Em formação

Como encontrar uma estrutura PDB de uma protease com um inibidor semelhante a um peptídeo


Eu me pergunto como, para fins de apenas ilustrar alguns conceitos como o alinhamento do substrato no sítio ativo da tríade catalítica, posso encontrar de forma rápida e eficiente uma estrutura de protease (irrelevante de qual organismo exatamente) que tem um inibidor do tipo peptídeo no banco de dados PDB.

Dicas apreciadas.


Aqui está um: http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2IPH. Foi cristalizado com o inibidor ligado à proteína.


vá para http://www.uniprot.org e digite o número de acesso da protease de seu interesse e consulte a seção de bancos de dados de estrutura 3D para ver se o arquivo PDB foi decifrado ou não. Encontrei este banco de dados (http://www.cf.ac.uk/biosi/staffinfo/ehrmann/tools/proteases/allproteases.html) apenas digitando no google "bancos de dados de protease PDB"


Beta-secretase

Como a beta-secretase é tão importante para o desenvolvimento da doença de Alzheimer, muitos laboratórios têm trabalhado arduamente para encontrar inibidores para bloqueá-la. O primeiro sucesso é mostrado aqui na parte superior da entrada 1fkn do PDB, e um composto aprimorado que se liga com muito mais firmeza é mostrado na parte inferior da entrada 1m4h do PDB. Estruturas de muitos outros candidatos a drogas podem ser encontradas no PDB. Infelizmente, esses compostos não são transportados de forma eficiente do sangue para o cérebro, por isso não têm sido particularmente úteis como medicamentos para combater a doença de Alzheimer. Mas a busca continua na luta contra essa doença debilitante.

Tópicos para discussão posterior

  1. Várias proteases usam um par de aminoácidos aspartato para clivar as cadeias de proteínas. Você pode encontrar outros exemplos no PDB?
  2. Muitas estruturas de inibidores ligados à beta-secretase estão disponíveis no PDB. Você pode encontrar exemplos de inibidores semelhantes a peptídeos que são muito semelhantes às cadeias de proteínas que são clivadas pela beta-secretase e outros inibidores que são significativamente diferentes dos peptídeos? Quais são as vantagens e desvantagens de cada um?

Recursos PDB-101 Relacionados

Referências

  1. C. E. Hunt e A. J. Turner (2009) Biologia celular, regulação e inibição da beta-secretase (BACE1). FEBS Journal 276, 1845-1859.
  2. J. H. Stockley e C. O'Neill (2008) Understanding BACE1: protease essencial para a produção de beta-amiloide na doença de Alzheimer. Cellular and Molecular Life Sciences 65, 3265-3289.

Sobre PDB-101

O PDB-101 ajuda professores, alunos e o público em geral a explorar o mundo 3D das proteínas e ácidos nucléicos. Aprender sobre suas diversas formas e funções ajuda a compreender todos os aspectos da biomedicina e da agricultura, desde a síntese de proteínas até a saúde e as doenças e a energia biológica.

Por que PDB-101? Pesquisadores de todo o mundo tornam essas estruturas 3D disponíveis gratuitamente no arquivo do Protein Data Bank (PDB). O PDB-101 cria materiais introdutórios para ajudar os iniciantes a começar no assunto ("101", como em um curso de nível básico), bem como recursos para aprendizado estendido.


Dipeptidil Peptidase 4

Em 2006, a Federal Drug Administration aprovou o primeiro desses inibidores DPP4, a sitagliptina (PDB, entrada 1x70), que foi rapidamente seguido por muitos outros medicamentos antidiabéticos conhecidos coletivamente como “gliptinas”. Todas essas drogas imitam o fim dos hormônios incretinas, bloqueando o sítio ativo da DPP4 de forma que não possa inativar os hormônios. Para explorar seis gliptinas diferentes e um análogo de um dos substratos DPP4, clique na imagem para um JSmol interativo.

Tópicos para discussão posterior

  1. Estruturas para vários outros hormônios que são clivados por DPP4 estão disponíveis no PDB, incluindo o peptídeo YY (2dez) e a quimiocina RANTES (1rtn). Dê uma olhada neles e encontre o dipeptídeo que é clivado pelo DPP4.
  2. Você pode usar o Protein Feature View do DPP4 para ver as porções da enzima que não estão incluídas na estrutura.

