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Eficiência de expressão de proteína baseada em lisado de células eucarióticas


Qual é a eficiência média dos sistemas de expressão de proteína à base de lisado de células eucarióticas em termos de (mg de proteína expressa) / (mg de lisado)?


Eficiência de expressão de proteína baseada em lisado de células eucarióticas - Biologia

Os produtos de PCR podem ser usados ​​para fazer proteínas de forma rápida e fácil em um sistema livre de células.

Avanços recentes ampliaram o espaço de aplicação de tais sistemas sem células.

A abertura de tais sistemas permite a triagem rápida e paralela de bibliotecas de proteínas.

As aplicações incluem estudos proteômicos, produção de microarray e triagem rápida.

Um método rápido e versátil de expressão e triagem de proteínas pode facilitar muito o desenvolvimento futuro de produtos biológicos terapêuticos, alvos proteômicos de drogas e biocatalisadores. Um candidato atraente é a síntese de proteínas livres de células (CFPS), um lisado baseado em células em vitro sistema de expressão, que pode utilizar DNA linear como modelos de expressão, ignorando as etapas de clonagem demoradas de métodos baseados em plasmídeo. Tradicionalmente, esses modelos de expressão de DNA linear (LET) têm sido vulneráveis ​​à degradação por nucleases presentes no lisado celular, levando a rendimentos mais baixos. Este desafio foi abordado de forma significativa no passado recente, impulsionando o CFPS baseado em LET como uma ferramenta útil para estudar, rastrear e projetar proteínas de uma maneira de alto rendimento. Atualmente, o CFPS baseado em LET é promissor em campos como proteômica funcional, microarranjos de proteínas e otimização de sistemas biológicos complexos.


BREVE RESUMO DA DIVULGAÇÃO

Uma estratégia geral aqui divulgada utiliza organelas em uma reação à base de lisado livre de células para fornecer regeneração de energia no sistema de reação. Esta estratégia é útil em alguns exemplos para realizar a síntese melhorada in vitro de biopolímeros (por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, polissacarídeos e carboidratos complexos). Em modalidades particulares, a presença de mitocôndrias em um sistema livre de células eucarióticas resulta em um sistema de reação melhorado em relação ao lote convencional e reações contínuas, por exemplo, reduzindo significativamente ou eliminando a necessidade de reagentes de entrega de energia adicionados (por exemplo, fosfato de creatina e / ou creatina quinase), e / ou suplementação de aminoácidos, enquanto também prolonga a duração da reação. Em alguns exemplos, a reação de polimerização livre de células divulgada é significativamente mais eficiente do que as reações convencionais atualmente utilizadas na técnica.

São descritos aqui métodos para a síntese de um biopolímero que compreende a combinação de um lisado celular compreendendo uma organela (por exemplo, plastídeos, cloroplastos e / ou mitocôndrias), um molde de polímero e unidades monoméricas do polímero em um volume de reação. Em algumas modalidades, o volume de reação não compreende o sistema de regeneração de energia de creatina fosfato / creatina quinase, por exemplo, de modo que nenhum fosfato ou fosfato mínimo seja adicionado ao volume de reação. Em modalidades particulares, a organela é uma mitocôndria. Em algumas modalidades, o lisado celular é um lisado de células eucarióticas, por exemplo, um lisado de uma célula de planta (por exemplo, tabaco, milho e soja). Um lisado celular em alguns exemplos é um lisado de células de tabaco Bright Yellow-2 (BY-2). Em algumas modalidades, o modelo de polímero é uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. As reações que utilizam RNA como molde do polímero produzem polipeptídeos como o biopolímero a partir de aminoácidos monoméricos por meio de uma reação de tradução. As reações que utilizam DNA como o modelo de polímero podem ser utilizadas para produzir outras moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA e RNA) como um biopolímero de nucleotídeos monoméricos através de uma replicação in vitro ou reação de transcrição, ou para produzir polipeptídeos através de uma reação de tradução que é acoplada a transcrição do modelo. Em certas modalidades, um método para a síntese sem energia de um biopolímero pode compreender, por exemplo e sem limitação, adicionar o (s) organelo (s), o modelo de polímero e / ou unidades monoméricas ao volume de reação e / ou isolar o biopolímero do volume da reação. Em alguns exemplos, o volume da reação não requer suplementação de aminoácidos para suportar a expressão da proteína, uma vez que os componentes do lisado são capazes de gerar aminoácidos usando vias de biossíntese endógena começando com intermediários do ciclo de TCA. Em alguns desses exemplos, portanto, os aminoácidos presentes no lisado que compreende a (s) organela (s) podem ser suficientes para suportar a síntese estendida de polipeptídeos.

