Em formação

Existe uma ferramenta de clonagem molecular de linha de comando?


Existem muitos softwares como SnapGene, Geneious, Vector NTI, ApE, Gentle e outros para assistência na clonagem. Suas principais funções são:

  • Fazendo mapas de plasmídeos
  • Anotando plasmídeos com características comuns
  • Encontrando sites de restrição
  • Mapeamento de leituras de sequenciamento Sanger
  • Mostrando sequência, complemento reverso da sequência, traduções em quadros diferentes
  • Projetando primers para aplicações específicas (como clonagem Gibson)

Existe uma ferramenta que executa funções como essas, mas é executada a partir de uma linha de comando?


Observação: Minha intenção não é tanto obter recomendações sobre o que usar, mas ter uma ideia de qual software está disponível atualmente. Obviamente, existem muitas ferramentas CLI que podem ser feitas para servir tb essas finalidades, até e incluindo editores de texto de uso geral, comovi.

Estou interessado em saber que esforço já foi feito para produzir software CLI especificamente destinado à clonagem (com isso me refiro às funções descritas acima).


Fazendo mapas de plasmídeos Anotando plasmídeos com características comuns

O Plasmapper funciona através da linha de comando

Encontrando sites de restrição

Pesquisas simples de regex podem fazer isso

Mapeamento de leituras de sequenciamento Sanger

O BLAST fará isso.

Mostrando sequência, complemento reverso da sequência, traduções em quadros diferentes

O EMBOSS possui uma coleção de ferramentas para essas coisas. (Getorfé uma ferramenta para encontrar ORFs)

Projetando primers para aplicações específicas (como clonagem Gibson)

Primer3 funciona através da linha de comando



Você pode simplesmente baixar toda a coleção EMBOSS. Possui muitas ferramentas úteis.


Para o alinhamento de proteínas, você tem coisas como Clustal W / Clustal X. Muitos, inclusive eu, usamos R para trabalhos relacionados à bioinformática e encontrei este pacote que pode ser encontrado no Bioconductor, que pode abordar um de seus pontos, mas eu não sei de qualquer CLI unificado para os pontos que você disse.

Eu não trabalhei com esse pacote específico, mas se você tiver R ou RStudio, que é meu IDE preferido, você simplesmente precisa inserir o comando

fonte ("bioconductor.org/biocLite.R")

comando para fazer upload do pacote biocLite e preparar R para download do banco de dados / depositário do biocondutor e, em seguida, execute o comando

biocLite ("ecolitk")

É principalmente para funções de plotagem para trabalhar com genômica circular e pode ser usado com outros genomas / plasmídeos de acordo com a descrição do pacote.


PSF-CMV-UB-HYGRO-SV40 ORI SBFI - HIGROMICINA / SV40 ORI PLASMIDE

Este vetor contém uma cassete de expressão de resistência à Higromicina (Hygro) sob o promotor Ub. Ele também contém o vírus Simian 40 (origem de replicação do SV40. Isso permite que o plasmídeo seja amplificado em células contendo o antígeno T grande do SV40. Isso pode ser usado para aumentar o sinal do transgene após a transfecção transitória. Também é relatado que é possível fazer linhas celulares contendo o plasmídeo como um epissoma de múltiplas cópias, no entanto, não o validamos para esse propósito. O cassete Ub Hygro é flanqueado por locais AscI neste plasmídeo e não foi projetado para ser dividido. Se você quiser o gene Higromicina sozinho ou o promotor Ub sozinho, consulte a seção de gene de seleção de mamífero ou a seção de promotor em nosso site. Este vetor também pode ser usado para forçar a recombinação no genoma de células de mamífero que não expressam o antígeno T grande de SV40 após transfecção e seleção de higromicina, embora este método pode ser ineficiente. Se as células estão expressando o antígeno T grande de SV40, aquelas que integram o plasmídeo provavelmente experimentariam instabilidade cromossômica porque o O antígeno arge T iniciaria a replicação do DNA de dentro do cromossomo hospedeiro.

Nível de expressão do promotor: Este plasmídeo contém o promotor CMV de mamífero para dirigir a expressão do gene. Testamos todos os nossos promotores de mamíferos em uma variedade de tipos de células e o CMV é consistentemente o mais forte entre aqueles que estudamos. No entanto, existem muitos relatos do promotor CMV demonstrando silenciamento por metilação em cultura de longo prazo. Por este motivo, temos em estoque uma série de outros promotores que são compatíveis com este plasmídeo e estão disponíveis mediante solicitação.

