Em formação

O DNA reage de todas as maneiras que a maioria dos outros ácidos o fazem?


Pelo que entendi de minha química básica, existem algumas reações fundamentais que existem entre qualquer ácido e outras substâncias, por exemplo, reações ácido-base que formam um sal e a existência de um estado de equilíbrio na água.

Essas reações e equilíbrios ocorrem com o DNA (ou, nesse caso, com o RNA), que só me foi descrito como um "ácido", e isso afeta os processos pelos quais o DNA passa, como replicação e transcrição?


Pode parecer contra-intuitivo que desoxirribonucléico ácido tem nitrogênio bases. No entanto, os ácidos nucléicos (incluindo assim o RNA) foram chamados dessa forma porque a estrutura do fosfato (ligada por grupos fosfodiéster) é um derivado do ácido fosfórico.

Ácido fosfórico

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Grupo Fosfodiéster

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Observe que a única diferença entre esses dois grupos é que, no caso do fosfodiéster, duas ligações O-H são substituídas por ligações O-C. Isso torna o último átomo de hidrogênio restante bastante ácido (pode ser rapidamente identificado pela forma como a base conjugada exibe ressonância). Na verdade, é tão ácido que em pH fisiológico, o grupo fosfodiéster está desprotonado, dando a esse nucleotídeo um carga negativa. Essa propriedade tem um efeito profundo na estrutura e no "comportamento" do DNA em uma célula e é frequentemente explorada na genética, como na eletroforese em gel.

Um fato interessante é que essa acidez do grupo fosfodiéster na verdade compete com a basicidade das bases nitrogenadas. No entanto, como na maioria das vezes o DNA é de fita dupla, as bases individuais farão uma ligação de hidrogênio com seu parceiro para formar pares de bases, o que estabiliza e, portanto, reduz essa basicidade.

TLDR: Embora diferentes ácidos de diferentes composições moleculares possam atuar de maneiras muito diferentes, a química ácido-base geral é visto em ácidos nucléicos.


Detalhes de DNA

DNA significa ácido desoxirribonucleico. É especial porque contém o código de cada célula do seu corpo. Isso mesmo. Cada célula do seu corpo usa o DNA como um manual de instruções. Se você quiser tirar a importância dessa afirmação, pode dizer que o DNA é apenas uma longa cadeia espiral de nucleotídeos. Mas é mais. Muito mais.

Então, você obtém todos esses nucleotídeos em duas longas cadeias que se torcem uma em torno da outra. Essa forma de torção é chamada de dupla hélice. A escada em espiral tem a capacidade de se enrolar e se desenrolar para que a cadeia de ácido nucléico possa se duplicar. Esse processo de duplicação, denominado replicação, ocorre sempre que uma célula se divide.


Que tipos de ácidos nucléicos existiam antes do RNA e do DNA?

Os 227 isômeros do RNA calculados pelos pesquisadores. O isômero biológico é destacado com uma cartela preta. Alguns deles podem ter propriedades químicas interessantes e ainda inexploradas.

O software de geração de estrutura permite que os cientistas comecem a explorar os tipos de ácidos nucléicos que poderiam ter existido antes, ao lado ou, na verdade, ao invés do ácido ribonucléico (RNA) e do DNA.

Dois dos 'blocos de construção' essenciais da vida são o DNA e o RNA, formas de ácido nucléico que carregam informações genéticas de uma geração para a outra. O RNA, ou ácido ribonucléico, é um polímero composto de monômeros repetidos de nucleotídeos, os quais são compostos da ribose do açúcar, um grupo fosfato e heterociclos de nitrogênio. O RNA é considerado uma molécula primordial, e muitos pesquisadores acham que entender sua origem é de fundamental importância para entender as origens da vida. No entanto, apesar de seu papel central, surpreendentemente pouco se sabe sobre de onde realmente veio o RNA. Nenhum estudo até o momento teve sucesso na geração de RNA em uma reação em um único vaso a partir de materiais de partida mais simples, embora isso não signifique que os ácidos nucléicos mais simples não existissem antes do RNA.

Henderson James Cleaves II, do Earth-Life Science Institute (ELSI) do Instituto de Tecnologia de Tóquio, juntamente com cientistas da Alemanha e dos Estados Unidos, gerou e examinou todos os isômeros possíveis de nucleosídeos de RNA. Eles queriam determinar onde o RNA poderia estar em termos de seu 'espaço estrutural' - o número de estruturas moleculares possíveis que poderiam existir dados certos parâmetros de definição. Suas descobertas sugerem que o RNA pode ter competido com várias outras estruturas antes de se tornar a molécula central na biologia que é hoje.

