Em formação

O que são células nulas?


Meu livro de histologia diz o seguinte:

A célula-tronco hemopoiética pluripotencial (que se assemelha a um linfócito) é um membro da população de células nulas de linfócitos.

Em seguida, acrescenta:

Existem três tipos de linfócitos:

  • Células T
  • Células B
  • Células nulas:
    • Células-tronco hemopoiéticas pluripotenciais
    • Células assassinas naturais

No entanto, este é o único texto que encontro que classifica as células-tronco hemopoiéticas pluripotenciais como células nulas. Minha pergunta é: o que são células nulas? (e este livro está correto)

Obrigado jsx


Células nulas são um "termo de gíria" para células da progênie de linfócitos que não são APC (células apresentadoras de antígenos) e não têm receptores de células T e B - portanto, elas são as células assassinas naturais (NK).


Perfil senescente de células T angiogênicas de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico

O ambiente inflamatório crônico associado ao lúpus eritematoso sistêmico pode levar a uma imunossenescência acelerada responsável pelo dano endotelial e aumento do risco cardiovascular observado nesses pacientes. O presente estudo analisou duas populações com efeitos opostos no endotélio vascular, células T angiogênicas e o subconjunto nulo de CD4 + CD28 senescente, em 84 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e 46 controles saudáveis. Além disso, 48 pacientes com artrite reumatóide e 72 indivíduos com fatores de risco cardiovascular tradicionais participaram como controles da doença. A caracterização fenotípica de células nulas CD28 + e CD28 foi realizada por meio da análise de marcadores de senescência (CCR7, CD27, CD57) e citotoxicidade (CD56, perforina, granzima B, IFN-γ). Os níveis séricos de IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17A, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, estimulador de linfócitos B e GM-CSF foram analisados ​​em níveis séricos sistêmicos pacientes com lúpus eritematoso e controles saudáveis. As células nulas CD4 + CD28 aumentaram notavelmente nos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e nos controles da doença em comparação com os controles saudáveis. Em contraste, as células T angiogênicas foram reduzidas apenas nos controles da doença (aqueles com artrite reumatóide ou fatores de risco cardiovascular tradicionais). No entanto, uma presença anômala de células T CD28 nulo -angiogênicas, com características citotóxicas e senescentes, foi observada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico em associação com título de anti-dsDNA, anticorpos anti-SSA / Ro e TNF-α circulante, IL-8, Quantidades de IFN-α e estimulador de linfócitos B. Este subconjunto também foi detectado em pacientes com fatores de risco cardiovascular tradicionais, mas não em pacientes com artrite reumatóide. Em contraste, as células T CD28 + -angiogênicas foram reduzidas em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico com distúrbios cardiovasculares. Em conclusão, a expressão de CD28 deve ser usada para redefinir a população de células T angiogênicas, porque em condições patológicas, um subconjunto de células T CD28 nulas -angiogênicas senescentes com efeitos inflamatórios, em vez de protetores, pode estar presente.

Abreviações


SINOPSE

  • A integração da transcriptômica espacial com os dados de referência de scRNAseq leva a um mapeamento de segmentação de células de alta resolução e anotação de tipo de célula.
  • JSTA identifica a distribuição espacial não aleatória de (sub) tipos de células para várias regiões do cérebro.
  • JSTA revela genes expressos espacialmente diferencialmente dentro de (sub) tipos de células.

RESULTADOS

OMA1 e YME1L modulam diferencialmente a atividade de fusão OPA1

Considerando que humano OPA1 tem oito variantes de splice de mRNA diferentes (Figura Suplementar S1A), tecidos de camundongo expressam apenas quatro - isoformas 1, 5, 7 e 8 (Akepati et al., 2008) (Figura 1A). Cada uma das isoformas 1 e 7 produz uma mistura de l-OPA1 e uma ou duas versões de s-OPA1, respectivamente. As isoformas curtas são produzidas por clivagem proteolítica da isoforma longa pelas proteases da membrana interna mitocondrial OMA1 (no local S1) e YME1L (no local S2). Em contraste, o processamento proteolítico das isoformas 5 e 8 vai para a conclusão e resulta em apenas isoformas curtas (Song et al., 2007).

FIGURA 1: OMA1 e YME1L regulam diferencialmente a atividade de fusão OPA1. (A) Esquema das isoformas da proteína OPA1 de camundongo, mostrando a origem das bandas de proteína umae. MEFs expressam as isoformas 1, 5, 7 e 8. As isoformas 1 e 7 produzem formas longas que constituem bandas uma e b e formas curtas que constituem bandas ce. As isoformas 5 e 8 produzem exclusivamente formas curtas que devem comigrar com bandas ce, mas para simplificar, bandas ce são marcados de acordo com sua origem nas isoformas 1 e 7. Os locais de clivagem MPP (peptidase de processamento mitocondrial), S1 (por OMA1) e S2 (por YME1L) são indicados com setas. A linha laranja e as setas mostram que as bandas c e d são derivados da isoforma longa 7 /uma, e a linha rosa e a seta mostram essa faixa e é derivado da isoforma longa 1 /b. (B) Análise de Western blot de bandas OPA1 em Oma1 e Yme1l MEFs mutantes. Cinco bandas OPA1 (umae) são aparentes em MEFs de tipo selvagem. Oma1- falta de MEFs nulos c e e Yme1l- falta de MEFs nulos d e Oma1 / Yme1l- MEFs nulos não possuem todas as formas abreviadas, ce. A tubulina foi usada como controle de carregamento. (C) Imagens representativas da morfologia mitocondrial (mito-DsRed) em WT e MEFs nulos de protease em diferentes meios. GLY: meio de alta glicose OXI: meio indutor de OXPHOS CHX: meio de alta glicose com 10 μM de cicloheximida. As inserções mostram a visualização ampliada. Barra de escala, 5 μm. (D) Quantificação da morfologia mitocondrial das células em C. Em cada experiência, 100 células foram pontuadas. As barras de erro mostram o SD de três experimentos independentes. (E) Comparação das taxas de fusão mitocondrial in vivo em diferentes meios de comunicação entre WT e Oma1 / Yme1l-null MEFs. A atividade de fusão foi medida pela redução da intensidade de PA-GFP em função do tempo. Barras de erro representam SDs de pelo menos seis medições independentes.

Em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), este grupo de quatro isoformas de mRNA dá origem a cinco bandas de proteínas quando os lisados ​​celulares são resolvidos em SDS-PAGE (rotulado umae na Figura 1, A e B). Bandas uma e b são as formas longas decorrentes da isoforma 7 e da isoforma 1, respectivamente (Figura 1A). Bandas c e d são produtos de clivagem S1 e S2 da isoforma 7 gerados por OMA1 e YME1L, respectivamente. Banda e é a forma curta clivada em S1 da isoforma 1. As isoformas 5 e 8 geram apenas isoformas curtas que poderiam contribuir para as bandas ce (Canção et al., 2007). O mesmo conjunto de bandas OPA1 foi observado em outros estudos, embora as intensidades relativas possam variar, talvez devido a diferenças nas condições de cultura (Anand et al., 2014).

As dependências das bandas ce nas proteases OMA1 ou YME1L foram confirmadas pelo padrão de banda OPA1 em lisados ​​de Oma1-null ou Yme1L- células nulas (Figura 1B). Os padrões de banda OPA1 observados nas células mutantes de protease são tabulados na Figura Suplementar S1B. As identidades do Oma1-null e Yme1Lcélulas nulas foram confirmadas por Western blotting contra as proteases relevantes (Figura Suplementar S1C). Notavelmente, há uma banda mais longa emergindo em ambos Yme1l-null e Yme1l / Oma1- células nulas, provavelmente devido à interrupção da formação de isoforma curta dependente de YME1L (isto é, isoforma 8).

Para entender o papel dessas proteases na regulação da função fusogênica OPA1, examinamos Oma1 / Yme1l MEFs de nocaute duplo, que contêm apenas formas longas de OPA1 (Anand et al., 2014). No meio de cultura padrão com alto teor de glicose, essas células mostram fragmentação mitocondrial aumentada em comparação com as células do tipo selvagem (WT) (Figura 1, C e D). Muitos Oma1 / Yme1l células mutantes, no entanto, mostram mitocôndrias tubulares curtas (Figura 1D), de modo que o grau de fragmentação mitocondrial é substancialmente menos grave do que em Mfn1 / Mfn2-null ou Opa1- células nulas (Chen et al., 2005, 2007). Oma1- MEFs nulos mostram perfis de morfologia mitocondrial normais, e Yme1l-null MEFs mostram mitocôndrias altamente fragmentadas (Figura 1D). As tendências gerais - que as mitocôndrias em Oma1 / Yme1l células mutantes são mais fragmentadas do que em células WT, mas menos do que em Yme1l células mutantes - são consistentes com um estudo anterior (Anand et al., 2014). Os padrões de banda OPA1 são semelhantes nas diferentes condições de mídia (Figura Suplementar S1D).

Testamos como essas células mutantes respondem às condições de cultura que aumentam o nível de fusão mitocondrial. MEFs cultivados aumentam a atividade de fusão mitocondrial e mostram alongamento mitocondrial quando cultivados em meio que induz fosforilação oxidativa (OXPHOS). Esta resposta demonstrou depender da atividade YME1L (Mishra et al., 2014). Consistente com essa ideia, descobrimos que o alongamento mitocondrial causado pelo meio indutor de OXPHOS foi anulado em Yme1l-null e Oma1 / Yme1l- MEFs nulos (Figura 1, C e D). Conforme medido no ensaio de fusão fotoativável (PA) - proteína fluorescente verde (GFP), a fusão mitocondrial sob condições basais foi substancialmente reduzida em Oma1 / Yme1- MEFs nulos em comparação com as células WT e não aumentaram em resposta ao meio indutor de OXPHOS (Figura 1E). Em contraste, as células de todos os genótipos testados neste estudo mostram um alongamento mitocondrial robusto em resposta ao tratamento com cicloheximida (CHX), que causa hiperfusão mitocondrial induzida por estresse (Tondera et al., 2009) (Figura 1, C – E). A hiperfusão é induzida rapidamente após a adição de CHX (Figura 1E). O tratamento com CHX melhorou a diluição do sinal PA-GFP em ambos WT e Oma1 / Yme1l-células nulas. As células WT mostraram uma taxa de fusão substancialmente maior do que as últimas, indicando a capacidade de fusão reduzida em Oma1 / Yme1l- células nulas, mesmo na presença de um forte estímulo de fusão. Juntas, nossas observações concordam com a descoberta anterior de que Oma1/Yme1l- células nulas, contendo apenas l-OPA1, retêm a atividade de fusão mitocondrial (Anand et al., 2014). No entanto, o nível de atividade de fusão é substancialmente menor em comparação com as células WT. As proteases OMA1 e YME1L regulam diferencialmente a função OPA1. A hiperfusão induzida por estresse não depende de nenhuma protease, consistente com o relatório de que l-OPA1 é suficiente para mediar a fusão sob esta condição de estresse (Tondera et al., 2009). Em contraste, o alongamento mitocondrial induzido por OXPHOS é dependente da atividade de YME1L, conforme observado anteriormente (Mishra et al., 2014).

O Opa1 O sítio S2 é necessário para mediar a fusão induzida por OXPHOS in vivo

Para esclarecer as funções da clivagem dependente de YME1L de OPA1, usamos o direcionamento de gene mediado por CRISPR-Cas9 em MEFs para gerar mutações no Opa1 locus genômico no exon 5b, que codifica o local de clivagem S2 (Figura 2, A e B). Esperávamos gerar deleções no exon 5b que interromperiam o Opa1 quadro de leitura, resultando em um códon de parada prematuro a jusante que impediria a formação de isoformas OPA1 funcionais contendo S2. Neste cenário, seria esperado que as células mutantes tivessem apenas a isoforma 1 longa (banda b) e o produto de clivagem S1 correspondente (banda e) Bandas uma, c, e d estaria faltando, porque eles surgem de transcritos contendo o exon 5b (Figura 2B).

FIGURA 2: O site S2 codificado por Opa1 O exão 5b é necessário para a fusão induzida por OXPHOS in vivo. (A) Esquema do exon 5b, mostrando as localizações de S2 e do alvo de gRNA CRISPR-Cas9. Deleções presentes nos clones 1 e 2 são indicadas. (B) Esquema da composição da isoforma OPA1 após a eliminação das isoformas contendo o exon 5b. Os Xs vermelhos indicam que se espera que as isoformas estejam ausentes nas células mutantes. (C) Análise de Western blot de ∆exon 5b Clones MEF. Os clones 1 e 2 são clones positivos que mostram o desaparecimento esperado de bandas uma, c, e d. A última pista é um clone negativo. A tubulina foi usada como controle de carregamento. (D) Quantificação da morfologia mitocondrial em WT e dois ∆exon 5b clones nos meios indicados. Cem células foram contadas para cada experimento. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes.

