento e a excisão de uma base de DNA danificada, a remoção do sítio abásico resultante, o processamento final, o preenchimento da lacuna e a ligação. Um dano comum no mtDNA que é reparado pelo reparo por excisão de base é a 8-oxoguanina produzida pela oxidação da guanina. [155]

As quebras de fita dupla podem ser reparadas por reparo de recombinação homóloga no mtDNA de mamífero [156] e no mtDNA de planta. [157] As quebras de fita dupla no mtDNA também podem ser reparadas por junção de extremidade mediada por microhomologia. [158] Embora haja evidências para os processos de reparo de reversão direta e reparo de incompatibilidade no mtDNA, esses processos não são bem caracterizados. [154]

Falta de edição de DNA mitocondrial

Alguns organismos perderam completamente o DNA mitocondrial. Nesses casos, genes codificados pelo DNA mitocondrial foram perdidos ou transferidos para o núcleo. [117] Cryptosporidium, têm mitocôndrias sem DNA, provavelmente porque todos os seus genes foram perdidos ou transferidos. [159] Em Cryptosporidium, as mitocôndrias têm um sistema de geração de ATP alterado que torna o parasita resistente a muitos inibidores mitocondriais clássicos, como cianeto, azida e atovaquona. [159] Mitocôndrias que não possuem seu próprio DNA foram encontradas em um dinoflagelado parasita marinho do gênero Amoebophyra. Este microorganismo, A. cerati, tem mitocôndrias funcionais sem genoma. [160] Em espécies relacionadas, o genoma mitocondrial ainda tem três genes, mas em A. cerati apenas um único gene mitocondrial - o gene citocromo c oxidase I (cox1) - é encontrado e migrou para o genoma do núcleo. [161]

A quase ausência de recombinação genética no DNA mitocondrial o torna uma fonte útil de informações para estudar a genética populacional e a biologia evolutiva. [162] Como todo o DNA mitocondrial é herdado como uma única unidade, ou haplótipo, as relações entre o DNA mitocondrial de diferentes indivíduos podem ser representadas como uma árvore gênica. Os padrões nessas árvores gênicas podem ser usados ​​para inferir a história evolutiva das populações. O exemplo clássico disso está na genética evolutiva humana, onde o relógio molecular pode ser usado para fornecer uma data recente para a Eva mitocondrial. [163] [164] Isso é frequentemente interpretado como um forte apoio para uma recente expansão humana moderna para fora da África. [165] Outro exemplo humano é o sequenciamento do DNA mitocondrial de ossos de Neandertal. A distância evolutiva relativamente grande entre as sequências de DNA mitocondrial de neandertais e humanos vivos foi interpretada como evidência da falta de cruzamento entre neandertais e humanos modernos. [166]

No entanto, o DNA mitocondrial reflete apenas a história das mulheres em uma população. Isso pode ser parcialmente superado pelo uso de sequências genéticas paternas, como a região de não recombinação do cromossomo Y. [165]

Medições recentes do relógio molecular para DNA mitocondrial [167] relataram um valor de 1 mutação a cada 7884 anos, datando do ancestral comum mais recente de humanos e macacos, o que é consistente com estimativas de taxas de mutação de DNA autossômico (10-8 por base por geração). [168]

Doenças mitocondriais Editar

Danos e disfunções subsequentes nas mitocôndrias são um fator importante em uma série de doenças humanas devido à sua influência no metabolismo celular. Os distúrbios mitocondriais costumam se apresentar como distúrbios neurológicos, incluindo autismo. [15] Eles também podem se manifestar como miopatia, diabetes, endocrinopatia múltipla e uma variedade de outros distúrbios sistêmicos. [169] As doenças causadas por mutação no mtDNA incluem a síndrome de Kearns-Sayre, a síndrome de MELAS e a neuropatia óptica hereditária de Leber. [170] Na grande maioria dos casos, essas doenças são transmitidas por uma mulher a seus filhos, pois o zigoto obtém suas mitocôndrias e, portanto, seu mtDNA do óvulo. Acredita-se que doenças como a síndrome de Kearns-Sayre, a síndrome de Pearson e a oftalmoplegia externa progressiva sejam devidas a rearranjos de mtDNA em larga escala, enquanto outras doenças, como a síndrome MELAS, neuropatia óptica hereditária de Leber, síndrome MERRF e outras são devidas a mutações pontuais em mtDNA. [169]

Em outras doenças, defeitos nos genes nucleares levam à disfunção das proteínas mitocondriais. Esse é o caso da ataxia de Friedreich, da paraplegia espástica hereditária e da doença de Wilson. [171] Essas doenças são herdadas em uma relação de dominância, como se aplica à maioria das outras doenças genéticas. Uma variedade de distúrbios pode ser causada por mutações nucleares de enzimas de fosforilação oxidativa, como deficiência de coenzima Q10 e síndrome de Barth. [169] Influências ambientais podem interagir com predisposições hereditárias e causar doença mitocondrial. Por exemplo, pode haver uma ligação entre a exposição a pesticidas e o aparecimento posterior da doença de Parkinson. [172] [173] Outras patologias com etiologia envolvendo disfunção mitocondrial incluem esquizofrenia, transtorno bipolar, demência, doença de Alzheimer, [174] [175] doença de Parkinson, epilepsia, acidente vascular cerebral, doença cardiovascular, síndrome da fadiga crônica, retinite pigmentosa e diabetes mellitus . [176] [177]

O estresse oxidativo mediado pela mitocôndria desempenha um papel na cardiomiopatia em diabéticos tipo 2. O aumento da distribuição de ácidos graxos ao coração aumenta a absorção de ácidos graxos pelos cardiomiócitos, resultando em aumento da oxidação de ácidos graxos nessas células. Este processo aumenta os equivalentes redutores disponíveis para a cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria, aumentando, em última análise, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS aumenta as proteínas desacopladoras (UCPs) e potencializa o vazamento de prótons através do translocador de nucleotídeo de adenina (ANT), cuja combinação desacopla a mitocôndria. O desacoplamento, então, aumenta o consumo de oxigênio pelas mitocôndrias, agravando o aumento da oxidação dos ácidos graxos. Além disso, isso cria um ciclo vicioso de desacoplamento, embora o consumo de oxigênio aumente, a síntese de ATP não aumenta proporcionalmente porque as mitocôndrias são desacopladas. Menos disponibilidade de ATP resulta em um déficit de energia que se apresenta como redução da eficiência cardíaca e disfunção contrátil. Para agravar o problema, a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático prejudicada e a recaptação mitocondrial reduzida limitam os níveis citosólicos de pico do íon de sinalização importante durante a contração muscular. A diminuição da concentração de cálcio intra-mitocondrial aumenta a ativação da desidrogenase e a síntese de ATP. Portanto, além de diminuir a síntese de ATP devido à oxidação de ácidos graxos, a síntese de ATP também é prejudicada pela sinalização deficiente do cálcio, causando problemas cardíacos para diabéticos. [178]

Relações com o envelhecimento Editar

Pode haver algum vazamento de elétrons de alta energia na cadeia respiratória para formar espécies reativas de oxigênio. Acreditava-se que isso resultasse em estresse oxidativo significativo nas mitocôndrias com altas taxas de mutação do DNA mitocondrial. [179] Ligações hipotetizadas entre envelhecimento e estresse oxidativo não são novas e foram propostas em 1956, [180] que mais tarde foi refinado na teoria dos radicais livres mitocondrial do envelhecimento. [181] Acreditava-se que ocorria um ciclo vicioso, pois o estresse oxidativo leva a mutações no DNA mitocondrial, que podem levar a anormalidades enzimáticas e mais estresse oxidativo.

Várias alterações podem ocorrer nas mitocôndrias durante o processo de envelhecimento. [182] Tecidos de humanos idosos mostram uma diminuição na atividade enzimática das proteínas da cadeia respiratória. [183] ​​No entanto, o mtDNA mutado só pode ser encontrado em cerca de 0,2% das células muito antigas. [184] Foi levantada a hipótese de que grandes deleções no genoma mitocondrial podem levar a altos níveis de estresse oxidativo e morte neuronal na doença de Parkinson. [185] Também foi demonstrado que a disfunção mitocondrial ocorre na esclerose lateral amiotrófica. [186] [187]

Uma vez que as mitocôndrias desempenham um papel fundamental na função ovariana, fornecendo ATP necessário para o desenvolvimento da vesícula germinativa ao oócito maduro, uma função mitocondrial diminuída pode levar à inflamação, resultando em falência ovárica prematura e envelhecimento ovariano acelerado. A disfunção causada é então refletida tanto em danos quantitativos (como número de cópias de mtDNA e deleções de mtDNA), qualitativos (como mutações e quebras de fita) e oxidativos (como mitocôndrias disfuncionais devido a ROS), que não são apenas relevantes no envelhecimento ovariano , mas perturbar a crosstalk ovócito-cumulus no ovário, estão ligados a distúrbios genéticos (como o X frágil) e podem interferir na seleção do embrião. [188]

As primeiras observações de estruturas intracelulares que provavelmente representavam mitocôndrias foram publicadas na década de 1840. [189] Richard Altmann, em 1890, os estabeleceu como organelas celulares e os chamou de "bioblastos". [189] [190] Em 1898, Carl Benda cunhou o termo "mitocôndria" do grego μίτος, mitos, "thread" e χονδρίον, condrion, "grânulo". [191] [189] [192] Leonor Michaelis descobriu que o verde de Janus pode ser usado como uma coloração supravital para mitocôndrias em 1900.Em 1904, Friedrich Meves, fez a primeira observação registrada de mitocôndrias em plantas em células do nenúfar branco, Nymphaea alba [189] [193] e em 1908, junto com Claudius Regaud, sugeriu que eles contêm proteínas e lipídios. Benjamin F. Kingsbury, em 1912, primeiro os relacionou com a respiração celular, mas quase exclusivamente com base em observações morfológicas. [189] Em 1913, partículas de extratos de fígado de cobaia foram ligadas à respiração por Otto Heinrich Warburg, que ele chamou de "grana". Warburg e Heinrich Otto Wieland, que também postularam um mecanismo de partículas semelhante, discordaram sobre a natureza química da respiração. Somente em 1925, quando David Keilin descobriu os citocromos, a cadeia respiratória foi descrita. [189]

Em 1939, experimentos usando células musculares picadas demonstraram que a respiração celular usando um átomo de oxigênio pode formar duas moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) e, em 1941, o conceito de ligações de fosfato de ATP sendo uma forma de energia no metabolismo celular foi desenvolvido por Fritz Albert Lipmann. Nos anos seguintes, o mecanismo por trás da respiração celular foi mais elaborado, embora sua ligação com as mitocôndrias não fosse conhecida. [189] A introdução do fracionamento do tecido por Albert Claude permitiu que as mitocôndrias fossem isoladas de outras frações celulares e que análises bioquímicas fossem conduzidas apenas nelas. Em 1946, ele concluiu que a citocromo oxidase e outras enzimas responsáveis ​​pela cadeia respiratória foram isoladas na mitocôndria. Eugene Kennedy e Albert Lehninger descobriram em 1948 que as mitocôndrias são o local de fosforilação oxidativa em eucariotos. Com o tempo, o método de fracionamento foi desenvolvido, melhorando a qualidade das mitocôndrias isoladas, e outros elementos da respiração celular foram determinados a ocorrer nas mitocôndrias. [189]

As primeiras micrografias eletrônicas de alta resolução apareceram em 1952, substituindo as manchas de Janus Green como a forma preferida de visualizar as mitocôndrias. [189] Isso levou a uma análise mais detalhada da estrutura das mitocôndrias, incluindo a confirmação de que estavam rodeadas por uma membrana. Ele também mostrou uma segunda membrana dentro da mitocôndria que se dobrou em cristas dividindo a câmara interna e que o tamanho e a forma das mitocôndrias variavam de célula para célula.