Usando software de geração de estrutura, Cleaves e sua equipe descobriram 227 estruturas isoméricas diferentes, bem como dezenas de análogos mais simples, que poderiam servir como blocos de construção para moléculas semelhantes a RNA. Eles selecionaram as estruturas após uma seleção cuidadosa do número total de possibilidades que poderiam ser derivadas da fórmula dos ribosídeos. Eles escolheram estruturas que provavelmente permaneceriam estáveis ​​em certas condições (pH e temperatura moderados, por exemplo), e aquelas com pelo menos dois grupos funcionais que permitiriam que os monômeros se tornassem parte de polímeros lineares mais complexos.

Seus resultados levantam muitas questões e sugerem que o RNA pode não ter estado sozinho em sua capacidade de transportar informações genéticas em um passado distante. Quase nenhuma das 227 estruturas neste conjunto foi investigada anteriormente e, portanto, sua capacidade de realizar funções de herança genética é desconhecida. A equipe de Cleaves pede mais pesquisas sobre esse enorme "espaço estrutural" de RNA para explorar mais essas descobertas.

RNA e suas origens controversas

O ácido ribonucléico (RNA) desempenha um papel central na transmissão de informações genéticas nas células. É provável que tanto o RNA quanto o DNA parceiro tenham evoluído como a abordagem ideal para essa tarefa, dados certos parâmetros definidores, como a capacidade de funcionar e permanecer estável em células pequenas. As soluções da natureza eram RNA e DNA, neste caso, mas o resultado poderia ter sido diferente se outras versões dessas moléculas tivessem dominado durante os primeiros dias da vida na Terra.

Até agora, nenhuma reação em um único vaso foi capaz de recriar monômeros de RNA em laboratório usando materiais prebióticos simples. Este cenário levou a uma disputa dentro do campo se o RNA é ou não uma molécula 'única', sozinha em seu próprio 'espaço estrutural'. Este é o primeiro estudo a examinar todos os isômeros possíveis que podem ser criados a partir da fórmula química básica do RNA: BC5H9O4, onde B é a nucleobase).

O 'espaço estrutural' de uma molécula

Com um determinado conjunto de ingredientes, é possível criar muitas combinações diferentes. No caso do RNA, os componentes constituintes do carbono, hidrogênio e oxigênio, junto com o complexo base-açúcar, podem criar muitas formas moleculares diferentes. Os isômeros são moléculas que têm a mesma fórmula química (ou os mesmos ingredientes), mas os átomos individuais são organizados de maneiras diferentes dentro da molécula. O número total de formas possíveis que uma molécula com a mesma fórmula química pode assumir, dentro de certos parâmetros de definição, é conhecido como o 'espaço estrutural' da molécula.

Esta pesquisa é a primeira a tentar definir o 'espaço estrutural' do RNA - para elucidar o total de isômeros possíveis de ribosídeos que poderiam formar a base das moléculas do tipo RNA. Cleaves e sua equipe descobriram 227 estruturas com probabilidade de sobreviver em ambientes moderados, que podem ter funções semelhantes ao RNA. Muitas dessas estruturas nunca foram descritas ou estudadas cientificamente.

Implicações da pesquisa atual

As descobertas deste estudo implicam que o RNA pode ter competido com um grande número de ácidos nucleicos alternativos durante a evolução biológica para se tornar o ácido nucleico chave que é hoje, e resultados evolutivos alternativos podem ocorrer em outros planetas. Os autores insistem em mais trabalhos nesta área e sugerem que se deve ter cuidado ao assumir que o RNA era único em seu "espaço estrutural" nos primeiros estágios da vida na Terra.


INTRODUÇÃO

A possibilidade de empregar moléculas de DNA na engenharia de nanoestruturas artificiais (1, 2) tem chamado a atenção cada vez mais durante as últimas duas décadas (3–5). O intenso desenvolvimento da nanotecnologia de DNA rendeu novos métodos para construir nanoobjetos definidos pelo usuário (6), como origami de DNA (7–11), para uma variedade de usos científicos e tecnológicos (12–16). Em particular, essas nanoformas de DNA personalizadas mostram uma promessa considerável em biomedicina e distribuição de drogas (17-21). Nanoveículos de DNA projetados racionalmente podem encapsular e exibir cargas selecionadas (22-25), agir como agentes terapêuticos (26), servir como plataformas para vários ligantes de direcionamento e sequências de ácido nucleico personalizadas (27, 28) ou hospedar diretamente diversos medicamentos de ligação ao DNA (29, 30). Neste último caso, o medicamento mais utilizado é a antraciclina doxorrubicina (DOX), um intercalador fluorescente de DNA, que é aplicado no tratamento de diversos tipos de câncer e principalmente na supressão do crescimento de tumores sólidos (31). Seu principal mecanismo de ação ocorre através da inibição da topoisomerase do DNA do tipo IIA, mas também afeta vários outros processos celulares por meio da intercalação do DNA e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (32). A potência terapêutica de várias nanoestruturas de origami de DNA carregadas com DOX (DONs) foi demonstrada usando em vitro e na Vivo modelos em vários relatórios (33–43).

