Em formação

Qual plasmídeo pode expressar T7 RNA polimerase em células de mamíferos?


Alguém sabe qual plasmídeo pode expressar a polimerase de RNA de T7 em células de mamíferos, gostaria de transfectá-lo com outro plasmídeo contendo o gene de interesse sob o controle do promotor T7. Muito obrigado!


Uma sequência líder capaz de aumentar a expressão de RNA e a síntese de proteínas em células de mamíferos

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen e Julia Flores contribuíram igualmente para este trabalho.

Centro de Medicina Evolutiva e Informática, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centro de Medicina Evolutiva e Informática, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Departamento de Química e Bioquímica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Center for Infectious Diseases and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5401

School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5912

Centro de Medicina Evolutiva e Informática, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Departamento de Química e Bioquímica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Correspondência para: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301. E-mail: [email protected] Pesquise mais artigos deste autor

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Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen e Julia Flores contribuíram igualmente para este trabalho.

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T7 e DH5 alfa - Ajude-me a esclarecer algumas coisas (04/02/2010)

Olá & # 33
Estou fazendo minha tese de mestrado e estou tentando esclarecer algumas coisas para entendê-las completamente. Agora estou investigando o sistema de expressão de T7. Se bem entendi as coisas, a T7 RNA polimerase é geralmente incorporada ao genoma cromossômico sob o controle de um operador lac iniciando a transcrição com a adição de IPTG. Em seguida, a polimerase encontra o promotor T7 no plasmídeo e começa a transcrever o mRNA desse local.

No entanto, li em algum lugar que minha cepa bacteriana, DH5 alfa, não carrega seu próprio gene T7 RNA polimerase, e que ele deve estar presente no plasmídeo e precisa ser transformado. Isso é verdade? Estou suspeitando que não, porque não consigo ver que meus plasmídeos (pTZ19R e pSE420) contêm tal coisa. Você poderia me ajudar a esclarecer as coisas?

O que você leu está correto. A maior parte da expressão de T7 é feita em cepas de bactérias que foram lisogenizadas com o fago DE3, carregando a polimerase de RNA de T7 sob o controle do promotor lac. DH5a não tem isso. Normalmente as cepas com esta modificação são indicadas em seu nome, como BL21 (DE3). A razão pela qual o DH5a normalmente não carrega essa modificação é que ele é pobre para a expressão de proteínas, uma vez que ainda possui a protease lon, que tende a degradar as proteínas expressas. A cepa BL21 é eliminada para esta e outras proteases.

Você certamente poderia carregar o promotor lac e o gene da polimerase do RNA T7 em um plasmídeo (seja o mesmo ou um em co-transformação) em DH5a. Poucas pessoas fazem isso, porque se preocupam com a expressão da proteína resultante.

Obrigado por sua resposta & # 33 Eu esperava ter entendido algo errado para que fizessem mais sentido. Voltei à minha fonte original e eles clonaram meu gene em um vetor de expressão pTZ19R e se transformaram em DH5a para expressão. Se DH5a é uma cepa de expressão gênica pobre, por que alguém iria querer fazer isso? E como ocorre a expressão se não há polimerase de RNA T7?

Eu tentei pesquisar o assunto agora, mas tudo o que ele faz está me deixando mais confuso. Eu encontrei isso em algum documento de informação da Invitrogen:
Importante: DH5 e # 945 E. coli não requer IPTG para induzir a expressão do promotor lac, mesmo
embora a cepa expresse o repressor Lac. O número de cópias da maioria dos plasmídeos excede
o número do repressor nas células. Se você está preocupado em obter níveis máximos de
expressão, adicione IPTG a uma concentração final de 1 mM.

Minha fonte original não menciona o IPTG de forma alguma, e presumi que fosse porque eles não queriam fornecer todas as informações sobre a produção da proteína, mas talvez eles simplesmente não a usem?

Além disso, notei que obtenho resultados mais claros em minha SDS-PAGE ao usar um método envolvendo PMSF. A opinião do meu supervisor é que não é necessário, mas acho que bloquearia a protease lon e teria algum tipo de efeito. Provavelmente farei mais alguns testes sobre isso, apenas para diversão pessoal.

Ok, estou apenas tagarelando com minhas perguntas, mas as primeiras são as mais importantes. Onde está a polimerase?

O plasmídeo pTZ19R possui AMBOS um promotor lac e um promotor T7 a montante do seu sítio de clonagem múltipla. Em uma cepa LacI-, isso será expresso a partir do promotor lac, não tendo nada a ver com o promotor T7. O promotor T7 existe para permitir a expressão em uma cepa BL21 (DE3). Se eu me importasse com a proteína, eu iria subclonar em BL21 (DE3) e induzir com IPTG, então (como você está fazendo) purificar na presença de PMSF, embora isso seja menos importante nas cepas de BL21.


RESULTADOS

Vetores de RNA não citopáticos.

O replicon não citopático SINrep19 foi projetado como um vetor de RNA subgenômico duplo, usando o promotor 5 'para a expressão de genes estranhos e um promotor 3' para conduzir a expressão de pac (Figura 1UMA) As células BHK foram transfectadas com RNAs de replicon capeados sintetizados em vitro, banhado e com permissão para se recuperar por 12–18 h. Em seguida, impusemos a seleção de células que haviam sido transfectadas produtivamente com os replicons por adição de puromicina ao meio de cultura de células. Dentro de 24 h, as células de controle ou não transfectadas foram completamente eliminadas (I.F., E.A., T.A. Hoffman, B.M.P., M.S. Lippa, S.S. e C.M.R., dados não publicados).

Vetores SIN não citopáticos. (UMA) O RNA SINrep19, o vetor de RNA não citopático subgenômico duplo, transcreve genes estranhos e o pac gene de modelos de fita negativa usando promotores subgenômicos separados (as posições do promotor são indicadas por setas em ambas as construções de DNA e RNA). (B) Um vetor de RNA bipartido não citopático depende do SINrep18 para apoiar a replicação de um genoma SIN de interferência defeituoso contendo um gene de interesse. O terminal 5 'do DI RNA tem uma sequência tRNA Asp (20). (C) SINrep21 é um vetor de DNA para o replicon SINrep19. Após a transfecção do DNA, os RNAs dos replicons foram transcritos por meio de enzimas nucleares e transportados para o citoplasma. Replicons iniciam a replicação autônoma e expressam o pac gene e genes estranhos de interesse. O run-off refere-se a locais convenientes para o run-off da transcrição MCS, locais de clonagem múltipla.