Aplicativo

Clonagem em um gene: Este plasmídeo foi projetado para ser compatível com uma variedade de técnicas de clonagem. O local de clonagem múltipla contém uma variedade de locais de restrição comumente usados ​​para clonagem. Usando esses locais, os genes podem ser inseridos usando métodos de clonagem padrão com DNA ligase. Outros métodos, como clonagem independente de ligase (LIC) Gibson Assembly InFusionHD ou Seamless GeneArt, também podem ser usados ​​e, como todos os nossos plasmídeos são baseados na mesma estrutura, o mesmo método pode ser usado para clonagem em todos os nossos vetores de catálogo.

Notas de sites de clonagem múltipla: Existem alguns sites importantes no MCS. Isso inclui o site NcoI, o site XbaI e os sites BsgI e BseRI. O local NcoI contém um códon de início que está imediatamente a jusante de um local de ligação ribossômica Kozak e Shine-Dalgarno. Isso permite o posicionamento ideal dos genes quando o códon de início é colocado neste local. Se isso não for necessário e você deseja usar um local a jusante para clonagem de genes, você pode remover o local NcoI clivando o plasmídeo com KpnI.

O site XbaI contém um códon de parada. Este códon de parada é posicionado em uma posição específica em relação aos locais BsgI e BseRI que estão imediatamente a jusante. Quando BseRI ou BsgI clivam o plasmídeo, eles produzem uma saliência TA a partir do códon de parada no local XbaI que é compatível com todos os nossos plasmídeos de marcação de peptídeo cortados com os mesmos locais. Os locais BseRI e BsgI são não palíndrômicos e clivam um número definido de bases de seu local de ligação.

Sempre que clonamos um gene em nosso sítio de clonagem múltipla, sempre posicionamos o códon de início e de parada nas mesmas posições no MCS. Se o início e o fim dos genes não forem compatíveis com NcoI e XbaI, estendemos a sequência para os locais externos mais próximos, mas mantemos as localizações dos códons de início e parada consistentes.


1. INTRODUÇÃO

Os príons são proteínas que podem mudar de estados não agregados para agregados altamente ordenados de auto-modelagem. Esta propriedade lhes permite conferir mudanças estáveis ​​em estados biológicos que são de grande interesse na biologia molecular e evolutiva (Newby e Lindquist, 2013). Por exemplo, eles criam doenças neurodegenerativas, perpetuam estados de atividade em sinapses neurais e fornecem acesso a um amplo domínio de diversificação fenotípica em micróbios. A capacidade de identificar potenciais proteínas semelhantes a príons a partir de dados de sequência aceleraria a busca por novos príons em uma ampla variedade de taxa. Nós desenvolvemos anteriormente (Alberti et al., 2009) um modelo de Markov oculto (HMM) para identificar príons candidatos e analisar esses candidatos em domínios semelhantes a príons (PrLDs) e não PrLDs, com base na composição de aminoácidos (AA). Resumidamente, o HMM tem dois estados ocultos, para PrLD e fundo, e os símbolos de saída são os 20 AAs. As probabilidades de saída para o estado PrLD foram construídas com base nas frequências AA nos PrLDs de quatro príons de Saccharomyces cerevisiae que eram conhecidos na época. Este algoritmo e extensões têm sido usados ​​em vários estudos para identificar sequências semelhantes a príons em leveduras (Holmes et al., 2013) e também em humanos (Kim et al., 2013 King et al., 2012), em que várias proteínas com PrLDs estão associadas a ALS e doenças neurodegenerativas relacionadas. Aqui, descrevemos um front-end baseado na web para o algoritmo de predição de príon, PLAAC, e damos uma visão geral da implementação e das extensões, mais detalhes são fornecidos no site do PLAAC.


Existe uma ferramenta de clonagem molecular de linha de comando? - Biologia

Faça coisas divertidas com arquivos de dados biológicos. Sério, dados biológicos são divertidos :)

Os módulos BuddySuite são ferramentas de linha de comando 'one-stop-shop' para manipulações comuns de arquivos de dados biológicos. Os formatos são detectados automaticamente, as conversões são contínuas e você pode entrar ou sair dos módulos para construir fluxos de trabalho de bioinformática personalizados, permitindo que você gaste mais tempo analisando suas sequências, alinhamentos e árvores filogenéticas, em vez de alterá-los.

Por exemplo, o comando a seguir lê três arquivos de sequência (todos em formatos diferentes), extrai registros com identificadores RefSeq, chama MAFFT para gerar um alinhamento, desloca lacunas para forçar um alinhamento de códon, chama RAxML para inferir uma filogenia e, em seguida, raízes a árvore em seu ponto médio.