O termo popular "potência da célula" foi cunhado por Philip Siekevitz em 1957. [3]

Em 1967, foi descoberto que as mitocôndrias continham ribossomos. [194] Em 1968, métodos foram desenvolvidos para mapear os genes mitocondriais, com o mapa genético e físico do DNA mitocondrial de levedura concluído em 1976. [189]


Diferenças na eficiência mitocondrial explicam a variação individual no desempenho de crescimento

As causas fisiológicas das diferenças intraespecíficas nos componentes do condicionamento físico, como a taxa de crescimento, são atualmente uma fonte de debate. Foi sugerido que as diferenças no metabolismo energético podem impulsionar a variação no crescimento, mas ainda não está claro se a covariação entre as taxas de crescimento e o metabolismo energético é: (i) um resultado de certos indivíduos adquirindo e, consequentemente, alocando mais recursos para o crescimento, e / ou é (ii) determinada pela variação da eficiência com que esses recursos se transformam em crescimento. Estudos de animais alojados individualmente em condições nutricionais padronizadas podem ajudar a esclarecer esse debate. Aqui nós quantificamos a variação individual na eficiência metabólica em termos da quantidade de trifosfato de adenosina (ATP) gerada por molécula de oxigênio consumida pelo fígado e mitocôndrias musculares e examinamos seus efeitos, tanto na taxa de síntese protéica nesses tecidos quanto na taxa de crescimento de corpo inteiro de truta marrom juvenil alimentada individualmente (Salmo trutta) recebendo uma ração alta ou baixa de comida. Como esperado, os peixes com a ração alta ganharam em média mais massa corporal e teor de proteína do que os mantidos com a ração baixa. Ainda assim, o desempenho de crescimento variou mais de 10 vezes entre os indivíduos com a mesma ração, resultando em alguns peixes com rações baixas crescendo mais rápido do que outros com rações altas. Essa variação no crescimento para uma dada ração estava relacionada a diferenças individuais nas propriedades mitocondriais: um alto desempenho de crescimento de corpo inteiro estava associado a uma alta eficiência mitocondrial da produção de ATP no fígado. Nossos resultados mostram pela primeira vez, até onde sabemos, que a variação entre os indivíduos na eficiência com a qual os substratos são convertidos em ATP pode ajudar a explicar a variação acentuada no desempenho de crescimento, independente da ingestão de alimentos. Este estudo destaca a existência de diferenças interindividuais na eficiência mitocondrial e sua importância potencial para explicar a variação intraespecífica no desempenho de animais inteiros.

1. Introdução

Animais individuais podem crescer em taxas amplamente diferentes, apesar de viverem nas mesmas condições - uma descoberta que foi documentada em uma ampla gama de taxa (revisada em [1,2]). Este fenômeno é freqüentemente interpretado em termos de variação na qualidade individual. Por exemplo, indivíduos que crescem mais rápido normalmente atingem a maturidade mais rapidamente e podem ter maior fecundidade do que indivíduos de crescimento mais lento, sugerindo consequências diretas para a aptidão da taxa de crescimento [3,4]. No entanto, os processos fisiológicos subjacentes a essa variação entre os indivíduos na taxa de crescimento são atualmente mal compreendidos.

Obviamente, um crescimento mais rápido pode ser alcançado aumentando a ingestão de alimentos. Indivíduos com uma alta taxa de ingestão de alimentos crescem mais rápido em comparação com indivíduos que têm uma taxa mais baixa de ingestão de recursos, porque grandes quantidades de ingestão de alimentos podem levar a um aumento da taxa de alocação de recursos para processos energeticamente caros, como a produção de biomassa e, por sua vez , crescimento. No entanto, a variação na taxa de crescimento pode persistir mesmo quando a ingestão de alimentos é padronizada. Por exemplo, peixes individuais alimentados até a saciedade e consumindo uma quantidade semelhante de comida exibiram diferenças de três vezes no desempenho de crescimento [5]. Da mesma forma, diferenças quíntuplas na taxa de crescimento foram mostradas entre os peixes que consomem uma quantidade idêntica de comida [6]. Isso sugere que a variação no crescimento pode ser, pelo menos parcialmente, atribuída à variação na eficiência da utilização dos recursos e sua alocação para a produção de biomassa. Ainda assim, surpreendentemente, poucas pesquisas investigaram os possíveis mecanismos que podem estar por trás dessa variação na eficiência metabólica e, portanto, no desempenho do crescimento [7].

Acredita-se que a variação na eficiência com a qual os alimentos são convertidos em energia desempenhe um papel importante na associação entre a ingestão de alimentos e o crescimento animal [7-9]. A energia derivada de nutrientes se torna utilizável para processos celulares somente após a transformação em moléculas de alta energia de trifosfato de adenosina (ATP). O ATP é a principal fonte de energia para a maioria das funções celulares, como DNA, RNA e síntese de proteínas (e, portanto, produção de biomassa). Os principais locais de conversão de energia são as mitocôndrias, que fornecem mais de 90% do ATP de uma célula [10]. O ATP mitocondrial é produzido via fosforilação oxidativa, um processo pelo qual substratos de energia são oxidados para gerar um gradiente de prótons que conduz a fosforilação de ADP em ATP. Embora a produção de ATP dependa da taxa de oxidação do substrato, o número de moléculas de ATP produzidas para cada molécula de substrato de oxigênio e energia (ou seja, piruvato, glutamato, acetil-CoA, etc.) consumido pela mitocôndria pode variar [11]. Uma proporção da energia que é gerada a partir da oxidação do substrato é dissipada através do vazamento de prótons através da membrana mitocondrial interna e esse vazamento pode diminuir a energia disponível para produzir ATP [12]. A quantidade de energia dissipada no vazamento de prótons mitocondrial varia entre os indivíduos [13,14] e essa variação é conhecida por se correlacionar com o desempenho do animal [15,16]. Isso levanta a possibilidade de que a variação no crescimento entre os indivíduos possa envolver diferenças na eficiência pela qual as mitocôndrias produzem ATP.

A eficiência mitocondrial pode ser quantificada por meio da medida da razão ATP / O que é a razão na quantidade de ATP gerada por unidade de oxigênio consumida [17]. Assim, quanto maior essa proporção, mais eficientemente um animal converte seus substratos metabólicos em ATP, com o ATP então disponível para processos celulares que demandam energia, como síntese de proteínas e produção de biomassa [18]. Uma série de estudos encontraram ligações positivas entre a taxa média de crescimento e a eficiência mitocondrial média ao comparar entre grupos de tratamento, populações ou linhas de seleção [9,19-23], mas até agora não houve, ao nosso conhecimento, nenhuma avaliação sobre se mitocondrial a eficiência poderia explicar a variação na taxa de crescimento entre animais individuais mantidos com a mesma ingestão de alimento.

Neste estudo, testamos, pela primeira vez ao nosso conhecimento, se a variação individual no desempenho de crescimento - medida como a taxa de ganho de massa de corpo inteiro e como a taxa de síntese de proteína - estava relacionada à variação entre indivíduos em eficiência mitocondrial. Para testar esta hipótese, avaliamos as relações entre a razão ATP / O, taxa fracionária de síntese de proteínas e desempenho de crescimento (taxa de crescimento, eficiência de crescimento e ganho de proteína) entre truta marrom alojada individualmente (Salmo trutta) da mesma idade e mantidos em condições padronizadas. A fim de padronizar sua ingestão alimentar, os peixes foram alimentados com rações individuais limitadas para garantir que as diferenças no desempenho do crescimento pudessem ser atribuídas a diferenças de eficiência mitocondrial. Escolhemos a truta marrom juvenil como nosso organismo de estudo porque o tamanho corporal maior na truta marrom é um dos principais determinantes da aptidão, com crescimento rápido resultando em maior sobrevivência [24] e maior tamanho corporal sendo associado a maior fecundidade [25]. Analisamos as propriedades mitocondriais e a síntese de proteínas no fígado e no músculo branco porque as propriedades fisiológicas desses tecidos são conhecidas por influenciar o desempenho do crescimento [16,26]. Previmos correlações interindividuais positivas entre eficiência mitocondrial, síntese de proteínas e desempenho de crescimento.

2. Material e métodos

(a) Animais experimentais

Os alevinos de truta marrom foram transferidos do incubatório (Howietoun, Reino Unido) para a Universidade de Glasgow em junho de 2015. Os peixes foram então mantidos em um tanque comunitário e mantidos sob fotoperíodo de 12 L: 12 D a 12 ° C e alimentados diariamente em excesso com ração de pelotas de truta (EWOS, West Lothian, Reino Unido). Em setembro de 2016, peixes (n = 60) foram transferidos para compartimentos individuais dentro de um sistema de tanque de fluxo que permitiu alimentação diária individual, mantendo os peixes nas mesmas condições de qualidade da água. Cada compartimento individual continha um pequeno abrigo (uma seção de tubo de plástico opaco).

Os peixes foram primeiro aclimatados por duas semanas em seus compartimentos individuais, durante as quais foram alimentados à mão diariamente em excesso com os mesmos pellets de truta. Os peixes foram então jejuados por 22 horas e brevemente anestesiados (50 ml.l -1 benzocaína em água) para medição da massa corporal (± 0,001 g) para permitir o cálculo da ingestão calórica e, portanto, das rações alimentares (como número de pellets). Para as próximas 5-10 semanas (veja abaixo), os peixes foram alimentados uma vez por dia com uma ração intermediária de pellets (presumivelmente suficiente para o crescimento, mas menos do que a taxa máxima de ingestão) usando uma equação de Elliott [27], o que permitiu o cálculo de rações individuais específicas em calorias em função da massa corporal do peixe (C) em gramas e temperatura da água (T) de 12 ° C como segue:

Os peixes foram alimentados com sua ração no início da manhã todos os peixes consumiram toda a sua ração diária em 2 h. A massa corporal foi medida a cada duas semanas, e as rações alimentares foram recalculadas para ajustar os ganhos de massa. Os peixes foram mantidos em jejum por 22 horas antes de cada medição de massa corporal e, ao retornarem aos seus compartimentos, foram alimentados 2 horas mais tarde do que o normal para permitir a recuperação do anestésico e garantir que comeram a ração. Todos os peixes consumiram toda a sua ração diária e ganharam massa durante o período de aclimatação.