Uma comparação da atividade β-gal total entregue por SINrep19 /lacaZ com aquele de outro SIN /lacaOs replicons Z são mostrados na Tabela 1. O replicon persistente produziu apenas ≈4% da atividade da enzima produzida pelo citopático SINrep3 /lacaReplicon Z. Isto está de acordo com os níveis diminuídos de RNAs SIN genômicos e subgenômicos observados em células transfectadas com o replicon não citopático parental (I.F., E.A., T. A. Hoffman, B.M.P., M. S. Lippa, S.S. e C.M.R., dados não publicados).

Expressão de β-gal por diferentes replicons SIN

Estratégias usando DI RNAs.

Uma característica definidora das partículas DI de alfavírus é o aumento dos níveis de replicação de RNA em relação ao vírus do tipo selvagem ou auxiliar (19). Os genomas DI suportados por um replicon SIN não citopático também podem exibir níveis de replicação aumentados e, conseqüentemente, produção de genes estranhos. Para um SIN DI, um determinante importante foi encontrado para ser a substituição de uma estrutura semelhante a tRNA para a extremidade 5 'autêntica de um genoma defeituoso (20). DI RNAs que codificam genes heterólogos foram construídos com base nesta estrutura e usados ​​em conjunto com um replicon não citopático contendo um único promotor subgenômico para conduzir pac expressão gênica (SINrep18).

Em uma estratégia, DI RNAs foram transfectados em células pur R já replicando SINrep18 (Fig. 1B) Para distinguir fenotipicamente as células transfectadas com DI de células não transfectadas, foi utilizado um segundo marcador selecionável dominante. o neo O gene, que confere resistência ao medicamento G418, foi colocado adjacente ao gene de interesse e conduzido pelo elemento interno do sítio de entrada do ribossomo do vírus da encefalomiocardite. O DI /lacZ-neo vetor produzido & gt20 vezes o nível de β-gal produzido por SINrep19, mas ligeiramente menos do que o do replicon citopático (Tabela 1). Marcação metabólica de espécies de RNA resistentes à actinomicina-d na Vivo indicou que DI RNAs replicaram para níveis mais altos do que os replicons não citopáticos sozinhos e que DI /lacZ-neoA expressão mediada era estável após múltiplas passagens, mesmo na ausência de seleção de G418 (dados não mostrados). Esses dados sugerem que um sistema de vetor DI / replicon é capaz de expressão de alto nível de genes estranhos, muito provavelmente devido ao aumento da replicação do genoma DI em relação ao do replicon.

Para caracterizar ainda mais a capacidade dos replicons não citopáticos de complementar um vetor DI, examinamos a capacidade do SINrep18 de induzir a expressão da luciferase em células que transcrevem constitutivamente DI /luc de um promotor nuclear. Esta transcrição serve como um modelo para replicação e transcrição após a introdução de um vírus auxiliar ou replicon (11). Como a Tabela 2 demonstra, as células não induzidas acumularam um baixo nível constitutivo de atividade da luciferase que foi aumentado pela infecção e proporcional à quantidade de vírus SIN adicionado. Quando essas células foram transfectadas com SINrep18 seguido de seleção e passagem com puromicina, a atividade abundante da luciferase se acumulou nos primeiros 5 dias e foi mantida por pelo menos mais 4 dias. Assim, embora os replicons não citopáticos expressem menos proteína por unidade de tempo do que suas contrapartes citopáticas, sua capacidade de expressão prolongada pode levar ao acúmulo de níveis muito elevados de proteína.

Indução de luciferase por replicons não citopáticos ou vírus SIN

Freqüência de células de expressão e estabilidade das populações de células após a passagem.

A estabilidade de um vetor de expressão de longo prazo define fortemente sua utilidade. Como os vírus de RNA, incluindo SIN, são geneticamente bastante plásticos, examinamos o padrão de expressão de β-gal por meio de replicons não citopáticos, por célula, ao longo do tempo. Como a Fig. 2 demonstra, uma população de células replicando SINrep19 /lacaZ continha & gt10% de células negativas para β-gal nas primeiras passagens e continuou a acumular células negativas de expressão após passagem adicional. Uma perda de expressão semelhante foi observada para SINrep18 + DI /lacaZ (Fig. 2) e para outros genes marcadores (dados não mostrados). Assim, apesar da seleção contínua de puromicina, bem como do fato de que o lacaZ e pac genes foram geneticamente ligados, variantes de expressão negativa surgiram dentro das populações selecionadas. Nós consideramos duas fontes principais para esta heterogeneidade: (eu) os replicons provavelmente acumulam mutações ou deleções no lacaGene Z durante a replicação SIN e (ii) os replicons são iniciados como uma população, o que deve refletir a heterogeneidade do em vitro RNAs sintetizados.

Estabilidade da expressão de β-gal por replicons não citopáticos. Durante o curso da passagem das células (1:10, aproximadamente a cada 48 h), uma porção das células foi semeada em poços separados e corada com X-gal, conforme descrito em Materiais e métodos. A estabilidade de linhas celulares clonadas que expressam β-gal foi avaliada usando clones selecionados para expressão de alto nível. A porcentagem de células β-gal-negativas foi calculada por exame microscópico de vários campos aleatórios.

Para abordar a primeira dessas preocupações. examinamos a estabilidade da expressão em populações clonadas de células β-gal-positivas. Como visto na Fig. 2, um derivado clonal de SINrep19 /lacaZ manteve a expressão de β-gal & gt90% ao longo de 10 passagens, resultados semelhantes foram observados com múltiplos clones de células (dados não mostrados). A estabilidade do SINrep18 + DI /lacaZ também melhorou com a clonagem de uma célula β-gal-positiva, embora a porcentagem de expressão tenha caído na 10ª passagem. Para populações clonadas de ambos SINrep19 /lacaZ e SINrep18 + DI /lacaZ, omitir a seleção não teve efeito sobre a porcentagem de células que expressam β-gal ao longo de sete passagens (dados não mostrados). Esses resultados sugerem que a perda de expressão ocorre como resultado da replicação do SIN, mas isso não explica totalmente a instabilidade em populações não clonadas. Em um sentido prático, essa instabilidade pode ser gerenciada por meio do uso de células de passagem precoce e pela clonagem direta de células de expressão positiva.

