Em formação

Como o GTP ajuda na etapa de reconhecimento de códons?


O anticódon de um par de bases de tRNA de entrada com o códon de mRNA complementar no local A. A hidrólise de GTP aumenta a eficiência e a precisão desta etapa. Como o GTP faz isso?


Mudanças estruturais baseadas em GTP (até mesmo ações motoras) são muito comuns em sistemas biológicos. Por ex. Proteínas G, Rab-GTPase (transporte vesicular), Ran-GTPase (exportação / importação nuclear).

Portanto, todas essas proteínas ligadas ao GTP fazem uso de uma atividade GTPase intrínseca ou assistida para converter GTP em GDP. Essa conversão causa mudança na estrutura da proteína associada. Voltar para a forma ligada ao GTP requer proteínas chamadas GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors).

Portanto, no caso de alongamento de translação, o fator de alongamento é uma GTPase que altera a confirmação após a hidrólise de GTP. Esta mudança de confirmação torce o tRNA de modo que o aminoácido ligado se mova para mais perto do centro da peptidil-transferase (se o local P estiver à esquerda, então o aminoácido está ligado à direitaCCAcauda do tRNA. A torção faz com que o aminoácido se mova para a esquerda - em direção ao local P).

Você pode consultar livros como Genes de Lewin para obter detalhes.


Ensaio sobre mRNA (para estudantes universitários e de medicina) | Biologia

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Ensaio nº 1. Introdução à tradução de mRNA:

A tradução é um processo onde a informação genética é traduzida de um & # 8220nucleic acid lan & shyguage & # 8221 em uma & # 8220 linguagem aminoácido & # 8221. É catalisado pelo ribossomo, que contém proteínas e RNA ribossômico (rRNA). A tradução é uma síntese de polipeptídeos dirigida por RNA. Este processo requer todas as três classes de RNA, mRNA, rRNA e RNA de transferência (t-RNA), que podem se ligar a códons de três pares de bases em um RNA mensageiro (mRNA) e também carregar o aminoácido apropriado codificado pelo códon. A química da formação da ligação peptídica é relativamente simples; os processos que levam à formação de uma ligação peptídica são extremamente complexos.

Os tRNAs carregam aminoácidos ativados para o ribossomo, que é composto de rRNA e proteínas ribossômicas. O ribossomo está associado ao mRNA garantindo o acesso correto dos tRNAs ativados e contendo as atividades enzimáticas necessárias para catalisar a formação de ligações peptídicas. O ribossomo é inativo quando existe como duas subunidades (uma grande e uma pequena) antes de entrar em contato com um mRNA. A pequena unidade do ribossomo inicia o processo de tradução quando encontra um mRNA no citoplasma.

A tradução prossegue em um processo ordenado. Primeiro ocorre a iniciação precisa e eficiente e, em seguida, o alongamento da cadeia e, finalmente, a terminação precisa e eficiente deve ocorrer. Todos esses três processos requerem proteínas específicas, algumas das quais associadas ao ribossomo e muitas outras separadas do ribossomo, mas podem estar temporariamente associadas a ele. O primeiro códon A-U-G na extremidade 5 & # 8242 do mRNA atua como um sinal & # 8220start & # 8221 para a maquinaria de tradução e codifica a introdução de um aminoácido metionina. A iniciação é concluída quando o tRNA da metionina ocupa um dos dois locais de ligação no ribossomo.

O primeiro local é o local onde o peptídeo em crescimento residirá, é conhecido como local P e outro local apenas na direção 3 & # 8242 do local P é conhecido como local A onde o tRNA de entrada é anexado. Cada proteína começa com o aminoácido metionina, nem todas as proteínas, no final das contas, terão metionina em uma extremidade. Se a & # 8220start & # 8221 metionina não for necessária, ela será removida antes que a nova proteína comece a funcionar

O ribossomo se liga ao mRNA no códon inicial (AUG), que é reconhecido apenas pelo tRNA iniciador. O ribossomo segue para a fase de alongamento da síntese de proteínas. Durante esse estágio, os complexos, compostos por um aminoácido ligado ao tRNA, se ligam sequencialmente ao códon apropriado no mRNA, formando pares de bases complementares com o tRNA anti & shycodon. O ribossomo se move de códon a códon ao longo do mRNA. Os aminoácidos são adicionados um a um, traduzidos em sequências polipeptídicas ditadas pelo DNA e representadas pelo mRNA. No final, um fator de liberação se liga ao códon de parada, terminando a tradução e re-libertando o polipeptídeo completo do ribossomo.

Ativação de Aminoácidos:

É a etapa em que cada um dos aminoácidos participantes reage com o ATP para formar o complexo AMP de aminoácidos e o pirofosfato. A reação é catalisada por uma enzima ativadora de aminoácidos específica chamada aminoacil-tRNA sintetase na presença de Mg 2+. Existe uma enzima separada aminoacil tRNA sintetase para cada tipo de aminoácido. Grande parte da energia liberada pela separação dos grupos fosfato do ATP fica presa no complexo AMP de aminoácidos. O complexo permanece temporariamente associado à enzima. O complexo enzimático AMP de aminoácidos é denominado aminoácido ativado.

O pirofosfato é hidrolisado em dois fosfatos inorgânicos (2pi). Cada tRNA e o aminoácido que ele carrega são reconhecidos pelas aminoacil-tRNA sintetases individuais. A ativação de aminoácidos requer energia na forma de ATP. Primeiro, a enzima liga o aminoácido ao alfa-fosfato de ATP com a liberação concomitante de pirofosfato. Este é denominado um intermediário aminoacil-adenilato. Em seguida, a enzima catalisa a transferência do aminoácido para o 2 & # 8242- ou 3 & # 8242-OH da porção ribose do resíduo de adenosina 3-terminal do tRNA gerando o aminoacil-tRNA acti e tímido, esta é a reação reversível.

O reconhecimento preciso do aminoácido correto, bem como do tRNA correto, é diferente para cada aminoacil-tRNA sintetase. Diferentes aminoácidos têm diferentes grupos R, a enzima para cada aminoácido tem um bolso de ligação diferente e tímido para seu aminoácido específico. É absolutamente necessário que a discriminação e inibição do aminoácido correto e do tRNA correto sejam feitos por uma determinada sintetase antes da liberação do aminoacil-tRNA da enzima. Depois que o produto é liberado, não há meios para verificar se um dado tRNA está acoplado ao seu tRNA correspondente (Fig. 8.13).

Carregamento de tRNA:

Aqui, o complexo aminoácido AMP-enzima se junta ao sítio de ligação do aminoácido de seu tRNA específico, onde seu grupo COOH se liga ao grupo OH do tripleto de base terminal CCA. A reação é catalisada pela mesma enzima, aminoacil tRNA sintetase. O complexo re & shysulting tRNA-aminoácido é chamado de tRNA carregado. O AMP e a enzima são liberados. A enzima liberada pode ativar e anexar outra molécula de aminoácido a outra molécula de tRNA. A energia liberada pela mudança de ATP em AMP é retida no complexo aminoácido-tRNA. Essa energia é mais tarde usada para conduzir a formação da ligação peptídica quando os aminoácidos se ligam e formam um polipeptídeo. O complexo de aminoácidos do tRNA se move para os ri e shibossomos, o local da síntese de proteínas.

Ativação do ribossomo:

É a etapa em que as subunidades menores e maiores do ribossomo são unidas. TKis é provocado pela cadeia de mRNA. O mRNA une-se à subunidade ribossômica menor com a ajuda do primeiro códon por um emparelhamento de bases com uma sequência apropriada no rRNA. A combinação dos dois é chamada de complexo de iniciação. A subunidade maior posteriormente se junta à subunidade pequena, formando o ribossomo ativo. A ativação do ribossomo por mRNA requer concentração adequada e inibição de Mg ++.

Ensaio nº 2. Tipos de tradução de mRNA:

A. Tradução procariótica de mRNA:

Formação de polipeptídeos em procariotos:

Envolve três eventos:

(c) Terminação da cadeia polipeptídica.