(b) Tratamento de dieta e medidas de crescimento

Após este período de aclimatação a uma dieta intermediária, os peixes foram trocados para o tratamento de dieta final por 14 dias. Esta duração foi escolhida porque limitou a extensão da renovação mitocondrial que ocorreria durante o período de crescimento, mas foi suficiente para detectar diferenças na taxa de crescimento entre os indivíduos [28]. Como apenas dois indivíduos por dia puderam ser analisados ​​quanto à sua função mitocondrial no final do experimento, o início do tratamento com dieta foi escalonado ao longo de um período de cinco semanas (de modo que o período de aclimatação anterior variou entre 5 e 10 semanas). Dois peixes por dia (que seriam posteriormente processados ​​juntos 14 dias depois) foram então alocados aleatoriamente para os tratamentos: um peixe teve sua ração aumentada para 150% da ração intermediária (ração alta, n = 30) e o outro teve sua ração diminuída para 50% da ração intermediária (ração baixa, n = 30). A ração baixa foi estimada para fornecer energia suficiente para cobrir as necessidades de manutenção e crescimento relativamente lento [27], enquanto a ração alta se aproximou da taxa máxima de ingestão de alimentos da truta marrom juvenil [27]. A massa corporal variou de 3,61 a 15,48 g entre os indivíduos no início do experimento, mas não diferiu entre os peixes posteriormente atribuídos aos dois tratamentos alimentares (ração alta: 8,15 ± 0,49 g, ração baixa: 8,18 ± 0,48 g, t-teste: t58 = −0.041, p = 0,967). A massa corporal foi medida novamente (como acima) no dia 7 do tratamento com dieta, e as rações foram recalculadas para ajustar o crescimento. Todos os peixes, exceto um, consumiram toda a sua ração diária em 2 h durante o período experimental, este peixe foi removido de todas as análises, resultando em um tamanho de amostra final de 59 peixes (alta alimentação: n = 29 comida baixa: n = 30).

A taxa de crescimento e a eficiência de crescimento foram estimadas simultaneamente ao longo de um período de 7 dias começando no dia 7 do tratamento experimental (denominado massa corporal inicial do peixe (MC) na seguinte equação) e terminando no dia 14 (MB final do peixe). A taxa de crescimento específica (% dia -1) foi definida como:

A ingestão alimentar diária foi calculada a partir da ração alimentar diária e expressa em termos de massa do pellet. A eficiência de crescimento (ganho de mg em massa corporal mg -1 alimento ingerido) foi medida para cada peixe como:

No final do período de tratamento de alimentos, as taxas fracionárias de síntese de proteínas e propriedades mitocondriais foram medidas nos peixes seguindo os protocolos descritos abaixo.

(c) Estimativa de ganho em proteína de corpo inteiro

A relação entre o teor de proteína de corpo inteiro e a massa corporal de peixes criados com rações intermediárias, baixas e altas foi usada para estimar o teor de proteína de cada peixe no início e no final do tratamento da dieta e, assim, estimar o ganho no teor de proteína durante o período de tratamento. Especificamente, primeiro determinamos a relação entre a massa corporal de um peixe e seu conteúdo de proteína de corpo inteiro (material eletrônico suplementar, figura S1), usando um grupo separado de trutas marrons da mesma idade e tamanho (consulte o material eletrônico suplementar para detalhes completos na seção 'Conteúdo de proteínas de corpo inteiro').

O conteúdo inicial de proteína de corpo inteiro (PA inicial) de cada peixe experimental foi, portanto, estimado a partir de sua massa corporal no início do tratamento com comida, usando a regressão de calibração para peixes na ração intermediária. O conteúdo final de proteína de corpo inteiro (PA final) de cada peixe experimental foi igualmente estimado a partir de sua massa corporal ao final do tratamento com comida, usando a equação apropriada para seu tratamento com dieta. A taxa de ganho de proteína específica (% dia -1) foi então definida como:

(d) Medição da taxa fracionária de síntese de proteínas

A porcentagem da massa de proteína sintetizada por dia - a taxa fracionária de síntese de proteína - foi medida usando o ensaio de dose de inundação [29], modificado para usar o marcador de isótopo estável, o anel-D5-fenilalanina (D5-Phe) [30]. Em suma, as proporções da quantidade de D5-Phe em relação à quantidade de fenilalanina total (Phe total igual a D5-Phe mais sua versão natural) no pool de proteínas e no pool livre de aminoácidos permitem o cálculo da taxa fracionária de síntese de proteínas. O ensaio foi validado pela primeira vez para a truta marrom desta idade e tamanho através da realização de um experimento preliminar ao longo do tempo (material eletrônico suplementar). A partir deste experimento de validação, determinamos que um D5-Phe período de incubação de aproximadamente 60 min foi uma duração de incorporação apropriada.

Para o experimento principal, os peixes jejuaram por 21 h antes de serem injetados no peritônio com o D5-Phe solução. Cada peixe foi então imediatamente colocado em um tanque individual contendo 2 l de água aerada por um período de aproximadamente 1 h (média ± s.e .: 1 h05 min ± 0h00 min) sem comida e no escuro. Os peixes foram então abatidos e seus fígados imediatamente dissecados, pesados ​​e lavados com água destilada. Uma subamostra de fígado foi pesada e mantida em tampão respirométrico gelado (EGTA 0,1 mM, EDTA 15 µM, MgCl 1 mM2, Taurina 20 mM, KH 10 mM2PO4, HEPES 20 mM, d-sacarose 110 mM, ácido lactobiônico 60 mM, albumina de soro bovino 1 g 1-1 essencialmente livre de ácidos graxos, pH 7,2 com KOH) para medição subsequente das propriedades mitocondriais (ver abaixo). Uma segunda alíquota do fígado para medição da síntese de proteínas foi pesada e imediatamente congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -70 ° C até análise posterior. Da mesma forma, duas amostras de músculo branco foram retiradas dorsalmente à linha lateral (para evitar contaminação com fibras vermelhas) e logo atrás da barbatana dorsal. Uma alíquota foi coletada de um lado do peixe e mantida em tampão respirométrico enquanto a outra alíquota foi coletada do outro lado e imediatamente congelada. Após a extração e quantificação dos isótopos de fenilalanina no pool de aminoácidos livres e no pool de proteínas (detalhes no material eletrônico suplementar), a taxa fracionária de síntese protéica (Ks em% dia -1) foi calculada como:

(e) Medição das propriedades mitocondriais

Como apenas duas amostras podiam ser executadas simultaneamente para medir as propriedades mitocondriais, as amostras de fígado dos dois indivíduos em um lote de processamento foram primeiro homogeneizadas como em [15,16] e avaliadas quanto à função mitocondrial, enquanto a subamostra de músculo branco foi preservada em tampão de respirometria no gelo para a execução subsequente.

Os sinais de fluorescência verde de oxigênio e magnésio foram detectados simultaneamente usando duas câmaras de respirometria equipadas com sensores fluorescentes e registrados usando o software D at L ab (Oroboros Instruments, Innsbruck Áustria). O homogenato de tecido de cada peixe foi adicionado a uma das duas câmaras de medição imediatamente após a preparação. A eficiência mitocondrial foi medida como em Salin et al. [31]. Resumidamente, usamos um protocolo para estimar a relação ATP / O que mede simultaneamente o consumo de oxigênio e a produção de ATP na mesma amostra. Citocromo c a respiração oxidase (COX) foi então medida para permitir a padronização da densidade mitocondrial dos tecidos [32]. A taxa de consumo de oxigênio simultaneamente à produção de ATP foi avaliada adicionando ADP saturante à câmara contendo substratos complexos I e II. A atividade COX foi medida após a adição de ascorbato e N,N,N′,N′ -Tetrametil-pdicloridrato de -fenilenodiamina. O ensaio muscular foi idêntico ao ensaio hepático, mas o inibidor de adenilato quinase foi adicionado à câmara de medição com a subamostra de músculo que foi mantida no gelo (consulte o material eletrônico suplementar para obter todos os detalhes do protocolo).

As taxas de consumo de oxigênio específico de massa e produção de ATP em cada etapa do protocolo foram calculadas em média ao longo de 30-60 s de estabilização. Fluxos de O2 e ATP foram expressos em pmoles s -1 mg -1 de peso úmido de tecido. A razão ATP / O foi calculada como a razão da produção de ATP corrigida para dobrar a taxa de O2 consumo no momento em que o ATP estava sendo produzido.

(f) Análise estatística

Primeiramente, usamos a análise de correlação para testar se os parâmetros fisiológicos (eficiência mitocondrial (razão ATP / O), densidade mitocondrial (atividade COX) e taxa fracionária de síntese protéica (Ks)) estavam correlacionados entre o fígado e o músculo branco no mesmo peixe. Em seguida, usamos modelos lineares mistos (LMMs) para determinar as ligações entre a eficiência mitocondrial do fígado e / ou músculo e a taxa fracionária de síntese protéica para diferentes taxas de ingestão de alimentos. Os modelos incluíram Ks de fígado ou músculo como a variável dependente, razão ATP / O de fígado e músculo como preditores contínuos e a ingestão de alimentos (alta ou baixa) como um fator fixo e interações bidirecionais entre a ingestão de alimentos e covariáveis. Para controlar os efeitos da densidade mitocondrial na taxa fracionária de síntese protéica, os modelos incluíram a atividade COX do fígado e do músculo como uma covariável e em interações bidirecionais com a ingestão de alimentos, com Ks como a variável dependente. O lote de processamento foi incluído como um efeito aleatório para controlar a ordem em que os peixes foram processados. Análises preliminares mostraram que a taxa fracionária de síntese protéica não foi afetada pela duração de D5-Phe exposição ou a massa da amostra usada para a extração dos isótopos da fenilalanina, portanto, a duração da exposição e a massa da amostra não foram incluídas como covariáveis ​​nos modelos finais. Finalmente testamos se o grau de eficiência mitocondrial e a taxa fracionária de síntese de proteínas do fígado e / ou do músculo explicavam a variação individual no desempenho de crescimento usando uma abordagem de modelo linear misto. Os modelos incluíram o desempenho de crescimento (taxa de crescimento específica, eficiência de crescimento e ganho de proteína específica) como variáveis ​​dependentes, e a razão ATP / O e Ks de fígado e músculo como preditores contínuos, a ingestão de alimentos como um fator fixo, com lote de processamento como um fator aleatório. Para controlar os efeitos da densidade mitocondrial no desempenho do crescimento, a atividade COX do fígado ou músculo foi incluída como uma covariável nos modelos com taxa de crescimento específica, eficiência de crescimento e ganho de proteína específica como variável dependente. Esses modelos também incluíram interações bidirecionais entre covariáveis ​​e regime alimentar. Para controlar os efeitos do tamanho corporal inicial sobre o desempenho do crescimento, a massa corporal inicial foi incluída como uma covariável nos modelos com taxa de crescimento específica ou eficiência de crescimento como variável dependente, enquanto a estimativa inicial para o conteúdo de proteína de corpo inteiro foi incluída como uma covariável no modelo para ganho de proteína específico. Todos os modelos foram simplificados pela remoção de termos não significativos em um procedimento de exclusão reversa, começando com a significância das interações bidirecionais quando os termos foram retirados do modelo. Todas as análises estatísticas foram realizadas no IBM SPSS Statistics 21 (Chicago, IL). Os dados são apresentados como médias ± s.e., e o nível de significância foi definido para p & lt 0,05.

3. Resultados

A eficiência mitocondrial (razão ATP / O) apresentou variação interindividual significativa, variando pelo menos duas vezes para cada tecido entre indivíduos com a mesma ingestão alimentar (material eletrônico suplementar, tabela S1). A taxa fracionária de síntese protéica Ks diferiu em até duas ou cinco vezes no fígado e músculo, respectivamente, entre indivíduos com a mesma ingestão alimentar (material eletrônico suplementar, tabela S1). Não houve correlação entre as características fisiológicas (relação ATP / O e Ks) do fígado e músculo de um mesmo peixe (material eletrônico suplementar, tabela S2).