A alta taxa de mutação da polimerase de RNA de SP6 pode contribuir para a heterogeneidade inicial dentro de uma população de replicon. Na Vivo a transcrição de replicons de RNA funcionais usando a RNA polimerase II nuclear da célula hospedeira pode ser uma alternativa para em vitro transcrição, semelhante às estratégias publicadas (21, 22). Esta abordagem foi testada pela primeira vez construindo p987 / SINrep19 / lacZ, que continha o SINrep19 /lacaO cDNA de Z flanqueado pelo promotor de repetição terminal de 5 'de comprimento do vírus do sarcoma de Rous e o sinal de poliadenilação 40 do vírus símio. A replicação deste replicon foi iniciada por transfecção transitória de DNA de plasmídeo e seleção com puromicina de populações transfectadas. Essas populações exibiram expressão prolongada de β-gal em & gt90% das células, embora uma pequena, mas detectável perda de expressão tenha sido observada (Fig. 2). Nenhuma diferença no nível de expressão foi observada entre os produtos expressos por SINrep19 vs. p987 / SINrep19. Com base neste projeto, um vetor de DNA geral, pSINrep21, foi construído em um vetor de cópia média (Fig. 1C).

Expressão de várias proteínas heterólogas.

Alguns genes representativos expressos usando replicons não citopáticos são mostrados na Fig. 3. SINrep19 / GFP contém uma versão otimizada de códons humanos sintéticos do Aequeorea victoria Gene GFP (12), que levou a fluorescência brilhante de populações pur R (Fig. 3UMA) Fig. 3B demonstra o padrão de coloração X-gal para uma quinta passagem SINrep19 /lacaPopulação de células que expressam Z.

Expressão de proteínas modelo por meio de vetores não citopáticos. As células foram selecionadas após a transfecção com SINrep19 / GFP (UMA), SINrep19 /lacaZ (B), SINrep19 / CD46 (C e E), ou SINrep18 (D e F) Todas as células eram populações representativas selecionadas para pur R conforme descrito no texto. As células foram preparadas por coloração X-gal (B) ou coloração imunofluorescente para CD46 (C e D). (E e F) mostram a condição das células 54 h após a infecção com MV [multiplicidade de infecção (moi) 0,1].

Estávamos particularmente interessados ​​em usar replicons não citopáticos para entregar proteínas à via secretora porque uma consequência da infecção SIN pode ser a desregulação desses compartimentos celulares (23). Expressamos a glicoproteína de superfície celular humana CD46, que está envolvida na regulação do complemento e é o receptor do vírus do sarampo (MV). O CD46 foi expresso na superfície das células que replicam SINrep19 / CD46 (Fig. 3 C e D) Como este receptor é necessário para a ligação e entrada de MV, testamos se a expressão de CD46 poderia conferir permissividade de MV a células BHK. Como pode ser visto na Fig. 3 E e F, uma população de células SINrep19 / CD46 demonstrou a formação de sincícios tipicamente induzida pela infecção por MV, enquanto as células SINrep18 permaneceram não permissivas.

Além disso, uma forma de fosfatase alcalina placentária humana (SEAP) não ancorada na membrana foi segregada no meio de células que replicam SINrep19 / SEAP a uma taxa de 400 ng / 106 células / 24 h. Da mesma forma, uma forma truncada da glicoproteína E2 do vírus da hepatite C (HCV), sem uma âncora transmembrana, foi adequadamente glicosilada e direcionada para secreção (dados não mostrados). As proteínas estruturais prM / E do vírus da febre amarela (YF) também foram expressas via SINrep19 e são adequadamente processadas em prM e E (dados não mostrados). Estes dados mostram que os vetores SIN não citopáticos podem entregar proteínas biologicamente ativas à via secretora.

Expressão de T7 RNA polimerase.

Examinamos a capacidade dos replicons não citopáticos de expressar a polimerase de RNA do fago T7 diretamente nas células hospedeiras. Esta enzima é comumente entregue às células de mamíferos usando um vírus vaccinia recombinante, vTF7-3, e encontrou ampla utilidade na superexpressão transitória de genes estranhos clonados a jusante do promotor T7 e sinais de tradução apropriados (24). A função da T7 RNA polimerase expressa via SINrep19 / T7pol foi demonstrada usando vários repórteres. Em um conjunto de experimentos, transfectamos essas células com DNA de plasmídeo contendo um clone funcional do vírus Mengo sob controle transcricional do promotor T7. Como pode ser visto na Fig. 4UMA, a formação de placas de vírus Mengo foi específica para células que abrigam SINrep19 / T7pol. Estas placas eram idênticas em tamanho e morfologia ao vírus Mengo iniciado a partir de em vitro transcrições (dados não mostrados).

Expressão funcional da T7 RNA polimerase. (UMA) Placas de vírus Mengo após transfecção de células BHK de controle (SINrep18) ou células BHK que expressam T7 (SINrep19 / T7pol) com um clone funcional dirigido por T7 do vírus Mengo. (B) Expressão da poliproteína do HCV com (pistas 2 e 3) ou sem (pistas 1 e 4) transfecção de pBRTM / HCV827–3011. As faixas 1 e 2 foram derivadas de células infectadas com vTF7–3, enquanto as faixas 3 e 4 representam células contendo SINrep19 / T7pol. (C) Expressão de luciferase após transfecção de pEMCLucβgAn em células que expressam T7 RNA polimerase via vTF7–3, SINrep19 / T7pol ou não expressam T7 RNA polimerase (controle). Os lisados ​​foram preparados 6, 24 ou 36 h após a transfecção. Este experimento é representativo de três experimentos independentes.

Em outro conjunto de experimentos, as células que expressam a polimerase de RNA T7 foram transfectadas com pBRTM / HCV827-3011, um plasmídeo contendo a região não estrutural do HCV sob controle do promotor T7 (25). Os produtos esperados foram imunoprecipitados, indicando que a poliproteína do HCV foi expressa e devidamente processada (Fig. 4B, pistas 3 e 4). Para comparação, também expressamos a polimerase do fago via vTF7–3, que rendeu os mesmos produtos, mas em maior abundância (Fig. 4B, pistas 1 e 2).

Para quantificar melhor a quantidade de produto expresso por T7, examinamos a expressão da luciferase ao longo do tempo em células transfectadas com um plasmídeo que codifica o gene luc conduzido por um promotor T7, pEMCLucβgAn (um presente de Jon A. Wolff, Universidade de Wisconsin). As células que expressam T7 RNA polimerase via vTF7–3 ou SINrep19 / T7pol tiveram atividade abundante de luciferase em todos os momentos examinados. As células infectadas com vaccinia demonstraram um pico de atividade anterior, que diminuiu em 36 h, consistente com a destruição das células infectadas pela vaccinia. Em contraste, SINrep19 / T7pol continuou a acumular luciferase, ultrapassando a atividade em células infectadas com vTF7-3 entre 24 e 36 h. Esses dados mostram que SINrep19 / T7pol pode expressar T7 RNA polimerase funcional em um nível comparável ao de vTF7-3, mas com menos citotoxicidade.