$: Seqbuddy seqs1.gb seqs2.embl seqs3.fasta --pull_records "[XN] M" | alignbuddy --generate_alignment mafft | alignbuddy --enforce_triplets | phylobuddy --generate_tree raxmlHPC-SSE3 | phylobuddy --root

BuddySuite é um projeto Python3, desenvolvido e amplamente testado em Linux e Mac OS X. Versões de lançamento completas também são testadas no Windows antes do lançamento, portanto, devem funcionar como esperado no Vista e superior.

A maneira mais simples de começar a trabalhar é:

Mais instruções estão disponíveis no guia de instalação.

Também existe um Guia para Iniciantes para mostrar o básico, bem como um Tutorial mais abrangente.

Cada ferramenta no BuddySuite foi amplamente documentada no wiki, completa com exemplos trabalhados e explicações para todos os argumentos / opções.

Todos os kits de ferramentas individuais do Buddy estão localizados no diretório 'buddysuite' e o ramo 'desenvolver' é onde todos os novos recursos foram implementados. Se você estiver interessado em contribuir, consulte a página do desenvolvedor para obter mais informações.

Se você usa BuddySuite em seu trabalho, agradeceríamos muito as referências ao nosso manuscrito:

Por meio de uma série de eventos infelizes e uma editora surpreendentemente indiferente, o manuscrito está atrás de um paywall. Graças a Deus por pré-impressões no bioRxiv!

Quaisquer comentários que você tenha seriam muito apreciados. Sinta-se à vontade para adicionar problemas ao rastreador de problemas do GitHub ou entre em contato com Steve Bond (desenvolvedor líder) diretamente em [email protected]


Resultados

O princípio central do HAC é baseado no anelamento de fragmentos de DNA (inserções) com a sequência homóloga do vetor, nas extremidades da molécula. Esta homologia é gerada na inserção, para coincidir com a da sequência do vetor alvo, adjacente a qualquer sítio de restrição de escolha. A sequência específica do vetor é anexada à inserção durante a amplificação por PCR utilizando iniciadores com cauda (HAC-caudas). Em uma única reação, o inserto e o vetor digerido por RE são tratados com T4 pol, produzindo extremidades homólogas de fita simples que são subsequentemente recozidas antes de serem transformadas em um padrão de clonagem competente E. coli cepa.

Requisitos de design do primer HAC-tail

A primeira etapa de HAC envolve o projeto de iniciador que incorpora caudas de HAC específicas de vetor no produto de PCR amplificado, permitindo assim que a inserção se emparelhe com o vetor linearizado. A cauda do primer HAC é dependente da sequência adjacente ao local de corte RE do vetor selecionado, levando em consideração as bases que permanecerão após a ação de exonuclease 3 ′ → 5 ′ de T4 pol, independentemente do padrão de clivagem de RE. Na extremidade 5 'do primer de PCR direto, a sequência complementar à fita negativa do vetor é selecionada e incorporada. Por outro lado, a sequência complementar à fita positiva no vetor é incorporada na extremidade 5 'do primer de PCR reverso. A Figura 1A representa a estratégia de design do primer HAC, ilustrando a abordagem usada para a incorporação de gfp em pUC19 no Hinlocal de corte dIII.

Figura 1: HAC: projeto e fluxo de trabalho do primer.

Esboço do procedimento

A inserção desejada é primeiro amplificada por PCR utilizando os iniciadores HAC-tailed enquanto o vetor desejado é digerido com uma enzima de restrição de escolha. O produto de PCR é então purificado com um kit de limpeza de DNA adequado. O vetor linearizado e o inserto são feitos de fita simples em suas extremidades por meio da ação de exonuclease 3 ′ → 5 ′ de T4 pol. A confiabilidade do kit de limpeza de DNA para a remoção de dNTPs não incorporados após PCR é crucial, que se permanecer na reação anulará a atividade da exonuclease T4 pol. Uma reação de tubo único (Fig. 1B) é configurada com vetor digerido de escolha, produto de PCR purificado (inserção), tampão T4 pol e T4 pol. Testamos proporções de inserto para vetor de até 10: 1 e descobrimos que uma proporção molar de 3: 1 produziu resultados excelentes. A reação é incubada por 1 min a 37 ° C, após o qual a reação é interrompida pela adição de EDTA, gerando, assim, moléculas de inserção e vetor com caudas de cadeia simples 5′. Para minimizar o pareamento de nucleotídeo incompatível entre as fitas complementares do vetor e a inserção, a reação é incubada por 1 min a 60 ° C, removida do calor e deixada resfriar até a temperatura ambiente, momento em que o anelamento da fita está completo e o plasmídeo recombinante resultante é pronto para transformação (Fig. 1B). A mistura de reação é então transformada em um quimicamente competente E. coli cepa de clonagem via choque térmico e os transformantes resultantes são rastreados por métodos padrão. As principais etapas do procedimento foram otimizadas experimentalmente, conforme descrito abaixo, com os resultados incluídos no método final recomendado.

