Em formação

Alguém usa bootstrapping para relatar o ganho de massa durante o experimento?


Ao realizar um experimento para relatar o ganho de massa corporal em um experimento, algum de vocês conhece um artigo cujos autores usaram um bootstrap para melhorar seus intervalos de confiança?

Tenho um n = 10 por grupo para um total de 6 grupos, medindo toda a massa corporal semanalmente em pequenos modelos animais de uma doença. O desenho experimental é essencialmente o tratamento pelo uso de um medicamento, ao longo de um período de dez semanas, e a análise do ganho final de peso corporal

(essencialmente pense em um termo de pesquisa do Google como bootstrap, massa corporal, mouse)


A eficiência de diferentes estratégias de pesquisa na estimativa de jackknife de parcimônia, bootstrap e suporte de Bremer

Para análises de parcimônia, a maneira mais comum de estimar a confiança é por planos de reamostragem (bootstrap não paramétrico, jackknife) e suporte de Bremer (índices de Decay). A literatura recente revela que as configurações de parâmetros comumente empregadas não são aquelas recomendadas por considerações teóricas e por estudos empíricos anteriores. A estratégia de pesquisa ideal a ser aplicada durante a reamostragem foi anteriormente abordada exclusivamente por meio de estratégias de pesquisa padrão disponíveis no PAUP *. A questão de um compromisso entre a extensão da pesquisa e a precisão do suporte aprimorado para o suporte de Bremer recebeu ainda menos atenção. Um conjunto de experimentos foi conduzido em diferentes conjuntos de dados para encontrar um ponto de corte empírico no qual o aumento da extensão da pesquisa não altera mais o suporte de Bremer e as proporções de canivete ou bootstrap.

Resultados

Para o número de réplicas necessárias para estimativas precisas de suporte em planos de reamostragem, é fornecido um diagrama que ajuda a resolver a questão de saber se os valores de suporte aparentemente diferentes realmente diferem significativamente. É mostrado que o uso de ciclos de adição aleatórios e iterações de catraca parcimoniosa durante a inicialização não se traduz em maior suporte, nem qualquer extensão da extensão de pesquisa além do esforço moderado de TBR (divisão de árvore e troca de ramo de reconexão) além de salvar uma árvore por replicação. Em vez disso, no caso de matrizes muito grandes, salvar mais de uma árvore mais curta por iteração e usar uma árvore de consenso estrito desses rendimentos diminuiu o suporte em comparação com salvar apenas uma árvore. Isso pode ser interpretado como um pequeno risco de superestimar o suporte, mas deve ser mais do que compensado por outros fatores que neutralizam um erro tipo I. Com relação ao suporte de Bremer, uma regra prática pode ser derivada afirmando que não se ganha muito em relação ao esforço computacional excedente quando as pesquisas são estendidas além de 20 iterações de catraca por nó restrito, pelo menos não para conjuntos de dados que caem dentro da faixa de tamanho encontrada em a literatura atual.

Conclusão

Em vista desses resultados, calcular as proporções de bootstrap ou jackknife com intervalos de confiança estreitos, mesmo para conjuntos de dados muito grandes, pode ser alcançado com menos despesas do que normalmente se pensa. Em particular, os métodos de bootstrap iterado que visam reduzir o viés estatístico inerente a essas proporções são mais viáveis ​​quando as buscas de bootstrap individuais requerem menos tempo.


Quão boas são as evidências para o manejo da anorexia nervosa?

Ironicamente, o mais letal dos transtornos psiquiátricos é a Cinderela da pesquisa. É difícil envolver pacientes com anorexia para tratamento, muito menos pesquisa. Além disso, a complexidade das abordagens coordenadas usadas na maioria dos centros especializados pode sobrecarregar os métodos de pesquisa convencionais.

Evidências de alta qualidade sobre os efeitos da fome no corpo estão disponíveis para orientar os aspectos físicos do cuidado. 2 Estudos genéticos, incluindo estudos de gêmeos e famílias, 3 e mais recentemente análises de genes, lançaram alguma luz sobre as causas, mas existem poucos ensaios clínicos randomizados de tratamento. Em contraste, muitos ensaios clínicos randomizados são encontrados no manejo da bulimia nervosa de peso normal. 4 Infelizmente, essas intervenções têm uma resposta pobre na anorexia nervosa.

Esta revisão é baseada em pesquisas no PubMed, Medline e PsycLIT para tratamento de anorexia nervosa e transtornos alimentares relacionados, e na diretriz clínica do National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE). 5 Não encontramos nenhuma evidência da categoria A (pelo menos um ensaio clínico randomizado como parte de um corpo de literatura consistente e de alta qualidade (nível de evidência 1)), e apenas as intervenções familiares preencheram os critérios da categoria B (estudos clínicos bem conduzidos, mas nenhum ensaio clínico randomizado (níveis de evidência 2 e 3) ou extrapolado da evidência de nível I). O NICE usa recomendações de categoria C (relatórios de comitês de especialistas ou experiência clínica de autoridades respeitadas (nível de evidência 4) ou extrapolação do nível 2 ou 3) para fornecer orientação onde evidências formais de alta qualidade estão ausentes.

Duas revisões da Cochrane cobrem o tratamento com antidepressivos para anorexia nervosa 6 e psicoterapia individual para adultos com o transtorno. 7 As revisões são baseadas em apenas sete e seis pequenos estudos, respectivamente, todos com limitações metodológicas importantes. Uma nova busca eletrônica e manual de artigos publicados mais recentemente é complementada por trabalhos na imprensa, apresentações em conferências e algumas comunicações pessoais com o grupo relativamente pequeno de especialistas internacionais na área.


2. Comparando dois meios

2.1. Introdução

Muitos estudos em nosso campo se resumem em gerar meios e compará-los entre si. Ao fazer isso, tentamos responder a perguntas como, & # x0201c É o tamanho médio da ninhada de mutantes x diferente do tipo selvagem? & # x0201d ou & # x0201c É a expressão do gene y em embriões maiores a 25 & # x000b0C do que a 20 & # x000b0C? & # x0201d É claro que nunca realmente obteremos valores idênticos de quaisquer dois experimentos. Isso é verdade mesmo que os dados sejam adquiridos de uma única população, as médias da amostra sempre serão diferentes umas das outras, mesmo que apenas ligeiramente. A questão pertinente que as estatísticas podem abordar é se as diferenças que inevitavelmente observamos refletem uma diferença real na populações onde as amostras foram adquiridas. Dito de outra forma, são as diferenças detectadas por nossos experimentos, que são necessariamente baseados em um tamanho de amostra limitado, provavelmente resultante ou não de efeitos aleatórios da amostragem (ou seja, amostragem casual) Se a amostragem aleatória pode explicar as diferenças observadas, então nossos resultados irão não ser considerado estatisticamente significativo 13 Em contraste, se é improvável que as diferenças observadas tenham ocorrido por acaso, então nossos resultados podem ser considerados significativos no que diz respeito às estatísticas. Se essas diferenças são ou não biologicamente significativo é uma questão separada reservada ao julgamento de biólogos.

A maioria dos biólogos, mesmo aqueles desconfiados de estatísticas, geralmente estão cientes de que o venerável t-teste (a.k.a., do aluno t-teste) 14 é o método padrão usado para abordar questões relacionadas às diferenças entre duas médias de amostra. Vários fatores influenciam o potência do t-teste para detectar diferenças significativas. Isso inclui o tamanho da amostra e a quantidade de variação presente na amostra. Se isso soa familiar, eles deveriam. Ambos foram fatores que influenciam o tamanho do SEM, discutido na seção anterior. Isso não é uma coincidência, como o coração de um t-O teste reside na estimativa do erro padrão da diferença entre duas médias (SEDM). Uma variação maior nos dados de amostra aumenta o tamanho do SEDM, enquanto tamanhos de amostra maiores o reduzem. Portanto, menor variância e amostras maiores tornam mais fácil detectar diferenças. Se o tamanho do SEDM for pequeno em relação à diferença absoluta nas médias, a descoberta provavelmente será considerada estatisticamente significativo.

Na verdade, não é necessário lidar diretamente com o SEDM para ser perfeitamente proficiente na interpretação dos resultados de um t-teste. Portanto, vamos nos concentrar principalmente nos aspectos do t-teste que é mais relevante para experimentalistas. Isso inclui a escolha de realizar testes unilaterais ou bicaudais e emparelhados ou não, suposições de variância igual ou não, e questões relacionadas a tamanhos de amostra e normalidade. Gostaríamos também de notar, de passagem, que alternativas para o t-teste existe. Esses testes, que incluem o bootstrap computacionalmente intensivo (consulte a Seção 6.7), normalmente requerem um pouco menos suposições do que o t-teste e geralmente produzirá resultados semelhantes ou superiores. Para tamanhos de amostra razoavelmente grandes, um t-teste fornecerá virtualmente a mesma resposta e atualmente é mais simples de realizar usando o software e sites disponíveis. É também o método mais familiar aos revisores, que podem ser céticos em relação às abordagens menos comumente usadas.

2.2. Compreendendo o teste t: uma breve incursão em alguma teoria estatística

Para ajudar a compreender a lógica por trás do t-teste, bem como os requisitos básicos para o t-teste para ser válido, precisamos introduzir mais alguns conceitos estatísticos. Faremos isso por meio de um exemplo. Imagine que estamos interessados ​​em saber se a expressão do gene uma é alterado em embriões em estágio de vírgula quando o gene b foi inativado por uma mutação. Para procurar um efeito, tomamos medidas de intensidade de fluorescência total 15 de um integrado uma:: Repórter GFP em embriões em estágio de vírgula tanto no tipo selvagem (Controle, Figura 5A) e b mutantes (Teste, Figura 5B). Para cada condição, analisamos 55 embriões. Expressão do gene uma parece ser maior na configuração de controle, a diferença entre as duas médias de amostra é de 11,3 bilhões de unidades de fluorescência (doravante simplesmente referidas como & # x0201c11.3 unidades & # x0201d).

Figura 5

Resumo dos dados de expressão do repórter GFP para um controle e um grupo de teste.

Junto com a média familiar e SD, a Figura 5 mostra algumas informações adicionais sobre os dois conjuntos de dados. Lembre-se de que na Seção 1.2, descrevemos a aparência de um conjunto de dados normalmente distribuído (Figura 1). O que não mencionamos é que a distribuição dos dados 16 pode ter um forte impacto, pelo menos indiretamente, sobre a validade ou não de um determinado teste estatístico. Esse é o caso do t-teste. Olhando para a Figura 5, podemos ver que os conjuntos de dados são, na verdade, um pouco assimétricos, tendo caudas um pouco mais longas à direita. Em termos técnicos, essas distribuições seriam categorizadas como enviesado direito. Além disso, como nosso tamanho de amostra foi suficientemente grande (n = 55), podemos concluir que as populações de onde os dados vieram também estão distorcidas para a direita. Embora não seja crítico para a nossa presente discussão, vários parâmetros são normalmente usados ​​para quantificar a forma dos dados, incluindo a extensão em que os dados se desviam da normalidade (por exemplo, assimetria 17 , curtose 18 e A ao quadrado 19). Em qualquer caso, uma pergunta óbvia agora se torna, como você pode saber se seus dados são distribuídos normalmente (ou pelo menos normalmente o suficiente), para executar um t-teste?

Antes de abordar essa questão, devemos primeiro lidar com um pouco de teoria estatística. A curva gaussiana mostrada na Figura 6A representa um teórico distribuição das diferenças entre as médias da amostra para nosso experimento. Dito de outra forma, esta é a distribuição de diferenças que esperaríamos obter se repetíssemos nosso experimento um número infinito de vezes. Lembre-se de que, para qualquer população, quando & # x0201cescolhermos & # x0201d uma amostra aleatoriamente, cada repetição gerará uma média de amostra ligeiramente diferente. Assim, se realizássemos tais repetições de amostragem com nossas duas populações ad infinitum, a distribuição em forma de sino das diferenças entre as duas médias seria gerada (Figura 6A). Observe que essa distribuição teórica de diferenças é baseada em nossas médias amostrais reais e SDs, bem como na suposição de que nossos conjuntos de dados originais foram derivados de populações normais, o que já sabemos que não é verdade. Então o que fazer?