CONCLUSÕES

Nossos resultados mostram que um conjunto ortogonal de fatores de transcrição sintéticos (com forte atividade no alvo e baixa atividade fora do alvo) pode ser construído em E. coli, e isso representa o primeiro sistema de ativação programável em bactérias do qual temos conhecimento, expandindo a gama de opções disponíveis para a atividade transcricional em bactérias e oferecendo a perspectiva de empregar a mesma classe de abordagens baseadas em recrutamento já disponíveis em organismos eucarióticos.

Em nosso desenvolvimento do sistema iiT7, usamos a mutação da T7 RNA polimerase e o truncamento de seu promotor pt7 de tipo selvagem para prejudicar as capacidades de ligação do T7 RNAP ao DNA, desacoplando assim o reconhecimento do promotor T7 RNAP e as funções de iniciação transcricional e permitindo o reconhecimento do promotor para tornar-se dependente de uma proteína auxiliar de ligação ao DNA. Um aprimoramento significativo no desempenho foi obtido pela substituição da fusão covalente entre os domínios de ligação ao DNA por interações proteína-proteína (por meio de nossos pares zíper de leucina), o que desacoplou ainda mais o processo de ligação ao DNA da iniciação da transcrição e provavelmente ajudou a facilitar o escape do promotor e o alongamento do transcrito .

Depois de testar uma gama de variantes e otimizar seu desempenho, a forma atual de melhor funcionamento do sistema iiT7 (conforme representado pelo gráfico de ortogonalidade na Figura 3E) consiste no seguinte: uma fusão de proteína incorporando um domínio de ligação de DNA fundido a uma leucina zíper (como ZFA5-LZ2A) uma segunda fusão de proteína incorporando um zíper de leucina selecionado para formar interações proteína-proteína com o primeiro construto e fundido a um T7 RNAP (como LZ2B-T7) e um promotor que incorpora tanto o DNA de ligação alvo da matriz de dedo de zinco e uma sequência de promotor T7 truncada (como p1zfa5-d1). Programar o sistema (criar novos alvos) envolve trocar os domínios ZFA e inserir as sequências de ligação de DNA correspondentes no promotor. O ajuste dos níveis resultantes de ativação pode ser realizado variando a escolha de domínios ZFA, domínios LZ ou ambos. O número de permutações disponíveis para ajuste pode ficar rapidamente fora de controle, então nosso conselho para designers que buscam usar o sistema (especialmente se trabalhar sem um pipeline de triagem de alto rendimento) seria selecionar um par LZ e deixar isso fixo enquanto exploram o os níveis de atividade resultantes da variação apenas dos domínios ZFA, mudanças nos domínios LZ podem ser introduzidos em um estágio posterior, se necessário, para ajustar os níveis de atividade.

Este sistema RNAP baseado em fago de dois componentes em bactérias começa a se assemelhar à transcrição em eucariotos, onde fatores de transcrição recrutam RNAPs centrais para promotores mínimos que têm pouca atividade ou especificidade isoladamente. Curiosamente, coincidente com a preparação deste manuscrito, Hillen et al. mostraram por cristalografia que o RNAP mitocondrial humano (homólogo do RNAP T7) utiliza um mecanismo muito semelhante ao que desenvolvemos aqui, onde o fator de transcrição mitocondrial TFAM substitui os ZFAs em nosso sistema (70). TFAM e o RNAP mitocondrial interagem através de domínios alfa-helicoidais notavelmente semelhantes aos zíperes de leucina que usamos para o mesmo propósito em nosso sistema (Figura Suplementar S8). É reconfortante ter convergido involuntariamente para o mesmo tipo de solução de bilhões de anos de evolução. Essa convergência também pode ser usada para informar direções futuras, sugerindo que o derretimento do DNA também pode ser desacoplado da transcrição em RNAP, pois o segundo fator de transcrição mitocondrial TFB2M assumiu esse papel no RNAP mitocondrial.

O sistema iiT7 oferece um método promissor para expandir o número de fatores de transcrição sintéticos disponíveis em contextos bacterianos, com o grande número de componentes ZFA e LZ conhecidos fornecendo a base para a construção modular de bibliotecas selecionadas pelo usuário de componentes ortogonais, cada um capaz de atividade transcricional após o recrutamento. Com uma pesquisa adicional do espaço mutacional da polimerase T7, pode ser possível encontrar um mutante com atividade transcricional na ausência de qualquer elemento do promotor T7 nativo, o que simplificaria ainda mais o sistema.

Uma divergência interessante na utilidade foi descoberta com o mutante T7 RNAP HEP. Este mutante, embora geralmente intensifique a expressão no alvo de promotores com base no truncamento d1 da sequência do promotor pt7 (com exceção da fusão ZFA1-T7 (HEP)), na verdade resultou em uma ligeira diminuição da ortogonalidade geral devido a um aumento uniforme em off atividade -alvo (Figura Suplementar S9). Curiosamente, os mesmos dados mostram que a fraca atividade no alvo da fusão direta ZFA1-T7 (HEP) foi restaurada na versão com ponte LZ do sistema: ZFA1-LZ2A + LZ2B-T7 (HEP) teve forte no alvo atividade, em um nível quase idêntico ao de seu irmão ZFA2-LZ2A + LZ2B-T7 (HEP). Compreender a relação entre os domínios ZFA e sua interação com RNAPs fundidos e de outra forma ligados requer uma investigação mais aprofundada.

Ambos os domínios de ligação de DNA e de interação proteína-proteína usados ​​aqui podem ser substituídos por novas variantes: nós demonstramos uma versão do sistema baseada em ZFA, mas em princípio qualquer domínio de ligação de DNA pode ser empregado, incluindo ativador-transcricional como efetores (TAL) e dCas9. Separar o evento de ligação ao DNA do recrutamento por meio de interações proteína-proteína abre a possibilidade de ajuste ou troca da atividade dos fatores de transcrição sintéticos por meio do número crescente de métodos conhecidos de modulação de interação proteína-proteína externa, incluindo indução química e de luz ( 71, 72). O complexo iiT7 dividido pode ser construído em torno de estruturas de polinucleotídeo e peptídeo usando domínios de ligação específicos de modalidade, agindo como um sensor (73, 74) e permitindo sintonia para respostas ultrassensíveis (75). A polimerase T7 RNAP é conhecida por operar em eucariotos (34), abrindo a possibilidade futura de criar fatores de transcrição sintéticos capazes de operar em procariotos ou eucariotos. Embora ainda haja trabalho a ser feito para desenvolver totalmente o design iiT7, esta é uma oportunidade não apenas para testar a universalidade dos princípios de design de transcrição, mas também para emular a evolução natural dos RNAPs do simples fago de domínio único T7 para as polimerases modulares e programáveis de células complexas.