Os sistemas de lisado celular divulgados podem ser suplementados com apenas uma quantidade mínima de fosfato de creatina exógena, uma quantidade mínima de creatina quinase ou ambos, desde que o volume de reação compreenda fosfato de creatina exógena e / ou creatina quinase em quantidades consideradas inadequadas para uma regeneração de energia sistema. Por exemplo, um volume de reação pode conter não mais do que 15 mM, não mais do que 10 mM, não mais do que 5 mM, não mais do que 1 mM, não mais do que 500 μM, não mais do que 100 μM, não mais do que 50 μM, ou não mais do que 10 μM de fosfato de creatina adicionado. Em outro exemplo, um volume de reação pode conter não mais que 100 μg / mL, não mais que 50 μg / mL, não mais que 10 μg / mL, não mais que 5 μg / mL, não mais que 1 μg / mL, que 0,5 μg / mL, ou não mais do que 0,1 μg / mL adicionado de creatina quinase. Estas quantidades são inadequadas e, portanto, requerem a inclusão de organelas celulares, tais como plastídios, mitocôndrias ou cloroplastos de acordo com os métodos e sistemas aqui divulgados, para sustentar a síntese de biopolímero (incluindo para sustentar a síntese de biopolímero por períodos prolongados aqui divulgados).

Algumas modalidades incluem sistemas para síntese de um biopolímero sem usar um sistema de regeneração de energia artificial. Nessas modalidades, o sistema compreende um lisado celular aquoso, uma organela celular (endógena ou heteróloga), um molde de polímero. Em modalidades particulares, o sistema também inclui unidades monoméricas do polímero. Os sistemas livres de células convencionais para a síntese de biopolímero in vitro compreendem ainda fosfato de creatina e creatina quinase, que é usada para regeneração de energia no sistema conforme a reação de síntese prossegue. Em modalidades aqui, o sistema é substancialmente desprovido de fosfato de creatina, nenhum fosfato de creatina e creatina quinase é adicionado ao sistema. Em certos exemplos, o sistema não compreende creatina fosfato ou creatina quinase. Em modalidades particulares, um sistema para a síntese de um biopolímero pode compreender ainda, por exemplo e sem limitação, um tampão de pH, magnésio (por exemplo, Mg (C5H8NÃO4)2), potássio (por exemplo, KC5H8NÃO4), nucleosídeos (por exemplo, trifosfatos de nucleosídeo, difosfatos de nucleosídeo e monofosfatos de nucleosídeo), enzimas (por exemplo, RNA polimerase) e cloranfenicol. Em modalidades específicas, nenhum aminoácido diferente de sal de glutamato (s) são adicionados aos já presentes no sistema (ou seja, os aminoácidos presentes no lisado e organela). Em alguns exemplos, um sistema de acordo com o anterior pode mostrar uma atividade prolongada de mais de 20 horas (por exemplo, cerca de 40 horas) e pode produzir significativamente mais (por exemplo, cerca de 60% a mais) proteína alvo do que um sistema convencional idêntico que compreende adicionado fosfato de creatina e creatina quinase.