A taxa fracionária de síntese de proteína muscular Ks em um peixe dependia da razão ATP / O de suas mitocôndrias hepáticas, embora esse efeito dependesse da ingestão de alimentos (ATP / O do fígado por interação de ingestão de alimentos, tabela 1). Enquanto o Ks do músculo foi positivamente relacionado com a razão ATP / O nas mitocôndrias do fígado de peixes com alta ração alimentar (t36 = 2.80, p = 0,008), não houve tal relação em peixes recebendo uma ração alimentar baixa (t36 = −0.92, p = 0,362 figura 1). A variação entre os indivíduos na taxa fracionária de síntese de proteína Ks no fígado não foi explicada pela eficiência mitocondrial no fígado ou músculo (LMM, p & gt 0,05).

Figura 1. Relação entre a taxa fracionária de síntese protéica (Ks) no músculo e a eficiência mitocondrial (razão ATP / O) no fígado de truta marrom juvenil com baixo e alto consumo de alimentos. As linhas contínuas mostram um efeito significativo. n = 28-30 peixes por nível de alimento. Consulte a tabela 1 para análises estatísticas.

Tabela 1. Resultados da análise de modelo linear misto da taxa fracionária de síntese protéica (Ks) no músculo de uma truta marrom em função de sua ingestão alimentar e das propriedades (razão ATP / O e citocromo c oxidase, atividade COX) da mitocôndria em seu músculo e fígado. (O lote de processamento foi incluído como um efeito aleatório para controlar a ordem em que os peixes foram processados. Termos não significativos foram excluídos da análise final. Negrito indica resultados significativos.)

a Consumo alimentar: fator fixo de dois níveis (baixo e alto consumo alimentar).

b Modelo completo: Ks musculares = ingestão alimentar + atividade COX hepática + atividade COX muscular + proporção ATP / O do fígado + proporção ATP / O muscular + ingestão alimentar × proporção ATP / O do fígado + ingestão alimentar × atividade COX hepática + ingestão alimentar × músculo Atividade COX + ingestão alimentar × relação ATP / O muscular.

Não surpreendentemente, a ingestão de alimentos teve um efeito positivo nas taxas de crescimento específicas, com peixes tendo, em média, uma taxa de crescimento específica três vezes maior na ração alta em comparação com a ração baixa (material eletrônico suplementar, tabela S1). No entanto, os indivíduos do mesmo tratamento alimentar variaram consideravelmente em sua taxa de crescimento específica, com os peixes de crescimento mais rápido na ração baixa excedendo o crescimento de alguns peixes na ração alta (figura 2uma baixa ingestão de alimentos: -6,00 a 110,57 mg dia -1 alta ingestão de alimentos: 68,86-394,43 mg dia -1). Esta variação individual na taxa de crescimento foi parcialmente explicada por diferenças na eficiência mitocondrial do fígado, embora o efeito dependesse da ingestão de alimentos (ATP / O do fígado por interação de tratamento alimentar, tabela 2). A taxa de crescimento específico dos peixes que recebem altas rações foi forte e positivamente ligada à razão ATP / O em suas mitocôndrias hepáticas (t41 = 4.46, p & lt 0,001 figura 2uma), enquanto a tendência não foi significativa quando a ingestão de alimentos era baixa (t41 = 0.33, p = 0,745). Independentemente da ingestão de alimentos, a taxa de crescimento específico de um peixe foi forte, mas negativamente ligada ao Ks em seu músculo após o controle do ATP / O do fígado (tabela 2). As taxas de crescimento específicas sob ambas as rações não foram relacionadas à razão ATP / O nas mitocôndrias musculares, ou ao Ks no fígado (tabela 2).

Figura 2. Relações entre os índices de desempenho de crescimento e eficiência mitocondrial (razão ATP / O) em juvenis de truta marrom em níveis baixos versus altos de alimentos. (uma) Taxa de crescimento específica em relação à razão ATP / O do fígado, e (b) eficiência de crescimento em relação à relação ATP / O do fígado. Linhas contínuas mostram efeitos significativos. n = 29-30 peixes por nível de alimento. Consulte a tabela 2 para análises estatísticas. (uma) Os traçados são resíduos parciais da taxa de crescimento específico para peixes com alta ração alimentar avaliada na massa corporal inicial média = 9,59 g. (b) São representados graficamente os resíduos parciais da eficiência do crescimento avaliada na massa corporal inicial média = 9,02 mg.

Tabela 2. Resultados de análises de modelos mistos lineares dos índices de desempenho de crescimento em truta marrom individual em função de sua massa inicial, sua densidade mitocondrial de fígado e músculo (atividade COX), ingestão de alimentos, eficiência mitocondrial de fígado e músculo (relação ATP / O ) e taxas fracionárias de síntese de proteínas (Ks). (O lote de processamento foi incluído como um efeito aleatório para controlar a ordem em que os peixes foram processados. Termos não significativos foram excluídos da análise final. Negrito indica resultados significativos.)

a Consumo alimentar: fator fixo de dois níveis (baixo e alto consumo alimentar).

b Modelo completo: taxa de crescimento específico = atividade COX do fígado + atividade COX do músculo + massa corporal inicial + ingestão de alimentos + relação ATP / O do fígado + relação ATP / O do músculo + Ks do fígado + Ks do músculo + ingestão de alimentos × atividade COX do fígado + ingestão de alimentos × atividade COX muscular + ingestão de alimentos × massa corporal inicial + ingestão de alimentos × razão ATP / O do fígado + ingestão de alimentos × razão ATP / O dos músculos + ingestão de alimentos × Ks do fígado + ingestão de alimentos × Ks dos músculos.

c Modelo completo: eficiência de crescimento = atividade COX do fígado + atividade COX do músculo + massa corporal inicial + ingestão de alimentos + relação ATP / O do fígado + relação ATP / O do músculo + Ks do fígado + Ks do músculo + ingestão de alimentos × atividade COX do fígado + ingestão de alimentos × atividade COX muscular + ingestão alimentar × massa corporal inicial + ingestão alimentar × razão ATP / O do fígado + ingestão alimentar × razão ATP / O muscular + ingestão alimentar × Ks do fígado + ingestão de alimentos × Ks dos músculos.

d Modelo completo: ganho de proteína específica = atividade COX do fígado + atividade COX do músculo + massa de proteína inicial + ingestão de alimentos + relação ATP / O do fígado + relação ATP / O do músculo + Ks do fígado + Ks do músculo + ingestão de alimentos × atividade COX do fígado + ingestão de alimentos × atividade COX muscular + ingestão de alimentos × massa protéica inicial + ingestão de alimentos × razão ATP / O do fígado + ingestão de alimentos × razão ATP / O dos músculos + ingestão de alimentos × Ks do fígado + ingestão de alimentos × Ks dos músculos.

A eficiência de crescimento variou entre os indivíduos de -0,13 a 2,23 de ganho de massa corporal por massa de alimento ingerido, mas não diferiu entre peixes com baixo e alto teor de alimentos (material eletrônico suplementar, tabela S1). Independentemente de sua ingestão de alimentos, os indivíduos que tinham a maior razão ATP / O no fígado tiveram a maior eficiência de crescimento (tabela 2, figura 2b).

A taxa de ganho de proteína da truta também diferiu consideravelmente entre os indivíduos, variando de -1,98 a 17,74 mg dia -1 para peixes com ração baixa e de -0,21 a 60,79 mg dia -1 para peixes com ração alta. Indivíduos que tinham uma razão ATP / O mais alta em suas mitocôndrias hepáticas e um Ks mais baixo em seus músculos tiveram um ganho específico mais rápido em massa de proteína (tabela 2). A taxa específica de ganho de proteína não foi relacionada à razão ATP / O na mitocôndria muscular nem ao Ks no fígado (tabela 2).

4. Discussão

Enquanto a tendência geral era de que o desempenho do crescimento aumentasse quando a ingestão de alimentos era maior, os indivíduos exibiam desempenho de crescimento marcadamente diferente, mesmo quando com ingestão de alimentos idêntica. Essa variação no crescimento estava relacionada à função mitocondrial: indivíduos que eram mais eficientes na produção de ATP dentro das mitocôndrias do fígado cresceram mais rápido, com mais eficiência e acumularam mais proteína do que aqueles indivíduos com mitocôndrias menos eficientes. Indivíduos que tiveram uma maior eficiência mitocondrial do fígado sob altos níveis de alimentos tiveram uma taxa mais rápida de síntese de proteínas em seus músculos. No entanto, essas diferenças na síntese de proteínas tiveram um efeito sobre o desempenho do crescimento na direção totalmente oposta à nossa previsão inicial de que 'a síntese de proteínas promove o crescimento'. Em resumo, nosso estudo mostra pela primeira vez, até onde sabemos, que sob condições de ingestão alimentar fixa, a eficiência mitocondrial de um animal individual pode determinar se ele cresce rápido ou lentamente.

A variação individual no desempenho do crescimento é provavelmente uma característica complexa e integrativa influenciada por vários traços fisiológicos e comportamentais. Como as diferenças individuais na taxa de crescimento variam com comportamentos que aumentam as taxas de alimentação [33], apenas estudos de animais com ingestão controlada de alimentos podem lançar luz sobre os fatores fisiológicos das diferenças de crescimento. A ingestão de alimentos em nosso experimento foi padronizada, revelando que o crescimento de peixes com a mesma ração pode variar mais de três vezes entre os indivíduos. Conseqüentemente, alguns peixes no tratamento de baixa ração estavam na verdade crescendo mais rápido do que outros no tratamento de alta ração, que consumiam três vezes mais comida. Embora já tenha sido demonstrado que o aumento da eficiência mitocondrial promove características relacionadas à aptidão (desempenho físico [34], desempenho de crescimento [9,21-23,35], produção reprodutiva [36] e envelhecimento [9,14,36,37] ), aqui demonstramos que essa relação pode ocorrer até mesmo quando os animais experimentam taxas semelhantes de ingestão de alimentos. Além de variar entre os indivíduos, a eficiência mitocondrial é uma característica flexível que pode mudar em resposta às condições ambientais [38,39] e ao estágio da vida [34,40]. Uma maior eficiência mitocondrial também pode ter um custo porque as mitocôndrias são um grande produtor de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a eficiência mitocondrial pode estar positivamente relacionada à produção de ROS [17,37]. Quando a geração de EROs em um organismo excede a capacidade de seus mecanismos de defesa e reparo antioxidante para combater seus efeitos, pode ocorrer um acúmulo de dano oxidativo [41]. As ROS foram propostas como um fator importante subjacente à senescência celular e de todo o organismo [41] e, portanto, um custo potencial ligado ao crescimento rápido [42,43]. Apesar desse custo, em alguns contextos, a seleção natural pode favorecer fenótipos com eficiência mitocondrial relativamente alta (porque isso pode levar a um crescimento mais rápido, aumento do tamanho do corpo na maturidade, risco de mortalidade minimizado e maior número de ovos), enquanto em outros contextos, um menor a eficiência mitocondrial e a diminuição da produção de ROS podem ser benéficas (por exemplo, sob condições de disponibilidade alimentar ad libitum) [7,17,37,44]. Esta hipótese está de acordo com vários estudos recentes que sugerem que a variação na função mitocondrial é um alvo chave da seleção natural [45,46].