Livro didático Canon: Expressando Any Genes in Bacteria - (09/08/2012)

Um exame superficial dos mapas de plasmídeo mostra genes de resistência a antibióticos, mas esses genes têm promotores se (1) for "sim"?

O tópico sobre controle de expressão gênica usa o operon como exemplo. Esses genes de antibióticos são induzidos por alguma coisa ou sob algum controle?

Nos livros didáticos, o fluxo é sempre obter o gene de interesse, cloná-lo e selecionar a bactéria portadora do plasmídeo usando os marcadores antibióticos ou a expressão do gene. Mas é tão simples ou os detalhes não são mencionados?

Eu acho que houve um post recente sobre o gene promoterless aqui também. E outro sobre dois promotores. Ambos me confundem ainda mais.

Obrigado a todos que me guiarem pacientemente.

Os genes devem ser transcritos em RNA e, em seguida, traduzidos em proteínas para serem expressos. A transcrição é controlada por promotores, 5 e # 39 da região codificadora da proteína. Existem promotores 5 e # 39 dos genes de resistência a antibióticos em plasmídeos. Normalmente, esses são os chamados promotores constitutivos, o que significa que estão sempre presentes em alguns genes de resistência a antibióticos, que são um tanto tóxicos para as células, e os promotores desses às vezes podem ser ativados seletivamente na presença do antibiótico, mas isso é um tanto raro.
Plasmídeos comuns usados ​​para clonagem frequentemente têm um promotor 5 e # 39 do local de clonagem, de modo que quando as regiões de codificação do gene são inseridas no local de clonagem, o gene é expresso. Alguns desses promotores são indutíveis, ou seja, podem ser ligados e desligados dependendo da presença de produtos químicos específicos, como IPTG ou arabinose. Espero que isto ajude.

1) Para transcrever um gene, você precisa de um promotor para a RNA polimerase se ligar e produzir mRNA (dependendo do promotor, você pode precisar também de um terminador) no mRNA, você precisa a montante do códon de início, um rbs (sítio de ligação ao ribossomo ) para que o ribossomo se ligue e faça a tradução resultando em sua proteína. Você deve tomar cuidado para que a origem ou replicação (para multiplicar o plasmídeo dentro da bactéria), promotor e rbs sejam específicos para bactérias se a bactéria for usada para expressão, ou levedura se você usar levedura etc. É possível que um plasmídeo tenha um origem de replicação para bactérias para que você possa cloná-la em bactérias, e outra origem de replicação para levedura, para você usar o plasmídeo para expressão de levedura.
2) Veja a resposta acima com a adição de que se você tiver uma resistência a antibióticos, você deve verificar para qual organismo seu promotor é específico, ou seja, eu tenho um plasmídeo que dá resistência à ampicilina em bactérias e resistência à gentamicina quando usado para infecção viral em células de insetos . Por outro lado, embora a resistência à gentamicina esteja presente no plasmídeo, em bactérias, isso não confere resistência à gentamicina porque o promotor é específico para a expressão de células de inseto.
3) Veja a resposta antes.
4) Por fenótipo você está se referindo à expressão de proteínas? Normalmente, a expressão de genes estranhos não fornece um fenótipo diferente da expressão de proteínas e crescimento mais lento. Às vezes, tenho um fenótipo quando estou expressando proteínas que excluem DNA / RNA, uma vez que se ligam a todos os DNAs e RNAs livres e se tornam tóxicos para a célula. Se você está se referindo à expressão de proteínas como fenótipo, não é tão fácil quanto parece no papel. Mas para responder à sua pergunta, você não precisa adicionar um promotor, os vetores vêm com um promotor antes do local de clonagem múltipla no qual você deve inserir seu gene de interesse. Existem alguns detalhes que as pessoas perdem e então se envolvem em problemas. Por exemplo, para fornecer apenas o básico:
a) Existem cepas bacterianas de clonagem, como DH5alpha ou XL1Blue, que não possuem endonucleases / recombinases específicas, o que as torna adequadas para recuperar DNA em grandes quantidades. Você usa essas cepas para transformar sua reação de ligação para obter seu plasmídeo final. Cresça devagar.
Existem cepas de expressão, como BL21, que não possuem proteases específicas para manter intacta a proteína expressa. Transforme o plasmídeo obtido anteriormente nessas cepas e use-o para expressão.
c) Há uma variante de BL21 chamada Gold que tem a vantagem de não ter as endonucleases / recombinases e ser adequada para expressão, levando à possibilidade de transformar a reação de ligação diretamente nesta cepa e pular a etapa DH5alpha / Xl1Blue
d) Se você estiver trabalhando com vetores pET (tendo o promotor T7), você deve trabalhar com cepas de expressão que têm (DE3) no nome (o que significa que eles podem expressar T7 RNA polimerase que reconhece este promotor)
e) Há casos em que, embora você tenha clonado tudo certo, sua proteína não se expressa ou resulta em corpos de inclusão ou fica reta mal dobrada e fragmentada dentro da bactéria. Nestes casos, você deve testar diferentes cepas de expressão, diferentes vetores com promotor de diferentes forças, diferentes temperaturas de expressão, diferentes meios, diferentes tags N-terminais que promovem o dobramento, diferentes fragmentos de proteína porque proteínas maiores que 50 kDa em bactérias são difíceis de expressar (algumas pessoas dizem que é maior que 27 kDa)

The thing with two/multiple promoters is that there are vectors that are made in such a way that you can use them for expression in different organisms i.e. E coli and insect cells without needing to reclone the gene by having two promoters one after the other such that when in bacteria the RNA polymerase recognizes the bacterial promoter, when in insect cells, the insect cells RNA polymerase recognizes the insect cell promoter. i.e. pTriEX from Novagen,

What you have asked is an entire field of expertise. If this would be easy to explain in 1-2 pages, I wouldn't be needed in my job:) I could suggest some material for reading such as Unit 5.24 from Current Protocol in Protein Science: Strategies to Optimize Protein Expression in E. coli by DM Francis and R. Page. If you cannot access it from your lab, drop me a message with your email address and I will send it to you.