Determinação do tempo de tratamento de exonuclease apropriado

Um aspecto importante da eficiência para HAC envolveu a determinação do tempo de incubação ideal com T4 pol para gerar as saliências de fita simples tanto na inserção quanto no vetor. Para conseguir isso de forma ideal, é necessário entender a taxa na qual o T4 pol exerce sua atividade de exonuclease. Dado por muito tempo, há o risco da inserção ser completamente degradada, enquanto um tempo de tratamento muito curto pode resultar em vetor / inserção insuficiente sendo de fita simples e não disponível para recozimento. Avaliamos isso de duas maneiras, ou seja, medição da "taxa de decaimento" da fluorescência Sybr e mudança de mobilidade eletroforética. Para fluorescência Sybr, testamos isso usando 100 ng de um produto de PCR de 762 bp purificado (gfp) juntamente com 1 U T4 pol (por reação) e incubando as amostras a 37 ° C. Nos pontos de tempo desejados, as reações individuais foram interrompidas com a adição de EDTA e Sybr Green I, uma coloração de DNA de fita dupla (dsDNA), foi adicionado. Devido à incapacidade de Sybr Green I de corar eficazmente o DNA de fita simples, a quantidade relativa de dsDNA pode ser medida como unidades de fluorescência relativa (rfu) em relação ao tempo em segundos (Fig. 2A). Observamos uma diminuição linear reproduzível em rfu para aproximadamente o ponto de tempo de 4 min (Fig. 2A). A partir daí, a taxa de declínio da fluorescência desacelera para um quase platô além do ponto de tempo de 5 minutos. É provável que a seção linear da curva nos primeiros 4 min represente um aumento linear na fita simples. Para avaliar a linearidade da incorporação de Sybr e a fluorescência resultante durante esta análise, preparamos 100 ng de amostras mistas de DNA de fita dupla e de fita simples em proporções definidas. A fluorescência Sybr dessas amostras de controle alinhada muito de perto com a do nosso DNA tratado com T4 (Fig. 2A, colunas cinza), validando assim a nossa abordagem. Uma taxa rudimentar de remoção de nucleotídeos pode ser calculada a partir da curva. Usando 26.000 rfu (ponto de tempo de 4 min) como uma indicação aproximada de degradação completa do fragmento (tamanho inicial 762 bp) e 90.000 rfu (ponto de tempo 0 s) como a indicação do fragmento de comprimento total, podemos considerar uma diminuição de 64.000 rfu como a quantidade de sinal perdido através da atividade de exonuclease de T4 pol para degradar todo o produto de PCR. Isso se traduz em aproximadamente 84 rfu / base. A taxa de diminuição para uma redução de 64.000 rfu ao longo de um período de 4 min equivale a aproximadamente 266 rfu / s. Com base nesses valores, calcularíamos a taxa de degradação em aproximadamente 3,2 bases / s. Considerando que o T4 pol está exercendo sua atividade de exonuclease em ambas as extremidades, a taxa geral de exonuclease de T4 pol seria aproximadamente a metade desse valor, a 1,6 bases / s ou 96 bases / min / extremidade da molécula.

Figura 2: Definição da taxa de atividade de exonuclease da T4 DNA polimerase.

Para avaliar ainda mais os efeitos da atividade da exonuclease de T4 pol em produtos de diferentes tamanhos, observamos os efeitos de T4 pol em conjunto com uma escada de 100 bp, tratada por 30 s, 1 min, 3 min e 5 min. Os resultados foram então visualizados por eletroforese em gel (Fig. 2B). Mesmo em 30 s, uma mudança na banda de 100 bp indica que ela foi modificada pelo tratamento, resultando em propriedades eletroforéticas alteradas, provavelmente devido à proporção decrescente de dsDNA modificando o peso molecular e a carga do fragmento e / ou aumento da flexibilidade conformacional devido às regiões estendidas de fita simples. O tratamento por 1 min degradou uma porção significativa do fragmento de 100 bp, enquanto que em 3 min ele foi completamente degradado. Além disso, muitas das bandas maiores também exibem taxas de migração alteradas em 5 min de incubação. Com base nesses dois resultados, determinamos que o tempo de incubação de 30 s é adequado para a geração de caudas de fita simples, porém recomendamos 1 min a 37 ° C para a clonagem efetiva, levando em consideração a possível variação nas taxas e eficiência da enzima devido à marca / origem ou às condições de armazenamento, garantindo que a inserção de escolha (mesmo as inserções pequenas) permaneça protegida de degradação completa.