Figura 6

Distribuição amostral teórica e simulada das diferenças entre duas médias. As distribuições são do exemplo de expressão gênica. A média e SE (SEDM) das distribuições teórica (A) e simulada (B) são aproximadamente 11,3 e 1,4 (mais).

Acontece que essa falta de normalidade na distribuição das populações das quais derivamos nossas amostras nem sempre representa um problema. A razão é que a distribuição das médias da amostra, bem como a distribuição das diferenças entre duas médias da amostra independente (junto com muitas outras estatísticas usadas convencionalmente), é freqüentemente normal o suficiente para que as estatísticas ainda sejam válidas. O motivo é o O Teorema do Limite Central, uma & # x0201c lei estatística da gravidade & # x0201d, que afirma (em sua forma mais simples 21) que a distribuição da média da amostra será aproximadamente normal, desde que o tamanho da amostra seja suficientemente grande. Qual é o tamanho suficiente? Isso depende da distribuição dos valores dos dados na população de onde veio a amostra. Quanto mais anormal for (geralmente, isso significa que mais inclinado), maior será o requisito de tamanho da amostra. Avaliar isso é uma questão de julgamento 22. A Figura 7 foi derivada usando uma abordagem de amostragem computacional para ilustrar o efeito do tamanho da amostra na distribuição da média da amostra. Nesse caso, a amostra foi derivada de uma população que está fortemente inclinada para a direita, uma característica comum de muitos sistemas biológicos onde valores negativos não são encontrados (Figura 7A). Como pode ser visto, com um tamanho de amostra de apenas 15 (Figura 7B), a distribuição da média ainda está enviesada para a direita, embora muito menos do que a população original. No momento em que temos tamanhos de amostra de 30 ou 60 (Figura 7C, D), no entanto, a distribuição da média está de fato muito próxima de ser simétrica (ou seja, normal).

Figura 12

Ilustração do Teorema do Limite Central para proporções binomiais. Os painéis A & # x02013D mostram os resultados de um experimento de amostragem computacional onde a proporção de sucessos na população é de 0,25. o x os eixos indicam as proporções obtidas de (mais.)

Figura 7

Ilustração do Teorema do Limite Central para uma população distorcida de valores. O painel A mostra a população (altamente inclinada para a direita e truncada em zero) Os painéis B, C e D mostram as distribuições da média para tamanhos de amostra de 15, 30 e 60, respectivamente, conforme obtido (mais).

Tendo o Teorema do Limite Central vindo em nosso socorro, podemos agora deixar de lado a advertência de que as populações mostradas na Figura 5 são não normais e prosseguir com nossa análise. Na Figura 6 podemos ver que o centro da distribuição teórica (linha preta) é 11,29, que é a diferença real que observamos em nosso experimento. Além disso, podemos ver que em ambos os lados desse ponto central, há uma probabilidade decrescente de que valores substancialmente mais altos ou mais baixos sejam observados. As linhas verticais azuis mostram as posições de um e dois SDs a partir do vértice da curva, que neste caso também podem ser referidos como SEDMs. Tal como acontece com outros SDs, cerca de 95% da área sob a curva está contida em dois SDs. Isso significa que em 95 de 100 experimentos, esperaríamos obter diferenças de médias entre & # x0201c8.5 & # x0201d e & # x0201c14.0 & # x0201d unidades de fluorescência. Na verdade, essa afirmação equivale a um IC de 95% para a diferença entre as médias, que é uma medida útil e passível de interpretação direta. Além disso, como o IC 95% da diferença nas médias não inclui zero, isso implica que o P-valor para a diferença deve ser inferior a 0,05 (ou seja, que a hipótese nula de nenhuma diferença nas médias não é verdadeira). Por outro lado, se o IC de 95% tivesse incluído zero, já saberíamos que o P-valor não apoiará conclusões de uma diferença com base no corte convencional (assumindo a aplicação do bicaudal t-teste veja abaixo).

A chave é entender que o t-teste é baseado na distribuição teórica mostrada na Figura 6A, assim como muitos outros parâmetros estatísticos, incluindo ICs de 95% da média. Assim, para o tPara ser válido, a forma das diferenças reais nas médias da amostra deve chegar razoavelmente perto de se aproximar de uma curva normal. Mas como podemos saber como seria essa distribuição sem repetir nosso experimento centenas ou milhares de vezes? Para responder a essa questão, geramos uma distribuição complementar mostrada na Figura 6B. Em contraste com a Figura 6A, a Figura 6B foi gerada usando um método de reamostragem computacional conhecido como bootstrapping (discutido na Seção 6.7). Mostra um histograma das diferenças nas médias obtidas ao realizar 1.000 em sílico repetições de nosso experimento. É importante ressaltar que, como esse histograma foi gerado usando nossos dados de amostra reais, ele leva automaticamente em consideração os efeitos de distorção. Observe que os dados desse histograma se aproximam muito de uma curva normal e que os valores obtidos para a média e SDs são virtualmente idênticos aos obtidos usando a distribuição teórica na Figura 6A. O que isso nos diz é que, embora os dados da amostra fossem de fato um tanto distorcidos, um t-teste ainda dará um resultado legítimo. Além disso, a partir deste exercício, podemos ver que com um tamanho de amostra suficiente, o t-teste é bastante robusto para algum grau de não normalidade nas distribuições de população subjacentes. Questões relacionadas à normalidade também são discutidas mais adiante.

2.3. Testes de uma contra duas amostras

Embora t-testes sempre avaliam diferenças entre duas médias, em alguns casos, apenas um dos dois valores médios pode ser derivado de uma amostra experimental. Por exemplo, podemos desejar comparar o número de destinos de células vulvares induzidos em hermafroditas de tipo selvagem versus mutantes m. Como é amplamente aceito que o tipo selvagem induz (em média) três células progenitoras da vulva, poderíamos, teoricamente, dispensar a nova medição deste valor estabelecido e, em vez disso, medi-lo apenas no mutante m antecedentes (Sulston e Horvitz, 1977). Nesses casos, seríamos obrigados a executar uma amostra t-teste para determinar se o valor médio de mutante m é diferente do tipo selvagem.

Há, entretanto, um problema em usar a abordagem de uma amostra, que não é estatística, mas experimental. Ou seja, sempre há a possibilidade de que algo sobre as condições de crescimento, execução experimental ou alinhamento dos planetas possa resultar em um valor para o tipo selvagem diferente daquele da norma estabelecida. Se assim for, esses efeitos provavelmente conspirariam para produzir um valor para mutante m que é diferente do valor de tipo selvagem tradicional, mesmo se não houver diferença real. Isso poderia levar a uma falsa conclusão de uma diferença entre o tipo selvagem e o mutante m. Em outras palavras, o teste estatístico, embora válido, seria realizado com dados falhos. Por este motivo, muitas vezes não se vê uma amostra t-testes na literatura sobre vermes. Em vez disso, os pesquisadores tendem a realizar experimentos paralelos em ambas as populações para evitar serem enganados. Normalmente, isso é apenas um pequeno inconveniente e fornece uma garantia muito maior de que quaisquer conclusões serão legítimas. Ao longo dessas linhas, controles históricos, incluindo aqueles realizados pelo mesmo laboratório, mas em momentos diferentes, devem ser evitados.

2.4. Uma contra duas caudas

Um aspecto do t-teste que tende a agitar os usuários é a obrigação de escolher uma ou duas versões do teste. O fato de o termo & # x0201ctails & # x0201d não ser particularmente informativo apenas agrava a questão. A principal diferença entre as versões unilateral e bicaudal se resume à questão estatística formal que está sendo colocada. Ou seja, a diferença está na formulação da pergunta de pesquisa. Para ilustrar este ponto, começaremos aplicando um modelo bicaudal t-teste nosso exemplo de expressão GFP embrionária. Nessa situação, nosso objetivo típico como cientistas seria detectar uma diferença entre as duas médias. Essa aspiração pode ser mais formalmente declarada na forma de um pesquisar ou hipótese alternativa. Ou seja, que os níveis médios de expressão de uma:: GFP em tipo selvagem e em mutante b são diferentes. o hipótese nula deve transmitir o sentimento oposto. Para bicaudas t-teste, a hipótese nula é simplesmente que a expressão de uma:: GFP em tipo selvagem e mutante b os fundos são os mesmos. Alternativamente, pode-se afirmar que a diferença nos níveis de expressão entre tipo selvagem e mutante b é zero.

Acontece que nosso exemplo, embora real e útil para ilustrar a ideia de que a distribuição de amostragem da média pode ser aproximadamente normal (e de fato deveria ser se um t-teste deve ser realizado), mesmo que a distribuição dos dados não seja, não é tão útil para ilustrar P-conceitos de valor. Portanto, continuaremos esta discussão com uma variação artificial: suponha que o SEDM fosse 5,0, refletindo uma quantidade muito grande de variação nos dados de expressão gênica. Isso levaria à distribuição mostrada na Figura 8A, que é análoga à da Figura 6A. Você pode ver como o aumento no SEDM afeta os valores contidos no IC de 95% resultante. A média ainda é 11,3, mas agora há alguma probabilidade (embora pequena) de obter uma diferença de zero, nossa hipótese nula. A Figura 8B mostra a mesma curva e SEDMs. Desta vez, no entanto, mudamos os valores do x eixo para considerar a condição sob a qual a hipótese nula é verdadeira. Assim, a diferença postulada neste cenário é zero (no pico da curva).

Figura 8

Representação gráfica de um bicaudal t-teste. (A) A mesma distribuição de amostragem teórica mostrada na Figura 6A na qual o SEDM foi alterado para 5,0 unidades (em vez de 1,4). Os valores numéricos no x-eixo representam diferenças da média (mais.)

Agora lembre-se de que P-valor responde à seguinte pergunta: Se a hipótese nula for verdadeira, qual é a probabilidade de que a amostragem aleatória possa ter resultado em uma diferença nas médias da amostra pelo menos tão extrema quanto a obtida? Em nosso experimento, a diferença nas médias da amostra foi de 11,3, onde uma:: GFP mostrou menor expressão no mutante b fundo. No entanto, para derivar o P-valor para o bicaudal t-teste, precisaríamos incluir as duas possibilidades a seguir, representadas aqui em formas de equação:

Mais notavelmente, com um bicaudal t-teste que impomos sem preconceito quanto à direção da diferença ao realizar a análise estatística. Olhando para a Figura 8B, podemos começar a ver como o P-valor é calculado. Retratado é um curva normal, com a diferença observada representada pela linha azul vertical localizada em 11,3 unidades (& # x0223c2.3 SEs). Além disso, uma linha azul vertical tracejada em & # x0221211.3 também está incluída. As linhas vermelhas estão localizadas em cerca de 2 SEs de cada lado do ápice. Com base em nosso entendimento da curva normal, sabemos que cerca de 95% da área total sob a curva reside entre as duas linhas vermelhas, deixando os 5% restantes para serem divididos entre as duas áreas fora das linhas vermelhas nas regiões da cauda . Além disso, a proporção da área sob a curva que fica para fora de cada linha azul individual é de 1,3%, para um total de 2,6%. Isso corresponde diretamente ao cálculo bicaudal P-valor de 0,026. Assim, a probabilidade de ter observado um efeito tão grande por mero acaso é de apenas 2,6%, e podemos concluir que a diferença observada de 11,3 é estatisticamente significativa.

Depois de entender a ideia por trás do modelo de duas caudas t-teste, o tipo de uma cauda é bastante simples. Para o unilateral t-teste, no entanto, sempre haverá duas versões distintas, cada uma com uma hipótese de pesquisa diferente e a hipótese nula correspondente. Por exemplo, se houver suficiente a priori 23 razão para acreditar que GFP wt será maior do que GFP mut b , então a hipótese de pesquisa poderia ser escrita como

Isso significa que a hipótese nula seria escrita como

Mais importante ainda, o P-valor para este teste responderá à pergunta: Se a hipótese nula for verdadeira, qual é a probabilidade de que o seguinte resultado possa ter ocorrido por amostragem ao acaso?