Thank you very much phage434 and ascacioc. I was reading about molecular biology to prepare ahead of my final year. I understand that I am still a long way out and I appreciate your taking the time to explain. Could not really sleep with so many question marks floating about but I am happy to put some of these away.

Just to note here: when I mentioned "phenotype", I was thinking along the line of a new "characteristics" conferred by the new gene. Maybe that was inaccurate and I got mixed up with Drosophila genetics The PET system is fascinating (first impression) but I am not looking to make so many proteins. Just mutant bacterial clones.

Going forward I am sure I will have more questions and I will try to find out the answers by myself first.

To just make a quick note on the phenotype thing: If you are refering to a particular characteristic confered by the gene: if you have a type of cell (bacteria, yeast, mamalian cell line) that is a mutant of a gene (deletion mutant), you can make a rescue experiment using a plasmid containing the gene you deleted from the chromosome. This means that the protein will be expressed from the plasmid and will make the cell healthy (behaving like wild type) again. Plasmids are not only for expression of proteins for purification towards biochemical analysis.

Yes, T7 promoters come from the T7 bacteriophage. Studier, who according to me is the father of cloning, has characterized the bacteriphage many years ago and came up with the idea of pET system. He did also other wonderful things in cloning and protein expression like the autoinduction media. If you have time, you could look up what other contributions he did to the field of cloning.

Indeed, there are many bacterial hosts. What I find important to know is to know what a K strain (cloning strain) and a B strain (expression strain) are. Also, if you start using them, you could start learning the genotyping codes. A strain comes with a certain genotype i.e. mutations and insertions of genes, which make it different to other strains. Basically, at this level you need to read only 1-2 lines of genotype code and be able to tell what is the use of this strain. But this is expert level. A good webpage for this is: http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes But again, this is knowledge you have in your mind when you do only this for many years. Nobody will expect you to know these things (most of the PhD students around me are happy without even knowing that this wiki exists)

Your questions:
1) Good question. Nunca pensei nisso. When I have seen it this morning, I was like: why would you do this? But just for theoretical purposes (even though, I am not 100% sure about what I am saying next): I think that the gene will be transcribed from both promoters i.e. once by RNA polymerase binding to one promoter and another time by binding to the other promoter. On the other hand, it will be crowded in this area and this might lead to slowing down or to shorter mRNA fragments because I imagine that if the first RNA polymerase binds on the upstream promoter and there is also another RNA polymerase downstream, the the first one stumbles accross the second one and cannot continue would wait a while until it cannot move anymore and then detach. Anyhow, we do not do that
2) http://www.amazon.com/Molecular-Cloning-Laboratory-Manual-Edition/dp/0879695773/ref=pd_sim_sbs_b_1 This the the bible of molecular cloning. However, nobody buys this for their own (check the price). Each good lab has a copy. I learn usually from internet, like wikis. The companies that sell the strains/vectors have also good material e.g Novagen. Also, there is a good journal, low impact factor, but specific for this fiels: Journal of Protein Expression & Purification. I check it regularly for new things in the field (generally there are tricks you can learn from how people dealt with their specific protein). Also there is a series of protocols: Current Protocols in Protein Science, or Current Protocols in Molecular Biology. They are written book style but they are mainly online. Actually, this is a field that, in my opinion is based on knowledge, not experience. There is a certain practical experience one needs, but if one lacks the basic knowledge of what is what, he can do the same mistake over and over again.

Yes, been going from one page to another in openwetware.org. Some things make sense and others are totally foreign. Same goes for the genotype notation am looking at Biobricks at the moment and already scratching my head.

Thank you so much for the explanations, Andreea. Obrigado.

A note on the two promoters situation (I asked a friend yesterday over lunch about this intersting question of yours and she had some additions):
-in the consideration that you are using a vector with its own promoter to clone a gene with natural promoter, and the gene is from the same organism as the vector is i.e. both promoters are recognized by the RNA polymerase that is present in the host, you get a mixture of mRNAs that have the following structure . vector promoter - vector rbs - original promoter - original rbs - AUGgene. and . original promoter - original rbs - AUGgene. (rbs = ribosome binding site).
-the rbs is not a precise sequence, it is 6 consequent nucleotides enriched in As and Gs. Moreover, it is 6-8 bases upstream of the AUG
-in the second construct everything is fine
-in the longer construct (which is most probably the abundant one since expression vector promoters are the strongest found in nature to make your host express mostly your protein) you have a different story: there is a long strand of nucleotides from the 5' end up to the original rbs (the right one for the right AUG) that might be, coincidently, detected as a rbs (the odds are that there are a lot of 6 consecutive A/Gs) and then the ribosome will look for a AUG donwstream the fake rbs and start translation. Again the odds are that there are other AUGs out of frame in this long extra strand of nucleotides. This might lead to the wrong protein being translated.

This is why we do not do this:) We don't like to gamble. If we want the original promoter (which sometimes is the case), we clone the gene with the promoter in such a way to get rid of the original promoter in the vector. If we do not insist on the natural promoter (which anyhow is a weak one, most of them are), we clone only the gene.

A little bit hijacking this topic, but if I understand it correctly there are 2 vectors: expression vectors and cloning vectors (or strains).

The cloning vectors are vectors that provide the possibility to clone (duplicate the plasmid?) the genes you want (stable transfer of the plasmid during cell division?). I assume these are high copy vectors and vectors that maintain the plasmid very stable in high copy numbers?
While expression vectors are vectors that provide everything for a stable expression, translation?

But what are the molecular differences between those? I noticed you mentioned the the lack of proteases in expression strains and the lack of endonucleases/recombinases in cloning vectors, but are there other specific differences?
(eg: high copy in cloning vs low copy in expression? Or a very strong promoter in the exrepssion vectors?).