Após a expressão transitória de Cas9 e gRNA (RNA guia) contra o exon 5b alvo em MEFs, identificamos várias colônias sem bandas uma, c, e d (Figura 2C). Para evitar efeitos específicos do clone, usamos três ou mais ∆exon 5b clones em todos os nossos experimentos e os resultados de dois clones diferentes são mostrados nas figuras. O sequenciamento de DNA mostrou que o clone 1 tem uma deleção de dois nucleotídeos homozigótica e o clone 2 tem duas deleções mais longas, cada uma causando deslocamento de quadro (Figura 2A).

o ∆exon 5b as células mostraram perfis mitocondriais normais quando cultivadas em meio contendo glicose regular. Além disso, eles mostraram uma resposta de hiperfusão induzida por estresse normal, alongando dramaticamente as mitocôndrias após a estimulação de CHX (Figura 2D e Figura Suplementar S2A). No meio indutor de OXPHOS, no entanto, as células mutantes não mostraram qualquer alongamento das mitocôndrias em comparação com o crescimento no meio de controle, indicando que a clivagem S2 de Opa1 é necessária para a hiperfusão induzida por OXPHOS. Embora o meio indutor de OXPHOS não promova o alongamento mitocondrial em ∆exon 5b células, não detectamos consequências fisiológicas. O meio indutor de OXPHOS causou a regulação positiva do consumo de oxigênio nessas células (Figura Suplementar S2B), indicando que o aumento da função respiratória não depende do alongamento mitocondrial. Além disso, ambas as células WT e ∆exon 5b as células mostraram crescimento celular semelhante após a mudança para meio indutor de OXPHOS (Figura Suplementar S2C). Além de MEFs, geramos dois ∆exon 5b linhas do mouse. A análise ocidental de tecidos mutantes mostrou revogação de Opa1 bandas de proteína contendo exon 5b (Figura Suplementar S2D). Apesar desta mudança bioquímica nas isoformas OPA1, os camundongos mutantes não mostraram nenhuma disfunção fisiológica óbvia e ganharam peso normalmente (Figura Suplementar S2E) por pelo menos 1 ano de idade.

Detecção de um novo local de clivagem OPA1 em WT e ∆exon 5b células

No decorrer deste estudo, mudamos para um sistema de gel de alta resolução para estudar essas isoformas da proteína OPA1. Com este novo sistema, o que antes era designado por banda d em células WT pode ser resolvido em bandas duplas, que designamos como d e d′ (Figura 3A). Após a reanálise, percebemos que ∆exon 5b as células produzem duas bandas Opa1 curtas, d' e e. Com a exclusão do site S2 dependente de YME1L, ∆exon 5b seria esperado que as células mostrassem apenas o processamento de OPA1 mediado por OMA1. No ∆exon 5b / Oma1- células nulas, banda e está faltando mas dA banda ′ permanece, indicando que é independente de OMA1 (Figura 3A).

FIGURA 3: Detecção de uma nova clivagem OPA1 em WT e ∆exon 5b células. (A) Análise Western de alta resolução de WT, ∆exon 5b, e ∆exon 5b/Oma1-null MEFs. Observe a banda adicional localizada em d em WT MEFs. Esta banda (referida como d′) É mais claramente visto em ∆exon 5b e ∆exon 5b/Oma1-clones nulos. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (B) Dependência de banda d' sobre Yme1l. As células que expressam o shRNA indicado foram analisadas por Western blotting. Os dois conjuntos de painéis foram executados no mesmo gel. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (C) análise de PCR de Opa1 transcrições em ∆exon 5b células. O primer direto está localizado no exon 3, e o primer reverso está localizado no exon 7 (Figura Suplementar S3C). As bandas correspondentes às isoformas 1 e 5 foram confirmadas por sequenciamento. (D) Esquema das isoformas 1 e 5 de OPA1 de comprimento total. (E) Análise de Western blot da forma curta produzida pela isoforma 5. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (F) Dependência da banda da isoforma 5 d′ Em YME1L. O OPA1 humano marcado com FLAG (isoforma 1 ou 5) foi expresso em células do genótipo indicado e analisado por Western blotting contra FLAG. HSP60 foi usado como controle de carregamento.

Como YME1L é a outra protease intermembrana conhecida envolvida no processamento pós-tradução de OPA1, usamos o RNA em gancho curto (shRNA) para testar se ele é essencial para a produção de banda d′. As eficiências de knockdown do Yme1l e Oma1 Os shRNAs foram confirmados por Western blotting (Figura Suplementar S3, A e B). Em células WT, o knockdown de YME1L causou o desaparecimento de bandas d e d′, Enquanto o knockdown de OMA1 causou o desaparecimento de bandas c e e (Figura 3B). A dependência de d′ Em YME1L, mas não em OMA1, foi confirmado em ambos Δexon 5b / Oma1- células nulas e Δexon 5b células (Figura 3B).

Para identificar a origem da nova banda curta OPA1 d′, Usamos a análise de PCR de cDNA de Δexon 5b células para identificar as principais restantes Opa1 transcrições de mRNA. Usando primers que flanqueiam os exons de splicing alternativo 4, 4b e 5b para distinguir transcritos de mRNA individuais (Figura Suplementar S3C), descobrimos que as células mutantes expressaram as variantes de splicing de mRNA 1 e 5 (confirmadas por análise de PCR e sequenciamento), com a isoforma 1 sendo ligeiramente mais abundante (Figura 3, C e D). Não é surpreendente que as isoformas 7 e 8 estejam ausentes, porque elas contêm o exon 5b. Em vez disso, a isoforma 5 contém o exon 4b alternativo (Figura 3D) e, como outras isoformas contendo o exon 4b, foi anteriormente demonstrado ser clivado constitutivamente em uma isoforma curta (Song et al., 2007). A clivagem constitutiva da isoforma 5 foi assumida como ocorrendo no local S1, o único local de clivagem conhecido nesta isoforma (Song et al., 2007). No entanto, questionamos se essa suposição pode estar incorreta, porque a clivagem da isoforma 5 em S1 levaria à banda e, não d′. Para testar se a isoforma 5 pode gerar banda d′, Expressamos a isoforma 5 em Opa1-células nulas. A isoforma 5 gerou uma isoforma curta que era claramente distinta de e e comigrou com o d′ Bandas presentes em ∆exon 5b e ∆exon5b / Oma1células nulas (Figura 3E). Esta observação indica que a isoforma 5 é a fonte provável da banda d′. Seu local de clivagem é N-terminal para S1, conforme indicado pelo tamanho ligeiramente maior de d' comparado com e.

Para determinar a protease responsável pela clivagem da isoforma 5 e ainda confirmar que a banda dependente de YME1L d′ De fato surge da isoforma 5, comparamos o comportamento das isoformas 5 e 1 humanas marcadas com FLAG C-terminal em MEFs mutantes sem OMA1 ou YME1L. Consistente com estudos anteriores mostrando clivagem em S1 por OMA1, a isoforma 1-FLAG produz uma isoforma curta que é dependente de OMA1 (Figura 3F). Quando YME1L está ausente, mais desta isoforma curta é produzida, presumivelmente devido à regulação positiva da atividade de OMA1 (Wai et al., 2015). Como esperado, a isoforma 5-FLAG é completamente processada em MEFs de controle. A ausência de OMA1 não afeta o padrão de clivagem, indicando que a produção da forma curta da isoforma 5 é independente de OMA1 (Figura 3F). A remoção de Yme1l anula completamente a produção desta forma curta e resulta em uma banda inferior que comigra com a isoforma curta gerada a partir da isoforma 1 (Figura 3F). Além disso, uma pequena quantidade da forma longa, anteriormente ausente, é formada. Estes resultados indicam que, em condições normais, a isoforma 5 é processada até a conclusão em um local a montante de S1, de uma maneira dependente de YME1L, para produzir banda d′. Quando YME1L está ausente, a clivagem é ativada no local S1 a jusante. Apenas a forma longa é gerada a partir da isoforma 5, quando OMA1 e YME1L estão ausentes (Figura 3F, última faixa). Juntos, os resultados sugerem que a isoforma 5 de OPA1 é altamente suscetível ao processamento de protease, normalmente por YME1L. Na ausência de YME1L, OMA1 processa a isoforma 5 em OPA1 clivado por S1. Nenhuma protease adicional é suficiente para a clivagem da isoforma 5, conforme indicado pela formação da isoforma 5 longa quando ambos Yme1l e Oma1 estão ausentes.

Identificação de um local de clivagem dependente de YME1L rico em leucina no exon 4b

Nossos resultados até agora sugerem que a isoforma 5 contém um novo local de clivagem dependente de YME1L a montante de S1. Para localizar o novo local de clivagem (que designamos como S3), perguntamos se a clivagem é dependente do exon 4b, o primeiro exon a montante do exon 5. O knockdown do exon 4b com shRNA reduziu substancialmente a intensidade da banda d′ Em WT, Δexon 5b, e Δexon 5b / Oma1- células nulas (Figura 4A, banda d′ Marcado com asteriscos). Esta dependência sugere que o local de clivagem provavelmente reside no exon 4b. Para testar essa ideia, analisamos o comportamento de uma série de mutantes da isoforma 5 (Mut 1-9) contendo várias deleções curtas no exon 4b (Figura 4B). Os mutantes 1, 2 e 3, contendo deleções na metade 5 ′ do exon 4b, não mostram nenhum defeito no processamento de clivagem da isoforma 5, indicando que a primeira metade do exon 4b não contém o local de clivagem (Figura 4C). As mutações 4, 5 e 6 resultam em pequenas quantidades da forma longa, que normalmente está ausente. Além disso, esses mutantes mostram produção proeminente de bandas e. Os mutantes 7 e 8 também mostram a presença da forma longa e banda e. Além disso, esses mutantes mostram novos produtos de clivagem formando uma mancha acima da banda e (Figura 4C). A mutação 9, que deletou os aminoácidos de ligação entre os exons 4b e 5, gera a banda e e produz novos produtos de clivagem sem gerar uma forma longa de isoforma 5. Esses resultados sugerem que a clivagem S3 é sensível a mutações na metade 3 ′ do exon 4b, e particularmente a mutações (mutantes 7 e 8) que afetam um trecho de cinco leucinas consecutivas (aminoácidos 199-203 na isoforma 5). Curiosamente, os efeitos mais proeminentes das mutações estão no aparecimento da forma longa e nos novos produtos de clivagem, em vez de na eliminação da banda d′.

FIGURA 4: Identificação do local de clivagem OPA1 S3 dependente de YME1L no exão 4b. (A) Dependência de banda d′ No exão 4b. shRNA contra Opa1 O exão 4b foi expresso em células do genótipo indicado. Asteriscos destacam banda d′. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (B) Esquema de Opa1 mutantes do exão 4b. No topo, as sequências polipeptídicas codificadas pelo exon 4b (vermelho) e exon 5 (azul) são mostradas. A seta vermelha indica o local de clivagem S1 conhecido no exon 5, as setas verdes indicam os novos locais S3 encontrados neste estudo. Os mutantes da isoforma 5 são listados, juntamente com os aminoácidos deletados no exon 4b. (C) Efeito de mutantes do exon 4b no processamento de OPA1. Mutantes de exon 4b marcados com FLAG da isoforma 5 humana foram expressos em Opa1- células MEF nulas e analisadas por Western blot. As isoformas 1 e 5 de WT marcadas com FLAG foram usadas como controles. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (D) Efeito de OMA1 e YME1L no processamento de OPA1 em mutantes da isoforma 5. Iso 5 humano WT e seus mutantes 2, 6 e 7 foram expressos em Oma1- e Yme1l- MEFs nulos e padrões de banda OPA1 marcados com FLAG foram analisados ​​por Western blot. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (E) Identificação de prováveis ​​locais de clivagem S3 dentro do exon 4b por espectrometria de massa em tandem de banda d′. Banda d′ Foi produzido pela expressão de FLAG-tagged Opa1 isoforma 5 em células 293T, purificada por imunoprecipitação anti-FLAG, resolvida por SDS-PAGE, digerida por tripsina e submetida a espectrometria de massa em tandem. À esquerda, o esquema indica os três peptídeos N-terminais irregulares identificados, coloridos de acordo com sua intensidade relativa. Certo, gráfico da intensidade dos três peptídeos. (F) Efeito de mutantes penta-leucina na geração de banda d′. Conforme indicado, as alaninas foram usadas para substituir 1, 2 ou 3 leucinas no trecho penta-leucina C-terminal codificado pelo exão 4b. Mutantes marcados com FLAG da isoforma 5 foram expressos em Opa1células nulas e analisadas por Western blot. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (G) Esquema do perfil de isoforma OPA1 em ∆exon 5b MEFs. A seta verde representa o novo site S3 identificado.

Para determinar as proteases responsáveis ​​pela clivagem dos mutantes, expressamos os mutantes marcados com FLAG em MEFs mutantes de protease (Figura 4D). Nos mutantes 6 e 7, o menor produto de clivagem desapareceu em Oma1- células nulas, indicando que é dependente de OMA1. No mutante 7, existem formas curtas maiores que são dependentes de YME1. Na ausência de OMA1 e YME1L, nenhuma clivagem foi observada, demonstrando que essas duas proteases são essenciais para o processamento da isoforma 5.

Para identificar o local de clivagem com mais precisão, usamos espectrometria de massa em tandem para determinar a sequência N-terminal da banda d′, Produzida por superexpressão da isoforma 5 humana marcada com FLAG em células 293T. Banda d′ Foi coletado por imunoprecipitação contra a tag FLAG, resolvido em SDS – PAGE e isolado para análise bioquímica. Os peptídeos foram gerados por digestão com tripsina e identificados por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem de ionização de nanospray (LC-MS). Dos peptídeos identificados, apenas três tinham terminais N não trípticos. Os dois predominantes tinham terminais N localizados dentro do exon 4b, começando com a penúltima leucina e a última leucina do trecho penta-leucina (Figura 4E). O último péptido teve de longe a intensidade mais elevada, sugerindo que representa o produto de clivagem S3 predominante. Para testar essa ideia, projetamos mutantes isoforma 5 (mutantes 10–13) em que as últimas 1–3 leucinas do trecho penta-leucina foram substituídas por alanina. Descobrimos que a substituição de uma única leucina (mutantes 12 e 13) teve pouco efeito na banda d′ Produção, embora um pequeno nível de produtos de clivagem maiores pudessem ser observados (Figura 4F). Quando as duas últimas leucinas foram substituídas (mutante 11), houve um nível mais substancial de clivagem aberrante, e a isoforma longa apareceu. Ambos os efeitos aumentaram quando as três últimas leucinas foram substituídas (mutante 10). Tomados em conjunto, o LC-MS e a análise mutacional argumentam fortemente que o local de clivagem S3 está dentro do trecho penta-leucina codificado pelo final do exon 4b. Embora os espectros de íons de produto indicassem que a clivagem ocorre principalmente no terminal N até a última leucina, os fenótipos mutacionais sugerem que a clivagem pode ocorrer em outros locais muito próximos ao trecho penta-leucina (Figura 4C, pistas 9-13). Nenhuma das mutações elimina completamente a produção de banda d′, Sugerindo que a clivagem ainda pode ocorrer muito perto de S3 quando o local está mutado. Também é aparente que a isoforma 5 é altamente propensa ao processamento proteolítico - quando o local S3 está mutado, a clivagem é ativada em S1 ou em locais crípticos N-terminal para S3, levando a formas clivadas variantes da isoforma 5. Nossa análise indica que ∆exon5b células retêm dois dominantes Opa1 transcrições de mRNA, isoformas 1 e 5. Este perfil de transcrição simplificado resulta em um l-OPA1 (da isoforma 1) e dois s-OPA1 (isoformas 1 / S1 e 5 / S3) (Figura 4G).