Olhando para a Figura 8B, podemos ver que a resposta é apenas a proporção da área sob a curva que se encontra ao direito de 11.3 positivo (linha azul vertical sólida). Como o gráfico é perfeitamente simétrico, o P-valor para este teste de cauda direita será exatamente a metade do valor que determinamos para o teste de duas caudas, ou 0,013. Assim, nos casos em que a direção da diferença coincide com uma hipótese de pesquisa direcional, o P-valor do teste unicaudal será sempre a metade do teste bicaudal. Esta é uma informação útil. Sempre que você vê um P-valor de um unilateral t-teste e queira saber qual seria o valor bicaudal, basta multiplicar por dois.

Alternativamente, se houvesse razão suficiente para postular a priori aquele GFP mut b será maior do que GFP wt, e então a hipótese de pesquisa pode ser escrita como

Claro, nosso resultado experimental de que GFP wt era maior do que GFP mut b claramente falha em apoiar esta hipótese de pesquisa. Nesses casos, não haveria razão para prosseguir com um t-teste, como o P-valor em tais situações é garantido como & # x0003e0.5. No entanto, para fins de completude, podemos escrever a hipótese nula como

E a P-valor responderá à pergunta: Se a hipótese nula for verdadeira, qual é a probabilidade de que o seguinte resultado possa ter ocorrido por amostragem ao acaso?

Ou, escrito de forma ligeiramente diferente para manter as coisas consistentes com a Figura 8B,

Este teste unicaudal produz um P-valor de 0,987, o que significa que a média inferior observada de uma:: GFP em mut b embriões é inteiramente consistente com uma hipótese nula de GFP mut b & # x02264 GFP wt.

Curiosamente, há um debate considerável, mesmo entre os estatísticos, a respeito do uso apropriado de monobloco versus bicaudal t-testes. Alguns argumentam que, como na realidade duas médias populacionais nunca são idênticas, todos os testes devem ser unilaterais, já que uma média deve de fato ser maior (ou menor) do que a outra (Jones e Tukey, 2000). Dito de outra forma, a hipótese nula de um teste bicaudal é sempre uma premissa falsa. Outros encorajam o uso padrão do teste de duas caudas principalmente por ser mais conservador. Ou seja, o P-valor será sempre maior e, portanto, menos resultados falso-positivos serão relatados. Além disso, os testes bicaudais não impõem preconceitos pré-concebidos quanto à direção da mudança, que em alguns casos pode ser arbitrária ou baseada em um equívoco. Uma regra universalmente aceita é que nunca se deve fazer a escolha de um unilateral t-teste post hoc 24 após determinar qual direção é sugerida por seus dados. Em outras palavras, se você espera ver uma diferença e seu P-valor é 0,06, então não decida que você realmente pretendia fazer um teste unilateral para reduzir o P-valor para 0,03. Alternativamente, se você não esperava nenhuma diferença significativa, escolher o teste unilateral que lhe dará o melhor P-valor é uma prática igualmente inaceitável.

De modo geral, os testes unicaudais costumam ser reservados para situações em que um resultado direcional claro é antecipado ou onde mudanças em apenas uma direção são relevantes para os objetivos do estudo. Os exemplos deste último talvez sejam encontrados com mais frequência em ambientes industriais, como o teste de um medicamento para o alívio dos sintomas. Nesse caso, não há razão para se interessar em provar que um medicamento agrava os sintomas, apenas que os melhora. Em tais situações, um teste unilateral pode ser adequado. Outro exemplo seria rastrear a população de uma espécie ameaçada ao longo do tempo, onde a direção prevista é clara e onde o custo de ser muito conservador na interpretação dos dados pode levar à extinção. Notavelmente, para o campo de C. elegans biologia experimental, essas circunstâncias raramente, ou nunca, surgem. Em parte por esse motivo, os testes bicaudais são mais comuns e servem para dissipar qualquer sugestão de que alguém tenha manipulado o teste para obter o resultado desejado.

2,5. Variâncias iguais ou não iguais

É comum ler nos livros didáticos que uma das premissas subjacentes do t-teste é que ambas as amostras devem ser derivadas de populações de variância igual. Obviamente, nem sempre será esse o caso. Além disso, ao usar o t-teste, normalmente não estamos perguntando se as amostras foram derivadas ou não de populações idênticas, como já sabemos que não são. Em vez disso, queremos saber se as duas populações independentes das quais eles derivaram têm médias diferentes. Na verdade, a versão original do t-teste, que formalmente não leva em consideração variâncias amostrais desiguais, é, no entanto, bastante robusto para diferenças pequenas ou mesmo moderadas na variância. No entanto, agora é padrão usar uma versão modificada do t-teste que ajusta diretamente para variações desiguais. Na maioria dos programas estatísticos, isso pode simplesmente exigir a marcação ou desmarcação de uma caixa. O resultado final é que, para as amostras que têm variâncias semelhantes, efetivamente não há diferenças em P-valores serão observados entre os dois métodos. Para amostras que diferem consideravelmente em suas variações, P-valores serão maiores usando a versão que leva em conta as variações desiguais. Este método, portanto, fornece uma estimativa um pouco mais conservadora e precisa para P-valores e geralmente podem ser recomendados.

Além disso, apenas para reforçar um ponto levantado anteriormente, uma maior variação nos dados da amostra levará a uma maior P-valores devido ao efeito da variação da amostra no SEDM. Isso tornará mais difícil detectar diferenças entre as médias de amostra usando o t-teste. Mesmo sem qualquer explicação técnica, isso faz sentido intuitivamente, uma vez que uma maior dispersão nos dados criará um nível de ruído de fundo que pode obscurecer as diferenças de potencial. Isso é particularmente verdadeiro se as diferenças nas médias forem pequenas em relação à quantidade de dispersão. Isso pode ser compensado até certo ponto, aumentando o tamanho da amostra. Isso, no entanto, pode não ser prático em alguns casos, e pode haver desvantagens associadas ao acúmulo de dados apenas com o propósito de obter P-values ​​(consulte a Seção 6.3).

2.6. Os dados são normais o suficiente?

Tecnicamente falando, sabemos que por tPara serem válidos, a distribuição das diferenças nas médias deve ser próxima ao normal (discutido acima). Para que seja esse o caso, as populações das quais as amostras são derivadas também devem estar suficientemente próximas do normal. É claro que raramente sabemos a verdadeira natureza das populações e só podemos inferir isso a partir de nossos dados de amostra. Assim, em termos práticos, a questão muitas vezes se resume a se os dados da amostra sugerem ou não que a população subjacente é normal ou normal o suficiente. A boa notícia é que, nos casos em que o tamanho da amostra não é muito pequeno, a distribuição da amostra refletirá razoavelmente a população da qual foi derivada (conforme mencionado acima). A má notícia é que, com amostras pequenas (digamos, abaixo de 20), podemos não ser capazes de dizer muito sobre a distribuição da população. Isso cria um enigma considerável ao lidar com pequenas amostras de populações desconhecidas. Por exemplo, para certos tipos de populações, como uma coleção teórica de bandas em um western blot, podemos não ter como saber se a população subjacente é normal ou distorcida e provavelmente não podemos coletar dados suficientes para fazer um julgamento informado. Nessas situações, você admitiria usar um t-teste por sua própria conta e risco 25.

Os livros didáticos dirão que usar dados altamente distorcidos para t-testes podem levar a não confiáveis P-valores. Além disso, a confiabilidade de algumas outras estatísticas, como ICs, também pode ser afetada pela distribuição dos dados. No caso do t-teste, sabemos que a questão final não é se os dados ou populações estão distorcidos, mas se a população teórica de diferenças entre as duas médias está distorcida. Nos exemplos mostrados anteriormente (Figuras 6 e 8), as formas das distribuições eram normais e, portanto, o t-testes foram válidos, embora nossos dados originais estivessem distorcidos (Figura 5). Uma regra básica é que se os dados forem normais ou apenas ligeiramente distorcidos, a estatística de teste será normal e o t- os resultados do teste serão válidos, mesmo para tamanhos de amostra pequenos. Por outro lado, se uma ou ambas as amostras (ou populações) forem fortemente distorcidas, isso pode resultar em uma estatística de teste distorcida e, portanto, em conclusões estatísticas inválidas.

Curiosamente, embora o aumento do tamanho da amostra não mude a distribuição subjacente da população, muitas vezes pode ser uma grande ajuda para corrigir a assimetria na estatística de teste 26. Assim, o t-teste freqüentemente se torna válido, mesmo com dados bastante distorcidos, se o tamanho da amostra for grande o suficiente. Na verdade, usando os dados da Figura 5, fizemos um estudo de simulação e determinamos que a distribuição da amostra para a diferença nas médias é de fato aproximadamente normal com um tamanho de amostra de 30 (dados não mostrados). Nesse caso, o histograma dessa distribuição de amostragem se parecia muito com o da Figura 6B, com a exceção de que o SD 27 da distribuição era & # x0223c1.9 em vez de 1,4. Em contraste, a realização de uma simulação com um tamanho de amostra de apenas 15 não produziu uma distribuição normal da estatística de teste e, portanto, o t-teste não teria sido válido.

Infelizmente, não existe uma regra simples para escolher um tamanho mínimo de amostra para proteger contra dados distorcidos, embora alguns livros recomendem 30. Mesmo um tamanho de amostra de 30, no entanto, pode não ser suficiente para corrigir a assimetria ou curtose na estatística de teste se o dados de amostra (isto é, populações) são severamente anormais para começar 28. O resultado final é que, infelizmente, não existem regras rígidas e rápidas nas quais confiar. Portanto, se você tiver motivos para suspeitar que suas amostras ou as populações das quais elas são derivadas são fortemente distorcidas, consulte o estatístico mais próximo para obter conselhos sobre como proceder. No final, dado um tamanho de amostra suficiente, você pode ser liberado para o t-teste. Alternativamente, várias classes de testes não paramétricos potencialmente podem ser usados ​​(Seção 6.5). Embora esses testes tendam a ser menos poderosos do que o tNo teste de detecção de diferenças, as conclusões estatísticas tiradas dessas abordagens serão muito mais válidas. Além disso, o método de bootstrapping intensivo em computação retém o poder do t-teste, mas não requer uma distribuição normal da estatística de teste para produzir resultados válidos.

Em alguns casos, também pode ser razoável supor que as distribuições da população sejam normais o suficiente. A normalidade, ou algo bem próximo a ela, é tipicamente encontrada em situações em que muitos pequenos fatores contribuem para a distribuição final da população. Como tais efeitos são freqüentemente encontrados em sistemas biológicos, muitas distribuições naturais podem ser normais o suficiente com respeito ao t-teste. Outra maneira de contornar esse enigma é simplesmente fazer uma pergunta diferente, que não requeira a t-teste abordagem. Na verdade, o exemplo do western blot é aquele em que muitos de nós olharíamos intuitivamente para analisar as proporções das intensidades das bandas dentro dos blots individuais (discutido na Seção 6.5).

2.7. Existe um tamanho mínimo de amostra aceitável?

Você pode se surpreender ao saber que nada pode impedi-lo de executar um t-teste com tamanhos de amostra de dois. Claro, você pode achar difícil convencer alguém da validade de sua conclusão, mas você pode executá-la! Outro problema é que tamanhos de amostra muito baixos irão renderizar qualquer teste muito menos poderoso. O que isso significa em termos práticos é que, para detectar uma diferença estatisticamente significativa com tamanhos de amostra pequenos, a diferença entre as duas médias deve ser muito grande. Nos casos em que a diferença inerente não é grande o suficiente para compensar um tamanho de amostra baixo, o P-valor provavelmente estará acima do limite crítico. Nesse caso, você pode afirmar que não há evidências suficientes para indicar uma diferença entre as populações, embora possa haver uma diferença que o experimento não conseguiu detectar. Alternativamente, pode ser tentador continuar coletando amostras para empurrar o P-valor abaixo do limite tradicionalmente aceitável de 0,05. Se este é um curso de ação cientificamente apropriado é uma questão de algum debate, embora em algumas circunstâncias possa ser aceitável. No entanto, essa tática geral tem algumas armadilhas graves, que são abordadas em seções posteriores (por exemplo, Seção 6.3).