Algumas modalidades incluem um kit para síntese de um biopolímero sem o uso de um sistema de regeneração de energia artificial. Em algumas modalidades, um kit compreende componentes de um sistema para síntese de um biopolímero sem usar um sistema de regeneração de energia artificial e instruções escritas para direcionar o uso do kit. Por exemplo e sem limitação, um kit pode compreender um ou mais dentre: um lisado celular aquoso, um organelo celular (endógeno ou heterólogo), um molde de polímero e unidades monoméricas do polímero, dispostos em um ou mais volumes separados, juntamente com instruções especificando a mistura dos componentes do kit e quaisquer componentes exógenos sem creatina fosfato e creatina quinase. A título de exemplo adicional, um kit pode compreender ainda um ou mais de um tampão de pH, magnésio, potássio, nucleosídeos, enzimas (por exemplo, RNA polimerase) e cloranfenicol. Um kit para a síntese de um biopolímero de acordo com modalidades específicas pode compreender um lisado celular aquoso (por exemplo, compreendendo cloroplastos e / ou mitocôndrias), unidades monoméricas de um polímero (por exemplo, nucleosídeos) e instruções escritas. Em tais modalidades específicas, as instruções escritas podem direcionar um usuário a combinar esses componentes com um modelo de polímero de interesse (por exemplo, uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo) e quaisquer outros reagentes, sem adicionar creatina fosfato (com creatina quinase para regeneração de energia) para A combinação.

As modalidades aqui incorporam mitocôndrias ativas para regeneração de energia em uma reação de síntese em andamento e, portanto, podem ser utilizadas para investigar quantitativamente compostos ou proteínas que afetam a função mitocondrial no contexto da síntese in vitro. Além disso, intermediários do ciclo de TCA podem ser utilizados durante a reação de síntese para produzir aminoácidos, de modo que a suplementação de aminoácidos não seja necessária para a síntese de polipeptídeos prolongada. Em algumas modalidades, um lisado celular para uso nos métodos, sistemas e kits deste documento compreende cloroplastos, o que reduz a dependência de oxigênio da reação de síntese. Por exemplo, um lisado celular pode ser preparado a partir de células ativas fotossintéticas, de modo que os plastídios, cloroplastos e / ou mitocôndrias sejam retidos no lisado, enquanto o material celular indesejável é removido. Em tais exemplos específicos, os métodos, sistemas e kits aqui podem utilizar energia derivada de plastídio, regeneração de energia derivada de mitocôndria, regeneração de energia derivada de cloroplasto ou uma combinação de ambas.

As características anteriores e outras se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias modalidades, que prossegue com referência às figuras anexas.


Um líder que qualquer um pode seguir

O desenvolvimento de sequências líderes que estimulam a tradução do mRNA de uma maneira independente da espécie pode oferecer novas possibilidades para a produção de proteínas eucarióticas e pesquisa proteômica.

Proteínas são coisas teimosas, e alcançar altos rendimentos de polipeptídeos adequadamente dobrados e modificados pode se tornar uma tarefa verdadeiramente hercúlea, com a produção baseada em células frequentemente prejudicada por questões de eficiência e toxicidade, bem como a dificuldade de coletar a proteína alvo.

Os sistemas baseados em lisados ​​livres de células existentes oferecem uma alternativa promissora, mas não uma solução perfeita. “Você pode fazer a preparação sem células em Escherichia coli na escala de vários litros ”, diz Kirill Alexandrov, da University of Queensland, Austrália. “Mas se você for para o mundo eucariótico, o que você tem que fazer porque E. coli não dobra adequadamente proteínas eucarióticas complexas, então as coisas se tornam muito mais difíceis. ” Sistemas preferidos como lisado de reticulócito de coelho e extrato de gérmen de trigo são insuficientes quando se trata de rendimento e escalabilidade, e Alexandrov estava ansioso para desenvolver uma abordagem mais eficiente e universal para a produção de proteína eucariótica.

A capacidade de envolver de forma específica e eficiente a maquinaria translacional lisada com mRNAs exógenos é vital para o sucesso da produção de proteínas livres de células, e a equipe de Alexandrov alcançou um avanço a esse respeito ao reexaminar as sequências líderes em suas transcrições iniciais. Evidências anteriores sugeriram que sequências ricas em poli (A) relativamente não estruturadas estimulam a montagem do complexo translacional e, ao projetar uma região 5 'não traduzida personalizada com base neste conceito, aumentaram consideravelmente a eficiência da tradução para transcritos vinculados em praticamente qualquer sistema livre de células . “Esta tradução é verdadeiramente independente da espécie e funcionou em todos os organismos que testamos, incluindo eucariotos e procariontes”, diz Alexandrov.