A forma curta clivada de S3 da isoforma 5 regula a tubulação mitocondrial

Em humanos e camundongos, metade dos Opa1 as formas de emenda contêm o exon 4b e são clivadas constitutivamente para produzir isoformas exclusivamente curtas (Song et al., 2007). Isso levanta a questão de por que Opa1 codifica várias formas de splice de mRNA, cuja única finalidade aparente é gerar isoformas curtas. Usamos a isoforma 5 para resolver esse problema. Consistente com estudos anteriores (Song et al., 2007), a isoforma 5 quase não tem atividade de alongamento mitocondrial quando expressa em Opa1- MEFs nulos, que têm mitocôndrias altamente fragmentadas devido à perda completa de fusão da membrana interna (Figura 5A e Figuras Suplementares S5A e S4A). Mutações da isoforma 5 que interrompem o processamento de S3, no entanto, mostram atividade de fusão mitocondrial substancial, conforme indicado por sua capacidade de alongar mitocôndrias (Figura 5A e Figuras Suplementares S5A e S4, A e B). Como esses mutantes produzem uma variedade de formas curtas e também longas, esses resultados se encaixam no modelo de que uma mistura de isoformas longas e curtas de OPA1 é importante para a atividade de fusão mitocondrial (Song et al., 2007). Alternativamente, esses resultados poderiam ser explicados propondo que é a produção da isoforma longa que induz a atividade de fusão mitocondrial.

FIGURA 5: A forma curta clivada em S3 da isoforma 5 regula a morfologia mitocondrial. (A) Elongação da mitocôndria por mutantes da isoforma 5. Os mutantes da isoforma 5 foram expressos em Opa1células nulas e morfologias mitocondriais foram quantificadas. Barras de erro indicam SD de seis experimentos independentes. (B) Esgotamento da banda d′ Por shRNA contra o exon 4b e reexpressão de d′ Pela isoforma 5. A expressão ectópica da isoforma 5 é suficiente para superar o efeito shRNA e produzir d′. As isoformas OPA1 foram analisadas por Western blotting contra OPA1. HSP 60 foi usado como controle de carregamento. (C) Efeito do shRNA do exon 4b na morfologia mitocondrial. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes. (D) Análise da expressão de OPA1 bicistrônica. Opa1- células nulas que expressam a isoforma 1 ou isoforma 1 mais a isoforma 5 foram analisadas por Western blotting contra OPA1. ∆exon 5b as células são mostradas para comparação. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (E) Efeito da banda d′ Na morfologia mitocondrial. Quantificação da morfologia mitocondrial de Opa1-null MEFs expressando isoforma 1 com YFP ou isoforma 1 com isoforma 5. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes. P os valores para fragmentado, tubular curto, tubular longo e interconectado foram 4,8 × 10 –4, 0,04, 0,001 e 9,9 × 10–7, respectivamente. P os valores foram calculados por Student's t teste. (F) Modelo mostrando as isoformas OPA1 em condições normais e S3 interrompidas. Quando S3 é interrompido (painel inferior, caixa), clivagens em S1 e locais crípticos são ativados, preservando a produção de s-OPA1. OM: membrana externa, IM: membrana interna.

Para distinguir entre esses dois modelos, investigamos ainda mais a função fisiológica da forma curta da isoforma 5. Usamos shRNA para derrubar o exon 4b em Δexon 5b e Δexon 5b / Oma1-células nulas, que têm um portfólio simplificado de Opa1 formas de junção de mRNA. Como esperado, o knockdown do exon 4b resultou na redução da banda d′ Em ambas as linhas celulares (Figuras 4A e 5B). No Δexon 5b MEFs, o knockdown do exon 4b leva à fragmentação mitocondrial dramática (Figura 5C e Figura Suplementar S5B). Da mesma forma, em Δexon 5b / Oma1- células nulas, o knockdown do exon 4b resulta em fragmentação mitocondrial (Figura 5C e Figura Suplementar S5B). Para verificar se o resultado do knockdown não é devido a efeitos fora do alvo, reexpressamos a isoforma 5 nos knockdowns do exon 4b (Figura 5B) e observamos o alongamento da morfologia mitocondrial em ambas as linhas celulares (Figura 5C e Figura Suplementar S5B).

Para testar ainda mais essa ideia de que uma forma curta de OPA1 pode colaborar com uma forma longa para regular a fusão mitocondrial, desenvolvemos um sistema de expressão para co-expressar duas formas de splice OPA1 diferentes em Opa1-null MEFs. Construímos um vetor de expressão bicistrônica para gerar a isoforma 1 junto com a isoforma 5, ou a isoforma 1 junto com o controle YFP. O Western blot confirmou o padrão de banda OPA1 esperado nessas células (Figura 5D). Com a expressão da isoforma 1 sozinha, a banda longa b e a banda curta e foi produzido. Com a expressão bicistrônica das isoformas 1 e 5, uma forma curta adicional (d′ Da isoforma 5) foi adicionado. Esta dupla expressão recapitulou as bandas observadas em Δexon 5b células (Figura 5D) e resultou em perfis mitocondriais mais longos. Significativamente, mais células continham mitocôndrias interconectadas e menos células tinham mitocôndrias fragmentadas, em comparação com a expressão da isoforma 1 sozinha (Figura 5E e Figura Suplementar S5C). Estes resultados sugerem que o s-OPA1 clivado por S3 pode funcionar com l-OPA1 para promover a fusão mitocondrial. Para determinar se esta sinergia requer atividade de hidrólise de GTP em s-OPA1, usamos o sistema bicistrônico para expressar a isoforma 1 de tipo selvagem com a isoforma 5 contendo um domínio GTPase disfuncional (iso 5-G300E) em Opa1-null MEFs. O padrão de banda de proteína foi semelhante em células que expressam Iso 1-IRES-Iso 5-G300E em comparação com células que expressam Iso 1-IRES-Iso 5 (Figura Suplementar S5D). A isoforma 5 mutada foi ineficaz na promoção da fusão mitocondrial em combinação com a isoforma 1 de tipo selvagem, demonstrando que a atividade de GTPase é necessária em s-OPA1 para manter a função de fusão (Figura Suplementar S5, C e E).


Parte 2: Descoberta e Caracterização de uma Proteína de Adesão Focal Implicada na Progressão do Tumor