Uma coisa boa sobre trabalhar com C. elegans, entretanto, é que para muitos tipos de experimentos, podemos obter tamanhos de amostra razoavelmente grandes sem muitos problemas ou despesas. O mesmo não pode ser dito para muitos outros sistemas biológicos ou experimentais. Essa vantagem deveria teoricamente nos permitir determinar se nossos dados são normais o suficiente ou simplesmente não nos importarmos com a normalidade, já que nossos tamanhos de amostra são altos. Em qualquer caso, devemos sempre nos esforçar para tirar vantagem desse aspecto de nosso sistema e não prejudicar nossos experimentos.Claro, não importa qual seja o seu sistema experimental, questões como conveniência e despesas não devem ser as principais forças motrizes por trás da determinação do tamanho da amostra. Em vez disso, essas decisões devem ser baseadas em argumentos lógicos, pragmáticos e estatisticamente informados (consulte a Seção 6.2 sobre análise de poder).

No entanto, existem certos tipos de experimentos comuns, como qRT-PCR, em que um tamanho de amostra de três é bastante típico. Claro, por três não queremos dizer três vermes. Para cada amostra em um experimento qRT-PCR, muitos milhares de worms podem ter sido usados ​​para gerar um único extrato de mRNA. Aqui, três se refere ao número de réplicas biológicas. Em tais casos, é geralmente entendido que vermes para os três extratos podem ter crescido em paralelo, mas foram processados ​​para isolamento de mRNA e síntese de cDNA separadamente. Melhor ainda, os modelos para cada réplica biológica podem ter sido cultivados e processados ​​em momentos diferentes. Além disso, os experimentos de qRT-PCR normalmente exigem réplicas técnicas. Aqui, três ou mais alíquotas de tamanho igual de cDNA da mesma réplica biológica são usadas como o modelo em reações de PCR individuais. É claro que os dados das réplicas técnicas quase sempre mostram menos variação do que os dados das réplicas biológicas verdadeiras. É importante ressaltar que as réplicas técnicas nunca devem ser confundidas com as réplicas biológicas. No caso do qRT-PCR, os primeiros são apenas informativos quanto à variação introduzida pelo processo de pipetagem ou amplificação. Assim, as réplicas técnicas devem ser calculadas e esse valor deve ser tratado como um único ponto de dados.

Nesse caso, suponha, para fins de discussão, que cada réplica contenha extratos de 5.000 vermes. Se todos os 15.000 vermes podem ser considerados de uma única população (pelo menos com relação ao mRNA de interesse), então cada valor observado é semelhante a uma média de uma amostra de 5.000. Nesse caso, pode-se provavelmente argumentar que os três valores vêm de uma população normal (o Teorema do limite central tendo feito sua mágica em cada um), e assim um t-teste usando a média desses três valores seria aceitável do ponto de vista estatístico. Possivelmente, ainda pode sofrer de falta de energia, mas o teste em si seria válido. Da mesma forma, os valores de quantificação do Western blot, que representam a média de proteínas de muitos milhares de vermes, também podem ser considerados como abrangidos por esse guarda-chuva.

2.8. Testes emparelhados e não emparelhados

O par t-test é uma maneira poderosa de detectar diferenças em duas médias de amostra, desde que seu experimento tenha sido projetado para tirar proveito dessa abordagem. Em nosso exemplo de expressão GFP embrionária, as duas amostras foram independente na medida em que a expressão em qualquer embrião individual não estava ligada à expressão em qualquer outro embrião. Para situações que envolvem amostras independentes, o par t-teste não é aplicável, realizamos um não emparelhado t-teste em vez disso. Para que o método emparelhado seja válido, os pontos de dados devem ser vinculados de forma significativa. Se você se lembra do nosso primeiro exemplo, vermes que têm uma mutação em b mostram expressão inferior do uma:: Repórter GFP. Neste exemplo de par t-teste, considere uma cepa que carrega uma construção que codifica um dsRNA em gancho correspondente ao gene b. Usando um promotor específico e o fundo genético apropriado, o dsRNA será expresso apenas na célula mais à direita de um par neuronal particular, onde se espera que iniba a expressão do gene b através da resposta de RNAi. Em contraste, o neurônio à esquerda não deve ser afetado. Além disso, esta cepa carrega o mesmo uma:: Repórter GFP descrito acima, e é conhecido que este repórter é expresso em ambos os neurônios esquerdo e direito em níveis idênticos no tipo selvagem. A hipótese experimental é, portanto, que, de forma análoga ao que foi observado em embriões, a fluorescência do uma:: Repórter GFP será mais fraco no neurônio certo, onde o gene b foi inibido.

Nesse cenário, os dados são emparelhados de forma significativa, pois estamos medindo os níveis de GFP em duas células distintas, mas dentro de um único worm. Em seguida, coletamos dados de fluorescência de 14 vermes do tipo selvagem e 14 b (RNAi) vermes. Uma exibição visual dos dados sugere que a expressão de uma:: GFP é talvez ligeiramente diminuído na célula direita onde o gene b foi inibido, mas a diferença entre o conjunto de dados de controle e experimental não é muito impressionante (Figura 9A, B). Além disso, enquanto os meios de expressão de GFP nos neurônios esquerdos no tipo selvagem e b (RNAi) vermes são quase idênticos, a média de expressão de GFP nos neurônios certos no tipo selvagem é um pouco maior do que nos neurônios certos de b (RNAi) vermes. Para nós tPara a análise de teste, uma opção seria ignorar o emparelhamento natural nos dados e tratar as células esquerda e direita de animais individuais como independentes. Ao fazer isso, no entanto, impediríamos nossa capacidade de detectar diferenças reais. A razão é a seguinte. Já sabemos que a expressão de GFP em alguns vermes será mais fraca ou mais forte (resultando em um sinal mais escuro ou mais brilhante) do que em outros vermes. Essa variabilidade, junto com uma diferença média relativamente pequena na expressão, pode impedir nossa capacidade de sustentar as diferenças estatisticamente. Na verdade, um bicaudal t-teste usando os dados (hipotéticos) para células certas do tipo selvagem e b (RNAi) cepas (Figura 9B) acabou por dar uma P & # x0003e 0,05.

Figura 9

Representação de dados emparelhados.

A Figura 9C, D, em contraste, mostra um arranjo ligeiramente diferente dos mesmos dados GFP. Aqui, o tipo selvagem e b (RNAi) as cepas foram separadas e estamos comparando especificamente a expressão nos neurônios esquerdo e direito para cada genótipo. Além disso, linhas foram traçadas entre os pontos de dados esquerdo e direito do mesmo animal. Duas coisas são bastante impressionantes. Uma é que vermes que são brilhantes em uma célula tendem a ser brilhantes na outra. Em segundo lugar, olhando para b (RNAi) vermes, podemos ver que dentro dos indivíduos, há uma forte tendência de ter expressão reduzida no neurônio direito em comparação com o seu homólogo esquerdo (Figura 9D). No entanto, devido à variabilidade inerente entre os vermes, essa diferença foi amplamente obscurecida quando deixamos de fazer uso da natureza emparelhada do experimento. Isso não foi um problema na análise embrionária, porque a diferença entre tipo selvagem e b mutantes era grande o suficiente em relação à variabilidade entre os embriões. No caso dos neurônios (e do uso do RNAi), a diferença foi, porém, muito menor e, portanto, ficou abaixo do nível necessário para a validação estatística. Usando um par de duas caudas t-teste para este conjunto de dados dá uma P & # x0003c 0,01.

A lógica por trás do uso do par t-teste é que ele leva dados vinculados de forma significativa em conta ao calcular o P-valor. O par t-teste funciona calculando primeiro a diferença entre cada par individual. Em seguida, uma média e uma variância são calculadas para todas as diferenças entre os pares. Finalmente, uma amostra t-teste é realizado onde a hipótese nula é que a média das diferenças é igual a zero. Além disso, o par t-teste pode ser de uma ou duas caudas, e os argumentos para qualquer um deles são semelhantes aos de dois meios independentes. É claro que os programas padrão farão tudo isso para você, portanto, o funcionamento interno é efetivamente invisível. Dado o poder aprimorado do par t-teste para detectar diferenças, geralmente vale a pena considerar como a análise estatística será realizada no estágio em que você está desenvolvendo seu projeto experimental. Então, se for viável, você pode projetar o experimento para tirar proveito do par t-método de teste.

2.9. A abordagem de valor crítico

Alguns livros, principalmente os mais antigos, apresentam um método conhecido como valor crítico abordagem em conjunto com o t-teste. Este método, que tradicionalmente envolve olhar para cima t-valores em apêndices longos, foi desenvolvido muito antes do software de computador estar disponível para calcular com precisão P-valores. Parte da razão pela qual esse método pode persistir, pelo menos em alguns livros didáticos, é que ele fornece aos autores um veículo para explicar a base do teste de hipótese junto com certos aspectos técnicos do t-teste. Como um método moderno de análise de dados, entretanto, há muito ele se tornou o mesmo dos dinossauros. Não sinta obrigação de aprender isso.


& # 8216Ring Of Fire & # 8217 Solar Eclipse In Gemini: A Shift In Mindset

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Estaremos tendo um Eclipse Solar de Lua Nova em Gêmeos em 10 de junho, que atinge o pico às 10:42 da manhã, horário universal. Será um eclipse anular que ocorre quando a Lua bloqueia quase completamente o Sol, com exceção de suas bordas externas. Parece assim porque a Lua está perto de seu apogeu, que é a sua maior distância da Terra. Este tipo de eclipse também é conhecido como "Anel de Fogo" devido ao fato de aparecer desta forma.

O eclipse anular completo só será visível em partes do norte de Ontário (Canadá), partes do norte de Quebec (Canadá), partes de Nunavut (Canadá), bem como o noroeste da Groenlândia e uma parte do leste da Rússia. Será visto como um eclipse parcial na maior parte do Canadá (com exceção da parte sudoeste), a metade norte do Alasca, a maior parte do leste dos EUA, partes do centro-norte dos EUA, Groenlândia, grande parte da Rússia, grande parte da Europa e partes da Ásia mais perto da Rússia. No entanto, de alguns desses locais o Sol mal estará eclipsado e com uma janela mais curta para vê-lo.

Um Eclipse Solar é um tipo muito mais significativo de Lua Nova que influencia um período de longo prazo do que um normal. É quando ocorre perto dos Nodos Lunares, que é onde o caminho do Sol e da Lua se cruzam de nossa perspectiva na Terra. Isso acontece a cada seis meses, junto com os eclipses lunares da Lua Cheia que acontecem antes ou depois. Neste caso específico, tivemos um Eclipse Lunar em Sagitário duas semanas antes deste. Você pode ler mais sobre isso aqui.

Ambos os eclipses solares e lunares refletem mudanças e deslocamentos que afetam os seis meses seguintes e também podem influenciar até seis semanas antes. Você pode ou não ver os efeitos disso no momento em que ocorre, mas pode senti-lo e vê-lo se manifestar nas semanas ou meses seguintes.

Os eclipses são sempre parte de uma série que ocorre nos mesmos signos opostos por 1,5 a 2 anos, que é onde os nós lunares estão na maior parte desse período. As posições dos eclipses e dos nós lunares refletem um processo evolutivo em como trabalhamos com as energias desses signos e pertencentes às áreas de nossas vidas que estão sendo afetadas (com base em nosso projeto astrológico no momento específico de cada nascimento). O que resulta de uma série de eclipses nos mesmos signos ao longo desses períodos de aproximadamente 1,5 a 2 anos pode ter efeitos de longo prazo além da janela em que ocorrem.

Eclipse solar do nó norte em Gêmeos

As mudanças refletidas por este eclipse estão conectadas aos temas e áreas da vida de Gêmeos, levando a uma revisão em como suas energias são expressas. É perto do Nodo Norte Lunar que em muitos casos também pode indicar mudanças que têm um efeito crescente nas expressões de Gêmeos.

Esse processo é algo que começou há um ano e vai continuar até o final do ano. No entanto, essa energia será a mais proeminente agora, do final da primavera ao início do verão. Isso ocorre porque ele será o único Eclipse Solar em Gêmeos (nesta série de eclipses) junto com sua régua Mercúrio sendo retrógrada aqui também.