A tradução em procariotos envolve a montagem dos componentes do sistema de tradução que são as duas subunidades ribossomais (pequena e grande), o mRNA a ser traduzido, o primeiro (formil) aminoacil tRNA (o tRNA carregado com o primeiro aminoácido), GTP (como fonte de energia) e três fatores de iniciação (IF1, IF2 e IF3) que auxiliam na montagem do complexo de iniciação.

O ribossomo tem três locais - o local A, o local P e o local E. O sítio A é o ponto de entrada para o aminoacil tRNA (exceto para o primeiro aminoacil tRNA, fMet-tRNAf Met, que entra no site P). O sítio P é onde o peptidil tRNA é formado no ribossomo, enquanto no sítio E, que é o sítio de saída do tRNA agora descarregado, depois de fornecer seu aminoácido à crescente cadeia de peptídeo.

A cadeia de mRNA tem em sua extremidade 5 & # 8242 um códon & # 8220initiator & # 8221 ou & # 8220start & # 8221 (AUG), seu reconhecimento que sinaliza o início da formação do polipeptídeo (Fig. 8.14). Este códon está próximo ao sítio P do ribossomo. Nos RNAs procarióticos policistrônicos, este códon AUG está localizado próximo a um elemento Shine-Delgarno no mRNA. O elemento Shine-Delgarno (Fig. 8.15) é reconhecido por sequências complementares na pequena subunidade rRNA (165 em E. coli).

O aminoácido formilmetionina (metionina em eucariotos) inicia o processo. É transportado por tRNA tendo um anticódon UAC que se liga ao códon iniciador AUG do mRNA. Fatores de iniciação (IF1, IF2 e IF3) e GTP promovem o processo de iniciação. A grande subunidade ribossômica agora se junta à pequena subunidade para completar o ribossomo. Nesta fase, o GTP é hidrolisado em PIB. O ribossomo possui tRNA contendo formilmetionina no local P. Posteriormente, a formilmetionina é alterada para metionina normal pela enzima deformilase em procariotos. Se não for necessário, a metionina é posteriormente separada da cadeia polipeptídica por uma enzima proteolítica aminopeptidase (Fig. 8.16).

No processo de iniciação da síntese de proteínas, os primeiros fatores de iniciação IF-1 e IF-3 se ligam à subunidade ribossomal 305, evitando que as subunidades 30S e 50S se combinem prematuramente. A ligação do mRNA à subunidade 30S ocorre de tal forma que o códon de iniciação (AUG) se liga a uma localização precisa na subunidade 30S. A prevenção da reassociação de subunidades permite que o complexo de pré-iniciação se forme. A ligação de IF-1 ajuda a garantir que o aminoacil-tRNA de iniciação, fMet-tRNA fMet pode se ligar apenas no local P e outro aminoacil-tRNA pode se ligar no local A durante a iniciação. O início da tradução requer o reconhecimento de um códon AUG. Nos RNAs procarióticos policistrônicos, o códon AUG está localizado adjacente a um elemento Shine-Delgarno no mRNA. O elemento Shine-Delgarno é reconhecido por sequências comparativas na pequena subunidade rRNA (165 em E. coli). IF-2 é uma pequena proteína de ligação ao GTP que se liga ao iniciador fMet-tRNA e o ajuda a se encaixar na pequena subunidade do ribossomo.

O alongamento da cadeia polipeptídica envolve a adição de aminoácidos à extremidade carboxila da cadeia em crescimento. A proteína em crescimento sai do ribossomo pela saída do polipeptídeo tun & shynel na subunidade grande (Fig. 8.17).

Três fatores de alongamento (EF Tu, EF Ts e EF G) auxiliam no alongamento da cadeia de polipeptídeo. O alongamento começa quando o fmet-tRNA entra no sítio P, causando uma mudança conformada e tímida que abre o sítio A para o novo aminoacil-tRNA se ligar. Esta ligação é facilitada pelo fator de alongamento-Tu (EF-Tu), uma pequena GTPase. Agora, o local P contém o início da cadeia peptídica da proteína a ser codificada e o local A tem o próximo aminoácido a ser adicionado à cadeia peptídica. O polipeptídeo em crescimento conectado ao tRNA no local P é separado do tRNA no local P e uma ligação peptídica é formada entre os últimos aminoácidos do polipeptídeo e o aminoácido ainda ligado ao tRNA no local A.

Esse processo, conhecido como formação de ligação peptídica, é catalisado por uma ribozima peptidiltransferase, uma atividade intrínseca ao RNA ribossômico 23 S na subunidade ribossômica 50S. Uma molécula de tRNA carregada junto com seu aminoácido, prolina, por exemplo, entra no ribossomo no sítio A. Seu anticódon GGA se localiza e se liga ao códon complementar CCU da cadeia de mRNA por ligações de hidrogênio. O aminoácido metionina é transferido de seu tRNA para o complexo de tRNA de prolina recém-chegado, onde os dois aminoácidos se unem por uma ligação peptídica.

O processo é catalisado pela enzima peptidil transferase localizada no ribossomo. Neste processo, a ligação entre o primeiro aminoácido e seu tRNA é quebrada, e o grupo & # 8211 COOH agora forma uma ligação peptídica com o -NH livre2 grupo do segundo aminoácido. Assim, o segundo tRNA carrega um dipeptídeo, formilmetioninaprolina. A energia necessária para a formação de uma ligação peptídica vem da energia livre liberada pela separação do aminoácido (formilmetionina ou metionina) de seu tRNA.

O primeiro tRNA, agora sem carga, separa-se da cadeia de mRNA no sítio P do ribo e shysome e retorna ao pool misto de tRNAs no citoplasma. Aqui, ele agora está disponível para transportar outra molécula de seu aminoácido específico. Agora, o ribossomo move um códon ao longo do mRNA na direção 3 & # 8242. Com isso, o complexo de dipeptídeo tRNA no local A é puxado para o local P. Este processo é denominado translocação. Requer GTP e uma proteína translocase chamada fator EF-G. O GTP é hidrolisado em GDP e fosfato inorgânico para liberar energia para o processo.

Nesse estágio, uma terceira molécula de tRNA com seu próprio aminoácido específico, arginina, por exemplo, chega ao sítio A do ribossomo e se liga com a ajuda do anticódon AGA ao códon complementar UCU da cadeia de mRNA. O dipeptídeo formilmetioninaprolina é deslocado do tRNA anterior no terceiro tRNA, onde se junta ao aminoácido arginina novamente com a ajuda da enzima peptidil transferase. O dipeptídeo, portanto, torna-se um tripeptídeo, formil-metionina-prolina-arginina. O segundo tRNA sendo agora descarregado, deixa a cadeia de mRNA, desocupando o sítio P. O complexo tRNAtripeptídeo é translocado do local A para o local P.

Todo o processo envolvendo a chegada do complexo tRNA-aminoácido, forma de ligação peptídica e timidez e translocação é repetido. À medida que o ribossomo se move sobre o mRNA, todos os códons do mRNA chegam ao sítio A, um após o outro, e a cadeia peptídica cresce. Assim, os aminoácidos são ligados em um polipeptídeo em uma sequência comunicada pelo DNA por meio do mRNA. Uma cadeia polipeptídica que está em processo de síntese é freqüentemente chamada de polipeptídeo nascente. Uma vez que os tRNAs estão ligados ao mRNA por par de bases códon-anticódon, os tRNAs se movem em relação ao ribossomo levando o polipeptídeo nascente do local A para o local P e movendo o tRNA descarregado para o local de saída E. Este processo é catalisado pelo fator de alongamento G (EF-G). O ribossomo continua a traduzir os códons restantes no mRNA à medida que mais aminoacil-tRNA se ligam ao sítio A, até que o ribossomo alcance um códon de parada no mRNA (UAA, UGA ou UAG). A crescente cadeia polipeptídica sempre permanece ligada ao seu ribossomo original e não é transferida de um ribossomo para outro. Apenas uma cadeia polipeptídica pode ser sintetizada por vez em um determinado ribossomo.