A presumida intercalação e liberação de DOX são tipicamente caracterizadas usando indicadores espectroscópicos, como mudanças espectrais de absorção de luz visível ou supressão de fluorescência de DOX após a ligação ao DNA. No entanto, além da intercalação, DOX pode ser complexado com DNA por meio de (pré-intercalação) ligação de sulco menor e empilhamento em agregados, dependendo da sequência de DNA, concentração de DOX prevalente e condições experimentais, como pH ou a força iônica da solução (44- 46). Os recursos espectroscópicos do DOX vinculado também dependem do modo de interação. Além disso, as moléculas de DOX têm dois estados de protonação distintos dentro de uma faixa de pH fisiologicamente relevante (pH ∼4–9) e são propensas a se autoassociar em altas concentrações (47). Portanto, as propriedades espectroscópicas de DOX também estão sujeitas a alterações em diferentes composições de mídia. Esses efeitos precisam ser cuidadosamente diferenciados das mudanças induzidas pela ligação ao DNA para evitar interpretações enganosas sobre a capacidade de carga de DOX, a eficiência de liberação e o efeito terapêutico (20).

Neste trabalho, estudamos sistematicamente a ligação de DOX a cinco DONs dois (2D) e tridimensionais (3D) estruturalmente distintos (uma estrutura exemplar mostrada na Figura 1). Por meio de espectroscopia de absorção e fluorescência, otimizamos o processo de carregamento e descobrimos as contribuições da força iônica, pH e concentração de DOX. Os resultados obtidos revelam que a capacidade de ligação de DOX de DONs tem sido frequentemente superestimada, em alguns casos relatados anteriormente em mais de duas ordens de magnitude.

Esquema do carregamento de doxorrubicina (DOX) em uma nanoestrutura de origami de DNA (DON) e liberação subsequente após degradação enzimática. Aqui, nós 1) estudamos como o DOX é carregado nos DONs (em segundos), otimizamos as condições para o carregamento monitorando os recursos espectroscópicos do DOX e caracterizamos os complexos DOX – DON formados. Através da detecção simultânea em tempo real das alterações de absorbância e fluorescência dos DONs carregados com DOX, nós 2) monitoramos a degradação dos DONs em fragmentos de DNA de fita simples por nucleases (DNase I, verde) (em minutos a horas sob uma DNase I concentração de 34 U ml −1) e 3) caracterizam os perfis de liberação de DOX subsequentes de DONs diferentes e mostram que os perfis de liberação de DOX dependem da superestrutura do origami de DNA e do conteúdo de DOX aplicado.

Esquema do carregamento de doxorrubicina (DOX) em uma nanoestrutura de origami de DNA (DON) e liberação subsequente após degradação enzimática. Aqui, nós 1) estudamos como o DOX é carregado nos DONs (em segundos), otimizamos as condições para o carregamento monitorando os recursos espectroscópicos do DOX e caracterizamos os complexos DOX – DON formados. Através da detecção simultânea em tempo real das alterações de absorbância e fluorescência dos DONs carregados com DOX, nós então 2) monitoramos a degradação dos DONs em fragmentos de DNA de fita simples por nucleases (DNase I, verde) (em minutos a horas sob uma DNase I concentração de 34 U ml −1) e 3) caracterizam os perfis de liberação de DOX subsequentes de DONs diferentes e mostram que os perfis de liberação de DOX dependem da superestrutura do origami de DNA e do conteúdo de DOX aplicado.