Recursos PDB-101 Relacionados

Referências

  1. D. Rohrborn, N. Wronkowitz & J. Eckel (2015) DPP4 in diabetes. Frontiers in Immunology 6, artigo 386.
  2. 3w2t: M. Nabeno, F. Akahoshi, H. Kishida, I. Miyaguchi, Y. Tanaka, S. Ishii & T. Kadowaki (2013) Um estudo comparativo dos modos de ligação de inibidores de dipeptidil peptidase IV recentemente lançados no sítio ativo . Biochemical and Biophysical Research Communications 434, 191-196.
  3. H. Zhong, X. Rao & S. Rajagopalan (2013) Um papel emergente da dipeptidil peptidase 4 (DPP4) além do controle da glicose: implicações potenciais em doenças cardiovasculares. Atherosclerosis 226, 305-314.
  4. 3vjk: T. Yoshida, F. Akahoshi, H. Sakashita, H. Kitajima, M. Nakamura, S. Sonda, M. Takeuchi, Y. Tanaka, N. Ueda, S. Sekiguchi, T. Ishige, K. Shima, M. Nabeno, Y. Abe, J. Anabuki, A. Soejima, K. Yoshida, Y. Takashina, S. Ishii, S. Kiuchi, S. Fukuda, R. Tsutsumiuchi, K. Kosaka, T. Murozono, Y. Nakamaru, H. Utsumi, N. Masutomi, H. Kishida, I. Miyaguchi & Y. Hayashi (2012) Descoberta e ensaios pré-clínicos de teneligliptina (3 - [(2S, 4S) -4- [4- (3-metil- 1-fenil-1H-pirazol-5-il) piperazin-1-il] pirrolidin-2-ilcarbonil] tiazolidina): um inibidor de dipeptidil peptidase IV altamente potente, seletivo, de longa duração e oralmente ativo para o tratamento de diabetes tipo 2 . Bioorganic and Medicinal Chemistry 20, 5705-5719.
  5. 3g0b: Z. Zhang, MB Wallace, J. Feng, JA Stafford, RJ Skene, L. Shi, B. Lee, K. Aertgeerts, A. Jennings, R. Xu, DB Kassel, SW Kaldor, M. Navre, DR Webb & SL Gwaltney (2011) Projeto e síntese de pirimidinona e inibidores de pirimidinodiona de dipeptidil peptidase IV. Journal of Medicinal Chemistry 54, 510-524.
  6. 3bjm: WJ Metzler, J. Yanchunas, C. Weigelt, K. Kish, HE Klei, D. Zie, Y. Zhang, M. Corbett, JK Tamura, B. He, LG Hamann, MS Kirby & J. Marcinkeviciene (2008 ) Envolvimento dos resíduos catalíticos DPP-IV na formação do complexo enzima-saxagliptina. Protein Science 17, 240-250.
  7. 2rgu: M. Eckhardt, E. Langkopf, M. Mark, M. Tadayyon, L. Thomas, H. Nar, W. Pfrengle, B. Guth, R. Lotz, P. Sieger, H. Fuchs & F. Himmelsbach ( 2007) 8- (3- (R) -aminopiperidin-1-il) -7-but-2-inil-3-metil-1- (4-metil-quinazolin-2-ilmetil) -3,7-di-hidropurina- 2,6-diona (BI 1356), um inibidor DPP-4 altamente potente, seletivo, de longa duração e biodisponível por via oral para o tratamento do diabetes tipo 2. Journal of Medicinal Chemistry 50, 6450-6453.
  8. 2b4n: I. Alana, J. C. Parker, V. A. Gault, P. R. Flatt, F. P. O’Harte, J. P. Malthouse & C. M. Hewage (2006) NMR e estudos de varredura de alanina de peptídeo insulinotrópico dependente de glicose em água. Journal of Biological Chemistry 281, 16370-16376.
  9. 1x70: D. Kim, L. Wang, M. Beconi, GJ Eiermann, MH Fisher, H. He, GJ Hickey, JE Kowalchick, B. Leiting, K. Lyons, F. Marsilio, ME McCann, RA Patel, A. Petrov, G. Scapin, SB Patel, RS Roy, JK Wu, MJ Wyvratt, BB Zhang, L. Zhu, NA Thornberry & AE Weber (2005) (2R) -4-oxo-4- [3- (trifluorometil) - 5,6-di-hidro [1,2,4] triazolo [4,3-a] pirazin-7 (8H) -il] -1- (2,4,5-trifluorofenil) butan-2-amina: um potente, inibidor de dipeptidil peptidase IV oralmente ativo para o tratamento de diabetes tipo 2. Journal of Medicinal Chemistry 48, 141-151.
  10. 1nu8: R. Thoma, B. Loeffler, M. Stihle, W. Huber, A. Ruf & M. Hennig (2003) Structural basis of proline-specific exopeptidase activity as observada in human dipeptidyl peptidase-IV. Structure 11, 947-959.
  11. 1d0r: X. Chang, D. Keller, S. Bjorn & J. J. Led (2001) Estrutura e dobramento do peptídeo-1- (7-36) -amida semelhante ao glucagon em trifluoroetanol estudado por NMR. Magnetic Resonance Chemistry 39, 477-483.
  12. 1jrj: J. W. Neidigh, R. M. Fesinmeyer, K. S. Prickett & N. H. Andersen (2001) Exendin-4 e glucagon-like-peptide-1: Comparações estruturais NMR na solução e estados associados a micelas. Biochemistry 40, 13188-13200.
  13. 1eot: M. P. Crump, K. Rajarathnam, K. S. Kim, I. Clark-Lewis & B. D. Sykes (1998) Solution structure of eotaxin, uma quimiocina que recruta seletivamente eosinófilos na inflamação alérgica. Journal of Biological Chemistry 273, 22471-22479.
  14. 1ron: S. A. Monks, G. Karagianis, G. J. Howlett & R. S. Norton (1996) Solution structure of human neuropeptide Y. Journal of Biomolecular NMR 8, 379-390.