00: 00: 03.26 Olá, meu nome é Mary Beckerle,
00: 00: 05.24 e sou professor de Biologia e Ciências Oncológicas na
00: 00: 08.26 Huntsman Cancer Institute da University of Utah.
00: 00: 11.04 Nesta parte da minha apresentação, eu quero
00: 00: 15.13 para descrever para vocês alguns trabalhos em meu laboratório
00: 00: 19.07 na descoberta e caracterização de uma adesão focal
00: 00: 22,22 proteína que está implicada na progressão do tumor.
00: 00: 28.01 Como discutimos na primeira parte, as células são cercadas por
00: 00: 34.19 outras células e matriz extracelular
00: 00: 37.05 material e muitas pistas solúveis e fatores que influenciam
00: 00: 42.01 o comportamento deles de maneiras realmente dramáticas e importantes.
00: 00: 45.13 E um tipo realmente importante de dica informativa vem da informação
00: 00: 55.10 que as células obtêm ao interagir com a matriz extracelular.
00: 01: 00.01 A interação da matriz extracelular ocorre em zonas especializadas da superfície celular,
00: 01: 09.12 que nas células em cultura são chamadas de aderências focais.
00: 01: 12.11 Essas aderências focais, como discutimos da última vez,
00: 01: 16,28 são áreas ricas em receptores de adesão de integrinas,
00: 01: 22.17 e eles estão desempenhando um papel muito importante
00: 01: 26,23 em comunicação transmembrana bidirecional.
00: 01: 32.21 As aderências focais detectam a matriz extracelular,
00: 01: 36.12, mas também estão envolvidos na detecção de pistas que estão presentes nas superfícies das células.
00: 01: 41.03 E eles também, como discutiremos na parte três,
00: 01: 44.12 pode sentir o estresse físico, como estimulação mecânica.
00: 01: 51.22 As respostas que as células lançam como resultado da sinalização por meio
00: 01: 58.20 essas regiões especializadas da membrana são realmente
00: 02: 01.13 muito diversificada e inclui o controle do crescimento ou morte celular,
00: 02: 05.26 motilidade celular, organização do citoesqueleto,
00: 02: 09.27 e esses sinais podem até resultar em mudanças no
00: 02: 14.05 expressão do gene, ilustrando que deve haver algum mecanismo por
00: 02: 18.01 que as moléculas presentes nestes locais de adesão
00: 02: 22.09 são capazes de se comunicar com o núcleo.
00: 02: 25.06 Integrinas são o receptor primário da matriz extracelular
00: 02: 30.22 que estão localizados nessas zonas de adesão especializadas.
00: 02: 36.11 Eles estão concentrados nessas aderências focais.
00: 02: 39.11 Eles medeiam bidirecional transmembrana
00: 02: 41.29 sinalização, e um desafio muito interessante tem sido tentar entender
00: 02: 47.01 como eles sinalizam para efetuar tantos comportamentos celulares realmente importantes.
00: 02: 52,08 Porque, ao contrário dos receptores do fator de crescimento,
00: 02: 54.22 eles próprios não têm nenhuma atividade catalítica intrínseca.
00: 02: 58.18 Em vez disso, eles parecem operar por meio do recrutamento de uma grande coleção de
00: 03: 04.11 proteínas citoplasmáticas para a face citoplasmática
00: 03: 11.04 da membrana plasmática, e são essas proteínas
00: 03: 13.27 o que realmente facilita a função de sinalização de integrina.
00: 03: 18.02 Existem mais de 50 componentes presentes
00: 03: 22.04 com integrinas nessas aderências focais,
00: 03: 25,28 e estas são estruturas altamente dinâmicas onde as proteínas
00: 03: 30.01 estão indo e vindo. Existem ambos os componentes estruturais
00: 03: 33,23 e constituintes catalíticos. Aqui você pode ver um exemplo
00: 03: 37.09 da evidência de um constituinte catalítico, e que
00: 03: 42.03 são tirosina quinases e seus substratos
00: 03: 45.28 porque aqui estamos rotulando a célula com um anticorpo
00: 03: 48,26 dirigido contra a fosfotirosina.
00: 03: 50.29 E você pode ver que essas manchas brilhantes aqui
00: 03: 55.25 onde a fosfotirosina é acumulada representam
00: 03: 58.26 as adesões focais onde as integrinas também estariam concentradas
00: 04: 03.10 e onde você pode ver que há uma conexão muito próxima com as extremidades
00: 04: 07,22 dos filamentos de actina, as fibras de tensão que terminam nesses locais.
00: 04: 13.14 Uma proteína que é uma das muitas proteínas presentes nessas adesões focais
00: 04: 20.11 é uma proteína que foi descoberta no meu laboratório,
00: 04: 23.02 vários anos atrás, chamado zyxin.
00: 04: 25.15 Este foi um processo de descoberta muito interessante, eu acho,
00: 04: 31.03 e um que foi muito fortuito.
00: 04: 33.01 Na verdade, eu estava fazendo muitos anticorpos diferentes contra a adesão focal
00: 04: 38,05 constituintes. Naquela época, sabíamos apenas de três constituintes de adesão focal,
00: 04: 42.15 e eu estava tentando procurar por novos.
00: 04: 44.02 E eu estava fazendo anticorpos contra algumas proteínas candidatas
00: 04: 47,24 e um dos coelhos, antes da imunização
00: 04: 50.12 na verdade estava produzindo um anticorpo que já corou
00: 04: 55.04 adesões focais de células em cultura.
00: 04: 56.22 E então eu segui o que este anticorpo estava reconhecendo,
00: 05: 02.07 e descobri que estava reconhecendo uma proteína que era
00: 05: 05.04 anteriormente não apreciado como um constituinte de adesão focal.
00: 05: 07.29 E esta proteína agora tem o nome de zyxin,
00: 05: 12.04 que vem da raiz grega zeugos, que significa juntar,
00: 05: 17.14 porque é em locais onde os filamentos de actina se unem à membrana plasmática.
00: 05: 20.21 Esta é uma proteína muito interessante que tinha uma série de
00: 05: 25.20 características estruturais incomuns: altamente enriquecido em resíduos de prolina
00: 05: 30.12 e também tinha 3 motivos de dedo de zinco duplo C-terminal chamados
00: 05: 36,16 o domínio LIM. O domínio LIM foi identificado pela primeira vez em três fatores de transcrição
00: 05: 42,25 Lin-11, Isl-1 e Mec-3. E todas essas são proteínas do homeodomínio
00: 05: 49.11 que continha dois domínios LIM do terminal N.
00: 05: 54.14 Em colaboração com Mike Summers e Dennis Winge
00: 05: 57.17 resolvemos a estrutura do domínio LIM,
00: 05: 59.19 e determinamos que é realmente uma estrutura de dedo de zinco duplo
00: 06: 04.10 com dois tipos de módulos independentes, cada um dos quais se liga a um átomo de zinco.
00: 06: 10.24 E, surpreendentemente, embora muitos dedos de zinco estejam envolvidos diretamente
00: 06: 17.24 ligação ao ácido nucleico, é bastante claro a partir da nossa análise que
00: 06: 22.13 Os domínios LIM servem como interfaces de ligação de proteínas.
00: 06: 26.03 No entanto, devo salientar que esta estrutura de
00: 06: 30.09 o domínio LIM é muito, muito semelhante ao domínio de ligação ao DNA GATA-1,
00: 06: 35.09 então permanece a possibilidade de que, além da interação proteína-proteína,
00: 06: 39.17 Domínios LIM podem ser capazes de se associar a ácidos nucleicos,
00: 06: 43.05, embora isso não tenha sido demonstrado diretamente.
00: 06: 46,28 Existem agora várias proteínas de domínio LIM que foram identificadas-
00: 06: 52,12 mais de 50 proteínas humanas, e elas são
00: 06: 57.04 funcionalmente bastante diverso. Alguns deles têm
00: 07: 00.00 características catalíticas, como servir como quinases,
00: 07: 04.00 outros estão presentes exclusivamente no núcleo e são conhecidos
00: 07: 08.01 para desempenhar um papel na regulação da expressão gênica
00: 07: 11.28 e muitos outros são encontrados em associação com o citoplasma.
00: 07: 16.20 E o que vou dizer hoje é que esta proteína zyxin,
00: 07: 20.11 parece ser uma proteína multifuncional que reside
00: 07: 24.00 com destaque nas aderências focais, mas também
00: 07: 26,27 tem. onde parece regular a motilidade celular
00: 07: 30.10 e talvez até morte celular, mas também tem
00: 07: 36.05 a capacidade de se mover para o núcleo, por isso é uma proteína incrivelmente interessante
00: 07: 41.02 que é um candidato a participar na comunicação direta
00: 07: 44.21 entre a superfície da célula e o compartimento nuclear.
00: 07: 48.28 Zyxin também, agora passamos a apreciar,
00: 07: 55.04 pode estar implicado em um tipo específico de câncer: o sarcoma de Ewing.
00: 08: 00.11 Quero falar um pouco sobre o sarcoma de Ewing, e depois
00: 08: 04.22 sobre as conexões entre esta proteína de adesão focal
00: 08: 08.28 e suas propriedades e a progressão
00: 08: 11.09 do sarcoma de Ewing que agora entendemos de estudos de modelos pré-clínicos.
00: 08: 17.16 O sarcoma de Ewing é uma infância e um jovem adolescente muito devastadores
00: 08: 24,26 tumor. É um tumor pequeno, redondo, de células azuis
00: 08: 28.22 que você pode ver histologicamente é muito homogêneo
00: 08: 33.18 em termos de como aparece no nível celular.
00: 08: 37,23 É um tumor ósseo, extremamente raro, mas muito, muito agressivo.
00: 08: 43.24 E embora seja raro, porque afeta crianças e jovens
00: 08: 48.13 tem havido uma grande ênfase em tentar entender sua causa
00: 08: 54.08 e desenvolver melhores estratégias de tratamento.
00: 08: 56.21 Neste momento, enfrentamos o desafio que metastático
00: 09: 01.01 O sarcoma de Ewing é realmente uma doença letal.
00: 09: 05.12 Aqui você pode ver alguns dados sobre a sobrevivência
00: 09: 08.22 do sarcoma de Ewing se a doença fosse localizada,
00: 09: 15.23 onde há uma taxa de sobrevivência muito boa, superior a 80%,
00: 09: 20.13 versus se o tumor se espalhou.
00: 09: 25.23 E muitos, muitos casos de sarcoma de Ewing têm micro-metástases
00: 09: 28,25 no momento da detecção inicial, e
00: 09: 31.02 você pode ver que uma vez que alguém tem doença metastática
00: 09: 35.04 há um prognóstico muito, muito ruim.
00: 09: 38.00 Ainda mais impressionante, acho que é o fato de que realmente não temos terapias eficazes
00: 09: 45,06 para tratar esta doença. E aqui você pode ver
00: 09: 47.11 os resultados para os pacientes após a recaída de seu
00: 09: 54.00 doença, e aqueles tratados com a terapia mais agressiva realmente
00: 10: 00.18 em última análise, não se saem muito melhor do que aqueles que recebem cuidados paliativos.
00: 10: 05.05 Então, infelizmente, este é um tumor raro, extremamente agressivo e
00: 10: 11.08 tumor difícil de tratar. Nós entendemos agora que
00: 10: 16.10 O sarcoma de Ewing é causado por uma translocação cromossômica recíproca,
00: 10: 21.00 e 1122 translocação que resulta na fusão produtiva de
00: 10: 26.13 uma região do gene EWS com uma região do gene FLI1.
00: 10: 32.17 E aqui você pode ver que sai dessa fusão uma proteína quimérica,
00: 10: 39.00 a quimera EWS-FLI1, que reúne um domínio de transativação de EWS com
00: 10: 46,05 um domínio de ligação ao DNA de FLI1.
00: 10: 50.17 Acredita-se que esta proteína funcione como um agente aberrante
00: 10: 54.20 fator de transcrição que sabemos ser responsável por
00: 11: 00.19 causa do sarcoma de Ewing.
00: 11: 02.21 No laboratório, podemos demonstrar que a expressão EWS-FLI1 é suficiente para se comportar
00: 11: 11.17 como uma oncoproteína, e é suficiente para transformar células.
00: 11: 14,26 Aqui estão à esquerda você pode ver as células cultivadas em ágar mole
00: 11: 19.10 quando eles estão expressando FLI1, e você não pode realmente ver nenhuma colônia se desenvolvendo aqui.
00: 11: 23.26 Mas quando essas células expressam a proteína de fusão EWS-FLI1,
00: 11: 30.27 você pode ver muitas colônias crescendo
00: 11: 34.16 neste ensaio de clonagem de ágar macio.
00: 11: 37.19 Portanto, essas células exibem crescimento celular independente de ancoragem
00: 11: 41,27 e se comportam como células transformadas por este ensaio clássico.
00: 11: 47.17 Então, vários grupos estão realmente interessados ​​em tentar entender
00: 11: 52.05 o que acontece dentro das células quando você expressa EWS-FLI1,
00: 11: 56.13 e houve um relatório recente de Amsellem e colegas
00: 12: 01.26 em que exploram qual é a diferença entre a expressão gênica
00: 12: 07.18 padrões em células 3T3 e em células 3T3 que são programadas para expressar o EWS-FLI1
00: 12: 15,14 oncoproteína. E sua análise identificou vários genes que eram
00: 12: 22.14 padrões de expressão alterados desregulados ou exibidos
00: 12: 26,21 quando EWS-FLI1 estava presente. E um desses foi
00: 12: 32.10 a proteína zyxin de adesão focal que mencionei
00: 12: 35.17 foi descoberto pelo meu laboratório.
00: 12: 38.10 Você pode ver aqui se olharmos para o nível de proteína em um controle de células 3T3
00: 12: 44.04 usando um anticorpo anti-zyxin, você vê
00: 12: 46,17 esta quantidade de proteína, e uma célula 3T3 típica expressando
00: 12: 51.04 EWS-FLI1 mostra esta redução dramática no nível da proteína zyxin.
00: 12: 56,27 E aqui você pode ver isso novamente por imunocitoquímica,
00: 13: 00.10 onde nas células de controle você pode ver a zyxin bem concentrada
00: 13: 04.18 nessas aderências focais, enquanto no
00: 13: 08.26 células 3T3 que foram transformadas com EWS-FLI1,
00: 13: 13.19 há uma morfologia alterada e uma perda de zyxin nas aderências focais.
00: 13: 20.10 Curiosamente, é claro, quando você coloca EWS-FLI1, um regulador transcricional nas células,
00: 13: 29.03 você espera que muitas, muitas mudanças dramáticas ocorram
00: 13: 33,04 nessas células. Então, vendo que o zyxin está baixo e está
00: 13: 35.20 correlacionado com esta mudança na morfologia
00: 13: 37.10 é uma coisa, mas saber que é responsável e em que medida
00: 13: 41.24 pode ser responsável por essa mudança na morfologia
00: 13: 43.28 é uma questão em aberto que precisa ser tratada diretamente.
00: 13: 48.01 E foi abordado por esses investigadores, tomando estes
00: 13: 52,05 células 3T3 que são transformadas com EWS-FLI1,
00: 13: 57.14 que novamente mostram esta morfologia alterada realmente dramática
00: 14: 01.08 desta morfologia semelhante a fibroblastos muito bem espalhada
00: 14: 07.00 para uma morfologia muito mais aparentemente móvel e não espalhada.
00: 14: 17.06 E o que eles conseguiram fazer foi perguntar, ok,
00: 14: 19.13 nessas células, se colocarmos de volta uma zyxina de tipo selvagem,
00: 14: 23.11 o que acontece? E notavelmente você pode ver este fenotípico realmente dramático
00: 14: 29.13 reversão onde a simples re-expressão deste gene, o zyxin
00: 14: 34.21 gene, causa uma reversão fenotípica para algo que parece
00: 14: 38.03 muito mais como as células não transformadas.
00: 14: 41.11 Então, isso forneceu uma indicação de que a proteína zyxin
00: 14: 45.22 não foi apenas reduzido na expressão, e em resposta a EWS-FLI1
00: 14: 51.20 transformação, mas também pode ser responsável por alguns dos
00: 14: 56.13 fenótipos transformados que estão associados à expressão de EWS-FLI1.
00: 15: 02.23 Portanto, meu laboratório está interessado em tentar entender qual é a função da zyxin.
00: 15: 08.07 E adotamos uma abordagem para gerar uma interrupção direcionada
00: 15: 12.20 do gene zyxin para eliminar completamente toda a expressão de zyxin
00: 15: 17.27 e então ser capaz de estudar as consequências da perda de zyxin
00: 15: 22.01 expressão para função celular.
00: 15: 24.19 E aqui você pode ver que geramos células com sucesso
00: 15: 29.21 sem zyxin. Aqui estão as células do tipo selvagem, fibroblastos de embrião de camundongo,
00: 15: 34,29 expressando zyxin. Você pode ver boas aderências focais
00: 15: 38,01 coloração. E aqui, você pode ver. você não pode ver. Existe uma célula aqui.
00: 15: 42.24 E foi marcado com anticorpo anti-zyxin e não há zyxin
00: 15: 46,28 proteína. E isso é confirmado pelo Western blot aqui, mostrando que
00: 15: 52.03 a interrupção do gene alvo foi eficaz
00: 15: 55.04 e elimina completamente a proteína zyxin.
00: 15: 58.06 Agora começamos a caracterizar essas células
00: 16: 03.01 e tentando pensar sobre como as mudanças nessas células
00: 16: 06.20 pode ser relevante para este sarcoma de Ewing
00: 16: 11.16 fenótipo que foi observado por Amsellem e colegas.
00: 16: 14.27 A primeira coisa que vimos desde que sabíamos que o zyxin estava presente nestes
00: 16: 20.13 adesões focais onde os filamentos de actina são amarrados à membrana plasmática
00: 16: 24.05 é se o citoesqueleto de actina foi perturbado nas células nulas de zyxin.
00: 16: 29,23 E aqui você pode ver que embora as células nulas de zyxin
00: 16: 35.09 exibir fibras de estresse de actina, então aqui estão as células de controle
00: 16: 39.22 e, em seguida, células nulas - ambas exibem fibras de estresse de actina, então não podemos
00: 16: 44.15 concluem que zyxin é absolutamente essencial
00: 16: 47,24 para o estabelecimento dessas matrizes de actina nas células.
00: 16: 51.14 Mas se perturbarmos este sistema e desafiá-lo com um inibidor de Rho quinase,
00: 16: 57.03 e lembre-se agora que a sinalização Rho é importante para a construção
00: 17: 02.07 de matrizes de fibras de estresse robustas, e Rho atua em parte por meio de
00: 17: 06.21 a atividade da Rho quinase. Então, se perturbarmos a sinalização da Rho quinase
00: 17: 13.12 com um inibidor de Rho quinase - se tratarmos células de tipo selvagem com um inibidor de Rho quinase para breve