Gêmeos pertence ao elemento Ar, que é social e intelectualmente orientado. Como um signo mercurial, está associado à mente, comunicação, informação, palavras, escrita, fatos, curiosidade e deslocamento. A energia de Gêmeos é adaptável, dualística, ágil, versátil, racional e de raciocínio rápido, mas também pode ser inquieta, dispersa, dúplice, excessivamente faladora e superficial.

Gêmeos se correlaciona com nosso ambiente local / imediato, vizinhança, vizinhos, irmãos / primos, dispositivos de comunicação / computadores, educação infantil, veículos e amigos / conhecidos de anos anteriores. A energia de Gêmeos também está associada a questões LGBTQ +, bem como às diferentes expressões e orientações sob esse guarda-chuva.

Eclipse solar em conjunção com mercúrio retrógrado, aplicando quadratura a Netuno

Como mencionado acima, Mercúrio, governante de Gêmeos, também está retrógrado em seu próprio signo de Gêmeos. O que é muito interessante é que a metade desse processo retrógrado (três semanas e meia) ocorrerá horas depois desse eclipse. É quando Mercúrio está alinhado com o Sol (e a Lua, neste caso), conhecido como sua & # 8216 conjunção inferior & # 8217, e é um período muito significativo de todo o retrógrado.

A & # 8216conjunção inferior & # 8217 é uma época em que Mercúrio passa pelo coração do Sol (de uma perspectiva geocêntrica) e é vista simbolicamente como uma & # 8216purificação & # 8217. Em nossa experiência no mundo real, pode ser um momento de nos livrarmos de certos pensamentos, idéias, percepções, velhos interesses, expectativas ou outras coisas que não estão nos servindo, enquanto o potencial para novos pode ser semeado. Podemos ter percepções importantes que podem contribuir para esse processo. Embora isso tecnicamente ocorra em 10/11 de junho, esses temas também podem se manifestar nos dias que cercam esse período.

Considerando que este evento astronômico significativo está ocorrendo nas horas seguintes ao eclipse, isso pode sugerir que o efeito retrógrado de Mercúrio de recalibrar nossas mentes e percepção também pode ser uma parte importante de um pano de fundo astrológico de longo prazo ao longo dos seis meses seguintes que é sob a influência deste eclipse. É uma ocorrência rara ter ambos acontecendo ao mesmo tempo, e é ainda mais raro e interessante que tudo esteja acontecendo em um signo que rege Mercúrio.

O Sol e a Lua neste Eclipse Solar também estão se movendo em direção a uma quadratura com Netuno em Peixes. Isso pode aumentar a dispersão e a falta de foco reflexivo de Gêmeos e da energia sagitariana do eclipse lunar anterior na mesma polaridade nodal. Isso também pode trazer confusão, incerteza e engano.

Fatos, detalhes e pensamento racional podem estar em conflito com ilusões, fantasia, escapismo e ideais. Questões relacionadas à falta de limites também podem ser um tema nos próximos meses. Essa energia pode ser boa para esforços criativos orientados para a mente ou para a comunicação, ou para práticas espirituais que envolvam o ar, como respiração e meditação. Parte disso pode acontecer por volta de 13/14 de junho, quando o Sol faz uma quadratura exata com Netuno.

Saturno em Aquário Quadrado Urano em Touro

Neste mês, Saturno em Aquário está atualmente em seu segundo quadrado exato com Urano em Touro, que mencionei em artigos anteriores. Isso começou em fevereiro quando ocorreu a primeira quadratura e está presente todo este ano e um pouco no próximo ano. Este mês, especialmente de 8 a 20 de junho, será um dos períodos mais fortes desta energia, especialmente quando atinge seu pico por volta de 14/15 de junho.

Isso reflete a tensão e os desafios entre os temas ou expressões de Saturno e Urano. Saturno é tradicional, conservador, sério, racional e cauteloso. Rege compromissos, maturidade, responsabilidades, limitações, restrições, o status quo, a ordem estabelecida e estruturas. É uma questão de paciência, praticidade, disciplina e limites.

Urano é busca de liberdade, desapegado, revolucionário, radical, rebelde, progressista, reformista, idealista, não convencional, inventivo, inovador, futurista e científico. Ele representa novas tecnologias, descobertas, surpresas, interrupções e separações.

Esta configuração pode funcionar como 'velho versus novo', 'restrições versus liberdade', 'o status quo versus revolução', 'compromissos / responsabilidades versus libertação', 'ancião versus juventude', 'progressividade versus tradição' e assim por diante. Este também pode ser um momento de integração de Saturno e Urano, como a aplicação de novas abordagens tecnológicas, científicas ou metafísicas para nos ajudar em nosso trabalho.

Em alguns casos, podemos expressar uma certa mistura de temas combinados de Saturno-Urano e estar em desacordo com uma mistura diferente dessas energias. Dependendo das variáveis, isso pode potencialmente levar a contradições ou hipocrisia.

Vênus & # 8216Out Of Bounds & # 8217, Square Chiron e Sextile Uranus

Vênus, o planeta do amor, relacionamentos, amigos, vida social, valores, dinheiro, beleza, arte e estética, saiu & # 8216 dos limites & # 8217 em 23/24 de maio que durará até 17/18 de junho. Isso ocorre quando um planeta se move para fora dos limites do céu em que o Sol viaja de nossa perspectiva na Terra. Trata-se de explorar um novo território, bem como sair de nossas limitações usuais e maneiras convencionais de fazer as coisas no que diz respeito a como abordamos as áreas da vida de Vênus. Isso também pode refletir ver as coisas de forma objetiva e de uma perspectiva diferente.

No momento deste eclipse, Vênus em Câncer está se movendo em direção a uma quadratura com Quíron em Áries, que ocorrerá exatamente em 12/13 de junho. Isso pode trazer feridas, bloqueios, padrões negativos ou pode refletir temas sobre cura, percepção holística ou talvez soluções quando se trata de amor, amizades, prazeres, valores ou questões monetárias. Em alguns casos, esses temas podem estar ligados a questões familiares, segurança ou necessidades emocionais, estando em conflito com nossa individualidade e necessidades pessoais.

Vênus também está em um sextil com Urano em Touro, que pode trazer uma energia nova, estimulante, incomum, excitante, inspiradora, libertadora, inesperada ou única em nossas relações com os outros. Isso também pode refletir surpresas, mudanças positivas ou tipos de desenvolvimentos libertadores em torno de questões financeiras.

Em alguns casos, pode ser bom para explorar novas maneiras de ganhar dinheiro que podem ser inovadoras, online, metafísicas ou orientadas para a tecnologia. Isso será mais forte em 13/14 de junho, mas é possível que nossas experiências de ambas as configurações Vênus-Urano e Vênus-Quíron mencionadas acima possam estar entrelaçadas.

Coisas a considerar

Existe algo que você precisa mudar quando se trata de sua mentalidade? Alguma de suas percepções, pensamentos, idéias ou abordagens de comunicação precisam ser revisados? O que tem surgido para você que pode estar contribuindo para esse processo? Existe alguma coisa que você precisa mudar ou ajustar no que diz respeito ao seu relacionamento com vizinhos, amigos íntimos, irmãos ou parentes? Suas fontes de informação são confiáveis, factuais e racionais? Você precisa olhar para as coisas de forma mais objetiva?

Estes são apenas alguns exemplos de temas que podem surgir durante este período e, ao longo dos próximos meses, no entanto, pode haver outras variações desta energia acontecendo também. Este não é um momento para necessariamente definir intenções, mas sim para abraçar o processo evolutivo que os eclipses facilitam. Ele atingirá o pico e atingirá seu eclipse máximo às 10:42 am, horário universal em 10 de junho, enquanto começará e terminará aproximadamente duas horas e meia antes e depois. O momento exato da Lua Nova será 10:53 da manhã, hora universal. Você pode clicar aqui para ver quando o pico está em seu fuso horário.

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Resumo

O surgimento do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV) e da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS) -CoV ressalta a ameaça de eventos de transmissão entre espécies levando a surtos em humanos. Aqui, examinamos o potencial de doença de um vírus semelhante ao SARS, SHC014-CoV, que está circulando atualmente nas populações de morcegos-ferradura chineses 1. Usando o sistema 2 de genética reversa SARS-CoV, geramos e caracterizamos um vírus quimérico que expressa o pico do coronavírus de morcego SHC014 em um esqueleto SARS-CoV adaptado a camundongos. Os resultados indicam que os vírus do grupo 2b que codificam o pico SHC014 em um backbone de tipo selvagem podem usar eficientemente múltiplos ortólogos da enzima conversora de angiotensina humana II do receptor SARS (ACE2), replicar-se eficientemente em células primárias das vias aéreas humanas e alcançar em vitro títulos equivalentes a cepas epidêmicas de SARS-CoV. Adicionalmente, na Vivo experimentos demonstram a replicação do vírus quimérico no pulmão de camundongo com patogênese notável. A avaliação das modalidades imunoterapêuticas e profiláticas baseadas em SARS disponíveis revelou baixa eficácia, tanto as abordagens de anticorpos monoclonais quanto de vacinas falharam em neutralizar e proteger da infecção com CoVs usando a nova proteína spike. Com base nessas descobertas, nós derivamos sinteticamente um vírus recombinante SHC014 de comprimento total infeccioso e demonstramos uma replicação viral robusta. em vitro e na Vivo. Nosso trabalho sugere um risco potencial de ressurgimento de SARS-CoV de vírus que circulam atualmente em populações de morcegos.

O surgimento do SARS-CoV marcou uma nova era na transmissão entre espécies de doenças respiratórias graves com a globalização, levando a uma rápida disseminação ao redor do mundo e um grande impacto econômico 3,4. Desde então, várias cepas - incluindo as cepas de influenza A H5N1, H1N1 e H7N9 e MERS-CoV - surgiram de populações animais, causando doenças, mortalidade e dificuldades econômicas consideráveis ​​para as regiões afetadas 5. Embora as medidas de saúde pública tenham sido capazes de impedir o surto de SARS-CoV 4, estudos metagenômicos recentes identificaram sequências de vírus semelhantes a SARS intimamente relacionados que circulam em populações de morcegos chineses que podem representar uma ameaça futura 1,6. No entanto, os dados de sequência por si só fornecem insights mínimos para identificar e se preparar para futuros vírus pré-pandêmicos. Portanto, para examinar o potencial de emergência (ou seja, o potencial de infectar humanos) de CoVs de morcegos circulantes, construímos um vírus quimérico que codifica uma nova proteína zoonótica de pico de CoV - a partir da sequência RsSHC014-CoV que foi isolada de morcegos-ferradura chineses 1 - no contexto do backbone adaptado ao mouse SARS-CoV. O vírus híbrido nos permitiu avaliar a capacidade da nova proteína spike de causar doenças independentemente de outras mutações adaptativas necessárias em sua estrutura natural. Usando esta abordagem, caracterizamos a infecção por CoV mediada pela proteína spike SHC014 em células primárias das vias aéreas humanas e na Vivo, e testou a eficácia da terapêutica imunológica disponível contra SHC014-CoV. Juntas, a estratégia traduz os dados metagenômicos para ajudar a prever e se preparar para vírus emergentes futuros.