Outubro de 2016, Sutapa Ghosh, David Goodsell

Sobre PDB-101

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Renderização

Como você acabou de ver, as estruturas macromoleculares podem ser bastante complexas e, às vezes, uma representação simplificada da molécula é mais útil do que uma representação atômica detalhada. Uma maneira simplificada de apresentar estruturas de proteínas é por meio de suas estruturas secundárias. Os principais elementos estruturais secundários em proteínas são &alfa-helices, &beta-sheets e loops. Para processar a estrutura secundária desta proteína, siga estas etapas:

No 'Visualizar'menu, sob'Biopolímero Display', selecione'Fita / Tubo '
Selecione tudo clicando no botão marcado Tudo e então bateu OK
Outra janela aparece como resposta OK para colorir a proteína pela estrutura secundária
No 'Visualizar'selecionar'Undisplay Atoms. '
Clique no botão marcado Subestruturas, selecione ROC39, um inibidor de protease de HIV e clique OK
Clique Invertido para selecionar tudo, exceto o inibidor, e aperte OK

  1. Qual é a estrutura secundária predominante neste polipeptídeo?
  2. Quanto tempo (em angstroms) é o mais longo &alfa-hélice nesta proteína?
  3. Qual interação não covalente é principalmente responsável pela estabilidade de &alfa-helices?

A estrutura que você está vendo aqui é apenas uma das duas cadeias polipeptídicas que constituem a protease ativa do HIV. Agora você vai continuar a estudar o sítio ativo da protease dimérica do HIV com mais detalhes.


Como encontrar a estrutura do PDB de uma protease com um inibidor do tipo peptídeo - Biologia

Instantâneo de dados experimentais

  • Método: & nbspDIFRAÇÃO DE RAIOS X
  • Resolução: & nbsp2,14 Å
  • Valor-R grátis: & nbsp0,225 & nbsp
  • R-Value Work: & nbsp0,191 & nbsp
  • Valor-R observado: & nbsp0,197 & nbsp

Validação wwPDB& nbsp & nbspRelatório 3D & nbspRelatório completo

A plasticidade dos bolsos de especificidade S2-S4 do carrasco caspase-7 revelada por análise estrutural e cinética.

(2007) FEBS J & nbsp274: 4752-4765

  • PubMed: & nbsp17697120 & nbsp Pesquisa no PubMed
  • DOI: & nbsp10.1111 / j.1742-4658.2007.05994.x
  • Citação primária de estruturas relacionadas: & nbsp
    2QLB, 2QLJ, 2QLF, 2QL9, 2QL7, 2QL5
  • Resumo PubMed: & nbsp

Muitos substratos de proteína de caspases são clivados em locais não canônicos em comparação com os motivos de reconhecimento relatados para os três subgrupos de caspases. Para fornecer informações sobre a especificidade e auxiliar no projeto de drogas para controlar a morte celular, as estruturas cristalinas da caspase-7 foram determinadas em complexos com seis análogos de peptídeos (Ac-DMQD-Cho, Ac-DQMD-Cho, Ac-DNLD-Cho , Ac-IEPD-Cho, Ac-ESMD-Cho, Ac-WEHD-Cho) que abrangem os principais motivos de reconhecimento dos três subgrupos.

Muitos substratos de proteína de caspases são clivados em locais não canônicos em comparação com os motivos de reconhecimento relatados para os três subgrupos de caspases. Para fornecer uma visão sobre a especificidade e auxiliar no projeto de drogas para controlar a morte celular, as estruturas cristalinas da caspase-7 foram determinadas em complexos com seis análogos de peptídeos (Ac-DMQD-Cho, Ac-DQMD-Cho, Ac-DNLD-Cho , Ac-IEPD-Cho, Ac-ESMD-Cho, Ac-WEHD-Cho) que abrangem os principais motivos de reconhecimento dos três subgrupos. As estruturas cristalinas mostram que o bolso S2 da caspase-7 pode acomodar diversos resíduos. Glu não é necessário na posição P3 porque Ac-DMQD-Cho, Ac-DQMD-Cho e Ac-DNLD-Cho com resíduos P3 variados são quase tão potentes quanto o Ac-DEVD-Cho canônico. P4 Asp estava presente nos melhores inibidores da caspase-7. No entanto, o bolso S4 do carrasco caspase-7 tem regiões alternativas para ligação de pequenos resíduos alifáticos ramificados ou polares semelhantes aos do iniciador caspase-8. A plasticidade observada dos subsites de caspase concorda muito bem com a clivagem relatada de muitas proteínas em locais não canônicos. Os resultados implicam que outros fatores além da sequência P4-P1, como exositos, contribuem para a especificidade do substrato in vivo das caspases. O novo sítio de ligação do peptídeo identificado na superfície molecular das estruturas atuais é sugerido ser um exosito da caspase-7. Estes resultados devem ser considerados na concepção de inibidores seletivos de pequenas moléculas desta protease farmacologicamente importante.

Afiliação Organizacional: & nbsp

Departamento de Biologia, Base Molecular da Doença, Georgia State University, Atlanta, GA 30302, EUA.