Nossas descobertas de que peixes com alta eficiência mitocondrial do fígado tiveram uma alta taxa de síntese de proteínas em seus músculos e crescimento mais rápido correspondem às nossas previsões de que uma maior eficácia na conversão de alimentos em ATP pode levar a uma maior alocação para processos energeticamente caros, como síntese e crescimento de proteínas . Contrariamente às expectativas, a taxa de síntese protéica no músculo branco foi negativamente correlacionada com o desempenho de crescimento dos indivíduos que cresceram melhor apresentaram taxas mais baixas de síntese protéica muscular para uma dada eficiência mitocondrial do fígado. Uma explicação para esta discrepância pode estar no fato de que as taxas de síntese de proteínas são específicas do tecido [47] e a correlação das taxas de síntese de proteínas em diferentes tecidos no mesmo indivíduo pode ser pobre (como mostrado por este estudo), e assim o A gama de tecidos que foi medida em nosso estudo pode não ser representativa da taxa geral de síntese protéica em todo o animal, porque isso seria definido como a soma das taxas específicas de tecido individuais de síntese protéica [48]. No entanto, relações positivas entre a síntese de proteínas no músculo branco e o crescimento corporal foram relatadas em outras espécies [26,47]. Uma explicação alternativa é baseada no fato de que as proteínas do corpo estão continuamente sendo quebradas, bem como sintetizadas, e assim a síntese de proteínas só resultará em crescimento se a taxa de síntese exceder a taxa de degradação, já foi demonstrado anteriormente que a variação de crescimento entre peixes individuais são mais explicados pela variação nas taxas de degradação de proteínas do que pelas taxas de síntese de proteínas [26]. Embora as medições das taxas de degradação da proteína estivessem além do escopo do presente estudo, só pode ser possível explicar os padrões observados de crescimento da proteína se todos os aspectos do metabolismo da proteína (síntese e degradação) forem considerados [49].

Em conclusão, nosso estudo demonstrou uma relação clara e positiva entre a eficiência com a qual as mitocôndrias do fígado convertem substratos de energia em ATP e o desempenho de crescimento do animal inteiro. Pesquisas futuras devem se concentrar em quantificar os custos presumidos de mitocôndrias altamente eficientes. Informações sobre as causas e consequências da variação na eficiência mitocondrial permitiriam a previsão das consequências para o desempenho do animal inteiro da variação na função mitocondrial, ligando assim os processos celulares à aptidão do organismo.

Ética

Todos os procedimentos foram realizados sob a jurisdição de uma licença de projeto do Home Office do Reino Unido (PPL 60/4292).


RESULTADOS E DISCUSSÃO

A atividade da via Shh aumenta a massa mitocondrial

Anteriormente, descobrimos que a exposição a uma forma bioativa de Shh (ShhN Chen et al., 2002a) ou o agonista de Shh SAG (Chen et al., 2002b) por 24-48 h ativa a via de sinalização Shh em neurônios do hipocampo em cultura (Yao et al., 2015). Uma das avaliações da atividade celular Shh é o nível de expressão da proteína Gli1 medido por immunoblot (Ingham e McMahon, 2001 Varjosalo e Taipale, 2008 Yao et al., 2015). Para determinar a rapidez com que os neurônios responderiam ao ShhN, incubamos neurônios com ShhN por várias durações de 1 a 24 h, coletamos os neurônios e analisamos o nível de expressão da proteína Gli1. Descobrimos que o nível de proteína Gli1 nos neurônios do hipocampo aumentou após apenas 1 h de exposição a ShhN, e o aumento continuou com o tempo de maneira linear (Figura 1A). Porque 24 h de incubação ShhN fortemente ativado a via, usamos este protocolo para a maioria dos experimentos descritos neste estudo, a menos que indicado de outra forma.

FIGURA 1: Shh aumenta a massa mitocondrial nos neurônios do hipocampo. (A) Os neurônios do hipocampo cultivados foram incubados com ShhN (10%) por várias durações de 1 a 24 h. A abundância do alvo transcricional Shh, Gli1, foi medida nos lisados ​​neuronais por imunoblot usando um anticorpo específico para Gli1. O mesmo Gli1 blot (filme) foi exposto por 5 ou 60 s, conforme indicado. (B) Imunoblot representativo mostrando os níveis de proteína COXIV em controle não tratado ou neurônios tratados com ShhN ou SAG. SAG foi usado a 400 nM. (C) Quantificação de B. A intensidade da banda para COXIV e β-actina foi medida usando ImageJ. Os níveis de β-actina foram usados ​​como controle de normalização. Os valores representam a média ± SEM quatro experimentos *p & lt 0,05. (D) Os neurônios de controle ou tratados com ShhN foram fixados, permeabilizados e coimunolados com um anticorpo para a enzima mitocondrial ATP sintase (verde) e um anticorpo para um marcador neuronal, β-tubulina classe III (Tuj vermelho). Os neurônios foram visualizados usando microscopia confocal.Imagens representativas da sintase de ATP mostram mitocôndrias alongadas em neurônios tratados com ShhN. Barras de escala, 25 μm (superior), 10 μm (inferior). (E) A abundância e morfologia das mitocôndrias foram visualizadas em neurônios de controle ou tratados com ShhN, coincubados com um corante mitocondrial, MitoTracker Green, e um corante marcador de membrana, BODIPY (vermelho). Imagens representativas de células vivas mostram mitocôndrias mais longas em neurônios tratados com ShhN. Barras de escala, 100 μm (parte superior), 10 μm (parte inferior). (F) Quantificação da morfologia mitocondrial e abundância (descrito em Materiais e métodos) Mais de 80.000 mitocôndrias marcadas com MitoTracker Green de quatro experimentos foram medidas. Os dados representam a média ± SEM. ***p & lt 0,001.

Em uma pesquisa inicial de neurônios tratados com ShhN, observamos níveis elevados de mRNAs para muitas moléculas relacionadas à mitocôndria (Tabela Suplementar S1), entre elas está o complexo da citocromo C oxidase IV (COXIV), uma proteína da membrana mitocondrial interna (Vogel et al., 2006, aumento de aproximadamente duas vezes de três réplicas biológicas por microarray). Portanto, medimos o nível da proteína COXIV em neurônios estimulados por ShhN por immunoblot, usando os níveis de β-actina como controle de normalização. Em neurônios tratados com ShhN, o nível de proteína COXIV foi visivelmente maior do que os neurônios de controle (Figura 1, B e C). Da mesma forma, o agonista de Shh SAG também aumentou significativamente o nível de COXIV (Figura 1, B e C).

Em seguida, examinamos a enzima mitocondrial ATP sintase por coimunomarcação dos neurônios com um anticorpo para ATP sintase e um anticorpo para um marcador neuronal, β-tubulina classe III (Tuj1). Embora mitocôndrias marcadas com ATP sintase tenham sido observadas em neurônios de controle e tratados com ShhN, as mitocôndrias eram visivelmente mais longas em neurônios tratados com ShhN (Figura 1D). Monitorando mitocôndrias com MitoTracker Green, que marca as membranas mitocondriais internas (Mitra e Lippincott-Schwartz, 2010), observamos novamente um aumento na população de mitocôndrias tubulares longas nos neurônios tratados com ShhN (Figura 1E). Usamos uma estratégia de análise customizada para quantificar as mudanças observadas na morfologia mitocondrial e abundância (descrito em Materiais e métodos) As medições de & gt80.000 mitocôndrias marcadas com MitoTracker Green revelaram que as mitocôndrias em neurônios tratados com ShhN eram ∼2,5 vezes mais longas do que as mitocôndrias em neurônios de controle não tratados (Figura 1F). Além disso, observamos uma maior densidade de mitocôndrias nos neurônios tratados com ShhN (Figura 1F). Coletivamente, essas descobertas sugerem que a ativação da via Shh em neurônios do hipocampo aumenta a massa mitocondrial global, promovendo o alongamento mitocondrial e aumentando o número mitocondrial.

A atividade da via Shh reduz a fissão mitocondrial

Observamos que o tratamento com Shh resulta em um aumento no comprimento das mitocôndrias individuais e em mais mitocôndrias totais. Embora esses dois efeitos juntos possam contribuir para o aumento da função mitocondrial (investigado posteriormente), o mecanismo para gerar esses efeitos pode ser considerado separadamente. O comprimento das mitocôndrias é regulado pelo equilíbrio entre a fissão e a fusão das mitocôndrias. O aumento observado no comprimento das mitocôndrias pode ser causado por níveis aumentados das proteínas promotoras de fusão mitofusina1 (Mfn1), mitofusina2 (Mfn2) e atrofia óptica 1 (Opa1 Scott e Youle, 2010 Westermann, 2010). Para investigar se a sinalização de Shh altera os níveis das proteínas promotoras de fusão, realizamos análise de Western blot de lisados ​​neuronais. Não observamos alterações nos níveis de Mfn1 ou Mfn2 em culturas tratadas com ShhN ou SAG (Figura 2, A e B). Também não observamos aumento significativo nos níveis de Opa1 em culturas tratadas com ShhN ou SAG (Figura 2, C, topo e D, esquerda).

FIGURA 2: Shh reduz a proteína de fissão mitocondrial Drp1. (A) Os neurônios cultivados foram incubados com ShhN (10%) ou SAG (400 nM) por 24 h, e lisados ​​neuronais foram coletados. Cada amostra foi dividida em três conjuntos iguais (∼20 μg por conjunto) e analisada em três immunoblots usando um anticorpo para mitofusina1 (Mfn1) ou mitofusina2 (Mfn2) ou β-actina. (B) Quantificação de A. A intensidade da banda foi medida usando ImageJ. Para cada amostra, a intensidade da banda Mfn foi normalizada para β-actina. Os dados apresentados são normalizados para as amostras de controle. Os dados representam a média ± SEM de três experiências. (C) Como em A, lisados ​​de células de controle ou neurônios tratados com ShhN ou SAG foram analisados ​​por imunotransferência. As amostras executadas em paralelo foram sondadas para Opa1, Drp1, Drp1 serina 616-forma fosforilada (p616Drp1) ou β-actina. (D) Quantificação de C. A razão de cada banda em relação à β-actina foi normalizada em relação ao valor das amostras de controle. Os dados são média ± SEM ***p & lt 0,001, seis experiências. Os níveis aumentados de Opa1 não são estatisticamente significativos (0,99 ± 0,02 no controle vs. 1,11 ± 0,07 em neurônios tratados com ShhN, p = 0,16 ou vs. 1,12 ± 0,02 em neurônios tratados com SAG, p = 0,06). (E) Para avaliar a abundância de proteínas associadas às mitocôndrias, as mitocôndrias foram isoladas (descrito em Materiais e métodos) O imunoblot de mitocôndrias purificadas mostra níveis reduzidos de Drp1 e p616Drp1 associados a mitocôndrias em neurônios tratados com ShhN. PonS, mancha manchada com Ponceau S correspondendo à área Drp1. (F) Quantificação de E. A intensidade das bandas nas amostras ShhN é exibida como uma porcentagem da intensidade das bandas nas células de controle. Os dados são média ± SEM. **p & lt 0,01, *p & lt 0,05 quatro experiências para Drp1 e cinco para p616Drp1. (G) Quantificação da taxa de eventos de fissão mitocondrial em células ShhN vs. controle (média ± SEM). Mitocôndrias em controle ou neurônios tratados com ShhN foram marcados com MitoTracker Green e imagens em intervalos de 10 s por 10 min usando um microscópio confocal de disco giratório. Os eventos de fissão foram identificados visualmente durante a revisão pós-aquisição dos conjuntos de dados. O gráfico exibe o número médio de eventos de fissão mitocondrial a cada 10 minutos por célula. **p & lt 0,01.