As sequências de SHC014 e o relacionado RsWIV1-CoV mostram que esses CoVs são os parentes mais próximos das cepas epidêmicas de SARS-CoV (Fig. 1a, b), no entanto, existem diferenças importantes nos 14 resíduos que ligam ACE2 humano, o receptor para SARS-CoV, incluindo os cinco que são críticos para a faixa de host: Y442, L472, N479, T487 e Y491 (ref. 7). Em WIV1, três desses resíduos variam da cepa epidêmica SARS-CoV Urbani, mas não se esperava que alterassem a ligação a ACE2 (Fig. 1a, b e Tabela 1 suplementar). Este fato é confirmado por ambos os experimentos de pseudotipagem que mediram a capacidade de lentivírus que codificam proteínas de pico WIV1 para entrar em células que expressam ACE2 humano (Fig. 1 Suplementar) e por em vitro ensaios de replicação de WIV1-CoV (ref. 1). Em contraste, 7 dos 14 resíduos de interação ACE2 em SHC014 são diferentes daqueles em SARS-CoV, incluindo todos os cinco resíduos críticos para a faixa de hospedeiro (Fig. 1c suplementar e Tabela 1 suplementar). Essas mudanças, juntamente com a falha de lentivírus pseudotipados que expressam o pico de SHC014 para entrar nas células (Fig. 1d complementar), sugeriram que o pico de SHC014 é incapaz de se ligar a ACE2 humano. No entanto, alterações semelhantes em cepas SARS-CoV relacionadas foram relatadas para permitir a ligação de ACE2 7,8, sugerindo que testes funcionais adicionais foram necessários para verificação. Portanto, sintetizamos o pico de SHC014 no contexto do backbone SARS-CoV adaptado a camundongo competente para replicação (doravante nos referimos ao CoV quimérico como SHC014-MA15) para maximizar a oportunidade de estudos de patogênese e vacinas em camundongos (Fig Suplementar . 2a). Apesar das previsões de modelagem baseada em estrutura e experimentos de pseudotipagem, SHC014-MA15 foi viável e replicado para altos títulos em células Vero (Fig. 2b suplementar). Similarmente ao SARS, SHC014-MA15 também exigia uma molécula ACE2 funcional para a entrada e poderia usar ortólogos ACE2 humanos, de civeta e morcego (Fig. 2c, d suplementar). Para testar a capacidade do pico de SHC014 de mediar a infecção das vias aéreas humanas, examinamos a sensibilidade da linha celular epitelial humana das vias aéreas Calu-3 2B4 (ref. 9) à infecção e encontramos uma replicação robusta de SHC014-MA15, comparável à de SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Para estender essas descobertas, culturas primárias de epitélio das vias aéreas humanas (HAE) foram infectadas e mostraram replicação robusta de ambos os vírus (Fig. 1d). Juntos, os dados confirmam a capacidade dos vírus com o pico de SHC014 de infectar células das vias aéreas humanas e destacam a ameaça potencial de transmissão de SHC014-CoV entre espécies.

(uma) As sequências do genoma de comprimento total de CoVs representativos foram alinhadas e mapeadas filogeneticamente conforme descrito nos Métodos Online. A barra de escala representa substituições de nucleotídeos, com apenas suporte de bootstrap acima de 70% sendo rotulado. A árvore mostra os CoVs divididos em três grupos filogenéticos distintos, definidos como α-CoVs, β-CoVs e γ-CoVs. Os clusters de subgrupos clássicos são marcados como 2a, 2b, 2c e 2d para os β-CoVs e como 1a e 1b para os α-CoVs. (b) As sequências de aminoácidos dos domínios S1 dos picos de β-CoVs representativos do grupo 2b, incluindo SARS-CoV, foram alinhadas e mapeadas filogeneticamente. A barra de escala representa substituições de aminoácidos. (c,d) Replicação viral de SARS-CoV Urbani (preto) e SHC014-MA15 (verde) após a infecção de células Calu-3 2B4 (c) ou culturas de células HAE de interface primária ar-líquido bem diferenciadas (d) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 para ambos os tipos de células. As amostras foram coletadas em pontos de tempo individuais com réplicas biológicas (n = 3) para ambas as experiências Calu-3 e HAE. (e,f) Perda de peso (n = 9 para SARS-CoV MA15 n = 16 para SHC014-MA15) (e) e replicação viral nos pulmões (n = 3 para SARS-CoV MA15 n = 4 para SHC014-MA15) (f) de camundongos BALB / c com 10 semanas de idade infectados com 1 × 104 p.f.u. de SARS-CoV MA15 adaptado a camundongo (preto) ou SHC014-MA15 (verde) por meio da via intranasal (i.n.). (g, h) Imagens representativas de seções de pulmão coradas para o antígeno SARS-CoV N de camundongos infectados com SARS-CoV MA15 (n = 3 ratos) (g) ou SHC014-MA15 (n = 4 ratos) (h) são mostrados. Para cada gráfico, o valor central representa a média do grupo e as barras de erro definem o s.e.m. Barras de escala, 1 mm.

Para avaliar o papel do pico de SHC014 na mediação da infecção na Vivo, infectamos camundongos BALB / c com 10 semanas de idade com 10 4 unidades formadoras de placas (p.f.u.) de SARS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1e-h). Os animais infectados com SARS-MA15 experimentaram rápida perda de peso e letalidade por 4 dias após a infecção (d.p.i.) em contraste, a infecção por SHC014-MA15 produziu perda de peso substancial (10%), mas nenhuma letalidade em camundongos (Fig. 1e). O exame da replicação viral revelou títulos virais quase equivalentes dos pulmões de camundongos infectados com SARS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1f). Enquanto os pulmões dos camundongos infectados com SARS-MA15 mostraram coloração robusta tanto nos bronquíolos terminais quanto no parênquima pulmonar 2 d.p.i. (Fig. 1g), aqueles de camundongos infectados com SHC014-MA15 mostraram redução na coloração do antígeno das vias aéreas (Fig. 1h), em contraste, nenhum déficit na coloração do antígeno foi observado no parênquima ou na pontuação geral da histologia, sugerindo infecção diferencial do tecido pulmonar para SHC014-MA15 (Tabela complementar 2). Em seguida, analisamos a infecção em animais idosos mais suscetíveis (12 meses de idade). Animais infectados com SARS-MA15 perderam peso rapidamente e sucumbiram à infecção (Suplementar Fig. 3a, b). A infecção por SHC014-MA15 induziu perda de peso robusta e sustentada, mas teve letalidade mínima. As tendências na histologia e nos padrões de coloração do antígeno que observamos em camundongos jovens foram conservadas nos animais mais velhos (Tabela Suplementar 3). Excluímos a possibilidade de que SHC014-MA15 estivesse mediando a infecção por meio de um receptor alternativo com base em experimentos usando Ace2 −/− camundongos, que não apresentaram perda de peso ou coloração de antígeno após infecção por SHC014-MA15 (Fig. 4a, b e Tabela 2 suplementar). Juntos, os dados indicam que os vírus com o pico SHC014 são capazes de induzir a perda de peso em camundongos no contexto de uma espinha dorsal CoV virulenta.

Dada a eficácia pré-clínica das terapias com anticorpos monoclonais Ebola, como o ZMApp 10, procuramos em seguida determinar a eficácia dos anticorpos monoclonais SARS-CoV contra a infecção com SHC014-MA15. Quatro anticorpos monoclonais humanos amplamente neutralizantes direcionados à proteína spike SARS-CoV foram relatados anteriormente e são prováveis ​​reagentes para imunoterapia 11,12,13. Examinamos o efeito desses anticorpos na replicação viral (expresso como porcentagem de inibição da replicação viral) e descobrimos que, enquanto o SARS-CoV Urbani do tipo selvagem foi fortemente neutralizado por todos os quatro anticorpos em concentrações de anticorpos relativamente baixas (Fig. 2a-d), a neutralização variou para SHC014-MA15. Fm6, um anticorpo gerado por mutantes de exibição de fago e escape 11,12, atingiu apenas níveis de fundo de inibição da replicação de SHC014-MA15 (Fig. 2a). Da mesma forma, os anticorpos 230.15 e 227.14, que foram derivados de células B de memória de pacientes infectados com SARS-CoV 13, também falharam em bloquear a replicação de SHC014-MA15 (Fig. 2b, c). Para todos os três anticorpos, as diferenças entre as sequências de aminoácidos do pico de SARS e SHC014 corresponderam a alterações de resíduos diretas ou adjacentes encontradas em mutantes de escape SARS-CoV (fm6 N479R 230.15 L443V 227.14 K390Q / E), o que provavelmente explica a ausência dos anticorpos & # 8217 atividade neutralizante contra SHC014. Finalmente, o anticorpo monoclonal 109.8 foi capaz de atingir 50% de neutralização de SHC014-MA15, mas apenas em altas concentrações (10 μg / ml) (Fig. 2d). Juntos, os resultados demonstram que os anticorpos amplamente neutralizantes contra SARS-CoV podem ter eficácia apenas marginal contra cepas emergentes de CoV semelhantes a SARS, como SHC014.

(umad) Ensaios de neutralização que avaliam a eficácia (medida como redução no número de placas) de um painel de anticorpos monoclonais, que foram todos originalmente gerados contra a epidemia de SARS-CoV, contra a infecção de células Vero com SARS-CoV Urbani (preto) ou SHC014-MA15 (verde). Os anticorpos testados foram fm6 (n = 3 para Urbani n = 5 para SHC014-MA15) 11,12 (uma), 230.15 (n = 3 para Urbani n = 2 para SHC014-MA15) (b), 227.15 (n = 3 para Urbani n = 5 para SHC014-MA15) (c) e 109,8 (n = 3 para Urbani n = 2 para SHC014-MA15) 13 (d) Cada ponto de dados representa a média do grupo e as barras de erro definem o s.e.m. Observe que as barras de erro em células Vero infectadas com SARS-CoV Urbani em b,c são sobrepostos pelos símbolos e não são visíveis.

Para avaliar a eficácia das vacinas existentes contra a infecção com SHC014-MA15, vacinamos camundongos idosos com SARS-CoV completo duplamente inativado (DIV). Trabalhos anteriores mostraram que o DIV pode neutralizar e proteger camundongos jovens do desafio com um vírus homólogo 14, no entanto, a vacina falhou em proteger os animais idosos nos quais a imunopatologia aumentada também foi observada, indicando a possibilidade de os animais serem prejudicados por causa da vacinação 15. Aqui descobrimos que DIV não forneceu proteção contra o desafio com SHC014-MA15 no que diz respeito à perda de peso ou título viral (Suplementar Fig. 5a, b). Consistente com um relatório anterior com outro grupo heterólogo 2b CoVs 15, soro de camundongos vacinados com DIV, também não conseguiu neutralizar SHC014-MA15 (Fig. Suplementar 5c). Notavelmente, a vacinação DIV resultou em patologia imunológica robusta (Tabela 4 complementar) e eosinofilia (Fig. 5d-f suplementar). Juntos, esses resultados confirmam que a vacina DIV não seria protetora contra a infecção com SHC014 e poderia possivelmente aumentar a doença no grupo idoso vacinado.

Em contraste com a vacinação de camundongos com DIV, o uso de SHC014-MA15 como uma vacina viva atenuada mostrou proteção cruzada potencial contra o desafio com SARS-CoV, mas os resultados apresentam ressalvas importantes. Infectamos camundongos jovens com 10 4 p.f.u. de SHC014-MA15 e os observou por 28 d. Em seguida, desafiamos os camundongos com SARS-MA15 no dia 29 (Fig. 6a Complementar). A infecção anterior dos camundongos com a alta dose de SHC014-MA15 conferiu proteção contra o desafio com uma dose letal de SARS-MA15, embora tenha havido apenas uma resposta de neutralização SARS-CoV mínima do anti-soro induzida 28 dias após a infecção por SHC014-MA15 ( Suplementar Fig. 6b, 1: 200). Na ausência de um reforço de antígeno secundário, 28 d.p.i. representa o pico esperado de títulos de anticorpos e implica que haverá uma proteção diminuída contra SARS-CoV ao longo do tempo 16,17. Resultados semelhantes mostrando proteção contra o desafio com uma dose letal de SARS-CoV foram observados em camundongos BALB / c idosos com relação à perda de peso e replicação viral (Fig. 6c, d suplementar). No entanto, a dose de infecção SHC014-MA15 de 104 p.f.u. perda de peso induzida & gt10% e letalidade em alguns animais idosos (Fig. 1 e Suplementar Fig. 3). Descobrimos que a vacinação com uma dose mais baixa de SHC014-MA15 (100 p.f.u.) não induziu perda de peso, mas também falhou em proteger animais idosos de um desafio de dose letal de SARS-MA15 (Fig. 6e, f suplementar). Juntos, os dados sugerem que o desafio de SHC014-MA15 pode conferir proteção cruzada contra SARS-CoV por meio de epítopos conservados, mas a dose necessária induz a patogênese e impede o uso como uma vacina atenuada.