Como encontrar a estrutura do PDB de uma protease com um inibidor do tipo peptídeo - Biologia

Instantâneo de dados experimentais

  • Método: & nbspDIFRAÇÃO DE RAIOS X
  • Resolução: & nbsp2,30 Å
  • Valor-R grátis: & nbsp0,230 & nbsp
  • R-Value Work: & nbsp0,208 & nbsp
  • Valor-R observado: & nbsp0,209 & nbsp

Validação wwPDB& nbsp & nbspRelatório 3D & nbspRelatório completo

Base estrutural para catálise e especificidade de substrato de uma protease de cisteína semelhante a 3C de um mesonivírus de mosquito.

(2019) Virologia & nbsp533: 21-33

  • PubMed: & nbsp31078932 & nbsp Pesquise no PubMedSearch no PubMed Central
  • DOI: & nbsp10.1016 / j.virol.2019.05.001
  • Citação primária de estruturas relacionadas: & nbsp
    5LAC, 5LAK
  • Resumo PubMed: & nbsp

O vírus Cavally (CavV) é um vírus de RNA de fita positiva transmitido por mosquitos da família Mesoniviridae (ordem Nidovirales). Apresentamos estruturas de raios-X para a protease CavV 3C-like (3CL pro), como uma enzima livre e em complexo com um inibidor de aldeído peptídico mimetizando os resíduos P4-a-P1 de um substrato natural.

O vírus Cavally (CavV) é um vírus de RNA de fita positiva transmitido por mosquitos da família Mesoniviridae (ordem Nidovirales). Apresentamos estruturas de raios-X para a protease tipo CavV 3C (3CL pro), como uma enzima livre e em complexo com um inibidor de aldeído peptídico que mimetiza os resíduos P4-a-P1 de um substrato natural. A estrutura 3CL pro (refinada para 1,94 Å) mostra que a proteína forma dímeros. Os monômeros são compostos de domínios N-terminais I e II, que adotam uma dobra semelhante a quimotripsina e um domínio C-terminal em hélice α III. A díade Cys-His catalítica é assistida por uma rede complexa de interações envolvendo uma molécula de água que medeia os contatos polares entre o His catalítico e um Asp conservado localizado na junção do domínio II-III e está adequadamente posicionada para estabilizar a carga positiva em desenvolvimento do His catalítico no estado de transição durante a catálise. O estudo também revela a base estrutural para a bolsa de ligação ao substrato específica de P2 Asn distinta do mesonivírus 3CL pro s.


Resumo

Atualmente, o perfil do substrato de protease quase se tornou uma tarefa de rotina para experimentalistas, e o conhecimento sobre substratos de peptídeo de protease é facilmente acessível através do banco de dados MEROPS. Apresentamos um fluxo de trabalho de triagem virtual baseado em forma usando vROCS que aplica as informações sobre a especificidade das proteases para encontrar novos inibidores de moléculas pequenas. Sequências de substrato de peptídeo para três a quatro posições de substrato de cada substrato do banco de dados MEROPS foram usadas para construir o conjunto de treinamento. As sequências de substrato bidimensional foram convertidas em conformações tridimensionais por meio da mutação de um substrato de peptídeo modelo. A consulta vROCS foi construída a partir de consultas de um único aminoácido para cada posição do substrato, considerando as frequências relativas dos aminoácidos. A abordagem de triagem virtual com base em forma baseada em substrato de peptídeo oferece bom desempenho para as quatro proteases trombina, fator Xa, fator VIIa e caspase-3 com o conjunto de dados DUD-E. Os resultados mostram que o método funciona para alvos de protease com diferentes perfis de especificidade, bem como para alvos com diferentes mecanismos de sítio ativo. Como nenhuma estrutura do alvo e nenhuma informação sobre inibidores de moléculas pequenas são necessárias para usar nossa abordagem, o método tem vantagens significativas em comparação com métodos convencionais baseados em estrutura e ligante.


Conteúdo

A protease de HIV madura existe como um homodímero de 22 kDa, com cada subunidade composta por 99 aminoácidos. [1] Um único sítio ativo encontra-se entre as subunidades idênticas e tem a sequência de tríade catalítica Asp-Thr-Gly (Asp25, Thr26 e Gly27) característica comum às proteases aspárticas. [8] Como o HIV-1 PR só pode funcionar como um dímero, a protease madura contém dois aminoácidos Asp25, um de cada monômero, que atuam em conjunto como resíduos catalíticos. [9] Além disso, a protease do HIV tem dois "retalhos" moleculares que se movem a uma distância de até 7 Å quando a enzima se torna associada a um substrato. [10] Isso pode ser visualizado com animações de abertura e fechamento dos retalhos.