Otimização de comprimentos de cauda HAC

A sequência complementar das caudas HAC entre a inserção e o vetor é a chave para o recozimento eficiente e específico entre os dois, permitindo assim uma clonagem altamente bem-sucedida e minimização de custos. Comparamos a eficiência do HAC usando inserções com caudas de primer HAC de 15, 20 ou 25 bp. Ao mesmo tempo, também exploramos o benefício potencial oferecido pela reversão de T4 pol para reparar lacunas de ssDNA após o recozimento de fragmentos. Nós clonamos o gfp gene em pUC19, em uma inserção de 3: 1 para a razão molar do vetor usando 50 ng de vetor linearizado no Hinsite dIII. A clonagem do gfp gene permitiu um método simples e imparcial para avaliar o sucesso do procedimento de clonagem por meio da identificação de colônias fluorescentes (Fig. 3). Esta estratégia permite a quantificação imediata de clones positivos entre todas as colônias resultantes (Tabela 1). A clonagem com caudas HAC de 15 pb resultou em 226 colônias de plaqueamento de 100 μl de transformantes (de 1 ml de volume recuperado equivalente a 2,5 ng de DNA do vetor ou ∼9 × 10 4 cfu / μg de DNA do vetor), dos quais, 217 foram fluorescente, o que equivale a 96% de taxa de sucesso de gfp inserção. Um aumento no comprimento das caudas HAC aumentou o número total de transformantes (467 ou ∼1,9 × 10 5 cfu / μg e 761 ou ∼3 × 10 5 cfu / μg colônias para caudas HAC de 20 pb e 25 pb, respectivamente) , aumentando a taxa de sucesso geral para 98% e 99%, respectivamente. Como referência, a competência avaliada do lote de células usado neste estudo foi um modesto 5 × 10 6 ufc / μg de pUC19, destacando ainda mais a eficiência do método considerando o nível modesto de competência das células usadas. Considerando essas percentagens de clonagem excepcionais, recomendamos o desenho de caudas HAC de 15 bp usando caudas HAC além de 15 bp serviriam apenas para aumentar o custo da síntese de primer, sem um benefício apreciável.

Figura 3: O gene gfp amplificado com 15 bp (A, B), 20 bp (C, D) ou 25 bp HAC-caudas (E, F) foram clonados em pUC19 via HAC.

Clonagem de gfp em pUC19
Parado com EDTA Reparado com dNTPs
Colônias fluorescentes Colônias totais % de sucesso Colônias fluorescentes Colônias totais % de sucesso
Saliências de 15 bp 217 226 96 143 175 82
Saliências de 20 bp 458 467 98 367 415 88
Saliências de 25 bp 754 761 99 625 686 91

Avaliação do método alternativo de captura de exonuclease

A T4 DNA polimerase reverterá para sua atividade preferida de 5 '→ 3' polimerase na presença de dNTPs. A adição de dNTP ao anelamento pós-inserção da reação facilitará o reparo de lacunas de ssDNA do plasmídeo. Isso pode ser realizado como uma alternativa à adição de EDTA para reduzir as possibilidades de fita simples estendida ou atividade de exonuclease não verificada. Portanto, testamos e comparamos as eficiências desse método alternativo e não observamos melhora na eficiência quando dNTP é usado, indicando que essa adição é desnecessária para o procedimento (Tabela 1). Portanto, recomendamos omitir esta etapa adicional em favor da solução de parada de EDTA mais simples e econômica.