Sua equipe trabalhou em estreita colaboração com um organismo particularmente intrigante, o tripanossomo Tarentolae de leishmania, com características que o tornam um candidato promissor para extratos livres de células. “É essencialmente um organismo de transição entre procariotos e eucariotos”, diz ele, “porque eles têm expressão de genes procarióticos [maquinário], mas dobramento de proteínas eucariotas e maquinário de modificação”. Outra vantagem potente deste organismo é a existência de uma sequência líder de 35 nucleotídeos ubíqua em todos os mRNAs endógenos, como resultado, a tradução destes poderia ser facilmente bloqueada com um Leishmania-nucleotídeo antisense específico, eliminando a necessidade de digestão com RNase como em outros métodos baseados em extrato.

Esta combinação de L. tarentolae extrato e sua sequência de tradução independente de espécie provaram ser potentes, resultando em um rendimento de proteína marcadamente maior do que os extratos eucarióticos concorrentes - até 300 microgramas de proteína por mililitro em 90 minutos - com uma variedade de sequências de codificação de proteínas, embora a eficiência do dobramento variou dependendo da proteína em questão. Como uma demonstração adicional da utilidade de seu método, os pesquisadores monitoraram o comportamento de difusão e interação de proteínas individuais diretamente na mistura de tradução livre de células usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Com base nesses experimentos iniciais, Alexandrov é encorajado que seu método oferece uma forte combinação de eficiência e a capacidade de aumentar a produção de proteína eucariótica para a escala de litro a uma fração do custo dos sistemas comerciais existentes - um grande benefício para os cientistas que procuram gerar cristais ou produzir anticorpos. Em contraste, há também vantagens importantes em 'ir pequeno' e a capacidade de produção de proteína altamente multiplexada usando o líder de sequência de tradução independente de espécie, seja com L. tarentolae extrato ou qualquer outro sistema de extrato, pode permitir estudos de análise de interação de alto rendimento ou até mesmo novas abordagens para lidar com a pesquisa proteômica. “Você pode encontrar um organismo, fazer um extrato e retrotraduzir seu genoma”, diz Alexandrov. “Craig Venter estima um pool total de 20 milhões de genes no planeta, e a maioria deles está em microorganismos com os quais não temos controle - e então esta poderia ser uma forma de gerar proteomas expressos rapidamente.”


Conclusão

Em vitro a síntese de proteínas foi comparada não apenas entre o sistema PURE mínimo e o sistema baseado em extrato, mas também entre os sistemas procariótico e eucariótico. A vantagem do em vitro Essa abordagem nos permitiu complementar um sistema com os lisados ​​ou suas frações de outro sistema, fornecendo, assim, insights sobre as diferenças fundamentais entre esses sistemas. Uma vez que ribossomos, fatores de tradução e aminoacil-tRNA sintetases estão entre as moléculas de RNA e proteínas mais conservadas, o sistema PURE pode se assemelhar a uma forma ancestral da maquinaria mínima de tradução de proteínas, que, como este estudo sugere, é suficiente, mas não eficiente na síntese de proteínas. . O sistema S30, em comparação, contém a versão bacteriana moderna, com fatores celulares adicionais capazes de aumentar a tradução e o enovelamento das proteínas. A maquinaria de tradução eucariótica pode ter evoluído de sua contraparte procariótica a fim de traduzir modelos mais complexos (difíceis de traduzir) em proteínas ativas.


Expressão de Proteína

A produção recombinante de proteínas é uma das técnicas mais poderosas utilizadas nas Ciências da Vida. A capacidade de produzir e purificar uma abundância de uma proteína recombinante desejada pode permitir uma ampla gama de possibilidades, incluindo seu uso em processos industriais, ou seu uso para diagnosticar ou tratar doenças.