Edição do Precursor

A poliproteína Gag-Pol, que contém proteínas codificadoras prematuras, incluindo HIV-1 PR. [9] PR está localizado entre a transcriptase reversa (que está no terminal C de PR) e o p6 pol (que está no terminal N de PR) da região transframe (TFR). [11]

Para que este precursor se torne uma proteína funcional, cada monômero deve se associar a outro monômero PR de HIV-1 para formar um sítio ativo catalítico funcional, cada um contribuindo com o Asp25 de suas respectivas tríades catalíticas. [9]

Edição do mecanismo de síntese

Quando o HIV-RNA viral entra na célula, é acompanhado por uma transcriptase reversa, uma integrase e um HIV-1 PR maduro. A transcriptase reversa converte o RNA viral em DNA, facilitando o papel da integrase na incorporação da informação genética viral ao DNA da célula hospedeira. [2] O DNA viral pode permanecer dormente no núcleo ou ser transcrito em mRNA e traduzido pela célula hospedeira na poliproteína Gag-Pol, que seria então clivada em proteínas funcionais individuais (incluindo um HIV-1 PR sintetizado recentemente) pelo HIV-1 PR maduro. [9]

O precursor de HIV-1 PR catalisa sua própria produção, facilitando sua clivagem da poliproteína Gag-Pol em um mecanismo conhecido como autoprocessamento. O autoprocessamento de HIV-1 PR é caracterizado por duas etapas sequenciais: (1) a clivagem intramolecular do terminal N no local de clivagem da p6 pol -protease, que serve para finalizar o processamento de PR e aumentar a atividade enzimática com o PR recém-formado - intermediário da transcriptase reversa e (2) a clivagem intermolecular do terminal C no local de clivagem da transcriptase reversa da protease, levando à montagem de duas subunidades PR em dímeros maduros. [12] [13] A dimerização das duas subunidades permite a formação de sítio ativo combinado totalmente funcional, caracterizado por dois resíduos catalíticos Asp25 (um de cada monômero). [14]

HIV-1 PR serve a um propósito duplo. O precursor HIV-1 PR é responsável por catalisar sua própria produção em enzimas PR maduras por meio do autoprocessamento de PR. [15] A protease madura é capaz de hidrolisar ligações peptídicas nas poliproteínas Gag-Pol em nove locais específicos, processando as subunidades resultantes em proteínas maduras totalmente funcionais. Essas proteínas clivadas, incluindo a transcriptase reversa, integrase e RNaseH, são codificadas pelos componentes da região codificadora necessários para a replicação viral. [4]

Como uma protease aspártica, o HIV-1 PR dimerizado funciona através do complexo do grupo aspartilo, a fim de realizar a hidrólise. Dos dois resíduos Asp25 no sítio ativo catalítico combinado de HIV-1 PR, um é desprotonado enquanto o outro é protonado, devido às diferenças de pKa do microambiente. [16]

Em um mecanismo geral de protease aspártica, uma vez que o substrato está adequadamente ligado ao sítio ativo da enzima, o aminoácido catalítico Asp25 desprotonado sofre catálise básica, tornando a molécula de água de entrada um melhor nucleófilo por desprotonação. O íon hidroxila resultante ataca o carbono carbonílico da ligação peptídica, formando um intermediário com um oxiânion transiente, que é estabilizado pelo Asp25 inicialmente protonado. O oxiânion forma novamente uma ligação dupla, levando à clivagem da ligação peptídica entre os dois aminoácidos, enquanto o Asp25 inicialmente desprotonado passa por catálise ácida para doar seu próton ao grupo amino, tornando o grupo amino um melhor grupo eliminável por completo clivagem da ligação peptídica e retorno ao seu estado desprotonado original. [2] [17]

Embora o HIV-1 PR compartilhe muitas das mesmas características de uma protease aspártica não viral, algumas evidências mostraram que o HIV-1 PR catalisa a hidrólise de uma maneira combinada, em outras palavras, a molécula de água nucleofílica e o Asp25 protonado atacam simultaneamente a cisão ligação peptídica durante a catálise. [17] [18]

Com seu papel integral na replicação do HIV, a protease do HIV tem sido o principal alvo da terapia medicamentosa. Os inibidores da protease do HIV atuam ligando-se especificamente ao sítio ativo, imitando o intermediário tetraédrico de seu substrato e, essencialmente, tornando-se "presos", desativando a enzima. Após a montagem e brotamento, as partículas virais sem protease ativa não podem amadurecer em vírions infecciosos. Vários inibidores de protease foram licenciados para terapia de HIV. [19]

Existem dez inibidores do HIV-1 PR atualmente aprovados pela Food and Drug Administration: indinavir, saquinavir, ritonavir, nelfinavir, lopinavir, amprenavir, fosamprenevir, atazanavir, tipranavir e darunavir. Muitos dos inibidores têm diferentes componentes moleculares e, portanto, diferentes ações mecanísticas, como o bloqueio do sítio ativo. Seus papéis funcionais também se estendem para influenciar as concentrações de circulação de outros medicamentos inibidores (ritonavir) e são usados ​​apenas em certas circunstâncias nas quais o vírus exibe tolerância a outros inibidores (tipranavir). [4] [20]

Evolução e resistência Editar

Devido às altas taxas de mutação de retrovírus, especialmente devido a regiões mutacionalmente sensíveis (notavelmente a região contendo a sequência da tríade catalítica), e considerando que as alterações em alguns aminoácidos dentro da protease de HIV podem torná-la muito menos visível para um inibidor, o ativo O local desta enzima pode mudar rapidamente quando sob a pressão seletiva de drogas inibidoras da replicação. [21] [22]