Em seguida, examinamos a proteína de fissão mitocondrial GTPase Drp1 semelhante à dinamina. A fosforilação de Drp na serina 616 aumenta a atividade de fissão da proteína (Taguchi et al., 2007, Chang e Blackstone, 2010). A diminuição da atividade de Drp1 pode contribuir para o aumento observado no comprimento mitocondrial, então quantificamos os níveis de Drp1 total e sua forma fosforilada com serina 616 (phos616 Drp1 ou p616Drp1). Embora não tenhamos visto uma mudança consistente no Drp1 total (Figura 2, C e D, meio), o nível de phos616Drp1 foi reduzido significativamente em neurônios tratados com ShhN ou SAG (Figura 2, C e D, à direita). Como o Drp1 é recrutado para locais de fissão na superfície mitocondrial (Scott e Youle, 2010 Westermann, 2010), purificamos as mitocôndrias dos neurônios tratados com ShhN e dos neurônios de controle não tratados e examinamos o Drp1 associado às mitocôndrias. A análise de imunoblot revelou uma redução significativa de Drp1 associado a mitocôndrias e phos616 Drp1 nos neurônios tratados com ShhN (Figura 2, E e F). Esses resultados sugeriram que a sinalização Shh altera o comprimento mitocondrial, reduzindo os eventos de fissão por meio da diminuição da atividade do Drp1.

Testamos essa hipótese usando imagens de fluorescência confocal ao vivo de mitocôndrias em controle versus neurônios tratados com ShhN e observamos que o tratamento com ShhN causou uma redução significativa no número de eventos de fissão mitocondrial em neurônios ShhN (0,33 evento de fissão a cada 10 minutos por célula, n = 10 células) em comparação com o controle (0,86 evento de fissão a cada 10 minutos por célula, n = 10 células p & lt 0,005 Figura 2G). Tomados em conjunto, nossos resultados suportam a hipótese de que Shh induz o alongamento mitocondrial em neurônios do hipocampo, em parte reduzindo os níveis e a atividade de phos616 Drp1, reduzindo assim a taxa geral de fissão mitocondrial.

Além de mitocôndrias mais longas, a estimulação Shh faz com que mais de duas vezes mais mitocôndrias se acumulem nos neurônios. Tomados isoladamente, seria de se esperar que a diminuição observada nos eventos de fissão causasse uma diminuição na população de mitocôndrias. Sabe-se, no entanto, que o alongamento das mitocôndrias diminui a degradação das mitocôndrias pela mitofagia (Rambold et al., 2011). Embora Shh estimule algumas formas de autofagia em neurônios do hipocampo (Petralia et al., 2013), o aumento do comprimento das mitocôndrias devido à diminuição da fissão após o tratamento com Shh provavelmente protege as mitocôndrias da degradação (Gomes et al., 2011).

Evidências emergentes sugerem uma ligação funcional entre Drp1, dinâmica do filamento de actina e proteínas reguladoras de actina (Korobova et al., 2013, 2014, Hatch et al., 2014 Ji et al., Solar 2015 et al., 2015), incluindo cofilina (Li et al., 2014, Prudent e McBride, 2016). A regulação negativa da cofilina afeta a fissão mitocondrial mediada por Drp1, levando ao alongamento das mitocôndrias (Li et al., 2014). Porque a atividade da via Shh nos neurônios do hipocampo efetivamente desregula a cofilina (Yao et al., 2015), é plausível que a atividade da via de sinalização Shh pudesse influenciar as mitocôndrias regulando Drp1 e cofilina.

A atividade da via Shh altera a aparência ultraestrutural mitocondrial

Em seguida, examinamos a ultraestrutura das mitocôndrias estimuladas por Shh usando microscopia eletrônica de transmissão. Considerando grandes variáveis ​​experimentais e resolução insuficiente de estruturas internas nas mitocôndrias desses neurônios cultivados, nos concentramos em comparar a aparência geral da mitocôndria nos neurônios tratados com ShhN com os neurônios de controle não tratados. A diferença notável entre os dois grupos foi a mitocôndria geralmente mais escura nos neurônios tratados com ShhN (Figura 3, A e B, e Figuras Suplementares S1 e S2). Para fazer comparações objetivas, quantificamos a intensidade das mitocôndrias em relação à intensidade do citoplasma do mesmo neurônio. As medições de 984 mitocôndrias confirmaram que a intensidade média das mitocôndrias em neurônios tratados com ShhN foi significativamente maior do que a das mitocôndrias em neurônios de controle não tratados (razão entre a intensidade mitocondrial e a intensidade citoplasmática para o tratamento 2-d ShhN: ShhN 32,0 ± 0,85 vs. controle 23,8 ± 1,14, p & lt 0,001 n ≥ 519 mitocôndrias, culturas de três ratos tratamento com ShhN 3-d: ShhN 39,6 ± 1,34 vs. controle 26,6 ± 0,91, p & lt 0,001 n ≥ 465 culturas de mitocôndrias de três ratos Figura 3C).

FIGURA 3: Shh altera a ultraestrutura mitocondrial. (A, B) Os neurônios do hipocampo foram tratados com ShhN por 2 ou 3 dias e processados ​​para microscopia eletrônica. Micrografias eletrônicas representativas (cinco exemplos para cada grupo) mostram a gama de estruturas mitocondriais e densidade em neurônios de controle e tratados com ShhN. Muitas mitocôndrias visivelmente mais escuras são vistas nos neurônios tratados com ShhN. A maioria das micrografias mostra regiões sinápticas onde axônios com terminais pré-sinápticos (pré) e dendritos podem ser facilmente distinguidos. Barra de escala, 500 nm (inferior esquerdo e três superiores), 1 μm (caso contrário). (C) A intensidade mitocondrial foi medida usando ImageJ. Em cada eletromicrografia, uma área aleatória sobre o citoplasma (livre de mitocôndrias) foi selecionada e a intensidade (valor médio de cinza) foi medida. A mesma área selecionada foi então movida sobre uma mitocôndria e a intensidade foi medida. Para cada micrografia, três mitocôndrias selecionadas aleatoriamente foram medidas e a razão de cada intensidade mitocondrial para a intensidade citoplasmática foi calculada (média ± SEM ***p & lt 0,001, ≥519 mitocôndrias para tratamento 2-d e ≥ 465 para tratamento 3-d). (D) As mitocôndrias foram purificadas dos neurônios controle e tratados com ShhN, e as proteínas solubilizadas foram separadas por SDS-PAGE. A análise de imunotransferência mostra que a proteína da membrana interna COXIV aumenta com o tratamento com ShhN, mas o nível da proteína da membrana externa VDAC é relativamente inalterado. (E) Quantificação de D. As intensidades das bandas foram quantificadas usando ImageJ. A intensidade das bandas nas amostras ShhN é normalizada para o valor nas amostras de controle. *p & lt 0,05, quatro experiências.

Avanços significativos foram feitos no entendimento da morfologia e estrutura das mitocôndrias. A relevância biológica da densidade de elétrons mitocondrial vista em microscopia eletrônica, entretanto, não é compreendida. Em um estudo inicial de microscopia eletrônica de células de fígado de rato, as mitocôndrias tornaram-se mais leves ou menos densas em elétrons após inanição e então realimentação (Rouiller e Bernhard, 1956). Em um estudo mais recente de fibroblastos embrionários de camundongo, as mitocôndrias eram mais escuras após a inanição sob algumas condições experimentais (Gomes et al., 2011). Essas observações implicam, pelo menos em células não neuronais, uma correlação entre a densidade de elétrons mitocondrial e sua atividade. No caso das células neuronais, as diferenças na densidade de elétrons mitocondriais parecem ser observadas apenas incidentalmente. Em uma caracterização microscópica eletrônica de cultura de neurônios do hipocampo - o tipo neuronal estudado neste trabalho, as mitocôndrias pareciam mais escuras nos axônios do que nos dendritos (Bartlett e Banker, 1984), embora a diferença não tenha sido investigada explicitamente. Uma diferença semelhante também foi observada nos nervos auditivos, para os quais as mitocôndrias pré-sinápticas pareciam visivelmente mais escuras (Redd et al., 2000).

Pode-se especular que mitocôndrias mais escuras são indicativas de maiores quantidades de proteínas mitocondriais, particularmente aquelas que residem nas membranas internas das mitocôndrias (Gomes et al., 2011). Porque a proteína COXIV reside nas membranas mitocondriais internas (Vogel et al., 2006) e seu nível está acentuadamente aumentado nos lisados ​​celulares totais de neurônios tratados com ShhN (Figura 1, B e C), comparamos o nível da proteína COXIV em mitocôndrias purificadas de neurônios tratados com ShhN com aqueles de neurônios de controle. A análise de imunoblot revelou que a COXIV mitocondrial foi aproximadamente quatro vezes maior em neurônios tratados com ShhN do que em neurônios de controle (4,27 ± 0,98 em tratados com ShhN vs. 0,99 ± 0,03 no controle, p = 0.045, n = 4 Figura 3, D e E).

A atividade da via Shh aumenta a atividade de fosforilação oxidativa mitocondrial

Em seguida, examinamos a função mitocondrial usando duas abordagens. Primeiro, nós coincubamos os neurônios com dois corantes: CMXRos, um corante fluorescente vermelho que se acumula nas membranas mitocondriais com base em seu potencial de membrana, e MitoTracker Green, que marca as mitocôndrias independentemente de seu potencial de membrana (Mitra e Lippincott-Schwartz, 2010). Usamos a proporção de CMXRos para MitoTracker Green para medir o potencial de membrana mitocondrial nos neurônios de controle tratados com ShhN e não tratados. Descobrimos que os neurônios tratados com ShhN têm proporções CMXRos: MitoTracker Green substancialmente maiores (∼10 vezes maior) do que os neurônios de controle (p & lt 0,001 Figura 4, A e B). Em segundo lugar, medimos a taxa de consumo de oxigênio celular (OCR) usando o sistema Seahorse (Ferrick et al., 2008) e comparou a respiração mitocondrial e a respiração ligada a ATP entre neurônios tratados com ShhN e de controle. Os neurônios tratados com ShhN têm atividades respiratórias basais e máximas significativamente maiores (Figura 4, C e D), bem como níveis aumentados de respiração ligada a ATP (Figura 4E). Essas descobertas sugerem que a atividade de sinalização Shh muda os neurônios do hipocampo de um estado metabólico anaeróbico de baixa produção de energia, principalmente dependente da glicólise, para um estado aeróbio de produção de energia mais alta, que também emprega fosforilação oxidativa para a produção de ATP (Wu et al., 2007).

FIGURA 4: Shh aumenta a atividade de fosforilação oxidativa mitocondrial. (A) Neurônios controle ou tratados com ShhN foram coincubados com CMXRos e MitoTracker Green. Imagens representativas mostram um mapa de calor da proporção de CMXRos para MitoTracker Green em neurônios vivos, de controle e tratados com ShhN. Abaixo, ampliações das regiões indicadas na parte superior. Barras de escala, 100 μm (superior), 20 μm (inferior). (B) Quantificação da razão de CMXRos para MitoTracker Green em controle vs. neurônios tratados com ShhN (seis experimentos, com ∼10 células em cada experimento médio ± SEM **p & lt 0,01). (C) OCR de controle e neurônios tratados com ShhN (descrito em Materiais e métodos) (D) Valores médios da capacidade respiratória basal e máxima em neurônios de controle e tratados com ShhN. (E) Respiração mais elevada ligada a ATP em neurônios tratados com ShhN. Para C – E, seis experimentos. Média ± SEM. **p & lt 0,01, *p & lt 0,05.