A terminação ocorre quando um dos três códons de terminação se move para o site A. Esses códons não são reconhecidos por nenhum tRNA. Não é unido pelo anticódon de nenhum complexo de tRNA de aminoácidos. Conseqüentemente, não pode haver mais adição de aminoácidos à cadeia polipeptídica e tímida. Em vez disso, eles são reconhecidos por proteínas chamadas fatores de liberação, nomeadamente RF1 (reconhecendo os códons de parada UAA e UAG) ou RF2 (reconhecendo os códons de parada UAA e UGA). Esses fatores desencadeiam a hidrólise da ligação éster no peptidil-tRNA e a re & shylease da proteína recém-sintetizada do ribossomo.

Um terceiro fator de liberação RF-3 cata e timidamente a liberação de RF-1 e RF-2 no final do processo de rescisão. A liberação é cata e tímida pela enzima peptidiltransferase, a mesma enzima que forma as ligações peptídicas. O ribossomo salta da cadeia de mRNA no códon de parada e se dissocia em suas duas subunidades. O polipeptídeo completo (cadeia de aminoácidos) fica livre no citoplasma. Os ribossomos e os tRNAs na liberação do mRNA podem funcionar novamente da mesma maneira e resultar na formação de outro polipeptídeo da mesma proteína.

B. Tradução Eucariótica de mRNA:

A iniciação da tradução em procariotos e eucariotos requer um tRNA iniciador específico, tRNA met, que é usado para incorporar o resíduo de metionina inicial em todas as proteínas, mas o tRNA met é específico para iniciação em eucariotos.

Fatores de iniciação eucariótica e suas funções:

As proteínas específicas não associadas ao ribossoma necessárias para uma iniciação translacional precisa são denominadas fatores de iniciação. Em E. coli, eles são chamados de Ifs, enquanto nos eucariotos eles são des & shinotados como elFs.

Numerosos elFs foram identificados conforme mostrado na Tabela 8.4:

A iniciação da tradução requer quatro etapas básicas específicas - O ribossomo deve se dissociar em suas subunidades & # 8217 405 e 605. Um complexo ternário, ou seja, o complexo de pré-iniciação, é formado envolvendo e evitando o iniciador, GTP, eIF-2 e a subunidade 405. O mRNA está ligado ao complexo de pré-iniciação. A subunidade 605 associa-se ao complexo de pré-iniciação para formar o complexo de iniciação 80S. Os fatores de iniciação eIF-1 e eIF-3 ligam-se à subunidade ribossomal 405, favorecendo a anti-associação à subunidade 605. A prevenção da reassociação de subunidades, portanto, permite que o complexo de pré-iniciação se forme (Fig. 8.18).

O primeiro passo na formação do complexo de pré-iniciação é a ligação do GTP ao elF-2 para formar um complexo binário. eIF-2 é composto por três subunidades, α, β e γ. O com & shyplex binário então se liga ao tRNA iniciador ativado, isto é, met-tRNA met formando um complexo ternário que então se liga à subunidade 40S formando o complexo de pré-iniciação 43S. O complexo de pré-iniciação é estabilizado por uma associação anterior de eIF-3 e eIF-1 à subunidade 40S. A estrutura cap de mRNAs eucarióticos é ligada por elFs específicos antes da associação com o complexo de pré-iniciação. A ligação do cap é realizada pelo fator de iniciação eIF-4F. Este fator é na verdade um complexo de 3 proteínas eIF-4E, A e G. A proteína eIF-4E é uma proteína de 24 kDa que reconhece fisicamente e se liga à estrutura cap. eIF-4A é uma proteína de 46 kDa que se liga e hidrolisa ATP e exibe atividade de RNA helicase. O desenrolamento da estrutura secundária do mRNA é necessário para permitir um acesso às subunidades ribossomais. eIF-4G auxilia na ligação do mRNA ao complexo de pré-iniciação 43 S.

Uma vez que o mRNA esteja devidamente alinhado ao complexo de pré-iniciação e o metRNA met iniciador é ligado ao códon AUG iniciador (um processo facilitado por eIF-1), a subunidade 60S se associa ao complexo. A associação da subunidade 60S requer a atividade de eIF-5, que já está ligada ao complexo de pré-iniciação. A energia necessária para provocar a formação do complexo de iniciação 80S a partir da hidrólise do GTP ligado ao eIF-2.

A forma vinculada ao PIB do eIF-2 então se liga ao eIF-2B, o que estimula a troca do GTP pelo PIB no eIF-2. Quando o GTP é trocado, o eIF-2B se dissocia do eIF-2. Isso é denominado como ciclo elF -2. Este ciclo é absolutamente necessário para que ocorra a iniciação translacional eucariótica. A reação de troca de GTP pode ser afetada pela fosforilação da subunidade a do eIF-2.

Neste estágio, o iniciador met-tRNA está ligado ao mRNA dentro de um local do local P do ribossomo. O outro local dentro do ribossomo ao qual os tRNAs carregados de entrada se ligam é o local A para o local do aminoácido. O ciclo de eIF-2 envolve a regeneração de eIF-2 ligado a GTP após a hidrólise de GTP durante a iniciação da tradução. Quando o complexo de pré-iniciação 405 está ligado ao ribossomo 60S para formar o complexo de iniciação 80S, o GTP ligado ao eIF-2 é hidrolisado, fornecendo energia para o processo de associação. A fim de evitar que rodadas adicionais de iniciação translacional ocorram, o PIB vinculado ao eIF-2 deve ser trocado por GTP. Esta é a função de eIF-2B, também chamada de fator de troca de nucleotídeo guanina (GEF).

O processo de alongamento também requer proteínas não ribossomais específicas. Em E. coli, estes são EFs e em eucariotos eEFs. O alongamento dos polipeptídeos ocorre de maneira cíclica, de modo que no final de uma rodada completa de adição de aminoácidos, o local A está disponível vazio e pronto para aceitar o aminoacil-tRNA de entrada, conforme ditado pelo próximo códon do mRNA. Isso significa que não apenas o aminoácido de entrada precisa ser anexado à cadeia do peptídeo, mas o ribossomo também deve se mover para baixo no mRNA para o próximo códon.

Cada aminoacil-tRNA de entrada é levado ao ribossomo por um complexo eEF-la-GTP. Quando o tRNA correto é registrado no sítio A, o GTP é hidrolisado e o complexo eEF-la-GDP se desassocia. Para eventos de translocação adicionais, o GDP deve ser trocado pelo GTP. Isso é realizado por eEF-lpy de forma semelhante à troca GTP que ocorre com eIF-2 catalisada por eIF-2B.

O peptídeo ligado ao tRNA no local P é transferido para o grupo amino no aminoacil-tRNA no local A. Esta reação é catalisada pela peptidiltransferase. Este processo e timidez é denominado transpeptidação. O peptídeo alongado agora reside em um tRNA no local A.

O local A precisa estar livre para aceitar o próximo aminoacil-tRNA (Fig. 8.19). O processo de mover o peptidil-tRNA do local A para o local P é denominado translocação. A translocação é catalisada por eEF-2 acoplado à hidrólise de GTP. No processo de transloca e shytion, o ribossomo é movido ao longo do mRNA de modo que o próximo códon do mRNA resida sob o sítio A. Após a translocação, o eEF-2 é liberado do ribossomo. O ciclo agora pode começar novamente. A capacidade do eEF-2 de realizar a translocação é regulada pelo estado de fosforilação da enzima, quando fosforilada a enzima é inibida. A fosforilação e a shilação de eEF-2 são catalisadas pela enzima eEF2 quinase (eEF2K).

Semelhante à iniciação e ao alongamento, a terminação da transiação requer fatores específicos de proteína identificados como fatores de liberação, RFs em E. coli e eRFs em eucariotos. Existe um eRFs em eucariotos. Os sinais de rescisão são os mesmos em procariotos e eucariotos. Esses sinais são códons de terminação presentes no mRNA. Existem 3 códons de terminação, UAG, UAA e UGA.