Dois tipos de mutações estão geralmente associados ao aumento da resistência aos medicamentos: mutações "principais" e mutações "secundárias". As principais mutações envolvem uma mutação no sítio ativo do HIV-1 PR, evitando que os inibidores seletivos se liguem a ele. As mutações secundárias referem-se a alterações moleculares na periferia da enzima devido à exposição prolongada de produtos químicos semelhantes, afetando potencialmente a especificidade do inibidor para HIV-1 PR. [3]

Uma abordagem para minimizar o desenvolvimento de resistência aos medicamentos no HIV é administrar uma combinação de medicamentos que inibam vários aspectos-chave do ciclo de replicação do HIV simultaneamente, em vez de um medicamento por vez. Outros alvos de terapia com drogas incluem transcriptase reversa, fixação de vírus, fusão de membrana, integração de cDNA e montagem de vírions. [23] [24]


Proteases Coronavírus

Os pesquisadores estão usando ativamente essas estruturas para buscar compostos que bloqueiem a ação das proteases, para uso como drogas antivirais. A diversidade de coronavírus representa um grande desafio com esse esforço: os coronavírus foram classificados em quatro gêneros separados, e estudos de sequência e estruturais mostraram que as proteases desses vírus podem ser muito diferentes, portanto, drogas destinadas a combatê-los podem não ser eficazes contra outros. Uma maneira possível de lidar com esse desafio é tentar projetar um inibidor de amplo espectro direcionado contra o coronavírus progenitor do morcego, como o mostrado aqui a partir da entrada 4yoi do PDB, que pode então fornecer uma vantagem para a descoberta de inibidores contra vírus emergentes. . O sítio ativo cisteína e histidina são mostrados na ilustração, com um inibidor em turquesa. Para explorar essa estrutura em mais detalhes, clique na imagem para um JSmol interativo.

Tópicos para discussão posterior

  1. Uma forma octamérica incomum da protease principal pode estar envolvida em sua maturação. Você pode ver isso na entrada 3iwm do PDB.
  2. Você pode comparar as dobras das principais proteases do coronavírus e serina proteases usando a ferramenta “Structure Align”. Tente usar tripsinogênio (PDB entrada 1tgs), de modo que toda a enzima seja uma cadeia para o alinhamento.

Recursos PDB-101 Relacionados

Referências

  1. Cui, J., Li, F., Shi, Z.L. (2019) Origem e evolução dos coronavírus patogênicos. Nat. Rev. Microbiol. 17, 181-192.
  2. 4yoi: St John, SE, Tomar, S., Stauffer, SR, Mesecar, AD (2015) Vírus zoonóticos direcionados: inibição baseada na estrutura da protease semelhante a 3C do coronavírus de morcego HKU4-O provável hospedeiro reservatório do coronavírus humano que causa a Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS). Bioorg.Med.Chem. 23: 6036-6048
  3. 4ow0: Baez-Santos, YM, Barraza, SJ, Wilson, MW, Agius, MP, Mielech, AM, Davis, NM, Baker, SC, Larsen, SD, Mesecar, AD (2014) X-ray Structural and Biological Evaluation of uma série de inibidores potentes e altamente seletivos de proteases semelhantes a papaína de coronavírus humano. J.Med.Chem. 57: 2393-2412
  4. Hilgenfeld, R. (2014) De SARS para MERS: estudos cristalográficos em proteases coronavirais permitem o design de drogas antivirais. FEBS J. 281,4085-4096
  5. 1q2w: Pollack, A. (2003) Company diz que mapeou parte do vírus SARS. New York Times, 30 de julho, seção C, página 2.

Fevereiro de 2020, David Goodsell

Sobre PDB-101

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Por que PDB-101? Pesquisadores de todo o mundo tornam essas estruturas 3D disponíveis gratuitamente no arquivo do Protein Data Bank (PDB). O PDB-101 cria materiais introdutórios para ajudar os iniciantes a começar no assunto ("101", como em um curso de nível básico), bem como recursos para aprendizado estendido.


Conteúdo

O sistema de classificação de protease MEROPS conta 16 superfamílias (em 2013), cada uma contendo muitas famílias. Cada superfamília usa a tríade ou díade catalítica em uma dobra protéica diferente e, portanto, representa a evolução convergente do mecanismo catalítico. A maioria pertence à família S1 do clã PA (superfamília) de proteases.

Para superfamílias, P = superfamília, contendo uma mistura de famílias da classe de nucleófilos, S = proteases puramente serina. superfamília. Dentro de cada superfamília, as famílias são designadas por seu nucleófilo catalítico, (S = serina proteases).