HAC para clonagem de múltiplos fragmentos

Muitas vezes, é desejável produzir vetores contendo várias inserções para fazer isso em uma única reação economiza um tempo considerável no laboratório. Portanto, investigamos a seguir a eficiência da utilização de HAC para a clonagem simultânea de duas inserções em um vetor. Para demonstrar isso claramente, amplificamos dois cassetes de resistência a antibióticos carregando o gato e neo genes (cm r e kan r ) conferindo resistência ao cloranfenicol (Cm) e canamicina (Kan), respectivamente. Caudas HAC apropriadas (15, 20, 25 bp) foram projetadas para a junção entre as cm r e kan r cassetes, bem como entre a cassete de antibiótico e o vector pUC19. A clonagem foi realizada com uma relação molar inserto para vetor de 3: 3: 1 (equimolar entre os dois insertos) para comparar a eficiência entre os diferentes comprimentos de cauda do HAC, bem como entre a parada com EDTA e o reparo com dNTPs. Ao plaquear um volume igual de transformantes em placas LB Amp e placas LB Cm / Kan (100 μl de 1 ml de células recuperadas de 2,5 ng de vetor), fomos capazes de comparar a taxa de sucesso da inserção de ambos os cassetes no vetor com base no colônias que cresceram na presença de Cm e Kan (Tabela 2). Como acima, aumentar o comprimento das caudas HAC aumentou o número total de colônias obtidas a partir da transformação, no entanto, ao clonar duas inserções juntas, é evidente que o comprimento da cauda do primer HAC aumentado também melhora a eficiência com 40%, 71% e 79% positivo clones obtidos com caudas HAC de 15, 20 e 25 pb, respectivamente. De acordo com isso, recomendamos o uso de caudas HAC mais longas para a clonagem de inserções múltiplas. A partir de nossos resultados, recomendaríamos um mínimo de 20 bp como suficiente para obter uma taxa de eficiência de alto nível, embora possa valer a pena usar até 25 bp caso seja necessário clonar mais fragmentos simultaneamente. Ao comparar a adição de dNTPs (reparo de lacunas) em vez de EDTA, a adição de dNTPs aumentou o número total de colônias obtidas, embora, novamente, não a eficiência com base no número de colônias em LB Cm / Kan. Embora defendamos que é desnecessário utilizar dNTPs para a clonagem de múltiplas inserções, caso a competência da cepa de clonagem seja um problema, utilizar o método alternativo de dNTPs pode melhorar o processo de clonagem simplesmente devido ao aumento do número de colônias obtidas.

Clonagem de cm r e kan r em pUC19
Parado com EDTA Reparado com dNTPs
Colônias Kan / Cm Colônias de amp % De sucesso aproximada Colônias Kan / Cm Colônias de amp % De sucesso aproximada
Saliências de 15 bp 38 96 40 124 296 42
Saliências de 20 bp 89 125 71 192 327 59
Saliências de 25 bp 189 239 79 351 558 63

Método HAC otimizado

Projete primers para a amplificação da inserção desejada, incorporando caudas HAC de 15 bp para inserção única e & gt20 bp para inserções múltiplas

Inserção amplificada por PCR com primers HAC-tailed

Limpe o produto de PCR para remover dNTPs não incorporados com o kit de limpeza de DNA apropriado

Prepare a reação HAC em gelo, contendo 50 ng de DNA de vetor digerido por RE, DNA de inserção purificado (inserção 3: 1: razão molar do vetor), tampão de polimerase T4 e 1 U de T4

Incubar a 37 ° C por 1 min, em seguida, adicionar EDTA a uma concentração final de 25 nM e misturar

Incubar a 60 ° C por 1 min e remover, permitindo que a reação esfrie até a temperatura ambiente

Transforme-se em quimicamente competente E. coli via choque térmico.

* Nb. Embora não seja necessário, realizamos rotineiramente a reação HAC em um termociclador para maior conveniência e precisão.

Comparação de HAC e SLIC de uma etapa

A fim de afirmar os benefícios do nosso método entre as diferentes variações de métodos baseados em LIC na literatura, optamos por realizar uma comparação direta de HAC com o método SLIC de uma etapa (Islam et al., 2017 Jeong et al., 2012). O SLIC de uma etapa foi descrito pela primeira vez como uma melhoria e simplificação do método SLIC original, que embora fosse a descrição mais antiga de um método LIC sem restrição de sequência, também era um procedimento um tanto complicado (Li & amp Elledge, 2007). Entre todos os métodos baseados em LIC, o SLIC de uma etapa é o mais semelhante ao HAC, mas difere do HAC em duas maneiras importantes, a primeira sendo que a atividade de exonuclease de T4 pol não é inativada e, a segunda, a etapa de recozimento depende de um período prolongado no gelo. A fim de comparar diretamente essas duas diferenças importantes, conduzimos o HAC com a relação molar inserto: vetor subótima de 2: 1 (como recomendado no SLIC de uma etapa) e com todas as outras condições idênticas. Nós clonamos o gfp gene com 15 bp HAC-caudas usando SLIC de uma etapa (50 ° C por 30 s, 10 min no gelo) (Islam et al., 2017) e HAC (37 ° C por 1 min, EDTA, 1 min 60 ° C ) Em nossas mãos, o SLIC de uma etapa mostrou uma eficiência de aproximadamente 72% em comparação com HAC com eficiência de 92% (Fig. S1). Vale a pena notar aqui que a eficiência de 92% alcançada neste experimento em particular é menor do que aquela alcançada ao usar nossa inserção recomendada: razão molar do vetor para HAC de 3: 1 (ver Tabela 1 acima).