00: 17: 20.06 períodos de tempo sob condições em que não vemos uma redução dramática nas fibras de tensão.
00: 17: 25.21 Se olharmos para as células nulas, vemos que as fibras de estresse são completamente eliminadas
00: 17: 31,22 quando zyxin não está lá. E isso seria
00: 17: 34.08 o resultado final para as células do tipo selvagem também
00: 17: 38.06 se continuássemos este tratamento por um período de tempo mais longo.
00: 17: 41.11 Então, esses resultados ilustraram que, embora as matrizes de fibras de estresse de actina sejam
00: 17: 49.10 presentes em células nulas de tipo selvagem e zyxin
00: 17: 52.14 que as matrizes que estão presentes nas células nulas de zyxin são menos robustas
00: 17: 57.02 e são mais sensíveis quando as vias das fibras de estresse estão comprometidas.
00: 18: 03.10 E isso é realmente muito interessante porque há uma longa história que ilustra que
00: 18: 11.18 o conteúdo de fibra de tensão está inversamente relacionado à motilidade. Isso é isso
00: 18: 15.13 quanto maiores e mais robustas as fibras de estresse são
00: 18: 19,05 quanto menos móveis as células são. Então você pode imaginar que
00: 18: 23.19 se as células nulas de zyxin tiverem conteúdo de fibra de estresse reduzido
00: 18: 28.29 ou conteúdo de fibra de estresse menos robusto
00: 18: 31,12 que se poderia antecipar que as células mostrariam motilidade aumentada.
00: 18: 36.05 E de fato é exatamente isso que vemos. Nós olhamos para
00: 18: 39.24 as células nulas de zyxin e avaliaram suas propriedades de motilidade,
00: 18: 43.22 de várias maneiras diferentes. E aqui está apenas um experimento
00: 18: 47.12 onde olhamos em um ensaio de ferida em monocamada.
00: 18: 51.17 Pegamos células nulas de tipo selvagem e zyxin e as cultivamos
00: 18: 56.17 em uma monocamada e, em seguida, coçou uma ferida nessa monocamada,
00: 19: 01.16 mediu essa lacuna da ferida e, em seguida, monitorou a recuperação dessa ferida à medida que as células
00: 19: 09.29 migrou para a área desmatada.
00: 19: 12.13 E esta é apenas uma análise de endpoint mostrada aqui,
00: 19: 16.11 mas depois de oito horas, você pode ver que o zyxin é nulo. o tipo selvagem
00: 19: 19.28 as células ainda têm uma lacuna bastante substancial nesta ferida,
00: 19: 23.05 enquanto as células nulas mostram a recuperação completa da ferida.
00: 19: 29.09 E uma análise cega de um grande número de ensaios de ferimento
00: 19: 34.15 e a quantificação da velocidade de migração celular revelou que
00: 19: 38.04 as células nulas de zyxin realmente migram cerca de duas vezes mais rápido que as células do tipo selvagem,
00: 19: 46,26 consistente com a ideia de que a perda de zyxin pode estar envolvida na progressão do tumor
00: 19: 55.08 e motilidade. As células nulas Zyxin também parecem exibir propriedades migratórias que são
00: 20: 02.11 desacoplado das pistas da matriz extracelular.
00: 20: 05.05 Falamos muito na primeira parte sobre como as células normalmente ficam
00: 20: 09.17 sinais substanciais do ambiente e como isso afeta
00: 20: 14,16 a saída de sinalização e o comportamento das células.
00: 20: 17,14 E neste experimento em que examinamos e comparamos
00: 20: 22.21 células de tipo selvagem e células nulas de zyxin
00: 20: 24.08 para suas propriedades de migração em uma câmara de Boyden, um ensaio de migração transwell,
00: 20: 30.27, temos alguma indicação de que as células nulas de zyxin estão migrando
00: 20: 35,26 em uma espécie de velocidade máxima, independentemente de quaisquer pistas da matriz extracelular.
00: 20: 41,23 E este é um fenótipo realmente impressionante.
00: 20: 44.27 Aqui você pode ver nos bares abertos o tipo selvagem
00: 20: 47.28 células e o que fizemos aqui foi colocar células no topo desta câmara de Boyden
00: 20: 53,26 e, em seguida, coloque diferentes quantidades de proteína da matriz extracelular, neste caso fibronectina,
00: 21: 00.24 na parte inferior desse filtro e permitiu a migração das células.
00: 21: 04.20 E o que você pode ver é que as células do tipo selvagem não migram muito bem
00: 21: 10.00 quando não há fibronectina presente, nenhum tipo de sinal,
00: 21: 13.09 nada para agarrar do outro lado desse filtro.
00: 21: 17,19 E conforme o nível de fibronectina aumenta, você pode ver que o
00: 21: 22.18 células do tipo selvagem começam a migrar de forma eficaz
00: 21: 26.11 através dos poros e para o outro lado do filtro.
00: 21: 29.29 Curiosamente, as células nulas em comparação, começam, até
00: 21: 34.25 sem pistas da matriz extracelular, migrando na velocidade máxima
00: 21: 39,28 e não parecem afetados pelo aumento da concentração de fibronectina.
00: 21: 45.25 Então, o que isso sugere é mais uma vez nos mostrando de forma consistente
00: 21: 50.03 que as células nulas de zyxin estão migrando de forma mais eficaz do que as células do tipo selvagem.
00: 21: 54.02 Mas também sugere que, na ausência de zyxin
00: 21: 57.25 as células estão quase preparadas para a migração.
00: 22: 01.04 Eles parecem se comportar como se tivessem um sinal
00: 22: 04.19 que havia matriz presente quando na verdade não há nenhuma matriz presente.
00: 22: 08.13 Agora, voltando ao sistema modelo de sarcoma de Ewing,
00: 22: 13.13 qual é o impacto da expressão da oncoproteína EWS-FLI1
00: 22: 21,05 em células 3T3 vis-à -vis migração?
00: 22: 24.14 E a restauração da expressão de zyxin também suprime um fenótipo migratório?
00: 22: 33.01 Então, aqui você pode ver o trabalho novamente de Amsellem e colegas
00: 22: 37.05 onde estamos observando a migração de células 3T3 normais
00: 22: 42.09 seguindo uma espécie de faixas de células e medindo
00: 22: 46,08 deslocamento líquido. E aqui você pode ver quando colocamos
00: 22: 51.04 o transgene EWS-FLI1 para essas células nas barras azuis,
00: 22: 56.23 vemos um aumento dramático na motilidade,
00: 23: 00.27 consistente com o que você esperaria de uma célula transformada.
00: 23: 05.06 E curiosamente. e nós vemos aqui embaixo
00: 23: 10.07 que os níveis de zyxin caíram como eu mostrei antes.
00: 23: 15.18 Agora, curiosamente, quando você coloca a zyxin de volta nessas células
00: 23: 19.10 quais são as consequências para a motilidade celular?
00: 23: 21.06 Bem, você vê uma restauração da motilidade mais lenta e do tipo selvagem.
00: 23: 27.06 Então, mais uma vez, parece que as mudanças nos níveis de zyxin
00: 23: 32.27 estão contribuindo substancialmente para o fenótipo móvel dessas células.
00: 23: 38,06 E eu acho que isso. algum insight sobre como isso
00: 23: 42.08 ocorre pode vir do trabalho do laboratório de Yu-li Wang, onde ele seguiu células individuais
00: 23: 50.07 que foram banhados em um substrato de poliacrilamida
00: 23: 55.05 em que ele embutiu contas de látex fluorescentes
00: 23: 57,29 para que ele pudesse realmente ver quanta força
00: 24: 00.19 é gerado em vários pontos de adesão,
00: 24: 04.08 pontos de amarração entre a célula e o substrato.
00: 24: 10.23 E ele notou uma coisa muito interessante, é que quando você
00: 24: 17.03 compare os mapas de tensão de tração, onde eles estão realmente medindo
00: 24: 20.21 o desvio dessas contas com a localização e intensidade
00: 24: 24.28 de expressão e localização de um GFP-zyxin,
00: 24: 29.24 o que eles observaram é que onde você tem forças de tração muito, muito altas
00: 24: 35.11 nesta vanguarda mostrada nesta cor vermelha mais profunda,
00: 24: 38.00 você vê que a área é realmente desprovida de zyxin.
00: 24: 42.01 Então, e então você pode acompanhar ao longo do tempo um único, o desenvolvimento de um único
00: 24: 48.18 adesão focal e veja se essa adesão focal começa
00: 24: 54.05 sem zyxin e, em seguida, o nível de zyxin sobe, sobe, sobe
00: 24: 58.14 e, em seguida, platôs. E surpreendentemente, como os níveis de zyxin estão subindo aqui
00: 25: 03.13 a tensão de tração está diminuindo.
00: 25: 06.20 Então, claramente, há uma relação inversa entre
00: 25: 09.15 a presença de zyxin nessas aderências focais
00: 25: 12.21 e estresse de tração, e esta poderia ser uma explicação funcional muito interessante
00: 25: 19.11 porque as células sem zyxin são mais migratórias,
00: 25: 24.25 ou seja, eles têm a capacidade de gerar uma maior ou mais sustentada
00: 25: 29,05 tensão de tração. E isso é algo que todos estamos muito interessados ​​em ver
00: 25: 33.01 com mais detalhes no futuro.
00: 25: 35.00 Portanto, em resumo desta parte da apresentação,
00: 25: 38.03 Descrevi o sarcoma de Ewing como uma doença letal e devastadora
00: 25: 46.02 da infância, felizmente raro que é causado por
00: 25: 51.14 uma translocação recíproca que dá origem à oncoproteína EWS-FLI1.
00: 25: 57.05 Expressão de EWS-FLI1 em um sistema de sarcoma modelo de Ewing
00: 26: 03.18 resulta em diminuição de zyxin e nossos estudos de nocaute
00: 26: 08.22 mostraram que as fibras de estresse de actina são menos robustas em células nulas de zyxin,
00: 26: 13.11 e que a diminuição da zyxin está associada com o aumento da motilidade celular.
00: 26: 17.23 Então, como essa motilidade aprimorada e o impacto no citoesqueleto de actina são alcançados?
00: 26: 26.02 Bem, aprendemos algo sobre isso, na verdade
00: 26: 29.19 por uma espécie de link surpreendente ao estudar Listeria,
00: 26: 35.02 um patógeno intracelular que é realmente o assunto de Julie Theriot
00: 26: 39.12 Apresentação do iBioSeminar, para que você possa aprender muito mais sobre
00: 26: 43.26 Listeria olhando para a sua apresentação.
00: 26: 46.00 Mas, os estudos de Listeria forneceram alguns insights importantes sobre a função da zyxin
00: 26: 53.20 e seu mecanismo de ação.
00: 26: 54.23 Resumidamente, Listeria é uma bactéria intracelular
00: 27: 00.08 que invade seu hospedeiro e é levado pela fagocitose.
00: 27: 04.12 É uma bactéria de origem alimentar que pode causar realmente
00: 27: 09.29 doença devastadora, particularmente em indivíduos imunocomprometidos.
00: 27: 13.25 Mas a biologia celular deste organismo é que ele
00: 27: 16.25 entra nesses fagossomas e consegue
00: 27: 20.22 escapar deste compartimento fagossômico
00: 27: 23.18 e é liberado no citoplasma, onde pode se replicar. E para o
00: 27: 27.08 para fins de nossa discussão, ele aproveita
00: 27: 29.17 o maquinário da célula hospedeira para montagem de actina,
00: 27: 32.02 crescendo esta bela cauda de cometa de actina longa,
00: 27: 36.23 que permite que ele se mova dentro da célula hospedeira e realmente gere estes
00: 27: 43.07 projeções de microspike que permitem invadir células vizinhas.
00: 27: 47.21 E, desta forma, é completamente capaz de se transmitir a partir de um
00: 27: 51.14 célula para a próxima sem nunca deixar a proteção do intracelular
00: 27: 56,25 ambiente. E a partir de uma variedade de investigações
00: 28: 02.02 agora entendemos que há uma única proteína presente na superfície da Listeria,
00: 28: 07.09 a proteína ActA, que é necessária e suficiente para a patogenicidade desta bactéria.
00: 28: 13,22 E é necessário e suficiente para a capacidade dessas bactérias de gerar
00: 28: 20.11 essas caudas de cometa de actina e, portanto, movem-se dentro da célula hospedeira e são transmitidas
00: 28: 26,03 de uma célula para a outra. A proteína ActA
00: 28: 31.00 é uma proteína que está ancorada na superfície bacteriana por meio de uma âncora de membrana
00: 28: 36.18 e, em seguida, tem uma longa área de sequência de proteínas que
00: 28: 43.07 está presente no citoplasma do hospedeiro.
00: 28: 45.29 E análise genética por meio de estudos mutacionais e estudos de deleção
00: 28: 51.03 mostraram que existem dois domínios funcionais realmente críticos na ActA,
00: 28: 55.18 que são importantes por sua capacidade de cooperar com o maquinário da célula hospedeira para construir
00: 29: 02.09 esta cauda de cometa de actina na superfície da bactéria.
00: 29: 06.02 Um é o domínio aqui que é crítico para a nucleação da montagem de actina.
00: 29: 09.21 E o outro é uma série de repetições de prolina que são críticas para a aceleração
00: 29: 15.04 de montagem de actina na superfície bacteriana.
00: 29: 18.06 E então, em colaboração com o laboratório de Daniel Louvard, fizemos um monte de
00: 29: 23.09 anticorpos contra Listeria ActA com a ideia de tentar procurar quais células endógenas
00: 29: 29.02 as proteínas ActA podem estar imitando na superfície da bactéria, a fim de
00: 29: 34.24 recruta maquinaria hospedeira e estimula a elaboração desta cauda de cometa de actina.
00: 29: 39.25 E quando fizemos isso, tivemos o resultado surpreendente
00: 29: 45.18 que os anticorpos contra Listeria ActA reconheceram
00: 29: 49.03 apenas uma única proteína eucariótica, uma única proteína humana,
00: 29: 53,27 pelo menos em nossos experimentos. E essa proteína acabou sendo zyxin.
00: 29: 57,27 E curiosamente, acontece que
00: 30: 01.01 este domínio rico em prolina realmente importante na ActA,
00: 30: 04.01 que é fundamental para a aceleração da montagem de actina,
00: 30: 06.15 é quase completamente conservado em zyxin,
00h30: 10h10 dando origem à ideia de que zyxin pode ser capaz de estimular a montagem de actina.
00: 30: 16.07 E, de fato, o zyxin compartilha com a ActA a capacidade
00: 30: 20.07 para interagir com proteínas da família Ena / VASP,
00: 30: 23.08 que são reguladores críticos da montagem de actina
00: 30: 27.19 que recrutam profilina e actina e por múltiplos mecanismos
00: 30: 32,26 melhorar a montagem de actina. Então, voltando ao modelo de sarcoma de Ewing então,
00: 30: 41.13, vemos que nas células do sarcoma modelo de Ewing que expressam o EWS-FLI1
00: 30: 47.03 transgene, que está associado à perda de zyxin,
00: 30: 54.14 diminuição das fibras de estresse de actina, que estão associadas à perda de zyxin,
00: 30: 58.15, assim como o aumento da motilidade. E então, eu acho que é
00: 31: 03.16 vai ser extremamente interessante para explorar mais
00: 31: 06.21 qual é o papel da zyxin no paciente humano
00: 31: 10.10 amostras e avaliar se há ou não perda de zyxin
00: 31: 14.23 está relacionado a doenças mais agressivas.
00: 31: 18.05 Curiosamente, nas experiências Amsellem originais
00: 31: 23.10 eles também, além de olharem para a motilidade,
00: 31: 26.02 verificou se o zyxin tem um impacto na fixação independente
00: 31: 31.25 crescimento de células deste fibroblastos transformados com EWS-FLI1.
00: 31: 35.19 E eles descobriram que teve um impacto realmente dramático.
00: 31: 40.11 Então, aqui você pode ver novamente as células 3T3 normais
00: 31: 43.26 que não são transformados não crescem em ágar mole,
00: 31: 49.06 e então você não tem nenhuma colônia.
00: 31: 51.21 Se você expressar, se você transformar essas células com um controle
00: 31: 57.19 vetor, você não vê nenhuma mudança.
00: 32: 00.15 Se você expressar mais zyxin nessas células, não verá nenhuma mudança.
00: 32: 04.08 Mas olhe, como vimos no experimento de clonagem de ágar mole original que mostrei a vocês
00: 32: 09.11 antes, quando você expressa EWS-FLI1 nessas células 3T3, você vê
00: 32: 15.12 um aumento dramático na capacidade dessas células de crescer em
00: 32: 19,14 ágar mole. E você pode suprimir essa capacidade reintroduzindo zyxin naqueles
00: 32: 25,19 células. Então, isso foi, além da motilidade
00: 32: 29.18 fenótipo, acho um dado muito impressionante que
00: 32: 33.28 sugeriu que zyxin também pode estar influenciando
00: 32: 37.21 proliferação celular ou apoptose e contribuindo para essa supressão
00: 32: 45,07 de crescimento celular independente de ancoragem.
00: 32: 48.15 Curiosamente, eu disse que é muito, muito difícil
00: 32: 54.11 tratar o sarcoma de Ewing, então há muitos
00: 32: 56.11 muitos investigadores estão realmente trabalhando duro para identificar novas estratégias
00: 33: 01.17 para intervenção terapêutica com esta doença.
00: 33: 05.26 E um conceito novo interessante no qual vários grupos estão trabalhando
00: 33: 10.29 é o uso de um anticorpo dirigido contra uma célula
00: 33: 15,21 componente de superfície, CD99, que é altamente expresso
00: 33: 19,29 nas células do sarcoma de Ewing, células tumorais humanas.
00: 33: 24.21 E acontece que se você tomar este anticorpo anti CD99 e
00: 33: 29.14 expor as células do sarcoma de Ewing a este anticorpo, o agrupamento daquele
00: 33: 36.10 marcador de superfície celular de alguma forma induz a apoptose das células do sarcoma de Ewing
00: 33: 43.03 por um mecanismo que neste momento realmente não é compreendido.
00: 33: 46.20 Quer dizer, não entendemos ainda qual é a função normal do CD99.
00: 33: 50.08 Mas porque é tão altamente enriquecido nas células do sarcoma de Ewing
00: 33: 53.19 e como o envolvimento de CD99 causa apoptose, é
00: 33: 58.25 sendo realmente pensado como uma potencial intervenção terapêutica para o sarcoma de Ewing.
00: 34: 05.10 E curiosamente, ao tentar entender
00: 34: 09.18 como agrupamento e engajamento de anti-CD99