Famílias de proteases de serina

Superfamília Famílias Exemplos
SB S8, S53 Subtilisina (Bacillus licheniformis)
SC S9, S10, S15, S28, S33, S37 Prolil oligopeptidase (Sus scrofa)
SE S11, S12, S13 D-Ala-D-Ala peptidase C (Escherichia coli)
SF S24, S26 Sinal de peptidase I (Escherichia coli)
SH S21, S73, S77, S78, S80 Citomegalovírus assemblin (herpesvírus humano 5)
SJ S16, S50, S69 Peptidase Lon-A (Escherichia coli)
SK S14, S41, S49 Protease Clp (Escherichia coli)
TÃO S74 Proteína autoclivante de endosialidase CIMCD de Fago K1F (Enterobacteria fago K1F)
SP S59 Nucleoporina 145 (Homo sapiens)
SR S60 Lactoferrina (Homo sapiens)
WL S66 Murein tetrapeptidase LD-carboxipeptidase (Pseudomonas aeruginosa)
ST S54 Romboide-1 (Drosophila melanogaster)
PA S1, S3, S6, S7, S29, S30, S31, S32, S39, S46, S55, S64, S65, S75 Quimotripsina A (Bos taurus)
PB S45, S63 Precursor da penicilina G acilase (Escherichia coli)
PC S51 Dipeptidase E (Escherichia coli)
EDUCAÇAO FISICA P1 DmpA aminopeptidase (Ochrobactrum anthropi)
não atribuído S48, S62, S68, S71, S72, S79, S81

Serina proteases são caracterizadas por uma estrutura distinta, consistindo em dois domínios de barril beta que convergem no sítio ativo catalítico. Essas enzimas podem ser ainda categorizadas com base em sua especificidade de substrato como tipo tripsina, tipo quimotripsina ou tipo elastase. [3]

Edição semelhante à tripsina

As proteases semelhantes à tripsina clivam as ligações peptídicas após um aminoácido carregado positivamente (lisina ou arginina). [4] Essa especificidade é impulsionada pelo resíduo que fica na base da bolsa S1 da enzima (geralmente um ácido aspártico ou ácido glutâmico com carga negativa).

Edição semelhante à quimotripsina

A bolsa S1 de enzimas semelhantes à quimiotripsina é mais hidrofóbica do que nas proteases semelhantes à tripsina. Isso resulta em uma especificidade para resíduos hidrofóbicos de médio a grande porte, como tirosina, fenilalanina e triptofano.

Edição semelhante à trombina

Estes incluem trombina, plasminogênio ativador de tecidos e plasmina. Descobriu-se que eles desempenham papéis na coagulação e na digestão, bem como na fisiopatologia de doenças neurodegenerativas, como a demência induzida por Alzheimer e Parkinson.

Edição tipo elastase

As proteases do tipo elastase têm uma fenda S1 muito menor do que as proteases do tipo tripsina ou quimiotripsina. Consequentemente, resíduos como alanina, glicina e valina tendem a ser preferidos.

Edição semelhante à subtilisina

A subtilisina é uma serina protease em procariotos. A subtilisina não está evolutivamente relacionada ao clã da quimotripsina, mas compartilha o mesmo mecanismo catalítico, utilizando uma tríade catalítica, para criar uma serina nucleofílica. Este é o exemplo clássico usado para ilustrar a evolução convergente, uma vez que o mesmo mecanismo evoluiu duas vezes independentemente durante a evolução.

O principal ator no mecanismo catalítico nas serina proteases é a tríade catalítica. A tríade está localizada no sítio ativo da enzima, onde ocorre a catálise, e é preservada em todas as superfamílias de enzimas serina protease. A tríade é uma estrutura coordenada que consiste em três aminoácidos: His 57, Ser 195 (daí o nome "serina protease") e Asp 102. Cada um destes três aminoácidos chave desempenha um papel essencial na capacidade de clivagem das proteases. Enquanto os aminoácidos membros da tríade estão localizados longe uns dos outros na sequência da proteína, devido ao enovelamento, eles estarão muito próximos uns dos outros no coração da enzima. A geometria particular dos membros da tríade é altamente característica para sua função específica: foi mostrado que a posição de apenas quatro pontos da tríade caracteriza a função da enzima que a contém. [5]

No caso de catálise, ocorre um mecanismo ordenado no qual vários intermediários são gerados. A catálise da clivagem do peptídeo pode ser vista como uma catálise ping-pong, na qual um substrato se liga (neste caso, o polipeptídeo sendo clivado), um produto é liberado (a "metade" do terminal N do peptídeo), outro o substrato se liga (neste caso, água), e outro produto é liberado (a "metade" do terminal C do peptídeo).

Cada aminoácido na tríade executa uma tarefa específica neste processo:

  • A serina possui um grupo -OH que é capaz de atuar como um nucleófilo, atacando o carbono carbonílico da ligação peptídica cindível do substrato.
  • Um par de elétrons no nitrogênio da histidina tem a capacidade de aceitar o hidrogênio do grupo serina-OH, coordenando assim o ataque da ligação peptídica.
  • O grupo carboxila do ácido aspártico, por sua vez, se liga à histidina, tornando o átomo de nitrogênio mencionado acima muito mais eletronegativo.