Tendo estabelecido que o pico de SHC014 tem a capacidade de mediar a infecção de células humanas e causar doença em camundongos, sintetizamos em seguida um clone infeccioso SHC014-CoV de comprimento completo com base na abordagem usada para SARS-CoV (Fig. 3a) 2. A replicação em células Vero não revelou nenhum déficit para SHC014-CoV em relação ao SARS-CoV (Fig. 3b), no entanto, SHC014-CoV foi significativamente (P & lt 0,01) atenuado em culturas primárias de HAE em 24 e 48 h após a infecção (Fig. 3c). Na Vivo a infecção de camundongos não demonstrou perda de peso significativa, mas mostrou replicação viral reduzida nos pulmões de infecção por SHC014-CoV de comprimento total, em comparação com SARS-CoV Urbani (Fig. 3d, e). Juntos, os resultados estabelecem a viabilidade do SHC014-CoV de comprimento total, mas sugerem que uma adaptação adicional é necessária para que sua replicação seja equivalente à do SARS-CoV epidêmico em células respiratórias humanas e em camundongos.

(uma) Esquema do clone molecular SHC014-CoV, que foi sintetizado como seis cDNAs contíguos (designados SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E e SHC014F) flanqueado por sítios BglI únicos que permitiram a montagem direcionada do cDNA de comprimento total expressando leitura aberta quadros (para 1a, 1b, pico, 3, envelope, matriz, 6–8 e nucleocapsídeo). Os nucleotídeos sublinhados representam as sequências salientes formadas após a clivagem da enzima de restrição. (b,c) Replicação viral de SARS-CoV Urbani (preto) ou SHC014-CoV (verde) após a infecção de células Vero (b) ou culturas de células HAE de interface primária ar-líquido bem diferenciadas (c) a um MOI de 0,01. As amostras foram coletadas em pontos de tempo individuais com réplicas biológicas (n = 3) para cada grupo. Os dados representam uma experiência para células Vero e HAE. (d,e) Perda de peso (n = 3 para SARS-CoV MA15, n = 7 para SHC014-CoV n = 6 para SARS-Urbani) (d) e replicação viral nos pulmões (n = 3 para SARS-Urbani e SHC014-CoV) (e) de camundongos BALB / c com 10 semanas de idade infectados com 1 x 105 p.f.u. de SARS-CoV MA15 (cinza), SHC014-CoV (verde) ou SARS-CoV Urbani (preto) via i.n. rota. Cada ponto de dados representa a média do grupo e as barras de erro definem o s.e.m. **P & lt 0,01 e ***P & lt 0,001 usando Student bicaudal & # 8217s t-teste de pontos de tempo individuais.

Durante a epidemia de SARS-CoV, as ligações foram rapidamente estabelecidas entre as civetas de palmeira e as cepas de CoV que foram detectadas em humanos 4. Com base nessa descoberta, o paradigma de emergência comum argumenta que a epidemia de SARS-CoV se originou como um vírus de morcego, saltou para as civetas e incorporou mudanças no domínio de ligação ao receptor (RBD) para melhorar a ligação à civeta Ace2 (ref. 18). A exposição subsequente a pessoas em mercados de animais vivos permitiu a infecção humana com a cepa de civeta, que, por sua vez, se adaptou para se tornar a cepa epidêmica (Fig. 4a). No entanto, a análise filogenética sugere que as primeiras cepas humanas de SARS parecem mais relacionadas às cepas de morcegos do que às cepas de algália 18. Portanto, um segundo paradigma argumenta que a transmissão direta morcego-humano iniciou a emergência de SARS-CoV e que as civetas de palmeira serviram como hospedeiro secundário e reservatório para a infecção contínua (Fig.4b) 19. Para ambos os paradigmas, a adaptação do pico em um hospedeiro secundário é vista como uma necessidade, com a maioria das mutações esperadas para ocorrer dentro do RBD, facilitando assim a infecção melhorada. Ambas as teorias implicam que os pools de CoVs de morcegos são limitados e que as mutações no hospedeiro são aleatórias e raras, reduzindo a probabilidade de eventos futuros de emergência em humanos.

As cepas de coronavírus são mantidas em pools de quase espécies que circulam nas populações de morcegos. (uma,b) As teorias tradicionais de emergência do SARS-CoV postulam que os mutantes na gama do hospedeiro (círculo vermelho) representam ocorrências raros e aleatórias que permitem a infecção de hospedeiros alternativos. O paradigma do host secundário (uma) argumenta que um hospedeiro não humano é infectado por um vírus progenitor de morcego e, por meio da adaptação, facilita a transmissão para humanos, a replicação subsequente em humanos leva à cepa viral epidêmica. O paradigma direto (b) sugere que a transmissão ocorre entre morcegos e humanos sem a necessidade de uma seleção de hospedeiro intermediário, então ocorre na população humana com vírus intimamente relacionados replicando em um hospedeiro secundário, permitindo persistência viral continuada e adaptação em ambos. (c) Os dados de vírus quiméricos do tipo SARS argumentam que os pools de quase espécies mantêm vários vírus capazes de infectar células humanas sem a necessidade de mutações (círculos vermelhos). Embora as adaptações em hospedeiros secundários ou humanos possam ser necessárias para o surgimento da epidemia, se os vírus contendo spike SHC014 recombinarem-se com backbones CoV virulentos (círculos com contornos verdes), então a doença epidêmica pode ser o resultado em humanos. Os dados existentes suportam elementos de todos os três paradigmas.

Embora nosso estudo não invalide as outras rotas de emergência, ele defende um terceiro paradigma no qual os pools de CoV de morcegos circulantes mantêm proteínas de pico & # 8216dentadas & # 8217 que são capazes de infectar humanos sem mutação ou adaptação (Fig. 4c). Esta hipótese é ilustrada pela capacidade de um vírus quimérico contendo o pico SHC014 em um esqueleto SARS-CoV para causar infecção robusta em ambas as culturas de vias aéreas humanas e em camundongos sem adaptação RBD. Juntamente com a observação de estruturas patogênicas de CoV previamente identificadas 3,20, nossos resultados sugerem que os materiais de partida necessários para cepas emergentes semelhantes a SARS estão circulando atualmente em reservatórios de animais. Notavelmente, embora SHC014-CoV de comprimento completo provavelmente requeira adaptação de backbone adicional para mediar doenças humanas, os eventos de recombinação de alta frequência documentados em famílias de CoV sublinham a possibilidade de emergência futura e a necessidade de preparação adicional.

Até o momento, as telas genômicas de populações animais têm sido usadas principalmente para identificar novos vírus em ambientes de surto 21. A abordagem aqui estende esses conjuntos de dados para examinar questões de emergência viral e eficácia terapêutica. Consideramos os vírus com o pico de SHC014 uma ameaça potencial devido à sua capacidade de se replicar em culturas primárias de vias aéreas humanas, o melhor modelo disponível para doenças humanas. Além disso, a patogênese observada em camundongos indica uma capacidade dos vírus contendo SHC014 de causar doença em modelos de mamíferos, sem adaptação de RBD. Notavelmente, o tropismo diferencial no pulmão em comparação com aquele com SARS-MA15 e atenuação de SHC014-CoV de comprimento total em culturas HAE em relação ao SARS-CoV Urbani sugere que fatores além da ligação de ACE2 - incluindo processabilidade de pico, biodisponibilidade do receptor ou antagonismo das respostas imunes do hospedeiro - pode contribuir para o surgimento. No entanto, mais testes em primatas não humanos são necessários para traduzir esses achados em potencial patogênico em humanos. É importante ressaltar que o fracasso da terapêutica disponível define uma necessidade crítica para estudos adicionais e para o desenvolvimento de tratamentos. Com esse conhecimento, programas de vigilância, reagentes diagnósticos e tratamentos eficazes podem ser produzidos que são protetores contra o surgimento de CoVs específicos do grupo 2b, como SHC014, e estes podem ser aplicados a outras ramificações de CoV que mantêm pools heterogêneos semelhantes.

Além de oferecer preparação contra futuros vírus emergentes, essa abordagem deve ser considerada no contexto dos estudos de pausa no ganho de função (GOF) exigidos pelo governo dos Estados Unidos 22. Com base em modelos anteriores de emergência (Fig. 4a, b), não se esperava que a criação de vírus quiméricos como SHC014-MA15 aumentasse a patogenicidade. Embora SHC014-MA15 seja atenuado em relação ao seu parental SARS-CoV adaptado a camundongo, estudos semelhantes examinando a patogenicidade de CoVs com o pico Urbani de tipo selvagem dentro da estrutura MA15 não mostraram perda de peso em camundongos e redução da replicação viral 23. Assim, em relação ao pico Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 mostra um ganho na patogênese (Fig. 1). Com base nessas descobertas, os painéis de revisão científica podem considerar estudos semelhantes que constroem vírus quiméricos com base em cepas circulantes muito arriscados de serem investigados, já que o aumento da patogenicidade em modelos de mamíferos não pode ser excluído. Juntamente com as restrições sobre cepas adaptadas a camundongos e o desenvolvimento de anticorpos monoclonais usando mutantes de escape, a pesquisa sobre o surgimento de CoV e a eficácia terapêutica pode ser severamente limitada no futuro. Juntos, esses dados e restrições representam uma encruzilhada de pesquisas do GOF. O potencial para se preparar e mitigar futuros surtos deve ser pesado contra o risco de criar patógenos mais perigosos. No desenvolvimento de políticas futuras, é importante considerar o valor dos dados gerados por esses estudos e se esses tipos de estudos de vírus quiméricos justificam uma investigação mais aprofundada em relação aos riscos inerentes envolvidos.

No geral, nossa abordagem usou dados metagenômicos para identificar uma ameaça potencial representada pelo morcego circulante do tipo SARS CoV SHC014. Devido à capacidade dos vírus SHC014 quiméricos de se replicarem em culturas de vias aéreas humanas, causam a patogênese na Vivo e para escapar da terapêutica atual, há uma necessidade tanto de vigilância quanto de terapêutica melhorada contra vírus circulantes semelhantes a SARS. Nossa abordagem também desbloqueia o uso de dados metagenômicos para prever a emergência viral e aplicar esse conhecimento na preparação para tratar futuras infecções virais emergentes.


Exemplos de análise integrativa

Montar esses bancos de dados e criar ferramentas de análise é, no entanto, apenas a primeira etapa. Para que tenham valor, eles devem ser úteis e usados. Consequentemente, ao desenvolver essas ferramentas, nos concentramos em abordar problemas biológicos reais. Aqui, descrevemos dois exemplos que requerem estratégias analíticas muito diferentes que ilustram como essas ferramentas têm sido úteis na análise de dados de expressão gênica e sua interpretação por meio da integração com outras fontes de informação.


Experiência na indústria vs. saída para um doutorado.

Eu me formei em bioquímica há cerca de 2,5 anos e trabalho na indústria de biotecnologia desde antes de me formar (cerca de 3 anos no total). Meu objetivo é liderar um projeto em biotecnologia de descoberta de drogas e, posteriormente, um grupo (biologia química idealmente). Fui promovido algumas vezes e reconhecido por meu trabalho e sinto que atualmente posso continuar subindo na escada, mas estou procurando conselhos sobre se agora é a hora de sair para o doutorado.

Devo abrir mão dos anos de experiência no setor (e salário) que poderia ganhar continuando a trabalhar para obter um doutorado. na esperança de aumentar minhas chances de ter a oportunidade de assumir um papel de liderança algum dia? A ideia de academia não me excita necessariamente, e eu adoraria permanecer na indústria, mas também não quero chegar a um teto onde descubro que não sou considerado para oportunidades de liderança por causa da minha falta de diploma.

Uma outra preocupação sobre a qual gostaria de um conselho é se NÃO é hora de deixar a indústria para fazer um doutorado. porque, presumo, meu emprego na indústria é muito mais estável do que seria meu lugar em um programa de pós-graduação por causa do COVID-19.

Qualquer conselho é apreciado!

Você poderia fazer um PhD da indústria.