Ferramentas digitais e recursos de amp

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Software QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology)
Conjunto poderoso de ferramentas de bioinformática de código aberto para realizar análises de microbiomas a partir de sequências brutas. * RNA

Isso permite uma navegação rápida pela página e o uso do * em Ctrl + F pesquisas para diferenciar entre
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Algoritmo

Fase 1: Localize regiões conservadas nas sequências de DNA, encontrando alinhamentos locais sem lacunas com uma pontuação de entropia baixa.
Fase 2: Projete primers usando variantes de algoritmos de aproximação simples, chamados CONTRACTION e EXPANSION (esses algoritmos aproximam o número de sequências que o primer faz não correspondência, desde que as sequências sejam sobre um alfabeto binário).
Fase 3: Execute um procedimento de hill-climbing ganancioso para melhorar os primers e selecione aquele com a maior cobertura como saída.

HYDEN pode projetar vários pares de primers degenerados que, juntos, cobrem muitos dos conjuntos de sequências fornecidos. Depois de projetar o primeiro par, HYDEN projeta um segundo par de primers no conjunto de sequências que não são cobertas pelo primeiro par. E assim por diante para o resto dos pares.

Os detalhes completos do algoritmo e a análise computacional relevante são descritos em [2,3].
HYDEN é escrito em C ++ e roda em Windows e Linux.


Existe uma ferramenta de clonagem molecular de linha de comando? - Biologia

O experimentDB é um aplicativo baseado na web para armazenamento, organização e comunicação de dados experimentais com foco em biologia molecular e dados bioquímicos. Este aplicativo também armazena dados sobre reagentes, incluindo anticorpos, construções e outras biomoléculas, bem como rastreia a distribuição de reagentes. Existem também algumas interfaces preliminares para outros recursos da web.

Status atual de compilação e teste

Este projeto contém vários subaplicativos, conforme descrito abaixo:

Este pacote define experimentos e os dados relacionados a eles associados. O modelo de experimento é o foco de todo o projeto. Ele contém detalhes sobre protocolos, notas, reagentes e detalhes do projeto. Os resultados são associados a objetos de experimento, permitindo que um experimento contenha vários resultados.

A intenção deste aplicativo é coordenar projetos específicos. Os projetos devem ser grandes, do tamanho de uma doação, projetos maiores no laboratório. Os subprojetos devem ser grupos de experimentos menores, potencialmente do tamanho de um papel. Um experimento pode ser parte de um, nenhum ou vários projetos ou subprojetos.

O aplicativo de clonagem define os parâmetros para a síntese e manutenção de construções geradas como parte de um experimento. As construções podem ser geradas por meio de clonagem ou mutagênese e resultarão em um objeto de clonagem ou mutagênese, respectivamente.

As proteínas referenciadas por este pedido podem ser alvos de um experimento ou reagente. Este aplicativo também contém informações mais detalhadas sobre proteínas específicas, normalmente acessadas de bancos de dados públicos usando bancos de dados externos ou por meio de ferramentas Biopython.

O aplicativo de reagentes armazena informações sobre todas as ferramentas usadas na pesquisa, muitas das quais são definidas por um objeto de experimento específico. Estes incluem objetos Primer, Cell (linhas celulares), Anticorpo, Strain, Chemical e Construct. Esses modelos são classes básicas abstratas de uma superclasse ReagentInfo que define a maioria das informações relevantes comuns.

A ideia é atribuir a modelos particulares referências sobre contatos externos ou fornecedores ou vincular em referências específicas importantes para os experimentos ou projetos.

O aplicativo de conjuntos de dados contém dados e visualizações para alguns bancos de dados externos. Isso pode incluir bancos de dados externos acessados ​​diretamente ou com um banco de dados interno espelhado. Este módulo é bastante específico de interesse de pesquisa e provavelmente será removido eventualmente.

ExperimentDB requer que um banco de dados e um servidor web sejam configurados. O ideal é que o banco de dados seja hospedado separadamente do servidor web e da instalação do ExperimentDB, mas isso não é necessário, pois ambos podem ser usados ​​no mesmo servidor. Se você estiver usando um servidor remoto para o banco de dados, é melhor configurar um usuário para esse banco de dados que só pode ser acessado do servidor da web. Se você deseja configurar várias instalações (ou seja, para diferentes usuários ou diferentes laboratórios), você precisa de bancos de dados separados e instalações ExperimentDB para cada um. Você também precisará configurar o servidor da web com endereços diferentes para cada instalação.