Toda a reação pode ser resumida da seguinte forma:

  • O substrato polipeptídico se liga à superfície da enzima serina protease de modo que a ligação cindível seja inserida no sítio ativo da enzima, com o carbono carbonílico dessa ligação posicionado próximo à serina nucleofílica.
  • A serina -OH ataca o carbono da carbonila, e o nitrogênio da histidina aceita o hidrogênio do -OH da [serina] e um par de elétrons da ligação dupla do oxigênio da carbonila se move para o oxigênio. As a result, a tetrahedral intermediate is generated.
  • The bond joining the nitrogen and the carbon in the peptide bond is now broken. The covalent electrons creating this bond move to attack the hydrogen of the histidine, breaking the connection. The electrons that previously moved from the carbonyl oxygen double bond move back from the negative oxygen to recreate the bond, generating an acyl-enzyme intermediate.
  • Now, water comes into the reaction. Water replaces the N-terminus of the cleaved peptide, and attacks the carbonyl carbon. Once again, the electrons from the double bond move to the oxygen making it negative, as the bond between the oxygen of the water and the carbon is formed. This is coordinated by the nitrogen of the histidine, which accepts a proton from the water. Overall, this generates another tetrahedral intermediate.
  • In a final reaction, the bond formed in the first step between the serine and the carbonyl carbon moves to attack the hydrogen that the histidine just acquired. The now electron-deficient carbonyl carbon re-forms the double bond with the oxygen. As a result, the C-terminus of the peptide is now ejected.

Additional stabilizing effects Edit

It was discovered that additional amino acids of the protease, Gly 193 e Ser 195, are involved in creating what is called an oxyanion hole. Ambos Gly 193 e Ser 195 can donate backbone hydrogens for hydrogen bonding. When the tetrahedral intermediate of step 1 and step 3 are generated, the negative oxygen ion, having accepted the electrons from the carbonyl double bond, fits perfectly into the oxyanion hole. In effect, serine proteases preferentially bind the transition state and the overall structure is favored, lowering the activation energy of the reaction. This "preferential binding" is responsible for much of the catalytic efficiency of the enzyme.

Host organisms must ensure that the activity of serine proteases is adequately regulated. This is achieved by a requirement for initial protease activation, and the secretion of inhibitors.

Zymogen activation Edit

Zymogens are the usually inactive precursors of an enzyme. If the digestive enzymes were active when synthesized, they would immediately start chewing up the synthesizing organs and tissues. Acute pancreatitis is such a condition, in which there is premature activation of the digestive enzymes in the pancreas, resulting in self-digestion (autolysis). It also complicates postmortem investigations, as the pancreas often digests itself before it can be assessed visually.

Zymogens are large, inactive structures, which have the ability to break apart or change into the smaller activated enzymes. The difference between zymogens and the activated enzymes lies in the fact that the active site for catalysis of the zymogens is distorted. As a result, the substrate polypeptide cannot bind effectively, and proteolysis does not occur. Only after activation, during which the conformation and structure of the zymogen change and the active site is opened, can proteolysis occur.

Zymogen Enzyme Notas
Trypsinogen trypsin When trypsinogen enters the small intestine from the pancreas, enteropeptidase secretions from the duodenal mucosa cleave the lysine 15 - isoleucine 16 peptide bond of the zymogen. As a result, the zymogen trypsinogen breaks down into trypsin. Recall that trypsin is also responsible for cleaving lysine peptide bonds, and thus, once a small amount of trypsin is generated, it participates in cleavage of its own zymogen, generating even more trypsin. The process of trypsin activation can thus be called autocatalytic.
Chymotrypsinogen quimotripsina After the Arg 15 - Ile 16 bond in the chymotrypsinogen zymogen is cleaved by trypsin, the newly generated structure called a pi-chymotrypsin undergoes autolysis (self digestion), yielding active chymotrypsin.
Proelastase elastase It is activated by cleavage through trypsin.

As can be seen, trypsinogen activation to trypsin is essential, because it activates its own reaction, as well as the reaction of both quimotripsina e elastase. Therefore, it is essential that this activation does not occur prematurely. There are several protective measures taken by the organism to prevent self-digestion:

  • The activation of trypsinogen by trypsin is relatively slow
  • The zymogens are stored in zymogen granules, capsules that have walls that are thought to be resistant to proteolysis.

Inhibition Edit

There are certain inhibitors that resemble the tetrahedral intermediate, and thus fill up the active site, preventing the enzyme from working properly. Trypsin, a powerful digestive enzyme, is generated in the pancreas. Inhibitors prevent self-digestion of the pancreas itself.

Serine proteases are paired with serine protease inhibitors, which turn off their activity when they are no longer needed. [6]

Serine proteases are inhibited by a diverse group of inhibitors, including synthetic chemical inhibitors for research or therapeutic purposes, and also natural proteinaceous inhibitors. One family of natural inhibitors called "serpins" (abbreviated from serine protease inhibitors) can form a covalent bond with the serine protease, inhibiting its function. The best-studied serpins are antithrombin and alpha 1-antitrypsin, studied for their role in coagulation/thrombosis and emphysema/A1AT, respectively. Artificial irreversible small molecule inhibitors include AEBSF and PMSF.

A family of arthropod serine peptidase inhibitors, called pacifastin, has been identified in locusts and crayfish, and may function in the arthropod immune system. [7]

Mutations may lead to decreased or increased activity of enzymes. This may have different consequences, depending on the normal function of the serine protease. For example, mutations in protein C can lead to protein C deficiency and predisposing to thrombosis. Also, some proteases play a vital role in host cell-virus fusion activation by priming virus's Spike protein to show the protein named "fusion protein" (TMPRSS2 activate SARS-CoV-2 fusion).

Determination of serine protease levels may be useful in the context of particular diseases.