À primeira vista, a expressão da proteína recombinante pode parecer simples. Essencialmente, o DNA que codifica uma proteína alvo é clonado a jusante de um promotor em um vetor de expressão. Este vetor é então introduzido em uma célula hospedeira, e a maquinaria de síntese de proteínas da célula e rsquos produz a proteína desejada. Na prática, entretanto, a expressão de proteínas pode ser muito desafiadora porque muitos fatores podem influenciar o processo. Por exemplo, cada proteína se dobra em sua própria maneira única, um processo que pode ser influenciado pela escolha do hospedeiro de expressão. Da mesma forma, algumas proteínas requerem modificações pós-tradução ou inserção adequada em uma membrana biológica. Finalmente, algumas proteínas podem ter uma atividade prejudicial ao hospedeiro. Assim, não existe uma solução única para a produção bem-sucedida de todas as proteínas recombinantes. Em vez disso, é benéfico ter acesso a uma ampla gama de ferramentas de expressão e disposição para explorar várias abordagens para melhorar suas chances de sucesso. Expressão de proteínas no NEB.

Escolha o tipo:

Artigos de destaque

Leia como evitar obstáculos comuns na expressão de proteínas que impedem interações com a maquinaria celular.

A síntese de proteínas livres de células tem o potencial de se tornar uma das tecnologias de alto rendimento mais importantes para genômica funcional e proteômica.

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Este artigo fornece uma visão geral dos avanços na expressão de proteínas e na metodologia de purificação nos últimos 40 anos.

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Este produto está coberto por uma ou mais patentes, marcas comerciais e / ou direitos autorais pertencentes ou controlados pela New England Biolabs, Inc (NEB).

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Para obter mais informações sobre direitos comerciais, entre em contato com a equipe de Desenvolvimento de Negócios Globais do NEB em [email protected]

Este produto destina-se apenas a fins de pesquisa. Este produto não se destina a ser usado para fins terapêuticos ou de diagnóstico em humanos ou animais.

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Introdução ao NEBExpress & reg Cell-free Protein Synthesis System

Assista a este tutorial que explica o fluxo de trabalho simplificado para nosso novo sistema de síntese de proteínas NEBExpress & reg Cell-free para aprender como você pode sintetizar facilmente sua proteína em apenas 2 a 4 horas.

Soluções para a expressão de proteínas difíceis

NEB tem uma longa história na expressão de proteínas recombinantes e desenvolveu uma ampla gama de soluções para proteínas que são difíceis de expressar.


Conclusões e Outlook

Apesar de sua baixa produtividade, grande pegada de produção e altos custos de processamento downstream em comparação com plataformas tradicionais, plantas e células vegetais possuem alguns pontos de venda exclusivos que os tornam atraentes para linhas de produtos específicas, como proteínas que requerem glicanos específicos de plantas, terapêutica veterinária, vacinas de emergência e proteínas livres de animais. No entanto, a tradução de muitos desses produtos da pesquisa para o mercado é lenta, limitando a visibilidade e a exploração comercial de plataformas baseadas em plantas para a produção de proteína recombinante. A tradução comercial é mais direta e rápida para proteínas não terapêuticas devido à menor carga regulatória. Esses produtos são, portanto, mais adequados em primeira instância para demonstrar a sustentabilidade econômica dos sistemas de produção baseados em plantas. Em contraste, as proteínas terapêuticas prometem margens de lucro mais altas, mas sua comercialização requer estudos pré-clínicos e clínicos abrangentes e caros com o apoio de parceiros industriais que fornecem experiência no desenvolvimento de medicamentos. Muitos estudos relativos à produção de proteínas terapêuticas em plantas, portanto, nunca vão além da expressão, purificação e análise baseada em células. O progresso ao longo da cadeia de valor requer trabalho adicional, incluindo estudos de toxicidade, a identificação de biomarcadores para estratificação de pacientes e monitoramento terapêutico, ensaios clínicos e aceitação por seguros de saúde e agências regulatórias. Outras considerações comerciais incluem propriedade intelectual / liberdade de operar, portfólio, participação de mercado, concorrentes em potencial e tempo de colocação no mercado. O lançamento de mais biofármacos derivados de plantas no mercado exigirá um investimento significativo e uma cooperação mais estreita com a indústria farmacêutica, autoridades regulatórias e médicos. É importante ressaltar que isso só faz sentido se o produto oferecer vantagens únicas em termos de qualidade, eficácia, escala / tempo de produção e / ou custo quando for produzido em plantas em vez de células CHO ou micróbios.