A atividade da via Shh protege os neurônios contra o estresse

Finalmente, investigamos a consequência funcional da atividade mitocondrial aumentada de Shh observada nos neurônios do hipocampo, examinando o efeito de várias toxinas. Os neurônios foram primeiro tratados com o agonista Shh SAG por 24 horas e depois expostos a um estressor neurotóxico por mais 24 horas. A viabilidade celular foi medida usando um ensaio de viabilidade celular colorimétrico. Os neurônios foram expostos às neurotoxinas por 24 horas, em vez de um período mais curto de tempo para imitar o estresse neurológico crônico ou doença, em vez de um insulto agudo.

Os agentes neurotóxicos usados ​​foram β-peptídeo amiloide (Aβ aminoácidos 1-42), peróxido de hidrogênio, glutamato e rotenona. Aβ foi usado para imitar as condições que os neurônios experimentam como Aβ agrega e se acumula no cérebro na doença de Alzheimer. A agregação de Aβ gera espécies reativas de oxigênio que causam peroxidação lipídica da membrana, manipulação de cálcio prejudicada e disfunção mitocondrial em neurônios (Mattson et al., 1992 Keller et al., 1997 Mark et al., 1997 Prasansuklab e Tencomnao, 2013). O tratamento com peróxido de hidrogênio foi usado para simular o estresse oxidativo celular, enquanto o glutamato induz excitotoxicidade e a rotenona reduz a função mitocondrial ao inibir o complexo I da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. Descobrimos que nos neurônios sem tratamento SAG, cada toxina comprometeu significativamente a viabilidade neuronal: redução de 39,3% com Aβ 7,5 µM, redução de 30,0% com peróxido de hidrogênio 15 µM, redução de 29% com tratamento de glutamato 50 µM e redução de 19,8% com 75 nM rotenona (Figura 5, A e B). A pré-exposição e o co-tratamento com SAG atenuaram significativamente a viabilidade celular comprometida causada por todas as toxinas testadas: 23,2, 17,4, 14 e 12,9% para neurônios tratados com Aβ, peróxido de hidrogênio, glutamato e rotenona, respectivamente (Figura 5, A e B) . Esses resultados indicam que a sinalização de Shh pode proteger os neurônios, pelo menos até certo ponto, contra a morte causada por estresse oxidativo, excitotóxico e metabólico.

FIGURA 5: Shh protege os neurônios contra neurotoxinas. Os neurônios do hipocampo foram tratados com SAG (200 nM) no dia 6 de cultura (A Aβ e H2O2 experimentos) ou 7 (experimentos de glutamato B e rotenona) por 24 h, seguido de coincubação com a neurotoxina indicada por mais 24 h. A viabilidade celular foi então avaliada usando um ensaio colorimétrico (descrito em Materiais e métodos) Os dados são plotados como porcentagem de viabilidade em comparação com as células de controle não tratadas. Todas as toxinas reduziram a viabilidade celular dos neurônios. O tratamento com SAG melhorou significativamente a viabilidade celular reduzida por cada toxina (**p & lt 0,01, *p & lt 0,05 pelo menos três experiências).

Neste estudo, fornecemos evidências de que Shh, bem conhecido como um morfogênio do desenvolvimento, pode influenciar a abundância mitocondrial, morfologia, função e resistência ao estresse em neurônios do hipocampo. Um relatório anterior de cultura de neurônios corticais cerebrais forneceu evidências de que Shh pode proteger os neurônios contra o estresse metabólico induzido pelo inibidor da succinato desidrogenase ácido 3-nitropropiônico (Wu et al., 2009). No entanto, o mecanismo subjacente não foi investigado. Descobrimos que a sinalização Shh aumenta o tamanho e o número de mitocôndrias e aumenta a respiração mitocondrial e a produção de ATP nos neurônios do hipocampo. Por causa de sua atividade elétrica contínua (potenciais de ação) e transmissão sináptica excitatória (mediada pelo glutamato), os neurônios têm uma demanda de ATP muito alta. Consequentemente, os decréscimos nos níveis de ATP tornam os neurônios vulneráveis ​​à excitotoxicidade, um tipo de morte neuronal conhecida por ocorrer no acidente vascular cerebral isquêmico e que também provavelmente ocorre nas doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (Mattson, 2003). Descobrimos que Shh protegeu os neurônios do hipocampo contra a excitotoxicidade induzida pelo glutamato e contra a morte induzida pela toxina mitocondrial rotenona e Aβ, ambos os quais mostraram aumentar a vulnerabilidade dos neurônios à excitotoxicidade (Mattson et al., 1992 Kanki et al., 2004). Nossos resultados sugerem que, ao aumentar a massa e função mitocondrial, Shh pode proteger os neurônios contra estressores patológicos que causam ou promovem disfunção neuronal e degeneração.

A função mitocondrial aprimorada por Shh possivelmente também desempenha um papel em outros processos celulares nos neurônios. Por exemplo, descobrimos anteriormente que a atividade da via Shh estimula seletivamente o crescimento de axônios dos neurônios do hipocampo (Yao et al., 2015), embora não tenhamos determinado se as mitocôndrias estavam envolvidas. No entanto, outros estudos demonstraram a importância das mitocôndrias no crescimento axonal (Mattson e Partin, 1999 Vaarmann et al., 2016). Portanto, é razoável considerar que a regulação positiva da função mitocondrial pela via de sinalização Shh é importante para o crescimento de axônio estimulado por Shh em neurônios do hipocampo (Yao et al., 2015) e outros tipos de neurônios (Charron et al., 2003, Parra e Zou, 2010 Wilson e Stoeckli, 2013).

Qual é o mecanismo subjacente à suprarregulação mitocondrial induzida por Shh? A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) desempenha um papel na biogênese mitocondrial (Hardie, 2011). Embora tenha sido relatado recentemente que a ativação de AMPK suprime a atividade da via de sinalização Shh em células tumorais (Li et al., 2015), não se sabe se o oposto se mantém, ou seja, se a sinalização Shh afeta AMPK. Nossas observações preliminares indicam que o efeito de Shh na AMPK é, pelo menos nos neurônios do hipocampo, inexistente ou insignificantemente pequeno (dados não publicados).

Finalmente, é interessante notar que a sinalização Shh foi proposta para ter um efeito oposto sobre as mitocôndrias em precursores de neurônios granulares cerebelares (CGNPs Malhotra et al., 2016). Uma distinção entre CGNPs e neurônios do hipocampo é que os primeiros estão proliferando, mas os últimos são diferenciados e pós-mitóticos. Se as diferenças na resposta à sinalização Shh surgem de diferenças intrínsecas nos tipos de células, estágios de desenvolvimento ou circuitos neurais associados são questões importantes. A discrepância entre nossos achados e os de Malhotra et al. (2016) também pode resultar de diferenças nas condições experimentais e design. Por exemplo, eles usaram Shh recombinante, cuja bioatividade parecia ser insignificante em comparação com a de ShhN (Figura Suplementar S3).


Máquinas moleculares

E quanto ao movimento turbulento nas proximidades das proteínas? As proteínas respiratórias são máquinas moleculares em nanoescala extraordinárias que podem mudar seu estado conformacional centenas de vezes por segundo, a ATP sintase gira em até 400 vezes por segundo [12].

Há uma tendência interessante nas proteínas respiratórias integrantes da membrana em metazoários, em que muitos dos aminoácidos hidrofóbicos em animais com baixas taxas metabólicas, como nematóides, são substituídos por resíduos de serina e treonina em animais mais ativos, notadamente pássaros e mamíferos [13]. Resíduos de serina e treonina podem formar redes extensas de ligações de hidrogênio fracas entre hélices transmembrana, o que poderia facilitar mudanças rápidas entre os estados conformacionais envolvidos no bombeamento de prótons [14]. Eles também podem ajudar a estabilizar a montagem de supercomplexos [14], que Chrétien e colegas mostram ser mais robustos em temperaturas mais altas do que complexos respiratórios individuais [1].


Estrutura Mitocondrial

Cada organela celular é exclusivamente projetada para suportar suas funções, como pode ser visto na estrutura e funções das mitocôndrias. Uma mitocôndria é composta por duas membranas: uma membrana externa e uma interna, ambas feitas de proteínas e outros compostos complexos. Uma vez que ambas as membranas têm propriedades distintas, uma única mitocôndria é composta pelo espaço intermembranar, o espaço crista e a matriz, além das duas membranas. Cada parte da organela tem um papel importante a desempenhar, e a estrutura de cada mitocôndria é fundamental para o desempenho delas.

A membrana externa abriga vários componentes da mitocôndria e é permeável a ATP, ADP ou outras moléculas. A membrana interna é composta por moléculas do sistema de transporte de elétrons, além de proteínas de transporte e vários complexos. É menos permeável do que a membrana externa. A matriz é citoplasmática e consiste nas moléculas de DNA, além de vários gases e enzimas. Os ribossomos são responsáveis ​​pela síntese de proteínas e estão contidos na matriz junto com outros complexos. As cristas são as introversões responsáveis ​​pelo aumento da área superficial da membrana interna.


Introdução

Espécies e populações dentro das espécies exibem variação substancial nas características da história de vida, como fecundidade, sucesso de incubação, taxa de desenvolvimento, taxa de crescimento e tamanho na maturidade (Roff 1992). No entanto, a variação nessas características não ocorre em todas as combinações possíveis na natureza (Stearns 1976, 1992). Em vez disso, foi proposto que ocorresse ao longo de um continuum lento a rápido, com espécies ou populações com baixa taxa reprodutiva, desenvolvimento lento e longa vida útil em uma extremidade do continuum, e aqueles com taxas reprodutivas e desenvolvimento mais rápidos, mas mais curtos tempo de vida do outro (Ricklefs e Wikelski 2002). Como tal, a hipótese do ritmo de vida tem seu fundamento no conceito clássico de seleção “r” e “K” (MacArthur e Wilson 1967 Pianka 1970). O conceito de ritmo de vida foi estendido para incluir uma variedade de traços fisiológicos e comportamentais (Reale et al. 2010), sugerindo a existência de uma síndrome complexa que liga traços múltiplos em níveis de organização biológica para variação em estratégias de história de vida. Essas diferenças observadas no ritmo de vida aparente e os traços fisiológicos e comportamentais associados (Reale et al. 2010) representam diferentes escolhas de alocação entre os investimentos em reprodução, crescimento e sobrevivência (Stearns 1976, 1992) resultantes de trade-offs devido ao alocação de recursos limitados entre diferentes funções (Stearns 1992 Zera e Harshman 2001). O conceito de ritmo de vida inspirou esforços de pesquisa substanciais e foi o assunto de várias sínteses recentes (ver, por exemplo, Dammhahn et al. 2018), mas sua validade e base mecanística subjacente ainda são uma questão de debate vigoroso (Royauté et al. 2018 ) O objetivo da presente revisão é examinar esse conceito no contexto da fisiologia térmica e, especificamente, explorar o papel potencial da variação na função mitocondrial como um mecanismo subjacente à variação no ritmo de vida como uma adaptação à temperatura ambiente.