00: 34: 13,23 com anticorpos anti-CD99 causa apoptose.
00: 34: 18.14 os investigadores descobriram que a zyxin é um componente crítico nessa via apoptótica.
00: 34: 27.21 E aqui você pode ver algumas análises de citometria de fluxo olhando para
00: 34: 33,03 a proporção de células viáveis ​​para células apoptóticas ou necróticas
00: 34: 36.15 antes ou depois do tratamento com anti-CD99, e
00: 34: 44.14 com níveis normais de zyxin ou níveis de zyxin suprimidos.
00: 34: 48.18 E aqui você pode ver que na população de células normais
00: 34: 53,06 76% das células estão no canal viável aqui.
00: 35: 00.01 E se você envolver essas células com o anticorpo monoclonal anti-CD99,
00: 35: 08.24 que é chamado de 0662, você pode ver uma mudança do canal viável para
00: 35: 14.26 o canal apoptótico consistente com a ideia de que
00: 35: 19.15 o anticorpo monoclonal pode induzir sinalização apoptótica
00: 35: 22,23 nessas células. Agora, isso não muda nada quando
00: 35: 29.04 você usa um construto antisense de controle,
00: 35: 33.12 mas se você usar uma construção que é projetada especificamente para derrubar os níveis de zyxin,
00: 35: 38.04 o que você vê é que você tem uma redução na resposta apoptótica
00: 35: 46.16 sugerindo que a zixina está pelo menos parcialmente envolvida ou parcialmente necessária
00: 35: 52.00 para a capacidade do anti-CD99 de induzir apoptose.
00: 35: 56.09 E então, isso leva a uma adição interessante ao
00: 36: 04.03 antes de pensar sobre a função zyxin que, além de
00: 36: 08.17 contribuindo para a regulação da motilidade,
00: 36: 12.28 que pode realmente ser um fator pró-apoptótico em algumas circunstâncias
00: 36: 17.29 e a perda de zyxin pode contribuir para o aumento da sobrevida.
00: 36: 21.16 Então, isso é bastante interessante no sentido de que
00: 36: 24.06 sabemos que a expressão de EWS-FLI1 causa redução na expressão de zixina neste
00: 36: 30.26 modelo 3T3, e isso seria então associado com
00: 36: 34.06 aumento da motilidade e aumento da sobrevivência com base nos estudos baseados em células.
00: 36: 39.26 E então eu acho que um objetivo futuro muito importante é realmente agora
00: 36: 44.07 vá e teste se o nível de expressão de zyxin é um indicador de estágio do tumor
00: 36: 50.23 e, além disso, se irá prever ou não a resposta terapêutica.
00: 36: 56.18 Por exemplo, se os níveis de zyxin forem extremamente baixos,
00: 36: 59.22 que pode nos dar a percepção de que esses tumores
00: 37: 04.08 têm maior potencial metastático porque
00: 37: 08.07 do aumento da motilidade associada à perda de zyxin.
00: 37: 10.29 Curiosamente, muitos investigadores estão agora começando a descobrir que o zyxin está com baixa regulação
00: 37: 18.08 em uma variedade de tumores, e aqui está um exemplo que mostra que é regulado para baixo
00: 37: 24.12 no câncer de bexiga invasivo. Aqui está o tumor superficial onde a coloração marrom
00: 37: 29.18 indica que ainda há uma expressão robusta de zyxin.
00: 37: 32.11 E neste carcinoma invasivo você vê
00: 37: 35.09 muito pouca expressão de zyxin, se houver.
00: 37: 38.15 E esses investigadores fizeram uma análise muito extensa para olhar
00: 37: 42,26 na associação de uma série de biomarcadores potenciais
00: 37: 48.14 com o estágio e grau do tumor e descobriu que os níveis de expressão para zyxin,
00: 37: 54.02, bem como alguns outros marcadores, foram diretamente associados ao estágio e grau do tumor.
00: 37: 59.09 Então, este poderia ser outro importante e valioso
00: 38: 03.18 insight que permite que os médicos sejam capazes de identificar tumores
00: 38: 08.28 e diagnosticá-los com um maior grau de resolução usando
00: 38: 12.28 esses tipos de biomarcadores para refinar ainda mais
00: 38: 16.06 o grau do tumor. Agora, mencionei no início que as aderências focais também são
00: 38: 22.11 muito importante para se comunicar com o núcleo da célula,
00: 38: 25,24 e que esses sinais que emanam de aderências focais
00: 38: 30.26 também influenciam a expressão gênica. E acho que um dos maiores desafios
00: 38: 34.22 que enfrentamos como biólogos celulares é
00: 38: 38.04 sabendo que isso ocorre, não entendendo bem qual é o mecanismo
00: 38: 42.13 de ação pela qual esses eventos que estão acontecendo na superfície da célula
00: 38: 47.05 são comunicados ao núcleo para regular diretamente
00: 38: 51,01 expressão do gene. E tenho certeza de que haverá uma série de mecanismos
00: 38: 57.01 envolvidos aqui, mas uma coisa que eu gosto de apontar é que a proteína zyxin
00: 39: 02.25 pode ser um candidato a se comunicar com o núcleo da célula.
00: 39: 07.00 E, de fato, um aluno do meu laboratório reconheceu há alguns anos
00: 39: 11.12 que a proteína zyxin tem sequência que se parece muito com
00: 39: 16.16 um sinal de exportação nuclear, mostrando esses resíduos de leucina altamente ordenados
00: 39: 22.11 que estão em posições semelhantes aos sinais de exportação nuclear
00: 39: 26,13 na proteína Rev do HIV1, bem como no IkB.
00: 39: 31.17 Então, olhamos para ver se excluímos aquela região rica em leucina de zyxin
00: 39: 37.16 teve um impacto na distribuição subcelular de zyxin,
00: 39: 41.10 e aqui você pode ver a expressão de zyxin de tipo selvagem nas células. E em estado estacionário
00: 39: 46.18 você realmente vê a zyxin concentrada nessas aderências focais,
00: 39: 50.03 e muito pouco zyxin, se houver, detectável por
00: 39: 52.13 imunocitoquímica dentro do núcleo.
00: 39: 54.11 Mas, se excluirmos apenas esses 17 aminoácidos da zixina, esta região rica em leucina,
00: 40: 00.06 e agora pergunte onde está essa proteína concentrada,
00: 40: 03.23 o que vemos é esta mudança realmente dramática na distribuição subcelular de zyxin com
00: 40: 09.07 a proteína migrando realmente substancialmente dessas aderências focais e acumulando
00: 40: 14,28 no compartimento nuclear.
00: 40: 17,26 Então, para testar mais se isso
00: 40: 22.06 sequência de zyxin realmente funciona como um sinal de exportação nuclear,
00: 40: 27.05 fizemos um experimento clássico onde pegamos aquela sequência de zyxin
00: 40: 31.26 e o ​​enganchei em uma proteína carreadora, neste caso estou mostrando a você
00: 40: 36.28 aqui GST, glutationa S-transferase, e perguntou
00: 40: 42.03 se injetarmos ou não GST normal ou GST marcado com esta sequência de zyxin
00: 40: 49,07 diretamente nos núcleos das células, se a sequência de zyxin suportará
00: 40: 54.06 a exportação nuclear dessa proteína GST.
00: 40: 57,27 GST é muito grande para se difundir através dos poros nucleares, então, se você injetar
00: 41: 02.06 para o núcleo na ausência de um sinal de exportação nuclear funcional,
00: 41: 06.00 será retido no núcleo.
00: 41: 07.17 E isso é exatamente o que você vê com o GST não modificado.
00: 41: 12.10 Você microinjeta no núcleo, e esta é uma versão com marcação fluorescente de GST,
00: 41: 17.05 coloque-o no núcleo, e ele fica lá.
00: 41: 20.09 Mas se você tomar apenas, neste caso, os aminoácidos 319 a 335 de zyxin
00: 41: 26.07 e anexar isso ao GST por meio de engenharia genética,
00: 41: 31.05 expressar essa proteína, rotulá-la e injetar essa proteína no núcleo,
00: 41: 34.29 você vê que muito, muito rapidamente essa proteína acaba no citoplasma,
00: 41: 41.09 ilustrando que essa sequência curta de zyxin tem a capacidade
00: 41: 45.03 para servir como um sinal de exportação nuclear
00: 41: 46,26 e transporte GST do núcleo para o citoplasma.
00: 41: 50.24 Isso foi muito emocionante porque realmente sugeria que a proteína zyxin tinha um sinal de exportação nuclear
00: 42: 00.21 e talvez estivesse presente em ambas as adesões focais
00: 42: 04.29 e o compartimento nuclear e poderia fazer parte do
00: 42: 07.18 maquinaria que realmente ligava funcionalmente a superfície celular ao núcleo.
00: 42: 12.15 No entanto, é claro, quando você está cortando pedaços de proteínas
00: 42: 15.14 e ao colocá-los em outras proteínas, podem acontecer coisas inesperadas,
00: 42: 20.21 e então realmente queríamos ter um mecanismo direto para verificar se o zyxin alguma vez
00: 42: 26.14 vai para o núcleo. E isso também foi importante
00: 42: 28.20 porque, como eu indiquei, no estado estacionário nós realmente não vemos zyxin
00: 42: 31.25 no núcleo, então desenvolvemos um ensaio para relatar
00: 42: 36.17 se a zixina vai para o núcleo.
00: 42: 39.05 E, eu acho, este é um experimento que David Nix no meu laboratório
00: 42: 43.08 fez quando ele era um estudante de graduação,
00: 42: 44.12 e acho realmente incrível que esse experimento tenha funcionado.
00: 42: 47.25 Ele decidiu testar se a zyxin vai ou não para o núcleo
00: 42: 53.21 pela injeção de um coquetel de dois anticorpos diferentes
00: 42: 57.17 diretamente nos núcleos das células individuais.
00: 43: 02.07 E os dois anticorpos eram um anticorpo monoclonal anti-zyxin
00: 43: 06.23 e um anticorpo de controle correspondente que não reconheceu nenhuma proteína celular.
00: 43: 11.25 E mais uma vez esses anticorpos, que foram marcados com fluorocromos de cores diferentes,
00: 43: 18.00 são muito grandes para se difundir através dos poros nucleares.
00: 43: 22.00 Então você esperaria que eles fossem retidos no
00: 43: 23,28 núcleo, a menos que sejam especificamente exportados
00: 43: 27,21 por ligação a outro parceiro de proteína.
00: 43: 31.08 Então, aqui começamos, injetamos esses dois anticorpos no núcleo das células.
00: 43: 36.24 Zyxin é, como mencionei, concentrado no citoplasma,
00: 43: 39.20 e se o zyxin não se movesse para o núcleo, você esperaria
00: 43: 44.22 ao longo do tempo para que os anticorpos permaneçam presos no núcleo
00: 43: 48.02 e para a zyxin permanecer no citoplasma.
00: 43: 51.23 Em contraste, se houver um vaivém acontecendo e zyxin
00: 43: 55.22 está se movendo das aderências focais para o núcleo e vice-versa
00: 43: 59,26 novamente, então podemos esperar uma de duas coisas.
00: 44: 03.08 Podemos esperar que a própria zyxin fique presa no núcleo
00: 44: 09.09 ao longo do tempo junto com seu parceiro de anticorpo.
00: 44: 13,05 Ou, alternativamente, podemos imaginar que a zyxin poderia migrar para o núcleo,
00: 44: 18.17 ligam o anticorpo anti-zyxin específico,
00: 44: 21.22 e porque o zyxin abriga um sinal de exportação nuclear,
00: 44: 25.17 ele poderia realmente extrair aquele parceiro zyxin do núcleo
00: 44: 31.25 e facilitar sua exportação nuclear. E surpreendentemente,
00: 44: 35.16 isso é exatamente o que vimos.
00: 44: 38.17 Então, aqui você pode ver uma célula na qual injetamos
00: 44: 43.07 controlar o anticorpo em A e o anticorpo anti-zyxin juntos no núcleo da célula
00: 44: 49,24 em B. E este é um ponto de tempo muito inicial após a injeção, e você pode ver
00: 44: 54.06 que ambos os anticorpos estão proeminentemente concentrados dentro
00: 44: 58.07 o núcleo da célula.
00: 45: 00.08 E se esperarmos o tempo, e então olharmos, o que vemos (e esta é uma célula diferente, é claro)
00: 45: 05.26 o anticorpo de controle marca o local da injeção. É retido no núcleo.
00: 45: 11.28 Mas olhe aqui, o anticorpo anti-zyxin que foi co-injetado no núcleo da célula
00: 45: 18.18 está completamente ausente deste núcleo
00: 45: 21.05 e agora começou a preencher essas aderências focais.
00: 45: 25.17 Portanto, este foi um resultado muito, muito impressionante
00: 45: 28.13 que nos ilustrou aquela proteína que estava no citoplasma,
00: 45: 32.06 a proteína zyxin no citoplasma pode mover-se para o núcleo.
00: 45: 35.08 E aquela proteína uma vez habitando no núcleo
00: 45: 38,22 poderia sair do núcleo e voltar às aderências focais,
00: 45: 42.15 na verdade, sugerindo claramente um mecanismo de comunicação
00: 45: 46,15 entre esses dois compartimentos celulares.
00: 45: 49.17 E agora podemos mostrar o uso da leptomicina, um agente que inibe
00: 45: 56.15 exportação nuclear, que de fato se tratarmos as células com leptomicina para inibir
00: 46: 02.01 exportação nuclear de que a zixina começa a se acumular no compartimento nuclear.
00: 46: 08.25 E se olharmos para grandes populações de células,
00: 46: 10.16 vemos que isso ocorre de forma assíncrona
00: 46: 13.16 ilustrando que deve haver alguns sinais fisiológicos
00: 46: 16.17 que estimulam a liberação de zyxin das aderências focais
00: 46: 21,24 e a importação da proteína para o núcleo.
00: 46: 25.21 E, claro, uma pergunta não respondida muito importante
00: 46: 29,26 é o que esses sinais podem ser.
00: 46: 32.26 Então, qual poderia ser o significado funcional do transporte nuclear de zyxin?
00: 46: 39.00 Bem, acho que existem duas possibilidades gerais. Uma é que a proteína zyxin
00: 46: 43.20 poderia servir como um fator nuclear. Você pode imaginar que o zyxin
00: 46: 48.15 a proteína é meio que retida nas aderências focais
00: 46: 51.14 onde está aguardando algum tipo de sinal
00: 46: 55.11 ou informações do ambiente extracelular
00: 46: 59.02 e sob certas condições seria lançado,
00: 47: 02.20 com permissão para entrar no compartimento nuclear, e talvez até
00: 47: 06.05 participam diretamente na regulação da expressão gênica ou alguma outra função nuclear.
00: 47: 11.00 E esta é uma ideia realmente intrigante, embora até hoje
00: 47: 18.16 não há realmente nenhuma evidência direta para um papel para zyxin
00: 47: 24.14 dentro do núcleo, e particularmente não na regulação da expressão gênica.
00: 47: 29.19 No entanto, vou apontar que a proteína zyxin, lembrá-lo de que a proteína zyxin
00: 47: 34.16 tem esses domínios LIM, que também são encontrados em muitos reguladores transcricionais,
00: 47: 40.22 então permanece, eu acho, uma possibilidade intrigante de que zyxin
00: 47: 44.09 pode estar influenciando diretamente alguma atividade nuclear.
00: 47: 47.21 A outra alternativa é mais geral que sugere que zyxin é, novamente,
00: 47: 55.10 sentado nessas aderências focais aqui, e então em resposta
00: 48: 00.18 novamente, para algum sinal, talvez ele pudesse se mover para o núcleo
00: 48: 04.10 e recupera uma proteína do núcleo,
00: 48: 09.13 devolvendo-o ao citoplasma e, assim, regulando para baixo
00: 48: 11,28 a atividade desse fator. Ou alternativamente
00: 48: 15.01 pode ser um acompanhante realmente projetado
00: 48: 20,24 para reter um fator nuclear no citoplasma.
00: 48: 24,24 Então, por exemplo, zyxin poderia estar sentado na adesão focal
00: 48: 28.20 segurando a proteína que tem um sinal de localização nuclear.
00: 48: 31.17 Quando essa proteína é ligada à zyxin, se alguma vez fosse para o núcleo, seria transportada
00: 48: 36.07 rapidamente por causa do NES em zyxin.
00: 48: 38.11 Mas, sob certas condições, você poderia imaginar que essa proteína seria
00: 48: 42.09 especificamente liberado de zyxin, com permissão para se mover para o núcleo
00: 48: 46.07 para ativar alguma função nuclear.
00: 48: 48,29 Então, novamente, agora entendemos que esta proteína zyxin
00: 48: 52.15 alterna claramente entre as aderências focais,
00: 48: 54.19 essas zonas de sinalização realmente importantes que são sensíveis a pistas extracelulares.
00: 48: 59.22 Ele faz um vaivém entre essas zonas e o compartimento nuclear.
00: 49: 04.27 E acho que o próximo desafio é tentar identificar o que
00: 49: 11.00 sinais específicos são que estimulam a liberação de zyxin
00: 49: 16.09 no núcleo, e qual a sua função específica pode haver.
00: 49: 20.00 Curiosamente, agora é apreciado, apenas no último
00: 49: 24,10 vários anos, que muitas proteínas de domínio LIM
00: 49: 27.19 tem esse tipo muito interessante de dualidade
00: 49: 31.14 em termos de sua distribuição subcelular.
00: 49: 33,24 Todas essas proteínas listadas aqui são proteínas que residem em
00: 49: 41.08 no citoesqueleto de actina ou nas aderências focais, e também têm
00: 49: 45,24 a capacidade de se mover para o núcleo.
00: 49: 48.03 Então eu acho que há uma classe dessas moléculas
00: 49: 50.25 que vai tocar um jogo muito interessante
00: 49: 53.17 papel na regulação da função nuclear
00: 49: 56.13 e em comunicação entre o citoesqueleto e
00: 50: 00.14 o núcleo, verdadeiros candidatos à comunicação intracelular.
00: 50: 03.26 Então, vou encerrar aí e apenas agradecer a algumas das pessoas no meu laboratório
00: 50: 07.17 que participou no trabalho que descrevi.
00: 50: 11.08 Acho que é um momento muito emocionante em que estamos apreciando
00: 50: 16.00 muito mais os papéis importantes das proteínas
00: 50: 19,24 que estão presentes nessas zonas adesivas especializadas,
00: 50: 24.09 e começando a ver não apenas como essas proteínas
00: 50: 27.14 influenciam o comportamento celular, como a motilidade, talvez
00: 50: 31.05 sinalização apoptótica, talvez comunicação com o núcleo,
00: 50: 35.22, mas também estão começando a ser capazes de colocar esses caminhos
00: 50: 40.24 em um contexto mais amplo e aprecie como a perturbação
00: 50: 44,17 das funções dessas moléculas nessas vias
00: 50: 47.05 pode impactar em doenças humanas.