Eu sei que minha escola faz isso onde alguns alunos de doutorado trabalharam em BI e talvez na Bayer. Sua bolsa era quase a mesma de um aluno de doutorado em universidades R1 tradicionais, mas eles trabalhavam em tempo integral na empresa e iam para a escola de vez em quando para participar de simpósios de pesquisa ou defesa.

Eu concordaria com seu sentimento de que ficar na indústria com um emprego é mais estável do que ir para a academia, mas eu não trabalho mais na academia, então deixarei isso para outros aqui participarem.

Fiz meu doutorado em indústria junto com meu trabalho. Efetivamente meu projeto de doutorado era meu trabalho por alguns anos. Há algum grande projeto chegando em que você trabalhará de qualquer maneira que você poderia transformar em uma tese? Se o seu chefe / empresa for bom, eles vão querer investir em sua própria equipe, pois você é uma quantidade conhecida. Vale a pena perguntar quais são as opções.

Esta é a abordagem correta para tentar primeiro. Trabalhe com sua empresa para tentar fazer um PhD na indústria.

Acho que, em última análise, depende da empresa. Recentemente, descobri que a AbbVie tem um programa para fazer isso. Mesmo com Pfizer, Biogen, AstraZeneca, etc.

Eu estava na mesma posição há cerca de dois anos. Eu trabalhava em uma grande indústria farmacêutica e estava sendo promovido rapidamente e tinha projetos independentes.

Falei com MUITOS mentores / pessoas em cargos em que finalmente me vi. Eu queria liderar um grupo de pesquisa sozinho e me preocupava, sem um PhD K, atingiria o teto antes de chegar lá.

O melhor conselho que recebi resume-se a estes pontos:

SE (grande se) você conseguir o papel de liderança que deseja sem um PhD, você nunca poderá deixar esse trabalho. Pela experiência de meu chefe, ele não podia deixar seu lugar de gerenciamento de projetos como um cientista principal porque apenas nossa empresa acreditava nele e outra empresa teria dificuldade em lhe dar a mesma função sem seu doutorado. Ele se arrepende de não ter o seu.

um PhD mais tradicional lhe dará uma experiência que você não conseguiria em outro lugar (ou seja, PhD da indústria), você pode realmente amar a academia e querer ficar ou pode mudar de área e ampliar seus próprios conjuntos de habilidades.

levaria ANOS para romper o teto sem um doutorado. O doutorado vai agilizar o processo, mesmo com perda de salário pelo tempo que você leva para obtê-lo.

Pelo que descobri conversando com as pessoas. Quanto mais cedo você conseguir o PhD, melhores serão seus caminhos de carreira e mais longos. Você ganha não apenas habilidades científicas valiosas, mas também habilidades para a vida.

Com base na minha própria experiência de decidir saltar sobre a arma, deixar meu emprego na indústria por um PhD. Não me arrependo. Eu & # x27conheci algumas das melhores pessoas aqui que são meus melhores amigos e eu nunca os teria conhecido de outra forma. Eu & # x27conheci mentores que irei respeitar e pedir ajuda pelo resto da minha vida. Adquiri todos os tipos de habilidades fora do laboratório que me ajudaram a crescer como pessoa.

Meu conselho. Se indústria é o que você deseja, obtenha seu PhD em um instituto de pesquisa. Não é uma universidade acadêmica típica. A pesquisa de tradução vai prepará-lo para um trabalho no setor e fornecer habilidades que você pode trazer de volta ao setor, além de usar suas habilidades no setor. Estou em um instituto de tradução associado a um hospital e sinto que é o lugar perfeito para guardar minhas ciências e minhas habilidades interpessoais para voltar à indústria quando terminar.

Não se preocupe com a "perda" de sua experiência no setor porque você saiu para fazer seu doutorado. Você SEMPRE colocará sua experiência no setor em seu currículo. E se você fez seu doutorado com o objetivo de expandir sua carreira, qualquer empresa seria burra em não ver isso como uma coisa boa.


Como funciona a inicialização

O spin de uma partícula reflete suas simetrias subjacentes, ou as maneiras pelas quais ela pode ser transformada que a deixa inalterada. Uma partícula de spin 1, por exemplo, retorna ao mesmo estado após ser girada por uma volta completa. Uma partícula de spin-$ latex frac <1> <2> $ deve completar duas rotações completas para voltar ao mesmo estado, enquanto uma partícula de spin 2 parece idêntica depois de apenas meia volta. Partículas elementares podem carregar apenas 0, $ latex frac <1> <2> $, 1, $ latex frac <3> <2> $ ou 2 unidades de spin.

Para descobrir qual comportamento é possível para as partículas de um determinado spin, os bootstrappers consideram as interações simples das partículas, como duas partículas aniquilando e produzindo uma terceira. Os spins das partículas colocam restrições nessas interações. Uma interação de partículas de spin 2, por exemplo, deve permanecer a mesma quando todas as partículas participantes são giradas em 180 graus, uma vez que são simétricas sob tal meia volta.

As interações devem obedecer a algumas outras regras básicas: o momentum deve ser conservado; as interações devem respeitar a localidade, que determina que as partículas se espalhem ao se encontrarem no espaço e no tempo e as probabilidades de todos os resultados possíveis devem somar 1, um princípio conhecido como unidade. Essas condições de consistência se traduzem em equações algébricas que as interações das partículas devem satisfazer. Se a equação correspondente a uma interação particular tem soluções, então essas soluções tendem a ser realizadas na natureza.

Por exemplo, considere o caso do fóton, a partícula de luz sem massa spin-1 e eletromagnetismo. Para tal partícula, a equação que descreve as interações de quatro partículas - onde duas partículas entram e duas saem, talvez depois de colidir e espalhar - não tem soluções viáveis. Assim, os fótons não interagem dessa maneira. “É por isso que as ondas de luz não se dispersam e podemos ver a distâncias macroscópicas”, explicou Baumann. O fóton pode participar de interações envolvendo outros tipos de partículas, como spin- $ latex frac <1> <2> $ elétrons. Essas restrições nas interações do fóton levam às equações de Maxwell, a teoria do eletromagnetismo de 154 anos.

Ou considere os glúons, partículas que transmitem a força forte que une os núcleos atômicos. Os glúons também são partículas de spin 1 sem massa, mas representam o caso em que existem vários tipos da mesma partícula de spin 1 sem massa. Ao contrário do fóton, os glúons podem satisfazer a equação de interação de quatro partículas, o que significa que eles interagem automaticamente. As restrições nessas auto-interações de glúons correspondem à descrição dada pela cromodinâmica quântica, a teoria da força forte.

Um terceiro cenário envolve partículas de spin-1 que têm massa. A massa surgiu quando uma simetria quebrou durante o nascimento do universo: uma constante - o valor do campo de Higgs onipresente - mudou espontaneamente de zero para um número positivo, imbuindo muitas partículas de massa. A quebra da simetria de Higgs criou partículas massivas de spin-1 chamadas bósons W e Z, os portadores da força fraca responsável pela decadência radioativa.

Então, "para o spin-2, um milagre acontece", disse Adam Falkowski, físico teórico do Laboratório de Física Teórica em Orsay, França. Nesse caso, a solução para a equação de interação de quatro partículas à primeira vista parece estar cercada de infinitos. Mas os físicos descobrem que essa interação pode ocorrer de três maneiras diferentes, e que os termos matemáticos relacionados às três opções diferentes conspiram perfeitamente para cancelar os infinitos, o que permite uma solução.

Essa solução é o gráviton: uma partícula de spin 2 que se acopla a si mesma e a todas as outras partículas com igual força. Essa imparcialidade leva direto ao princípio central da relatividade geral: o princípio da equivalência, o postulado de Einstein de que a gravidade é indistinguível da aceleração através do espaço-tempo curvo e que a massa gravitacional e a massa intrínseca são uma e a mesma. Falkowski disse sobre a abordagem bootstrap: "Acho esse raciocínio muito mais convincente do que o abstrato de Einstein."

Assim, pensando nas restrições colocadas nas interações de partículas fundamentais por simetrias básicas, os físicos podem entender a existência das forças fortes e fracas que moldam os átomos e as forças do eletromagnetismo e da gravidade que esculpem o universo em geral.

Além disso, os bootstrappers descobrem que muitas partículas diferentes de spin-0 são possíveis. O único exemplo conhecido é o bóson de Higgs, a partícula associada ao campo de Higgs de quebra de simetria que imbui outras partículas de massa. Uma partícula hipotética de spin 0 chamada de ínflaton pode ter impulsionado a expansão inicial do universo. A falta de momento angular dessas partículas significa que menos simetrias restringem suas interações. Por causa disso, os bootstrappers podem inferir menos sobre as leis que regem a natureza, e a própria natureza tem uma licença mais criativa.

Spin- $ latex frac <1> <2> $ partículas de matéria também têm mais liberdade. Estas constituem a família de partículas massivas que chamamos de matéria, e são individualmente diferenciadas por suas massas e acoplamentos às várias forças. Nosso universo contém, por exemplo, spin- $ latex frac <1> <2> $ quarks que interagem com glúons e fótons e spin- $ latex frac <1> <2> $ neutrinos que não interagem com nenhum deles.

O espectro de spin para em 2 porque os infinitos na equação de interação de quatro partículas matam todas as partículas sem massa que têm valores de spin mais altos. Podem existir estados de spin mais alto se forem extremamente massivos, e tais partículas desempenham um papel nas teorias quânticas da gravidade, como a teoria das cordas. Mas as partículas de spin mais alto não podem ser detectadas e não podem afetar o mundo macroscópico.


Experimentos Médicos no Terceiro Reich

A experimentação médica antiética (sem o consentimento do paciente ou qualquer salvaguarda) realizada durante o Terceiro Reich pode ser dividida em três categorias.

1. Experimentos que lidam com a sobrevivência de militares

Muitos experimentos nos acampamentos pretendiam facilitar a sobrevivência dos militares do Eixo no campo. Por exemplo, em Dachau, médicos da Força Aérea Alemã e da Instituição Experimental Alemã de Aviação conduziram experimentos de alta altitude em prisioneiros para determinar a altitude máxima a partir da qual as tripulações de aeronaves danificadas poderiam saltar de pára-quedas em segurança. Cientistas também realizaram os chamados experimentos de congelamento em prisioneiros para encontrar um tratamento eficaz para a hipotermia. Os prisioneiros também foram usados ​​para testar vários métodos de tornar potável a água do mar.

2. Experimentos para testar drogas e tratamentos

Outros experimentos objetivaram desenvolver e testar drogas e métodos de tratamento para lesões e doenças que militares alemães e pessoal de ocupação encontraram no campo. Nos campos de concentração alemães de Sachsenhausen, Dachau, Natzweiler, Buchenwald e Neuengamme, os cientistas usaram prisioneiros do campo para testar compostos de imunização e anticorpos para a prevenção e tratamento de doenças contagiosas, incluindo malária, tifo, tuberculose, febre tifóide, febre amarela e hepatite infecciosa. Os médicos de Ravensbrück conduziram experimentos em enxerto ósseo e testaram drogas sulfa (sulfanilamida) desenvolvidas recentemente. Em Natzweiler e Sachsenhausen, os prisioneiros foram expostos a fosgênio e gás mostarda para testar possíveis antídotos.

3. Experimentos para promover os objetivos raciais e ideológicos nazistas

Uma terceira categoria de experimentação médica buscou promover os princípios raciais e ideológicos da visão de mundo nazista.Os mais famosos foram os experimentos de Josef Mengele em gêmeos de todas as idades em Auschwitz. Ele também dirigiu experimentos com roma (ciganos), como fez Werner Fischer em Sachsenhausen, para determinar como diferentes "raças" resistiam a várias doenças contagiosas. A pesquisa de August Hirt na Universidade de Estrasburgo também pretendia estabelecer a "inferioridade racial judaica". Outras experiências horríveis destinadas a promover os objetivos raciais nazistas incluíram uma série de experiências de esterilização, realizadas principalmente em Auschwitz e Ravensbrück. Cientistas testaram vários métodos em um esforço para desenvolver um procedimento eficiente e barato para a esterilização em massa de judeus, ciganos e outros grupos de líderes nazistas considerados racial ou geneticamente indesejáveis.


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