Acredita-se que a variação na taxa metabólica desempenhe um papel importante como causa ou consequência da variação no ritmo de vida (Ricklefs e Wikelski 2002 Wiersma et al. 2007 Williams et al. 2010 Glazier 2015), como indivíduos no final rápido de o ritmo do espectro de vida tende a ter taxas metabólicas de repouso mais altas, mesmo depois que as diferenças no tamanho do corpo foram contabilizadas (Ricklefs e Wikelski 2002). De fato, em um elegante estudo com guppies de Trinidad, Auer et al. (2018) mostrou que a taxa metabólica padrão tinha uma forte correlação positiva com um conjunto de características associadas ao ritmo de vida (como idade masculina e massa na maturidade, idade feminina e massa no primeiro parto, intervalo entre ninhadas e distribuição reprodutiva ) em populações naturais expostas a diferentes pressões de predação, e que a mudança evolutiva no ritmo de vida após o transplante experimental para locais com diferentes pressões de predação foi acompanhada por mudanças na taxa metabólica. Esses estudos demonstram o potencial para uma associação estreita entre a variação na taxa metabólica e o ritmo de vida, e destacam a importância evolutiva dessas associações. No entanto, os mecanismos fisiológicos e bioquímicos subjacentes que causam variação na taxa metabólica e, portanto, potencialmente no ritmo de vida, não são totalmente conhecidos e podem incluir processos que atuam em muitos níveis de organização biológica (Versteegh et al. 2012 Konarzewski e Książek 2013 Wone et al. 2013 Pettersen et al. 2018).

Um processo celular que pode desempenhar um papel fundamental em influenciar o ritmo de vida é a fosforilação oxidativa mitocondrial (Fig. 1). As mitocôndrias são a principal fonte de geração de ATP nas células animais e, portanto, estão intimamente envolvidas no metabolismo de nutrientes e energia. A produção aeróbia de ATP na mitocôndria ocorre via fosforilação oxidativa, que é realizada pelas proteínas do sistema de transporte de elétrons mitocondrial (ETS) e a ATP sintase (Complexo V), que são uma série de proteínas que atravessam a membrana ou associadas à membrana localizadas em a membrana mitocondrial interna. As proteínas do ETS aceitam elétrons de NADH e FADH2 nos complexos I e II do ETS, respectivamente. Esses elétrons são então transportados através do ETS, e esse processo de transporte de elétrons resulta na translocação de prótons (H +) pelos complexos I, III e IV da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana. O gradiente de prótons resultante é aproveitado pela ATP sintase para produzir ATP. Observe que esse processo não é perfeitamente eficiente, pois os prótons também podem se mover através da membrana mitocondrial interna através de uma variedade de vias, como as proteínas desacopladoras e a translocase do nucleotídeo de adenina, ou mesmo através da própria membrana (Jastroch et al. 2007), contornando a ATP sintase, que resulta na dissipação do gradiente de prótons sem a síntese de ATP.

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Transporte mitocondrial de elétrons e síntese de ATP. O sistema de transporte de elétrons (ETS) consiste em uma série de complexos proteicos associados à membrana (Complexos I-IV) embutidos na membrana mitocondrial interna que separa a matriz mitocondrial e o espaço entre as membranas (IMS). Os transportadores de elétrons transferem elétrons principalmente para os complexos I e II, que os passam para a coenzima Q, uma molécula solúvel em gordura que está presente na fase lipídica da membrana. A coenzima Q então passa os elétrons para o Complexo III, e eles são finalmente transferidos para o oxigênio através da ação do Complexo IV (citocromo c oxidase). A transferência de elétrons através do ETS está associada à translocação de prótons (H +) para o IMS. O próton resultante (ΔP) e elétrico (Ψm) gradiente é usado pelo Complexo V (ATP sintetase) para sintetizar ATP. Os prótons também podem passar pela membrana através de uma variedade de vias de vazamento, como as proteínas desacopladoras (UCP) e o translocador de nucleotídeo de adenina (ANT), que não resultam na síntese de ATP.

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Transporte mitocondrial de elétrons e síntese de ATP. O sistema de transporte de elétrons (ETS) consiste em uma série de complexos proteicos associados à membrana (Complexos I-IV) embutidos na membrana mitocondrial interna que separa a matriz mitocondrial e o espaço entre as membranas (IMS). Os transportadores de elétrons transferem elétrons principalmente para os complexos I e II, que os passam para a coenzima Q, uma molécula solúvel em gordura que está presente na fase lipídica da membrana. A coenzima Q então passa os elétrons para o Complexo III, e eles são finalmente transferidos para o oxigênio através da ação do Complexo IV (citocromo c oxidase). A transferência de elétrons através do ETS está associada à translocação de prótons (H +) para o IMS. O próton resultante (ΔP) e elétrico (Ψm) gradiente é usado pelo Complexo V (ATP sintetase) para sintetizar ATP. Os prótons também podem passar através da membrana através de uma variedade de vias de vazamento, como as proteínas desacopladoras (UCP) e o translocador de nucleotídeo de adenina (ANT), que não resultam na síntese de ATP.

O oxigênio é o aceptor final de elétrons ao longo do ETS e, portanto, é crítico para o funcionamento contínuo do ETS e da fosforilação oxidativa. No entanto, sob certas circunstâncias (Murphy 2009), o oxigênio também pode interagir com transportadores de elétrons em várias etapas ao longo da ETS, formando superóxido, um tipo de espécie reativa de oxigênio (ROS). A produção de ROS pela mitocôndria pode resultar em dano oxidativo às membranas mitocondriais, proteínas e DNA. O dano não se restringe à mitocôndria, pois essas ROS também podem ser liberadas na célula e causar danos generalizados, que se acredita ser um dos principais determinantes do envelhecimento celular e, portanto, da expectativa de vida (Selman et al. 2012). No entanto, a produção de ROS não é o único determinante da extensão do dano oxidativo. As células têm vários mecanismos eficientes para tamponar a produção de ROS por meio de uma variedade de antioxidantes não enzimáticos e enzimáticos (Birben et al. 2012). A extensão do estresse oxidativo experimentado por um organismo e, portanto, o potencial de dano oxidativo, refletirá o equilíbrio entre a produção de ROS e a extensão dos mecanismos antioxidantes. Portanto, é provável que esse equilíbrio entre a produção de ROS e as defesas antioxidantes seja um componente importante das compensações que se acredita estarem subjacentes à variação no ritmo de vida (Monaghan et al. 2009). O fato de que a mitocôndria desempenha um papel fundamental tanto nos mecanismos subjacentes à taxa metabólica aeróbica quanto na produção de ROS sugere que esta organela pode ser um nexo crítico da evolução da história de vida que poderia desempenhar um papel no estabelecimento dos trade-offs subjacentes ao ritmo da hipótese de vida (Speakman et al. 2015 Janssens e Stoks 2018).


Dinâmica

Formalmente, o termo "dinâmica mitocondrial" inclui todas as diferentes maneiras pelas quais as características geométricas das redes mitocondriais mudam ao longo do tempo. Mais comumente, "dinâmica mitocondrial" se refere à dinâmica de fissão e fusão que remodelam constantemente a rede mitocondrial. A fissão corta um túbulo em dois, enquanto a fusão pode unir dois túbulos para formar um túbulo mais longo ou um ramo. O equilíbrio entre fissão e fusão é importante para moldar redes mitocondriais; mais fissão do que fusão leva a redes super-fragmentadas, enquanto mais fusão do que fissão leva a redes superconectadas em comparação com redes normais de tipo selvagem (artigos originais revisados ​​em [24]) (Figura 2a). Se a fusão for aumentada o suficiente sobre a fissão, todas as regiões mitocondriais separadas têm o potencial de serem interconectadas em uma única rede mitocondrial. A mitocôndria "individual" canônica ou pequenas sub-redes mitocondriais surgem devido a eventos de fissão. No entanto, estes não são, de fato, indivíduos separados, mas sub-regiões temporariamente separadas de toda a rede mitocondrial que está em algum estado de fissão e fusão a qualquer momento. Estudos de fotoconversão de proteínas repórter direcionadas à matriz em levedura mostraram que toda a rede mitocondrial está completamente interconectada e, portanto, o conteúdo da matriz de toda a rede se misturou, em 5 segundos após o início da fotoconversão em metade das células, enquanto na outra metade, 30 a 95% da rede está interconectada nesse período. Em 10 minutos, toda a rede de todas as células tornou-se interconectada e todos os seus conteúdos de matriz misturados [2]. Uma vez que a taxa média de fissão e fusão em células de levedura é de cerca de um por minuto por célula [25], isso sugere que na maioria das células a maior parte da rede já está interconectada e no resto das células torna-se assim por meio de vários eventos de fusão. Em células de mamíferos, as taxas de fissão e fusão são mais lentas [26] e as redes mitocondriais também são muito maiores. Uma diminuição da taxa de dinâmica e aumento do tamanho juntos deve levar a um período de tempo mais longo no qual as redes mitocondriais são interconectadas, consistente com as observações experimentais [27, 28]. Além disso, como a fusão requer um potencial de membrana mitocondrial [29, 30], as sub-regiões da rede que perderam a capacidade de funcionar adequadamente e gerar esse potencial de membrana podem permanecer separadas indefinidamente e acredita-se que sejam direcionadas para mitofagia [28] .

As máquinas moleculares responsáveis ​​por exercer a dinâmica de fissão e fusão têm sido amplamente estudadas. A fissão ocorre através da proteína Dnm1p, que é uma DRP (proteína relacionada à dinamina) GTPase que pode se reunir em uma estrutura espiral e se contrair após a ativação pelas proteínas acessórias Mdv1p e Fis1p [31, 32]. Curiosamente, o ER está associado a locais de ligeira constrição dos túbulos mitocondriais que se tornam futuros locais de fissão. Essas constrições podem permitir a ligação Dnm1p e eventos de fissão mais eficientes [33]. Recentemente, a ativação da atividade de polimerização da actina por meio de forminas também foi implicada nesses locais de fissão mitocondrial associados ao ER, sugerindo que um possível mecanismo para a constrição mitocondrial associada ao ER pode ser através da regulação da dinâmica do citoesqueleto [34]. A fusão envolve dois outros DRPs, Fzo1p e Mgm1p, para a fusão da membrana externa e da membrana interna, respectivamente, com os dois processos sendo coordenados por Ugo1p [35]. O processo de fusão requer ligação de GTP e hidrólise, bem como um potencial de membrana [29, 30].

Além de regular a topologia da rede mitocondrial, a dinâmica da fissão e fusão pode contribuir para a saúde homeostática da rede mitocondrial. Recentemente, um "mecanismo de controle de qualidade mitocondrial" foi proposto com base em resultados experimentais e computacionais [36]. Conforme ilustrado na Figura 3, os eventos de fusão permitem a mistura de conteúdos mitocondriais danificados por oxidação, gerados como um subproduto da respiração. Assim, um fragmento mitocondrial danificado pode ser restaurado quando ele se funde novamente à rede. A própria fusão depende do potencial da membrana mitocondrial. Portanto, quanto mais danificado estiver um fragmento de rede, menor será a probabilidade de ele se fundir novamente. Em vez disso, se permanecer isolado, é alvo de renovação por mitofagia.A fissão, por outro lado, é o mecanismo que permite a criação contínua de pequenos fragmentos mitocondriais, que podem se refundir com a rede ou ser segregados se estiverem excessivamente danificados. Este modelo configura uma importante estrutura para decifrar a causalidade entre a estrutura e função mitocondrial.

O diagrama do "mecanismo de controle de qualidade mitocondrial" mostra três pontos de tempo sequenciais de fissão e fusão. As setas no Tempo 1 representam dois eventos de fissão. A seta no tempo 3 representa a refusão do fragmento rosa à rede e a dissipação de seus danos. O fragmento vermelho acumulou muitos danos e não pode voltar a se fundir com a rede. Ele será direcionado para mitofagia. A barra colorida representa a quantidade de dano mitocondrial.


Assista o vídeo: Aula Mitocôndrias e Conversão de Energia (Janeiro 2022).