Resumo

Objetivo:

Foi demonstrado que as células T nulas CD4 + CD28 estão associadas a eventos coronários recorrentes e são sugeridas como biomarcadores em potencial e alvo terapêutico. Não se sabe se as células T nulas CD4 + CD28 se associam a eventos cardiovasculares pela primeira vez. Examinamos células T CD4 + CD28 nulas em uma coorte populacional prospectiva e em pacientes com aterosclerose avançada.

Abordagem e resultados:

Células T nulas CD4 + CD28 foram quantificadas em 272 indivíduos experimentando um evento coronário pela primeira vez durante até 17 anos de acompanhamento e 272 controles pareados por idade e sexo em um estudo de caso-controle, aninhado no Malmö de base populacional Dieta e estudo do câncer. O tercil mais alto de células T nulas CD4 + CD28 foi associado a uma menor incidência de eventos coronários pela primeira vez em comparação com o tercil mais baixo (odds ratio, 0,48 [IC 95%, 0,29-0,79], P= 0,004) ao ajustar para fatores de risco de Framingham. Essa associação permaneceu significativa para eventos registrados após & gt9 anos de acompanhamento, quando a maioria dos eventos coronários ocorreu, mas não durante os primeiros 9 anos de acompanhamento, apesar da razão de chances semelhante. Além disso, analisamos células T CD4 + CD28 nulas em 201 pacientes com aterosclerose avançada submetidos à endarterectomia carotídea. A razão de risco ajustada para eventos cardiovasculares em pacientes com aterosclerose avançada foi de 2,11 (IC de 95%, 1,10–4,05, P= 0,024), comparando o mais alto com o mais baixo tercil de células T nulas CD4 + CD28.

Conclusões:

Nossos achados revelam associações complexas entre células T CD4 + CD28 nulas e doença cardiovascular. Embora confirmemos as associações positivas relatadas com um prognóstico adverso em pacientes com doença já estabelecida, as associações opostas com eventos coronários pela primeira vez na coorte de base populacional podem limitar o uso clínico de células T CD4 + CD28 nulas.


Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Daniel L. Purich por suas sugestões úteis e ao Dr. Nicolas Demaurex por realizar as investigações do Fura-2.

Este manuscrito foi financiado pelo National Institutes of Health (RO1AI / GM 23262, RO1HL54188) e uma bolsa da Zyma Research Foundation.

O endereço atual de W. Witke é EMBL, Mouse Biology Program, 00016 Monterotondo-Scalo, Itália.

Abreviações usadas neste artigo: [Ca 2+]eu, intracelular [Ca 2+]eu ES, tronco embrionário MCSF, fator estimulador de colônia de macrófagos PAF, fator de ativação de plaquetas PIP2, fosfatidilinositol 3,4 ou 4,5-bisfosfato.


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Quimiotaxia

Quimiotaxia é um sistema de transdução de sinal que confere a capacidade das células de responder a gradientes químicos espaciais e temporais. Em procariotos e eucariotos unicelulares, a quimiotaxia controla o comportamento móvel. No multicelular eucariotos, a quimiotaxia desempenha um papel importante na determinação da migração de células em muitos processos biológicos, incluindo resposta imune, desenvolvimento, embriogênese, cicatrização de feridas e angiogênese (1, 2, 3, 4). Durante a embriogênese, as células respondem a estímulos quimiotáticos, possibilitando a organização de tecidos e órgãos, e a migração neuronal (5, 6, 7). Uma elaborada rede de quimioatraentes direciona os leucócitos para seus locais corretos e facilita as interações célula-célula no sistema imunológico. A quimiotaxia é fundamental para a cicatrização de feridas e opera em estados de doença, como metástases e aterosclerose (8, 9, 10, 11, 12).

Embora o aparelho de motilidade seja diferente entre os organismos, o mecanismo geral de controle da quimiotaxia é conservado ao longo de todos procariota bactérias e arquéias. Central para o controle quimiotático é o sistema de dois componentes em que a fosforilação de um regulador de resposta reflete a fosforilação de um histidina autocinase que detecta parâmetros ambientais (117). Este é o modo mais comum de sistema de transdução de sinal em bactérias, e o sistema de dois componentes controla diversos processos, como expressão gênica, esporulação e quimiotaxia.

As proteínas de quimiotaxia procariótica compreendem quatro grupos - um grupo de reconhecimento e transdução de sinal, um grupo de excitação, um grupo de adaptação e um grupo de remoção de sinal (para desfosforilar CheY-P). O grupo de reconhecimento e transdução de sinal inclui os receptores e proteínas de ligação ao ligante, que são capazes de se ligar a efetores fora da célula. Alguns receptores, no entanto, são citoplasmáticos: (modelo de quimiotaxia geral de imagem: proteínas de tabela em quimiotaxia). Os procariontes reagem como sensores pontuais, determinando gradientes estáticos por amostragem temporal.