Em E. coli, os códons de terminação UAA e UAG são reconhecidos por RF-1, enquanto RF-2 reconhece os códons de terminação UAA e UGA. O eRF liga-se ao local A do ribo e tisomo em conjunto com o GTP. A ligação de eRF ao ribossomo estimula a atividade da peptidiltransferase para transferir o grupo peptidil para água em vez de um aminoacil-tRNA. O tRNA não carregado resultante deixado no local P é expelido com a hidrólise concomitante de GTP. O ribossomo inativo então libera seu mRNA e o complexo 80S se dissocia nas subunidades 40S e 60S, pronto para outra rodada de tradução.


Resumo

Os fatores de liberação RF1 e RF2 reconhecem os códons de parada presentes no sítio A do ribossomo e ativam a hidrólise do peptidil-tRNA para liberar a cadeia peptídica. As interações com RF3, uma GTPase dependente do ribossomo, então iniciam uma série de reações que aceleram a dissociação de RF1 ou RF2 e sua reciclagem entre os ribossomos. Duas regiões de Escherichia coli RF1 e RF2 foram identificados anteriormente como envolvidos no reconhecimento do códon de parada e na hidrólise do peptidil-tRNA. Mostramos aqui que a remoção do domínio N-terminal de RF1 ou RF2 ou a troca deste domínio entre os dois fatores não afeta a especificidade de RF, mas tem efeitos diferentes na atividade de RF1 e RF2: RF1 truncado permanece altamente ativo e capaz de suportar células rápidas crescimento, enquanto as células com RF2 truncado crescem apenas fracamente. O transplante de uma alça de 13 resíduos de aminoácidos de RF2 para RF1 muda a especificidade do códon de parada. A interação dos fatores truncados com RF3 no ribossomo é defeituosa: eles falham em estimular a troca de nucleotídeos guanina em RF3, a reciclagem não é estimulada por RF3 e RF3 sem nucleotídeos não consegue estabilizar a ligação de RF1 ou RF2 ao ribossomo. No entanto, o domínio N-terminal parece não ser necessário para a expulsão de RF1 ou RF2 por RF3: GTP.


Rescisão da tradução

O término da tradução ocorre quando um códon de parada ou códon sem sentido (UAA, UAG ou UGA) é encontrado. Ao se alinharem com o local A, esses códons de parada são reconhecidos por fatores de liberação em procariotos e eucariotos que instruem a peptidil transferase a adicionar uma molécula de água à extremidade carboxila do aminoácido do local P. Essa reação força o aminoácido do sítio P a se desprender de seu tRNA, e a proteína recém-produzida é liberada. As subunidades ribossômicas pequenas e grandes se dissociam do mRNA e umas das outras são recrutadas quase imediatamente para outro complexo de iniciação da tradução. Depois que muitos ribossomos completaram a tradução, o mRNA é degradado para que os nucleotídeos possam ser reutilizados em outra reação de transcrição.


Quais são as seis etapas da tradução em eucariotos

A tradução é executada em seis etapas: (i) ligação de mRNA ao ribossomo, (ii) aminoacilação, (iii) iniciação, (iv) alongamento, (v) terminação e (vi) modificação pós-tradução, (i) Ligação de mRNA para ribossomo

EU. ligação de mRNA ao ribossomo

Os ribossomos ocorrem no citoplasma em condição dissociada, ou seja, suas subunidades menores e maiores separadas. No procarioto, o fator de transcrição IF3 ajuda na dissociação das duas subunidades do ribossomo e então se liga à subunidade 30S para prevenir a associação prematura das duas subunidades. Primeiro, o mRNA se liga à subunidade menor. A subunidade menor tem dois sítios de ligação: um sítio ou sítio aminoacil e sítio P ou sítio peptidil.

O tRNA de entrada com seu aminoácido específico se liga ao local A e o peptidil tRNA que transporta o polipeptídeo de alongamento se liga ao local P. O ribossomo bacteriano contém outro sítio, o sítio E ou sítio de Saída ao qual o tRNA descarregado ou tRNA cujo peptidil já foi transferido se liga antes de sua liberação do ribossomo.

O mRNA procariótico tem uma sequência líder em seu início imediatamente antes do códon de iniciação AUG. Esta sequência é conhecida como Sequência Shine-Delgarno (região SD), que tem homologia com a extremidade 3 & # 8242 do rRNA 16S (região ASD) encontrada na subunidade 30S.

Esta complementaridade garante que a subunidade 30S se liga na posição correta do mRNA e o processo de tradução começa no início do mRNA. No eucarioto, a subunidade 40S entra na extremidade s & # 8217 limitada do mRNA e, em seguida, avança para o códon de início por varredura linear.

(ii) Aminoacilação

A aminoacilação ou ativação do aminoácido é a etapa em que todos os vinte aminoácidos estão ligados ao seu tRNA específico no citoplasma. Esta reação é catalisada pela enzima aminoacil-tRNA sythctasc.

Existem 20 tipos diferentes de sintetases para 20 aminoácidos diferentes. Os aminoácidos reconhecidos por duas ou mais moléculas de tRNA estão ligados pela mesma enzima. Na primeira etapa da aminoacilação, o complexo enzimático aminoacil adenilato ou aminoacil-AMP-Enzima é formado com a liberação de pirofosfato.

Amino aminoacil aminoacil adenilato

Sintetase de ácido e complexo de enzima # 8211

Na segunda etapa, este complexo fica associado à extremidade 3 & # 8242-OII (com a sequência CCA desemparelhada) da molécula de tRNA específica. O AMP agora é hidrolisado para formar uma ligação éster entre o aminoácido e seu tRNA específico, e a enzima também é liberada.

(iii) Iniciação

A síntese de proteínas começa na extremidade do terminal amino do polipeptídeo, prossegue pela adição de aminoácidos através da formação da ligação peptídica e termina na extremidade do terminal carboxila. Em procariotos, o aminoácido de iniciação é mctheoninc formilado, enquanto em cukaryotc é mcthconinc. Portanto, no procarioto, existem dois tipos de tRNA para o mctheoninc. Um é tRNAP & # 8221 ct para iniciação carregando formilmetonina e o outro é tRNA met para transportar mctheoninc normal para polipeptídeo em crescimento.

O início da síntese de polipeptídeos em procariotos requer o seguinte: 1.raRNA, 2. subunidade 30S do ribossomo, 3. formilmetheonil-tRNA (fmet-tRNAf & # 8221iet), 4. Fatores de iniciação IF-i, IF-2 e IF-3 , 5. GTP, 6. subunidade ribossômica 50S e 7. Mg + 2 a sequência de eventos que ocorre durante a iniciação são:

1. A subunidade 30S menor do ribossomo liga-se ao fator de transcrição IF-3 que impede a associação prematura das duas subunidades ribossômicas.

2. O mRNA se liga à subunidade 30S por meio da interação da região SD do mRNA e da região ASD do ribossomo, de modo que o códon de iniciação AUG esteja corretamente posicionado no local P do ribossomo.

3. O fMet-tRNAf * & # 8221 1 (o tRNA específico aminoacilado em formil metionina) se liga ao códon AUG no sítio P. O tRNAP & # 8221 * é o único tRNA que se liga ao seu códon presente no sítio P todos outro tRNA junto com seus respectivos aminoácidos ligam-se ao seu códon presente no local A.

É por isso que os códons AUG se apresentam como códigos de códons de iniciação para a formilmetionina e, quando presentes em outros códigos de posição, para a metionina normal. Pode-se lembrar que existem dois tipos de moléculas de tRNA que reconhecem o mesmo códon AUG, mas carregam duas formas diferentes de metionina.

4. O fator de iniciação IF-i liga-se ao local A e evita a ligação de qualquer outro aminoacil tRNA ao códon no local A durante a iniciação.

5. Agora, o IF-2 ligado ao GTP (GTP-IF-2) e o fMet-tRNAP 1 & # 8221 inicial unem-se ao complexo da subunidade 3oS-IF3-IFi-mRNA.