There are 2 strains you use for the same vector: cloning strain (K strain e.g. DH5alpha, XL1Blue) is the one with mutant dnases and recombinases and expression strain (B strain e.g BL21, Rosseta etc) is the one with mutant proteases.
In the K strain your ligated plasmid would be nicely transformed since there are minimum dnases and recombinases to affect it. These strains grow slow but have great transformation efficiency. They are also very easy to make competent using the Hanahan method which was actually developed for K strains. These strains are used mainly for plasmid production for mini/midi preping.
In the B strain, your protein will be nicely expressed and protected from the proteases, so it can accumulate up to the harvest time. Minimum preoteases to chop your protein up. Grow faster but have terrible transformation efficiency.
The story behind the original B-strains and K-strains is long. Initially, they were doing this old fashion UV-mutation/selection for the nice bacterial strains that people wanted to have. So they obtained strains to suit them but with lots of mutations. Hence, there are quite a few differences on the genome level between the strains. For more details, I recommend:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19765592 (as I said, Studier writes all the nice articles )
The normal workflow from gene to protein in bacteria: PCR your insert with overhangs for the restriction enzymes you want to use restrict digest the vector and the insert with these enzymes ligate vector and insert transform in K strain and plate check the ontained colonies for the right insert by colony PCR miniprep a few of them and send for sequencing once sequence confirmed, transform the plasmid in B-strain and do the expression of your protein in the B-strain.

Now, this is the classical way (details omitted for simplicity do not take it as a protocol there are some steps in between that are essential such as PCR clean up. ). If you for example want to transform an epPCR library or any kind of library of variants and select based on expression of your protein, then you cannot wait to obtain the plasmid from K strain, you have to go directly to the B-strain. So, in this case, due to the fact that nowadays we have a bit of more knowledge of how to manipulate bacteria, beyond UV, people have modified the classical BL21(DE3) to get BL21-Gold(DE3) (and similar strains) which has the advantage that it is also a mutant of endonucleas A (as K strains are, but this one is done nicely with modern molecular biology methods not UV ) Now, you will be tempted to say, hack, why should I use the long way and not transform the ligation directly to BL21(DE3)-Gold? Well, you could do that, but I personally do not like strains with too many mutations (endonuclease A is needed in the bacteria) because they are not too healthy and stressed bacteria do not produce tons of protein. But this is just me.

Another question that might arise would be: why do you go through K-strain until the expression strain:
1- easy to transform ligation reaction into if you use BL21(DE3) for transforming you might end up with no clones, but you might also be lucky. The question is: do you want to play the lotery in the lab?
2 - easy to mini/midiprep your plasmid to have enough for sequencing or other things for which you need ug amounts. Again, nobody says you cannot miniprep from BL21, but you need to be good at. I minipreped successfully from B strains, but I am a mixture of luck and good hands:) I have seen people not being able to miniprep from B-strains. So again: how lucky do you feel to do that? You might end up repeating the entire cloning procedure because you were too lazy to go through the K-strain. (we have a saying in my language: the lazy one, runs more I thought appropriate to insert some wisdom from the elders here )

This was the story about the strains = living organisms that multiplicate on their own. Not to be confused with plasmids: round pieces of DNA that is not able to multiply on its own. For simplicity, I will refer from now own only to bacterial plasmids, even though the parts are common for many other plasmids.
In a plasmid you generally have:
-origin of replication - needed by the bacteria to recognize the plasmid for replication these origins are that thing that give the copy number you can have high copy number plasmids (100 copies per cell) or low copy number plasmids (1-10) this is regulated by the origin of replication. In general, for expressing proteins, you want a low copy number plasmid. But for cloning in bacteria a plasmid to be used for mammalian cell culture imaging or for yeast protein expression, basically to be used in another organism, then you use a high copy number plasmid.
-antibiotic resistance - with its own constitutive promoter and terminator produces protein to clear the antibiotic makes the bacterium survive in the certain antibiotic used for selection
-promoter - used for transcription of mRNA from your insert
-terminator -stops mRNA transcription
-rbs - ribosome binding site - ribosome recognition site for translation to happen
-MCS - multiple cloning site with various restriction sites for you to put your insert into
These are the minimum components you have on an expression vector in bacteria. On top, you have some other regulatory components. But this is advanced molecular biology I will let you discover on your own

Hi carlmartin and Andreea,

Am I correct in saying that since we don't want to "gamble" with the outcome , it also follows that when one wishes to express a protein, it is crucial that the 'thing' downstream of the promoter be an ORF? Or else, we'll have a situation similar to the two-promoter scenario in our hands.

lyok on Sat Aug 11 09:22:22 2012 said:

I could be wrong but I understand both clonagem e expression vectors as genetic elements independent of their copy number. While the term expression vector seems to bring to mind a vector used for the overproduction of proteins for purification, a cloning vector can be an 'expression' vector by virtue of it having a promoter (err. right?).

In a rescue / complementation experiment, I believe that plasmids such as the pUC or pGEM with their respective promoters and being in the right environment would be expressed and restore the host.

As for stability and maintenance, it does appear to me in the beginning that high copy number is more superior to low copy one but after some digging found that the latter can be stably maintained too.

ascacioc on Sat Aug 11 10:32:24 2012 said:

I guess certain things are just like that . Brings to mind a discussion I had a while back with someone here regarding copy number and the resulting mRNA and protein but that's for another topic.


Informações de Apoio

Figura S1.

Expression of eYFP-NLS decreases as the space between the promoters increases. Western blot probed with anti-GFP. The levels of eYFP-NLS expression were normalised against the BiP loading control. Two independent clones of each plasmid were examined and the percentage of cells fluorescent after induction is shown.

Figura S2.

Flow cytometry analysis of Lister 427 pSPR2.1 p3227 and Lister 427 p3383. Two independent clones of each cell line were analysed with the typical result presented here. Red line untransformed Lister 427 pSPR2.1, black line uninduced, green line 18 hours tet induction.

Tabela S1.

Table describing inducible tagging plasmids produced.

Tabela S2.

Table describing plasmids used in this study. pLEW100 is described in Wirtz et al. [2]. p2948 and pDEX377 are described in Kelly et al. [8].

Tabela S3.

DNA sequences of all the plasmids used in this study.


Associated Data

Designing and building multigene constructs is commonplace in synthetic biology. Yet functional successes at first attempts are rare because the genetic parts are not fully modular. In order to improve the modularity of transcription, we previously showed that transcription termination in vitro by bacteriophage T7 RNA polymerase could be made more efficient by substituting the standard, single, TΦ large (class I) terminator with adjacent copies of the Vesicular Stomatitis Virus (VSV) small (class II) terminator. However, in vitro termination at the downstream VSV terminator was less efficient than at the upstream VSV terminator, and multigene overexpression in vivo was complicated by unexpectedly inefficient VSV termination within E. coli células. Here, we address hypotheses raised in that study by showing that VSV or preproparathyroid hormone (PTH) small terminators spaced further apart can work independently (i.e. more efficiently) in vitro, and that VSV and PTH terminations are severely inhibited in vivo. Surprisingly, the difference between class II terminator function in vivo versus in vitro is not due to differences in plasmid supercoiling, as supercoiling had a minimal effect on termination in vitro. We therefore turned to TΦ terminators for 𠇋ioBrick” synthesis of a pentameric gene construct suitable for overexpression in vivo. This indeed enabled coordinated overexpression and copurification of five His-tagged proteins using the first construct attempted, indicating that this strategy is more modular than other strategies. An application of this multigene overexpression and protein copurification method is demonstrated by supplying five of the six E. coli translation factors required for reconstitution of translation from a single cell line via copurification, greatly simplifying the reconstitution.