O mecanismo de quimiotaxia em eucariótico as células são diferentes das dos procariotos, embora as células eucarióticas também respondam a gradientes químicos de sinalização. Em virtude de seu tamanho maior, os eucariotos são capazes de detectar gradientes de concentração ao longo de suas membranas plasmáticas, onde as diferenças de ocupação do receptor fornecem dados para detecção de discrepância de gradientes. Em resposta aos gradientes quimioatraentes, o desequilíbrio entre a ação do ativador e a ação do inativador resulta em uma sinalização persistente orientada espacialmente. A maioria das células eucarióticas emprega GPCRs para detectar esses sinais químicos, de modo que a sinalização é amplificada por um feedback positivo baseado no suprimento de substrato que atua por meio de pequenas proteínas G. Essa amplificação é ativada apenas na presença contínua do gradiente de sinal externo, proporcionando assim o mecanismo de sensibilidade às alterações do gradiente. Outros receptores de membrana incluem aminoácidos, insulina e peptídeos vasoativos. Os receptores quimiotáticos são desencadeados por peptídeos formil, quimiocinas (α, CXC β, CC δ, CX3C γ, C) e leucotrienos (mediadores lipídicos eicosanóides autócrinos e parácrinos derivados do ácido araquidônico pela 5-lipoxigenase).

Após a detecção do sinal por um GPCR, um ativador de ação local (PI3-quinase) e um inativador de ação global (PTEN ou uma fosfatase semelhante) são controlados de forma coordenada pela ativação da proteína G [1]. O sistema de sinalização se adapta às mudanças espacialmente homogêneas no quimioatraente. Em gradientes quimioatraentes, um desequilíbrio entre a ação do ativador e do inativador resulta em uma sinalização persistente orientada espacialmente, amplificada por um feedback positivo baseado no suprimento de substrato agindo através de pequenas proteínas G. A amplificação é ativada apenas na presença contínua do gradiente de sinal externo, fornecendo assim o mecanismo de sensibilidade às alterações do gradiente.

Durante o curso da evolução, os cílios eucarióticos foram adaptados para funcionar como mecanorreceptores e quimiorreceptores. Os cílios e flagelos eucarióticos diferem dos flagelos das eubactérias, que por sua vez diferem dos flagelos das arqueobactérias. Organismos como Amoebae e Tetrahymena são capazes de rastejar ou nadar, utilizando o citoesqueleto / cílios / flagelos. O bolor limoso, Dictyostelium discoideum começa a detecção de gradiente com modificação da membrana fosfolipídica na borda de ataque da célula. A modificação inclui o recrutamento de várias proteínas para a membrana, iniciando um processo que culmina na extensão do pseudópode em direção ao quimioatrator. As células expostas a gradientes quimioatraentes superficiais respondem com forte acúmulo da enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K, PI3K) e seu produto D3-fosfoinositídeo (PIP3) na membrana plasmática exposta à concentração mais alta de quimioatraente, enquanto a enzima de degradação de PIP3 PTEN e seu produto fosfosfato de fosfatidilinositol (PIP2) se localizam em um padrão complementar [Gamba]. Este evento inicial de quebra de simetria é uma etapa obrigatória para o movimento celular direcionado eliciado por quimioatraentes. Foi sugerido que 'o sensoriamento direcional é a consequência de um processo de ordenação de fase mediado pela difusão de fosfoinositídeo e conduzido pela distribuição do sinal quimiotático'.

Quando faminto, D. discoidem as células se diferenciam, polarizam e migram direcionalmente em direção ao monofosfato de adenosina cíclico 3 ', 5'-cíclico (cAMP). O cAMP é detectado por quatro GPCRs, designados cAR1-cAR4, que são acoplados a uma única proteína G heterotrimérica (19). Leucócitos de mamíferos acoplam 20 tipos de quimioatraentes, receptores de quimiocinas à mesma proteína G, Gi (20, 21). Os sistemas de mamíferos também empregam aumentos transitórios induzidos por quimioatraentes em fosfoinositídeos (PIs), 1 cAMP, cGMP, trifosfato de inositol (IP3) e Ca2 +, e rearranjos no citoesqueleto (16, 22). A PI3-quinase eleva os níveis locais de PIP3, que determina os locais de novas projeções cheias de actina. PIP3 é um importante intermediário na sinalização quimiotática em D. discoideum, amebas e leucócitos de mamíferos (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34). 'O controle robusto dos níveis temporais e espaciais de PIP3 é alcançado pela regulação recíproca de PI3K e PTEN.' [2, fft]

Ras, PI3K e TOR são conhecidos como reguladores principais do crescimento celular e desempenham um papel crítico na regulação do citoesqueleto de actina, polaridade celular e movimento celular, indicando que várias etapas na via de transdução de sinal regulam coordenadamente a motilidade celular.

A quimiotaxia é importante no início do desenvolvimento embriológico e no sistema imunológico. Em organismos multicelulares, tipos específicos de células, como as do sistema imunológico / hematológico (granulócitos, monócitos, macrófagos, linfócitos) e células especializadas e independentes (mastócitos, células endoteliais, fibroblastos e, infelizmente, células tumorais) são capazes de respostas móveis a sinais químicos. A motilidade e a migração empregam moléculas de adesão celular.

Џ bela animação em Flash 8 - Vida Interna da Célula, que mostra a quimiotaxia em ação, e Interpretação da Vida Interna da Célula Џ

Além da quimiotaxia, as células realizam:
1) quimiocinesia - examinando o ambiente,
2) haptotaxia - geração de um gradiente quimioatraente no ECM empregado na migração transendotelial e angiogênese, e
3) necrotaxia - resposta negativa ou positiva a quimioatraentes liberados de células apoptóticas ou necróticas.


Volume 2

56.5.4 Troca de Na + / H + em Fisiologia Gástrica

PH intracelular (pHeu) a regulação em células epiteliais gástricas e o papel da troca Na + / H + neste processo são de considerável interesse devido ao pH periodicamente muito baixo do lúmen gástrico. Embora haja alguma discordância sobre o pHeu estabilidade em repouso e células parietais isoladas estimuladas, 375.376 sua capacidade de manter ou aumentar o pH intracelular apesar de grandes fluxos de H + é bastante notável. A troca Na + / H +, descrita pela primeira vez na mucosa gástrica por Paradiso et al., 377.378, desde então, foi implicada no pH da mucosa gástricaeu homeostase, 379 regulação do volume celular associada à estimulação secretora, 380 e restituição epitelial gástrica após lesão. 381.382 Muitas das isoformas NHE identificadas até o momento (exceto NHE5, NHE6 e NHE9 ver Fig. 56.2) são expressas no epitélio gástrico, com NHE1–4 sendo melhor descrito.

O NHE1 é expresso nas membranas basolaterais das células mucosas da superfície e do pescoço, células principais e, em menor extensão, nas células parietais. 144.383 Avaliações morfométricas da histologia gástrica em camundongos NHE1 - / - revelaram adelgaçamento do epitélio glandular e alargamento considerável do espaço intersticial entre as glândulas gástricas. 104 Essas mudanças morfológicas não foram atribuíveis à inflamação e não pareceram se traduzir em perturbações detectáveis ​​na homeostase ácido-base sistêmica sem diferença no pH do sangue total, PCO2, PO2, ou concentração de bicarbonato entre camundongos NHE1 - / - e seus companheiros de ninhada de tipo selvagem. 104 Não se sabe se o crescimento atrofiado observado em camundongos NHE1 - / - com 2 semanas de idade ou mais pode ser atribuído a alterações na morfologia epitelial gástrica.

O NHE2 tem uma distribuição tecidual semelhante à do NHE1 na mucosa gástrica. 144 Embora sem suporte imuno-histoquímico, acreditava-se que o NHE2 estava localizado na membrana basolateral. A sensibilidade incomumente alta de NHE2 ao pH extracelular levou os investigadores a especular que a alcalinização basolateral, durante a secreção ácida estimulada pelas células parietais, resulta em aumento da atividade NHE basolateral - provavelmente mediada por NHE2. Também foi especulado que o aumento da atividade NHE2 na membrana basolateral em resposta à alcalinização intersticial poderia permitir que esta isoforma participasse da secreção ácida, viabilidade das células parietais e proteção da mucosa. De fato, os mutantes homozigotos NHE2 exibiram alterações marcantes na histologia e função da mucosa gástrica. Os camundongos NHE2 - / - têm um número drasticamente reduzido de células parietais e principais, resultando em uma perda de secreção de ácido líquida. 156 A redução do número de células zimogênicas pode ser secundária à diminuição da viabilidade das células parietais, que se desenvolvem normalmente, mas sofrem necrose prematuramente. 156 Esse processo é acompanhado por inflamação progressiva na forma de gastrite corporal difusa que varia de infiltração neutrofílica transmural a uma atrofia profunda consistente com acloridria crônica, dependente da idade e do estágio da inflamação. 157 No entanto, Hue et al. 384 relataram que a proteína NHE2 está localizada nas membranas apicais do epitélio da superfície gástrica e que o fator trifólio 3 (TFF3) falhou em induzir a restituição da mucosa de lesões microscópicas (cicatrização de feridas) quando o NHE2 foi inibido. Mais recentemente, estudos in vitro com células RGM1 epiteliais gástricas de rato mostraram inesperadamente que a expressão forçada de NHE2 diminuiu significativamente a velocidade de restituição após pré-incubação com ácido. 385 A discrepância entre os estudos in vivo anteriores e esses estudos in vitro ainda precisa ser abordada.

A expressão da isoforma NHE3 no estômago é um tanto controversa. Embora documentado em ratos, 184 humanos e cobaias, 386 não foi detectado na mucosa gástrica de coelhos. 144,183 De acordo com Kulaksiz et al., 386 a expressão da proteína NHE3 estava confinada à membrana basolateral das células mucosas da superfície em espécimes humanos e de cobaia. Esta distribuição subcelular surpreendente é provavelmente verdadeira, uma vez que os mesmos anticorpos coraram adequadamente a membrana da borda em escova dos enterócitos duodenais. 386 Essas descobertas foram posteriormente contestadas por estudos funcionais em glândulas gástricas isoladas de ratos perfundidas, que demonstraram atividade semelhante a NHE3 na membrana apical da célula parietal. 387 Nenhuma descrição de anormalidades gástricas foi relatada em estudos em camundongos deficientes em NHE3 200, portanto, a expressão e o papel fisiológico de NHE3 no epitélio gástrico ainda permanecem obscuros.

O NHE4 é abundantemente expresso no epitélio da glândula gástrica, com proteína localizada na membrana basolateral das células parietais e principais e em menor extensão nas células mucosas. 144.284 Semelhante à função putativa do NHE2 na membrana basolateral das células parietais, a alta expressão de NHE4 foi sugestiva de um papel importante que este NHE desempenha na manutenção do pHeu homeostase e na secreção de ácido. A acidez gástrica normal em camundongos NHE2 - / - jovens 156 foi sugestiva de outra isoforma NHE basolateral. Uma vez que NHE1 tem expressão relativamente baixa em células parietais, NHE4 era um provável gene candidato a participar da fisiologia das células parietais. De fato, dados recentes de estudos de direcionamento de genes revelaram que camundongos NHE4 - / - tinham hipocloridria. 292 Em muitos aspectos, o quadro fenotípico assemelhava-se ao observado em camundongos NHE2 - / - ou AE2 - / -, com um número reduzido de células parietais devido à apoptose e necrose e com perda concomitante de células principais maduras. Uma das diferenças distintivas entre as duas mutações direcionadas ao NHE foi que a acloridria em camundongos NHE4 - / - foi detectada no início da vida pós-natal e não estava progredindo com a idade. Especulou-se que NHE4 é normalmente acoplado com Cl - / HCO basolateral3 - trocador (AE2) e que desempenha um papel crítico na regulação da secreção de ácido gástrico e diferenciação das células epiteliais foveolares.

A expressão apical de NHE8 foi descrita nas glândulas fúndicas e pilóricas de camundongo por Xu et al. 310 camundongos com ablação direcionada de SLC9A8 gene mostrou que a expressão gástrica de NHE8 foi crítica para a manutenção da secreção de bicarbonato pelo Cl - / HCO3 - inadenoma regulado para baixo do trocador (DRA SLC26A3), e que, em comparação com seus companheiros de ninhada de tipo selvagem, os camundongos deficientes em NHE8 tiveram uma incidência maior de formação de úlcera gástrica. 310 Embora o mecanismo responsável pela regulação negativa da expressão de DRA permaneça desconhecido, parece ser um fenômeno consistente em todos os órgãos porque, como também foi descrito no cólon, 311 conjuntiva, a córnea e as glândulas lacrimais. 315


Jeffrey B. Eells, Ph.D.

O foco de minha pesquisa é como os estressores ambientais que estão ligados à esquizofrenia e outras doenças mentais alteram a regulação e a função da neurotransmissão da dopamina e mudam o comportamento e a função cognitiva em camundongos. Este trabalho enfocou principalmente o fator de transcrição nuclear Nurr1, que é necessário para o desenvolvimento normal e a função continuada dos neurônios de dopamina mesencefálica. Um dos objetivos é determinar o mecanismo de como a expressão e função de Nurr1 são controladas nos neurônios da dopamina e as consequências das mudanças no Nurr1 na neurotransmissão da dopamina. Atualmente, estamos usando vetores virais para direcionar populações específicas de dopamina para determinar as consequências das mudanças na expressão de Nurr1 na neurotransmissão da dopamina. Além disso, estamos investigando como dois estressores ambientais diferentes, o estressor inicial do isolamento pós-desmame em camundongos e a infecção pelo parasita protozoário Toxoplasma gondii, ambos fatores de risco para esquizofrenia, alteram a expressão de Nurr1, neurotransmissão e comportamento da dopamina. Depois de compreendermos algumas das maneiras como esses estressores ambientais alteram a neurotransmissão da dopamina, podemos investigar o potencial de mitigar ou reverter esses efeitos para prevenir ou tratar doenças mentais.

As técnicas atuais utilizadas nesses experimentos incluem cirurgia estereotáxica em camundongos, imunohistoquímica, qPCR em tempo real, microdissecção de captura a laser, HPLC para análise de catecolaminas, testes comportamentais para processamento sensorial, atividade locomotora, memória de trabalho, memória episódica, memória espacial, ansiedade e depressão.