6. Em seguida, a subunidade 50S junta-se ao complexo formado na etapa anterior. O GTP ligado ao IF-2 é hidrolisado em GDP e Pi. Todos os três fatores de iniciação deixam 1 ribossomo. Este complexo de ribossomo 70S, mRNA e fMct-tRNAf Me: ligado ao códon de iniciação no local P é conhecido como complexo de iniciação.

(iv) alongamento

A etapa de alongamento envolve a adição de mais aminoácidos para que a cadeia polipeptídica cresça. Esta etapa requer o seguinte: 1. o complexo de iniciação, 2. diferentes aminoacil-tRNAs, 3 dois fatores de alongamento (EF-Tu e EF-Ts) e 4.GTP. O processo de alongamento ocorre em três etapas:

Etapa I - Ligação de aminoacil de entrada

O aminoacil-tRNA de entrada se liga a um complexo de EF-Tu-GTP para resultar em um complexo aminoacil-tRNA-Tu-GTP. Este complexo liga-se ao sítio A do complexo de iniciação 70S. Em seguida, o GTP é hidrolisado em GDP e Pi e o complexo EF-Tu-GDP é liberado do ribossomo. O complexo EF-Tu-GTP é regenerado e reciclado por EF-Ts e GTP da seguinte forma:

EF-Tu-PIB + EF-Ts = EF-Tu -Ts + PIB EF-Tu-Ts + GTP = EF-Tu-GTP + EF-Ts Etapa II- Formação de ligação peptídica Este é um processo catalítico durante o qual uma ligação peptídica é formado entre dois aminoácidos ligados por suas moléculas de t RNA ao sítio A e ao sítio P. Esta ligação peptídica é formada entre o carboxílico livre. Grupo do grupo X-formilmetionina ligado por seu tRNA ao local P e o segundo aminoácido ligado por seu tRNA ao local A. O grupo X-formil é transferido para o grupo amino do segundo aminoácido ligado ao seu tRNA no local A. Como resultado, o tRNA

At the A site contains a dipeptide and that at the P site becomes empty. The enzyme responsible for the peptide bond formation is peptidyl transferase. In bacteria the 23S rRNA a component of the 50S ribosomal subunit is thought to carry out peptidyl transferase function.

In this step the peptidyl tRNA bound to the A site comes to the P site of ribosome, the empty tRNA at P site comes to the E site and the A site is occupied by a new codon for the next incoming aminoacyl tRNA. This is accomplished by the movement of ribosome by one codon more in 5′ to 3′ direction of mRNA.

The translocation of ribosome requires EF-G (translocase) and GTP. The deacylated tRNA interacts with the E site mainly located on 50S subunit through its CCA sequence at the 3′-end. The two step transfer of tRNA molecules from A site to P site and from P site to E site could result from the reciprocating motions of the two subunits of ribosome.

This means that 50S and 30S subunits move alternately not simultaneously. Finally the deacylated (empty) tRNA is released to cytosol from the E site.

(v) Termination

Termination of the synthesis of polypeptide is brought about by the presence of any one of the three termination codons on the mRNA. These termination codons are recognized by any one of the three release factors/ termination factors, RFi, RF2 and RF3. RFi and RF2 resemble the structure of tRNA and compete with it for binding to any one of the termination codon at the A site of ribosome.

This phenomenon is known as molecular mimicry.RFi recognises UAG and RF2, UGA. Both recognize UAA. When the A site of the ribosome encounters a termination codon occupied by a release factor instead of an aminoacyl tRNA, elongation of polypeptide stops. At the P site one tRNA with the polypeptide chain is bound to another codon.

The release factor RF3 coupled with GTP splits the peptidyl-tRNA bond. The polypeptide is thus released and the discharged or empty last tRNA is also released from the P site. The ribosome dissociates into 50S and 30S subunits. In eukaryote only one release factor cRFI is known.

The.fundamental mechanism of elongation and termination in eukaryotc resemble with that of prokaryotc.

(vi) Post-translational modifications

The released polypeptide is modified in various ways. The enzyme dcformylasc removes the formyl group from the first amino acid methionine. Then, due to action of exo-amino-peptidase enzyme certain amino acids may be removed from the X- terminal end or C-terminal end or both.

The polypeptide chains singly or in association with other polypeptides fold properly to take a tertiary structure to become functional proteins. Inhibition of transcription and translation

Transcription is selectively inhibited by several antibiotics and drugs. Actinomycin D inhibits the elongation process by intercalating between successive G-C base pairs. Translation is also selectively inhibited by several drugs and antibiotics in prokaryotes. However, these inhibitors are relatively harmless in eukaryotes. Puromycin C is one such important inhibitor which structurally resembles 3′ end of aminoacyl tRNA So this can participate in peptide bond formation producing peptidyl-puromycin. It dissociates from the ribosome and thus terminates translation.


B. Translation - First Steps

1. Making Aminoacyl-tRNAs

Translation is perhaps the most energy-intensive job a cell must do, beginning with the attachment of amino acids to their tRNAs. The basic amino-acylation reaction is the same for all amino acids. A specific aminoacyl-tRNA synthase attaches each tRNA to (charges) an appropriate amino acid. Charging tRNAs requires ATP and proceeds in three steps (shown below).

In the first step, ATP and an appropriate amino acid bind to the aminoacyl-tRNA synthase. ATP is hydrolyzed releasing a pyrophosphate (PPi) and leaving an enzyme-AMP-amino acid complex. Next, the amino acid is transferred to the enzyme, releasing the AMP. Finally, the tRNA binds to the enzyme, the amino acid is transferred to the tRNA and the intact enzyme is regenerated and released. The charged tRNA is ready to use in translation.

Several studies had already established that polypeptides are synthesized from their amino (N-) terminal end to their carboxyl (C-) terminal end. When it became possible to determine the amino acid sequences of polypeptides, it turned out that around 40% of E. coli proteins had an N-terminal methionine, suggesting that tudo proteins began with a methionine. It also turned out that, even though there is only one codon for methionine, two different tRNAs for methionine could be isolated. One of the tRNAs was bound to a methionine modified by formylation, chamado formylmethionine-tRNAfmet(ou fmet-tRNAf for short). The other was methionine-tRNAconheceu (met-tRNAconheceu for short), charged with an unmodified methionine.

Methionine and formylated methionine are shown below.

tRNAconheceu e tRNAf each have an anticodon to AUG, the only codon for methionine, but have different base sequences encoded by different tRNA genes. tRNAconheceu is used to insert methionine in the middle of a polypeptide. tRNAf is the initiator tRNA, and is only used to start new polypeptides with formylmethionine. In prokaryotes, methionine on met-tRNAf is formylated at its amino group to make the fmet-tRNAf. The formylating enzyme that does this does not recognize methionine on met-tRNAconheceu.

No E. coli, a formylase enzyme removes the formyl group from all N-terminal formyl methionines at some point after translation has begun. As we noted, the methionine itself (and sometimes more N-terminal amino acids) are also removed from about 60% of E. coli polypeptides. Eukaryotes have inherited both the initiator tRNAf and the tRNAmet, using only met-tRNAf during initiation. However, methionine on the eukaryotic initiator met-tRNAf is never formylated in the first place. What&rsquos more, methionine is absent from virtually all mature eukaryotic polypeptides.

Early in evolution, the need for an initiator tRNA must have ensured a correct starting point for translation on an mRNA and therefore growth of a polypeptide from one end to the other, that is, from its N- to its C-terminus. At one time, formylation of the N-terminal methionine may have served to block accidental addition of amino acids or other modifications at the N-terminus of a polypeptide. Today, formylation seems to be a kind of molecular appendix in bacteria. Since then, evolution (in eukaryotes at least) has selected other features to replace actual formylation as the protector of the N-terminus of polypeptides.

2. Initiation

Now that we have charged the tRNAs, we can look more closely at the three steps of translation. Understanding translation initiation began with a molecular dissection of the components of E. coli cells required for cell-free (in vitro) protein synthesis, including cell fractionation, protein purification and reconstitution experiments. Initiation starts with when the Shine-Delgarno sequence forms Hbonds with a complementary sequence in the 16S rRNA bound to 30S ribosomal subunit. The Shine-Delgarno sequence is a short nucleotide sequence in the 5&rsquo região não traduzida (5&rsquo-UTR) of the messenger RNA, just upstream of the initiator AUG codon. This requires the participation of initiation factors IF1 e IF3. In this event, IF1 and IF3 as well as the mRNA are bound to the 30S ribosomal subunit (below).