  1. http://github.com/davebridges/ExperimentDB/downloads para a versão atual

  2. http://github.com/davebridges/ExperimentDB para o código-fonte

  3. de pypi inserindo:

Baixar e / ou descompactar criará um diretório chamado ExperimentDB. Você pode atualizar para a revisão mais recente a qualquer momento usando git ou baixando e reinstalando a versão mais recente. Alterar ou atualizar as versões do software não alterará os dados salvos, mas você terá que atualizar o arquivo localsettings.py (descrito abaixo).

Pitão. Requer a versão 2.6, ainda não é compatível com Python 3.0. Baixe em Python.

Django. Download from Django. This will be automatically installed if you installed experimentdb with pip. This will be automatically installed if you installed experimentdb with pip. The current version supported is Django 1.4

Database software. Typically MySQL is used, but PostgreSQL, Oracle or SQLite can also be used. You also need to install the python driver for this database (unless you are using SQLite, which is internal to Python 2.5+). For more information see Instructions.

Python Dependencies These can be automatically installed using pip with the following command from the root directory:

Create a new database. You need to record the user, password, host and database name. Refer to the database documentation for how to do this with a specific database engine. If you are using SQLite3, you only need to set the engine and the database name. It is recommended to use PostgreSQL.

Go to experimentdb/localsettings_empty.py and edit the ADMINS and TIME_ZONE settings. Change the secret key to a random sequence of letters. Depending on your webserver you may also want to set the MEDIA_URL, LOGIN_URL and STATIC_URL settings:

Save this file as localsettings.py in the experimentdb directory.

Run the test client by going into the main directory and running the following. There should be no errors at this point:

ExperimentDB upgrades may involve schema changes. We use south to control schema migrations. To update database schema, first initial migrations must be run, shortly after installation. If an upgrade (either via SVN or by a new download) involves a change in the database schema, errors may occur. Look at HISTORY in the root folder to see if an upgrade invovles schema migrations. To set up south, shortly after installation enter at the command line:

Generate the initial database tables then move the static files to the STATIC_ROOT by entering:

When asked, generate an administrative superuser and set the email and password.

You need to set up a server to serve both the django installation and saved files. Ideally a separate webserver would be set up to serve both the /static and /media files. Although if it is easier you can use apache for both. You can serve media and static files from any location on your server, just indicate this by setting STATIC_ROOT and MEDIA_ROOT in localsettings. You can also choose to serve from a different url (rather than /media or /static) by changing the MEDIA_URL or STATIC_URL respectively. The preferred setup for the django files is to use Apache2 with mod_wsgi. The following is a httpd.conf example where the code is placed in /usr/src/django/ExperimentDB:

If you want to restrict access to these files, change the Allow from all directive to specific domains or ip addresses (for example Allow from 192.168.0.0/99 would allow from 192.168.0.0 to 192.168.0.99)

Final Configuration and User Setup

Go to experimentdb/admin/auth/users/ and create users, selecting usernames, full names, password (or have the user set the password) and then choose group permissions.

If an app is migrated during an upgrade enter the following where "APP" is data, datasets, reagents, cloning, sharing, projects, external, proteins or hypotheses without the quotes and the "OPTIONAL DESCRIPTION" is something describing the changes, if desired:

See the South documentation, or submit an issue if problems occur.


  • Publisher &rlm : &lrm Cold Spring Harbor Laboratory Press 1st edition (May 31, 2006)
  • Language &rlm : &lrm English
  • Paperback &rlm : &lrm 800 pages
  • ISBN-10 &rlm : &lrm 0879697717
  • ISBN-13 &rlm : &lrm 978-0879697716
  • Item Weight &rlm : &lrm 1.1 pounds
  • Dimensions &rlm : &lrm 8.5 x 1.25 x 11 inches

Principais críticas dos Estados Unidos

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The condensed protocols version of Molecular Cloning is well written, concise and adequately referenced. Protocols are easy to follow and provide options depending upon individual experimental needs and preference.

The protocols provide information from home made recipes to prepared reagents available commercially.

The protocols work in my hands.

The book is large and not easily used on bench top. Otherwise it is a good resource for the laboratory.


Assume you want to merge changes someone has committed to a git repository which was at some point cloned from the official Biopython branch. He needs to make his repository available to you (read-only) by giving you a URL. Typically this will be on GitHub (but it may be any public git url). Let us assume that the url is (which happens to be my clone of Biopython):

First, you need to get the code from this repository:

Then you can see what branches are there:

Let’s say you want to merge changes from test-branch. You need to make sure you are up to date with the official branch:

And then you can do the actual merge:

And (assuming you are OK with the results of git diff and git status), you can push to the public repository on GitHub (please don’t try that with this exemplary data):

After you’re done, you can remove the reference to the remote repo:


Assista o vídeo: 12 Linha de Comando (Janeiro 2022).