Competent Cell Selection Guide

There are many properties to consider when choosing a strain for your experiments. Requirements such as plasmid preparation, blue/white screening, cytoplasmic disulfide bond formation, and fast colony growth necessitate specific strain choices. The following selection chart highlights the characteristics and formats of NEB&rsquos strains to help select the optimal strain for a particular experiment. The free online tool, NEBcloner can also be used to help select competent cells. For more information, please visit Cloning Competent Cell Strains or E.coli Expression Strains.

CAUTION: Chemically Competent E. coli contain DMSO, a hazardous material. Review the MSDS before handling.

Cloning Strain Properties

  • Dam/Dcm methyltransferase free plasmid growth
  • Fastest growth &ndash colonies visible after 6.5 hours
  • Plasmid preparation after 4 hours
  • Versatile cloning strain
  • DH5&alpha&trade derivative
  • Toxic gene cloning
  • F´ strain with extremely high transformation efficiency
  • Large plasmid and BAC cloning
  • DH10B&trade derivative
  • Cloning unstable inserts
  • Isolating and propagating retroviral/lentiviral clones
  • Ideal for subcloning efficiency transformations, such as plasmi transformation or routine subcloning

Protein Expression Strain Properties

  • Versatile non-T7 expression strain
  • Protease deficient
  • Routine T7 expression
  • Tunable T7 expression for difficult targets
  • Improved purity of target proteins isolated by IMAC
  • Routine non-T7 expression
  • Most popular T7 expression strain
  • Protease deficient
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Better reduction of basal expression
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Highest level of expression control
  • T7 expression/K12 strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Tightly controlled expression of toxic proteins
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Control of IPTG induced expression from Placa, Ptac, Ptrc and T5laca
  • Protease deficient

(1) Rhamnose solution is provided instead of SOC control plasmid is included.
(2) Important for high-quality plasmid preparation.
(3) Lacks Lon and OmpT protease activity.
(4) Constitutively expresses a chromosomal copy of the disulfide bond isomerase DsbC.
(5) nit = nitrofurantoin, tet = tetracycline, cam = chloramphenicol, str = streptomycin, spec = spectinomycin
(6 )Resistance to low levels of streptomycin may be observed.
(7) Legend 50 = 50 µl tubes 200 = 200 µl tubes 96 = 96 well plate 384 = 384 well plate strips = 96 tube strips (50 µl/tube) 400 = 400 µl tubes
(8) 1-5 x 10 8 for R-format.
(9) 1-3 x 10 8 for P-format.


Characterization

Contorno

1) Expression of different proteins: monitoring growth

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

3) SDS-PAGEs for the expression assay over the time of Full Construct (BBa_K3037003)

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

Experiments in Detail

1) Expression of different proteins: monitoring growth

To evaluate the impact on the metabolic burden of over-expressing proteins, we tested different constructs cloned into our backbone. For this we used: HRP (BBa_K3037007) and our full construct (BBa_K3037003). After cloning, the constructs were expressed in E. coli pRARE T7 and we monitored growth over time (Figure 2). Induction of the system was performed after 165 min with 1 mM IPTG. Overall, the results prove that when expressed, none of our proteins inhibit growth.

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

To use this backbone as convenient expression vector in iGEM, we had to include the Prefix and Suffix of the BioBrick Assembly. Subsequentially, we compared the expression of the original vector we recieved, pOCC97, to our optimized version for iGEM, BBa_K3730000.

We found that the original plasmid (= non-optimized) had a XbaI site, which we used to insert our BioBrick BBa_K3037003. This ilegal restriction site was later removed with an overhang PCR. The original XbaI restriction site was positioned downstream of the T7 polymerase promoter and upstream the RBS sequence of the plasmid. This way only BioBricks that already has a RBS fused to them could be expressed. Since we were using the RFC25 standard of Freiburg for our fusion proteins, the inserted protein contained already its own RBS in the Prefix.

However, we experienced on our own how difficult it is to add such a small sequence, as an RBS, to our other constructs. Therefore we redesigned the plasmid to be ready for expression in a single digestion+ligation reaction. We removed the XbaI restriction site and included a Prefix and Suffix of the RFC 10 standard after the RBS of the plasmid (=optimized).

We used the BioBrick assembly method to insert our BioBrick BBa_K3037003, which also has its own RBS due to the RFC25 standard.

In Figure 3, we show the expression of the protein BBa_K3037003 using both plasmids optimized (left) and non-optimized (right) and also different IPTG concentrations for induction and temperature.


The comparison of the growth curves shows that, the new plasmid adapted to the RFC 10 standard did not affect the growth, as it shows similar behavior compared to the original one (Figure 4).

3) SDS-PAGEs of the expression assays of the full construct (BBa_K3037003)

Down below follow several SDS-PAGEs of loaded crude cell extract (all normalized to an OD of 0.5) harvested at different time points pre- and post-induction. Used IPTG concentrations are indicated. Arrows indicate predicted size of the protein of interest.

Comparison of the expression of MBP-HRP (BBa_K3037008) and Full Construct (BBa_3037003)

Expression of full construct in pOCC97 not optimized at 18ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 at 37ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 optimized

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

The previously shown SDS-pages were then further analysed by using the software ImageJ to correct for loading differences and be able to draw conclusions about the best conditions to express the Full Construct in pOCC97.


Temperature and IPTG induction dependence of the optimized pOCC97

Temperature and IPTG induction dependence of the not optimized pOCC97

Comparison between optimized and not optimized pOCC97


Based on this analysis, it can be concluded that optimal conditions for the expression of our fusion protein, BBa_3037003, is an overnight expression at 18ºC and inducing with 0.5 mM IPTG. We are proud to say that our optimized pOCC97 shows an increased expression and robustness under various conditions tested.


Assista o vídeo: REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO (Dezembro 2021).