Demonstration of the binding of an mRNA to a ribosomal subunit required isolation and separation of the 30S ribosomal subunit, an RNA fraction of the cell, and the purification of initiation factor proteins from the bacterial cells. This was followed by reconstitution (adding the separated fractions back together) in the correct order show that mRNA would only bind to the 30S subunit in the presence of the two specific initiation factor proteins.

Next, with the help of GTP and another initiation factor (IF2), the initiator fmettRNAf recognizes and binds to the AUG start codon found in all mRNAs. Some call the resulting structure (shown below) the Initiation Complex, which includes the 30S ribosomal subunit, Ifs 1, 2 and 3, and the fmet-tRNAf.

In the last step of initiation, the large ribosomal subunit binds to this complex. IFs 1, 2 and 3 disassociate from the ribosome and the initiator fmet-tRNA fmet ends up in the P site of the ribosome.

Some prefer to call the structure formed at this point the initiation complex (below).

Initiation can happen multiple times on a single mRNA, forming the polyribosome, or polysome described in Chapter 1. Each of the complexes formed above will engage in the elongation of a polypeptide described next.

3. Elongation

Elongation is a sequence of protein factor-mediated condensation reactions and ribosome movements along an mRNA. As you will see, polypeptide elongation requires a considerable input of free energy.

A) Elongation 1

The first step in elongation is the entry of the next aminoacyl-tRNA (aa2- tRNAaa2), which requires the free energy of GTP hydrolysis. The energy is supplied by the hydrolysis of GTP bound elongation factor 2 (EF2-GTP) The aa2-tRNAaa2 enters the ribosome based on codon-anticodon interaction at the UMA site as shown below.

The GDP dissociates from EF2 as aa2-tRNAaa2 binds the anticodon in the A site. To keep elongation moving along, elongation factor (EF3) rephosphorylates the GDP to GTP, which can re-associate with free EF2.

B) Elongation 2

Peptidyl transferase, a ribozyme component of the ribosome itself, links the incoming amino acid to a growing chain in a condensation reaction.

In this reaction, the fmet is transferred from the initiator tRNAf in the P site to aa2-tRNAaa2 in the A site, forming a peptide linkage with aa2.

C) Elongation 3

Translocase catalyzes GTP hydrolysis as the ribosome moves (translocates) along the mRNA. After translocation, the next mRNA codon shows up in the A site of the ribosome and the first tRNA (in this example, tRNAf) ends up on the E site of the ribosome.

The movement of the ribosome along the mRNA is illustrated below.

The tRNAf, no longer attached to an amino acid, will exit the E site as the next (3rd) aa-tRNA enters the empty A site, based on a specific codon-anticodon interaction (assisted by elongation factors and powered by GTP hydrolysis) to begin another cycle of elongation. Note that in each cycle of elongation, an ATP is consumed to attach each amino acid to its tRNA, and two GTPs are hydrolyzed in the cycle itself. In other words, at the cost of three NTPs, protein synthesis is the most expensive polymer synthesis reaction in cells!

As polypeptides elongate, they eventually emerge from a groove in the large ribosomal subunit. As noted, a formylase enzyme in E. coli cytoplasm removes the formyl group from the exposed initiation fmet from all growing polypeptides. While about 40% of E. coli polypeptides still begin with methionine, specific proteases catalyze the hydrolytic removal of the amino-terminal methionine (and sometimes even more amino acids) from the other 60% of polypeptides. The removal of the formyl group and one or more N-terminal amino acids from new polypeptides are examples of post-translational processing.

4. Termination

Translation of an mRNA by a ribosome ends when translocation exposes one of the three stop codons in the A site of the ribosome. Stop codons are not situated some distance from the 3&rsquo end of an mRNA. The region between a stop codon to the end of the mRNA is called the 3&rsquo untranslated region of the messenger RNA (3&rsquoUTR).

Since there is no aminoacyl-tRNA with an anticodon to the stop codons (UAA, UAG or UGA), the ribosome actually stalls and the translation slow-down is just long enough for a protein termination factor to enter the A site. This interaction causes release of the new polypeptide and the disassembly of the ribosomal subunits from the mRNA. The process requires energy from yet another GTP hydrolysis. After dissociation, ribosomal subunits can be reassembled with an mRNA for another round of protein synthesis. Translation termination is illustrated below.

We have seen some examples of post-translational processing (removal of formyl groups in E. coli, removal of the N-terminal methionine from most polypeptides, etc.) Most proteins, especially in eukaryotes, undergo one or more additional steps of posttranslational processing before becoming biologically active. We will see examples in upcoming chapters.

Let&rsquos conclude this chapter with a &ldquowe thought we knew everything&rdquo moment! A recent study reports that ribosomes can sometimes re-initiate translation in the 3&rsquo UTR of an mRNA using AUG codons upstream of the normal start codon of the mRNA. There is evidence that the resulting short polypeptides may be functional! Click here to read more: here.


How does GTP help in the step of codon recognition? - Biologia

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On the mRNA, the start site for translation is crucial. If translation were to begin one nucleotide before or after the start codon, every codon that follows in the mRNA will be misread, synthesizing a non-functional sequence of amino acids.

Translation begins with the codon AUG, and an initiator tRNA that carries the amino acid Methionine or, the chemically modified formylmethionine in bacteria. 

The initiator tRNA also contains conserved nucleotides that are recognized by proteins called eukaryotic initiation factors, or eIFs. 

Together with eIF2 and GTP, the initiator tRNA binds the P site of the small ribosomal subunit forming the eukaryotic pre-initiation complex.

This complex recognizes the mRNA by interacting with initiation factors eIF4E bound to the 5’ cap, and eIF4G bound to the poly(A) tail-binding proteins.

Powered by ATP hydrolysis, the complex then moves from 5ʹ to 3ʹ direction, with the tRNA anticodon searching for the first AUG sequence on the mRNA.

Upon codon-anticodon recognition, GTP is hydrolyzed and the initiation factors dissociate, allowing the large ribosomal subunit to join the complex and form an intact ribosome.

Now, a new tRNA, carrying the second amino acid, can bind to the A-site on the ribosome and protein synthesis can begin.

In bacteria, mRNAs do not have 5’ caps to initiate translation. 

Instead, each bacterial mRNA contains a leader sequence upstream of the first AUG codon, called the Shine-Dalgarno sequence.

This consensus AGGAGGU sequence serves as the ribosomal binding site by base pairing with a complementary sequence on the 16S rRNA of the small ribosomal subunit. 

Now, the 50S ribosomal subunit can bind to the initiation complex, with the complete ribosome ready to begin translation.

9.5: Initiation of Translation

Initiating translation is complex because it involves multiple molecules. Initiator tRNA, ribosomal subunits, and eukaryotic initiation factors (eIFs) are all required to assemble on the initiation codon of mRNA. This process consists of several steps that are mediated by different eIFs.

First, the initiator tRNA must be selected from the pool of elongator tRNAs by eukaryotic initiation factor 2 (eIF2). The initiator tRNA (Met-tRNAi) has conserved sequence elements including modified bases at specific positions. This makes Met-tRNAi different from other

tRNAs carrying Methionine.

Next, the eIF2/GTP/Met-tRNAi ternary complex and other eIFs bind to the small ribosomal subunit to form a 43S preinitiation complex. Before the preinitiation complex binds the mRNA, to make sure that a correctly processed mRNA is translated, the cell uses initial recognition of the 5’ cap of the mRNA by the eIF4E subunit of eIF4F.

Most eukaryotic mRNAs are monocistronic, that is, they encode only a single protein. Once the preinitiation complex is bound to the mRNA, the complex moves forward to search for the first AUG triplet, which is usually 50� nucleotides downstream of the 5′-terminal cap.