1. Introdução

A expressão funcional de proteínas recombinantes em hospedeiros procarióticos é de considerável interesse industrial, com aplicações que vão desde proteínas terapêuticas e produção de enzimas recombinantes até engenharia metabólica para sintetizar biomoléculas de valor agregado [1,2]. No entanto, a superexpressão de proteína recombinante em hospedeiros procarióticos comumente resulta em formações de agregados de proteína, denominados corpos de inclusão [3], que excedem em muito a capacidade de dobramento do hospedeiro. Consequentemente, processos de redobragem in vitro caros e demorados têm sido amplamente aplicados para recuperar proteínas funcionalmente ativas em suas formas solúveis. Além disso, a formação de corpos de inclusão é geralmente prejudicial ao hospedeiro por meio do aumento da carga metabólica celular e das interações intermoleculares com outros componentes celulares [4,5], reduzindo a viabilidade celular e o rendimento geral da produção.

Na Vivo e em vitro estratégias para solubilizar proteínas recombinantes em uma conformação ativa durante o processo de produção inicial [6] incluem marcadores de aumento de solubilidade para prevenir intrinsecamente a formação de proteínas mal dobradas in-vivo [7,8,9], modificação da condição físico-química para equilibrar os processos de tradução e dobramento [10 , 11], e superexpressão de chaperone molecular para melhorar a desagregação do hospedeiro e a capacidade de dobramento [12,13,14]. Chaperones moleculares, que podem ajudar as células a lidar com a desnaturação de proteínas induzida por estresse [15,16], constituem ferramentas poderosas para produzir proteínas recombinantes funcionalmente ativas e solúveis em água. Entre as opções, o uso de chaperones moleculares é mais econômico e menos demorado, pois nenhum processamento pós-tradução e compromissos nas condições de crescimento celular são necessários. No entanto, a co-superexpressão direta da chaperona nativa com proteínas alvo produz apenas solubilização limitada durante a produção da proteína recombinante. Embora chaperonas moleculares abundantes possam estar disponíveis através das abordagens de co-expressão de chaperonas, elas podem não se difundir efetivamente através do citosol lotado para interagir em tempo hábil com um polipeptídeo nascente antes que as dobras incorretas aconteçam [17]. A rápida cinética do processo de dobramento que ocorre durante a tradução de proteínas recombinantes resulta facilmente no dobramento incorreto irreversível, agregação e degradação se não forem assistidos por moduladores de dobramento em tempo hábil. Portanto, nossa estratégia era forçar o chaperone molecular e a interação do peptídeo nascente ou de tradução para evitar mais dobramento incorreto e agregação, bem como para facilitar os processos de redobramento mediado por chaperone.

Consequentemente, transformamos a região não traduzida 3 & # x02032 (3 & # x02032UTR) do mRNA que codifica uma proteína recombinante alvo em um arcabouço para ancorar uma chaperona molecular na proximidade do local de parada da tradução. Por tal arranjo, a tradução da proteína é acoplada ao processo de redobragem. Alternativamente, colocamos os genes da chaperona molecular e da proteína alvo em conjunto ou em um arranjo sobreposto para acoplar suas traduções, permitindo que as duas proteínas interajam rapidamente durante o processo de tradução. A abordagem anterior, denominada esqueleto de mRNA de recrutamento de chaperone (CRAS), foi projetada para evitar a agregação e posterior desdobramento de proteínas recém-sintetizadas antes do dobramento nativo final. A última abordagem, nomeadamente expressão co-localizada de substrato-chaperona (CLEX), permitiu o envolvimento da proteína na outra tradução & # x02019s e facilitou o dobramento co-tradução. Escolhemos o chaperone e co-chaperones do sistema chaperone DnaK (Hsp70) como os moduladores dobráveis ​​empregados em nossos projetos, pois eles desempenham um papel central na rede chaperone, reconhecem uma ampla gama de substratos e trabalham diretamente com a dobragem de polipeptídeos nascentes [18,19]. Em um ciclo funcional DnaK típico, o co-chaperone DnaJ (Hsp40) se liga aos remendos hidrofóbicos de polipeptídeos não dobrados, transfere as moléculas de substrato para DnaK para o processo de dobramento. Os polipeptídeos dobrados são liberados do DnaK pelo fator de troca de nucleotídeos GrpE e podem ser entregues a outras chaperones para dobras adicionais [20]. Como a holdase que primeiro interage com polipeptídeos desdobrados e evita o desdobramento e agregação adicionais, DnaJ também pode funcionar de uma maneira independente de DnaK [21,22]. Assim, selecionamos DnaJ como a co-chaperona direcionada ao 3 & # x02032UTR no sistema CRAS e para ser co-superexpressada com uma proteína alvo no sistema CLEX. Para introduzir uma função de ligação de RNA a DnaJ, fundimos DnaJ a um domínio Nova-1 KH3 humano, que se liga especificamente a um motivo UCAU de tetranucleotídeo em uma alça em gancho de fita simples de uma molécula de RNA [23].