During this scan, the nucleotides adjacent to the start codon affect the efficiency of codon recognition. If the recognition site is substantially different from the consensus recognition sequence (5ʹ-ACCAUGG-3ʹ), the preinitiation complex may skip over the first AUG triplet in the mRNA and continue scanning to the next AUG. This phenomenon is known as “leaky scanning.” Several viruses, such as the human papillomavirus, use leaky scanning as the predominant mechanism during translation. Other cells also frequently use this to produce multiple proteins from the same mRNA molecule.

Bacterial ribosomes can assemble directly on a start codon that lies several nucleotides downstream of the Shine-Dalgarno sequence. So, a single molecule of bacterial mRNA can code for several different proteins, which makes bacterial mRNAs polycistronic.


Resumo

GTP hydrolysis by elongation factor Tu (EF-Tu) on the ribosome is induced by codon recognition. The mechanism by which a signal is transmitted from the site of codon−anticodon interaction in the decoding center of the 30S ribosomal subunit to the site of EF-Tu binding on the 50S subunit is not known. Here we examine the role of the tRNA in this process. We have used two RNA fragments, one which contains the anticodon and D hairpin domains (ACD oligomer) derived from tRNA Phe and the second which comprises the acceptor stem and T hairpin domains derived from tRNA Ala (AST oligomer) that aminoacylates with alanine and forms a ternary complex with EF-Tu·GTP. While the ACD oligomer and the ternary complex containing the Ala-AST oligomer interact with the 30S and 50S A site, respectively, no rapid GTP hydrolysis was observed when both were bound simultaneously. The presence of paromomycin, an aminoglycoside antibiotic that binds to the decoding site and stabilizes codon−anticodon interaction in unfavorable coding situations, did not increase the rate of GTP hydrolysis. These results suggest that codon recognition as such is not sufficient for GTPase activation and that an intact tRNA molecule is required for transmitting the signal created by codon recognition to EF-Tu.

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Wi 626/11-2), the Alfried Krupp von Bohlen und Halbach-Stiftung, and the Fonds der Chemischen Industrie. T.P. acknowledges a fellowship of the Werner Richard-Dr. Carl Dörken-Stiftung.

Present address: Abteilung Molekulare Entwicklungsbiologie, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, 37077 Göttingen, Germany.

Present address: Department of Biochemistry, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London SW7 2AY, U.K.

Correspondence should be addressed to this author at the Institute of Molecular Biology, University of Witten/Herdecke, 58448 Witten, Germany. Phone: +49 2302 669 119 Fax: +49 2302 669 117 E-mail: [email protected]


Stalling of the ribosome by SecM

Similar to TnaC described above, the peptide SecM exists solely to stall the ribosome synthesizing it. But unlike TnaC, which also requires the presence of high levels of trytophan, SecM has an intrinsic stalling capability. Stalling of the ribosome synthesizing SecM provides time for a downstream RNA helix on the same mRNA strand to unwind. Unwinding of this helix then allows for a new ribosome to bind and synthesize a new protein, SecA, a bacterial ATP-driven translocase that aids the passage of nascent proteins across membranes in conjunction with SecY (see also Dynamics of Protein Translocation). When sufficient levels of SecA have been reached, SecA interacts with the SecM-stalled ribosome to pull on SecM, freeing it and allowing translation to resume (illustrated schematically in Fig. 13). SecM, which serves no other purpose than to stall the ribosome, is released into the cell and degraded.

Much of what is known about SecM stalling comes from biochemical experiments, in which every amino acid in SecM's sequence has been mutated and the resulting effects measured. These experiments revealed few residues as critical, although one stands out in every species as invariable: arginine 163 (R163, see Fig. 13 below). However, until recently, little was known about the precise mechanisms at work. A cryo-EM map of a SecM-stalled ribosome revealed a shifted linkage in the PTC between the P-site tRNA and the SecM peptide. Although the shift was only 0.2 nm, it was hypothesized to be sufficient to inhibit peptide-bond formation, preventing synthesis of the remainder of SecM.

In order to elucidate precisely how SecM stalls the ribosome, we first applied MDFF to the cryo-EM map of the SecM-stalled ribosome to develop an atomic model of the complex. Next, we carried out extensive simulations of this wild-type model along with mutants of both the ribosome and SecM known to disrupt stalling. We discovered a putative communication pathway between the critical R163 and the PTC that causes the observed shifted linkage the pathway is shown schematically in Fig. 13. Finally, through steered MD simulations in which we pulled on the N-terminal end of SecM outside the ribosome, we determined that the pulling action of SecA can break the crucial interactions identified in our previous simulations and, thus, alleviate stalling.

Fig. 13. (left) Structure of the SecM-stalled ribosome determined with MDFF. SecA is shown for visualization purposes only. (middle) Atomic-scale view of SecM in the ribosome's exit tunnel, near the PTC at the top. Residues involved in ribosome-SecM interactions are labeled. (right) Schematic of the communication pathway connecting SecM to the ribosome's PTC.


15.4 RNA Processing in Eukaryotes

Nesta seção, você explorará as seguintes questões:

  • What are the steps in eukaryotic transcription?
  • What are the structural and functional similarities and differences among the three RNA polymerases?

Conexão para Cursos AP ®

Scientists discovered a strand of mRNA translated into a sequence of amino acids (polypeptide) shorter than the mRNA molecule transcribed from DNA. Before the information in eukaryotic mRNA is translated into protein, it is modified or edited in several ways. A 5′ methylguanosine (or GTP) cap and a 3′ poly-A tail are added to protect mature mRNA from degradation and allow its export from the nucleus. Pre-mRNAs also undergo splicing, in which introns are removed and exons are reconnected. Exons can be reconnected in different sequences, a phenomenon referred to as alternative gene splicing, which allows a single eukaryotic gene to code for different proteins. (We will explore the significance of alternative gene splicing in more detail in other chapters.)

Information presented and the examples highlighted in the section support concepts outlined in Big Idea 3 of the AP ® Biology Curriculum Framework. The Learning Objectives listed in the Curriculum Framework provide a transparent foundation for the AP ® Biology course, an inquiry-based laboratory experience, instructional activities, and AP ® Exam questions. A Learning Objective merges required content with one or more of the seven Science Practices.

Grande Ideia 3 Os sistemas vivos armazenam, recuperam, transmitem e respondem às informações essenciais aos processos vitais.
Compreensão Duradoura 3.A As informações herdáveis ​​proporcionam a continuidade da vida.
Conhecimento Essencial 3.A.1 O DNA e, em alguns casos, o RNA, é a fonte primária de informações hereditárias.
Prática de Ciências 6.5 The student can evaluate alternative scientific explanations.
Objetivo do aprendizado 3.1 The student is able to construct scientific explanations that use the structures and mechanisms of DNA and RNA to support the claim that DNA and, in some cases, that RNA are the primary sources of heritable information.

Teacher Support

Have students work in groups of 4–5 and ask them to prepare models of RNA molecules undergoing processing. Supply scissors, glue, large sheets of white paper, and colored construction paper to differentiate the components of RNA molecules, exons and introns, and the other molecules such as transcription factors and enzymes associated with the process. Emphasize the importance of the order of the steps. Ask students to specify whether these steps happen in the nucleus or in the cytoplasm.

Ask students which mRNAs would they expect to be stable and which mRNAs should have short half-lives. Proteins that control growth and cell cycles are associated with short-lived RNAs. The globin mRNAs which encode the protein parts of hemoglobin are unusually stable. Synthesis of globin continues in red blood cells without the nucleus being present.

Explain that introns and exons vary in number and length. Mention that not all exons will be included in the final polypeptide and that there is alternative splicing which allows cells to produce different proteins using the same gene.

After transcription, eukaryotic pre-mRNAs must undergo several processing steps before they can be translated. Eukaryotic (and prokaryotic) tRNAs and rRNAs also undergo processing before they can function as components in the protein synthesis machinery.

MRNA Processing

The eukaryotic pre-mRNA undergoes extensive processing before it is ready to be translated. The additional steps involved in eukaryotic mRNA maturation create a molecule with a much longer half-life than a prokaryotic mRNA. Eukaryotic mRNAs last for several hours, whereas the typical E. coli mRNA lasts no more than five seconds.

Pre-mRNAs are first coated in RNA-stabilizing proteins these protect the pre-mRNA from degradation while it is processed and exported out of the nucleus. The three most important steps of pre-mRNA processing are the addition of stabilizing and signaling factors at the 5' and 3' ends of the molecule, and the removal of intervening sequences that do not specify the appropriate amino acids. In rare cases, the mRNA transcript can be “edited” after it is transcribed.

Conexão de evolução

RNA Editing in Trypanosomes

The trypanosomes are a group of protozoa that include the pathogen Trypanosoma brucei, which causes sleeping sickness in humans (Figure 15.13). Trypanosomes, and virtually all other eukaryotes, have organelles called mitochondria that supply the cell with chemical energy. Mitochondria are organelles that express their own DNA and are believed to be the remnants of a symbiotic relationship between a eukaryote and an engulfed prokaryote. The mitochondrial DNA of trypanosomes exhibit an interesting exception to The Central Dogma: their pre-mRNAs do not have the correct information to specify a functional protein. Usually, this is because the mRNA is missing several U nucleotides. The cell performs an additional RNA processing step called RNA editing to remedy this.

Other genes in the mitochondrial genome encode 40- to 80-nucleotide guide RNAs. One or more of these molecules interacts by complementary base pairing with some of the nucleotides in the pre-mRNA transcript. However, the guide RNA has more A nucleotides than the pre-mRNA has U nucleotides to bind with. In these regions, the guide RNA loops out. The 3' ends of guide RNAs have a long poly-U tail, and these U bases are inserted in regions of the pre-mRNA transcript at which the guide RNAs are looped. This process is entirely mediated by RNA molecules. That is, guide RNAs—rather than proteins—serve as the catalysts in RNA editing.

RNA editing is not just a phenomenon of trypanosomes. In the mitochondria of some plants, almost all pre-mRNAs are edited. RNA editing has also been identified in mammals such as rats, rabbits, and even humans. What could be the evolutionary reason for this additional step in pre-mRNA processing? One possibility is that the mitochondria, being remnants of ancient prokaryotes, have an equally ancient RNA-based method for regulating gene expression. In support of this hypothesis, edits made to pre-mRNAs differ depending on cellular conditions. Although speculative, the process of RNA editing may be a holdover from a primordial time when RNA molecules, instead of proteins, were responsible for catalyzing reactions.

  1. mRNA editing changes the coding sequence of the mRNA, but mRNA processing does not.
  2. mRNA editing splices out noncoding RNA, but mRNA processing does not.
  3. mRNA editing adds a cap of 5’-methylguanosine to the mRNA, but mRNA processing does not.
  4. mRNA editing adds a 3’ poly-A tail, but mRNA processing does not.

5' Capping

While the pre-mRNA is still being synthesized, a 7-methylguanosine cap is added to the 5' end of the growing transcript by a phosphate linkage. This moiety (functional group) protects the nascent mRNA from degradation. In addition, factors involved in protein synthesis recognize the cap to help initiate translation by ribosomes.

3' Poly-A Tail

Once elongation is complete, the pre-mRNA is cleaved by an endonuclease between an AAUAAA consensus sequence and a GU-rich sequence, leaving the AAUAAA sequence on the pre-mRNA. An enzyme called poly-A polymerase then adds a string of approximately 200 A residues, called the poly-A tail . This modification further protects the pre-mRNA from degradation and signals the export of the cellular factors that the transcript needs to the cytoplasm.

Pre-mRNA Splicing

Eukaryotic genes are composed of exons , which correspond to protein-coding sequences (ex-on signifies that they are expressed), and intervening sequences called introns (int-ron denotes their intervening role), which may be involved in gene regulation but are removed from the pre-mRNA during processing. Intron sequences in mRNA do not encode functional proteins.

The discovery of introns came as a surprise to researchers in the 1970s who expected that pre-mRNAs would specify protein sequences without further processing, as they had observed in prokaryotes. The genes of higher eukaryotes very often contain one or more introns. These regions may correspond to regulatory sequences however, the biological significance of having many introns or having very long introns in a gene is unclear. It is possible that introns slow down gene expression because it takes longer to transcribe pre-mRNAs with lots of introns. Alternatively, introns may be nonfunctional sequence remnants left over from the fusion of ancient genes throughout evolution. This is supported by the fact that separate exons often encode separate protein subunits or domains. For the most part, the sequences of introns can be mutated without ultimately affecting the protein product.

All of a pre-mRNA’s introns must be completely and precisely removed before protein synthesis. If the process errs by even a single nucleotide, the reading frame of the rejoined exons would shift, and the resulting protein would be dysfunctional. The process of removing introns and reconnecting exons is called splicing (Figure 15.14). Introns are removed and degraded while the pre-mRNA is still in the nucleus. Splicing occurs by a sequence-specific mechanism that ensures introns will be removed and exons rejoined with the accuracy and precision of a single nucleotide. The splicing of pre-mRNAs is conducted by complexes of proteins and RNA molecules called spliceosomes.

Conexão Visual

  1. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites.
  2. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an exon, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites.
  3. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also delete existing spliceosome recognition sites.
  4. Mutations at the each end of intron and exon, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites and delete existing sites.

Note that more than 70 individual introns can be present, and each has to undergo the process of splicing—in addition to 5' capping and the addition of a poly-A tail—just to generate a single, translatable mRNA molecule.

Link para aprendizagem

See how introns are removed during RNA splicing at this website.

  1. Helper proteins attach themselves to the ends of introns so that they can be spliced out during RNA splicing and coded areas are spliced together to form mRNA which then codes for the final protein.
  2. Helper proteins attach themselves to the ends of exons so that they can be spliced out during RNA splicing and coded areas are spliced together to form mRNA which encodes the final protein.
  3. Helper proteins attach themselves to mRNA in order to remove the non-coded areas and thus form the pre-mRNA which codes for the final protein.
  4. Helper proteins help the pre-mRNA to recruit various other components which splice out the non-coded regions and form mRNA which codes for the final protein.

Processing of tRNAs and rRNAs

The tRNAs and rRNAs are structural molecules that have roles in protein synthesis however, these RNAs are not themselves translated. Pre-rRNAs are transcribed, processed, and assembled into ribosomes in the nucleolus. Pre-tRNAs are transcribed and processed in the nucleus and then released into the cytoplasm where they are linked to free amino acids for protein synthesis.

Most of the tRNAs and rRNAs in eukaryotes and prokaryotes are first transcribed as a long precursor molecule that spans multiple rRNAs or tRNAs. Enzymes then cleave the precursors into subunits corresponding to each structural RNA. Some of the bases of pre-rRNAs are methylated that is, a –CH3 moiety (methyl functional group) is added for stability. Pre-tRNA molecules also undergo methylation. As with pre-mRNAs, subunit excision occurs in eukaryotic pre-RNAs destined to become tRNAs or rRNAs.

Mature rRNAs make up approximately 50 percent of each ribosome. Some of a ribosome’s RNA molecules are purely structural, whereas others have catalytic or binding activities. Mature tRNAs take on a three-dimensional structure through intramolecular hydrogen bonding to position the amino acid binding site at one end and the anticodon at the other end (Figure 15.15). The anticodon is a three-nucleotide sequence in a tRNA that interacts with an mRNA codon through complementary base pairing.

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    • Authors: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Editor / site: OpenStax
    • Book title: Biology for AP® Courses
    • Publication date: Mar 8, 2018
    • Local: Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/15-4-rna-processing-in-eukaryotes

    © Jan 12, 2021 OpenStax. O conteúdo do livro didático produzido pela OpenStax é licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution License 4.0. O nome OpenStax, logotipo OpenStax, capas de livro OpenStax, nome OpenStax CNX e logotipo OpenStax CNX não estão sujeitos à licença Creative Commons e não podem ser reproduzidos sem o consentimento prévio e expresso por escrito da Rice University.


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