Ao projetar o mRNA que codifica uma proteína recombinante propensa à agregação alvo com uma estrutura em gancho adicional 3 & # x02032UTR ou o segundo cistron expressando DnaJ, fomos capazes de superar a co-superexpressão de DnaJ simples com proteínas alvo em termos de produção de proteínas solúveis. Uma proteína alvo pode ser produzida em até 90% na fração solúvel quando a tradução é auxiliada com a alta concentração local de chaperones em CRAS / CLEX. Nossos sistemas podem produzir proteínas-alvo solúveis mesmo quando a chaperona é incapaz de solubilizar qualquer quantidade apreciável de proteína com a co-superexpressão de DnaJ. As combinações de vários fatores envolvidos nos mecanismos de redobramento / desagregação, como as distâncias do gene, número de grampos de cabelo, componentes de chaperone, etc. dos dois sistemas foram examinadas para maximizar a eficiência do método.


Expressão de Proteína

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Este produto destina-se apenas a fins de pesquisa. Este produto não se destina a ser usado para fins terapêuticos ou de diagnóstico em humanos ou animais.

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Introdução ao NEBExpress & reg Cell-free Protein Synthesis System

Assista a este tutorial explicando o fluxo de trabalho simplificado para nosso novo sistema de síntese de proteínas NEBExpress & reg Cell-free para aprender como você pode sintetizar facilmente sua proteína em apenas 2 a 4 horas.

Soluções para a expressão de proteínas difíceis

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Escolhendo um sistema

Procarióticos ou eucarióticos, caseiros ou comerciais, à base de extrato bruto ou reconstituído? A escolha do sistema depende de suas necessidades e restrições específicas.

Quais espécies? A menos que você esteja prototipando partes genéticas ou precise da maquinaria de expressão de um organismo específico, um sistema livre de células baseado em E. coli deve ser sua primeira escolha. A família mais antiga e mais amplamente utilizada de sistemas livres de células, os sistemas de E. coli foram otimizados para uma expressão gênica confiável e produção de proteína de alto rendimento.

Vai ser comercial? Produzir seu próprio extrato celular requer equipamento e experiência para cultivar e lisar grandes volumes de células. Um punhado de fornecedores vendem seus próprios sistemas livres de células, derivados de organismos modelo e linhas de células laboriosas, mas eles não são baratos. Espere pagar pelo menos US $ 7 por reação, contra centavos por reação para um sistema caseiro.

Bruto ou reconstituído? A maioria dos sistemas de expressão livres de células são feitos com lisado celular bruto, que contém muito mais enzimas do que a maquinaria de expressão do gene central. Isso pode ser uma coisa boa - os sistemas modernos baseados em lisado de E. coli contêm chaperonas e a maior parte do metabolismo central, o que aumenta o rendimento de proteínas e os títulos do produto. Se você precisar remover completamente a atividade de uma determinada enzima, um sistema reconstituído conhecido como PURE (síntese de proteínas usando elementos recombinantes) pode ser a opção certa. No PURE, cada proteína necessária para a expressão do gene é purificada e adicionada à reação, dando a você o máximo controle sobre a composição da reação. Protocolos simplificados foram publicados recentemente para produzir economicamente os dois tipos de sistemas, mas você também pode comprar um kit.


Assista o vídeo: Curso de Bioquimica: Regulação da expressão gênica em procariotos (Dezembro 2021).