Finalmente, imitamos uma via de liberação de DOX plausível e fisiologicamente relevante submetendo os DONs carregados com DOX à digestão com desoxirribonuclease I (DNase I) (ver Figura 1) (48–50). O monitoramento em tempo real das mudanças espectroscópicas durante a digestão mostra que as taxas de degradação do DNA e os perfis de liberação de DOX dependem da superestrutura do origami do DNA e da quantidade de DOX carregada. Acreditamos que, por meio da identificação dessas características fundamentais e de algumas características previamente desconhecidas do processo de carregamento, as propriedades espectroscópicas de DOX, bem como os fatores de estabilidade dependentes da superestrutura de DONs em condições fisiológicas (51-54), pode se tornar possível racionalmente projetar a capacidade de entrega, controlar a dose e, assim, atingir a eficácia terapêutica ideal na entrega de DOX.


Como funciona o DNA

O DNA carrega todas as informações de suas características físicas, que são essencialmente determinadas por proteínas. Portanto, o DNA contém as instruções para fazer uma proteína. No DNA, cada proteína é codificada por um gene (uma sequência específica de nucleotídeos de DNA que especificam como uma única proteína deve ser feita). Especificamente, a ordem dos nucleotídeos em um gene especifica a ordem e os tipos de aminoácidos que devem ser colocados juntos para formar uma proteína.

Uma proteína é feita de uma longa cadeia de produtos químicos chamados aminoácidos As proteínas têm muitas funções:

  • Enzimas que realizam reações químicas (como enzimas digestivas)
  • Proteínas estruturais que são materiais de construção (como colágeno e queratina das unhas)
  • Proteínas de transporte que transportam substâncias (como a hemoglobina transportadora de oxigênio no sangue)
  • Proteínas de contração que causam a compressão dos músculos (como actina e miosina)
  • Proteínas de armazenamento que retêm substâncias (como a albumina na clara do ovo e a ferritina que armazena ferro no baço)
  • Hormônios - mensageiros químicos entre as células (incluindo insulina, estrogênio, testosterona, cortisol, etc.)
  • Proteínas protetoras - anticorpos do sistema imunológico, proteínas de coagulação no sangue
  • Toxinas - substâncias tóxicas, (como veneno de abelha e veneno de cobra)

A sequência particular de aminoácidos na cadeia é o que torna uma proteína diferente da outra. Esta sequência é codificada no DNA, onde um gene codifica para uma proteína.

Como o DNA codifica as informações de uma proteína? Existem apenas quatro bases de DNA, mas existem 20 aminoácidos que podem ser usados ​​para proteínas. Assim, grupos de três nucleotídeos formam uma palavra (códon) que especifica qual dos 20 aminoácidos vai para a proteína (um códon de 3 bases produz 64 padrões possíveis (4 * 4 * 4), o que é mais do que suficiente para especificar 20 aminoácidos. Porque há 64 códons possíveis e apenas 20 aminoácidos, há alguma repetição no código genético. Além disso, a ordem dos códons no gene especifica a ordem dos aminoácidos na proteína. Pode exigir de 100 a 1.000 códons (300 a 2.000 nucleotídeos) para especificar um determinada proteína. Cada gene também tem códons para designar o início (códon de início) e fim (parar códon) do gene.


Resumo & # 8211 DNA vs RNA

DNA e RNA são dois tipos de ácidos nucléicos. Eles são macromoléculas compostas de nucleotídeos. O DNA funciona como o material genético da maioria dos organismos vivos. Por outro lado, o RNA envolve a síntese de proteínas. Além disso, o DNA é de fita dupla, enquanto o RNA é de fita simples. Além disso, o DNA é mais longo do que o RNA. Além disso, o DNA reside dentro do núcleo, enquanto o RNA reside principalmente no citoplasma. O DNA é passado de pais para filhos, enquanto o RNA não herda. Isso resume a diferença entre DNA e RNA.

Referência:

1. “O que é DNA? & # 8211 Genetics Home Reference & # 8211 NIH. ” Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, National Institutes of Health. Disponivel aqui
2. Nature News, Nature Publishing Group. Disponivel aqui

Cortesia de imagem:

1. & # 8221DNA simple2 & # 8243By Forluvoft & # 8211 Trabalho próprio, (domínio público) via Commons Wikimedia
2. & # 8221Difference DNA RNA-EN & # 8221By Roland1952, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia


Como funciona o DNA

Como o único anel de poder em & quotLord of the Rings, & quot de Tolkien ácido desoxirribonucleico (DNA) é a molécula mestre de cada célula. Ele contém informações vitais que são transmitidas a cada geração sucessiva. Ele coordena a formação de si mesmo e de outras moléculas (proteínas). Se for ligeiramente alterado, podem ocorrer consequências graves. Se for destruída além do reparo, a célula morre.

Mudanças no DNA das células em organismos multicelulares produzem variações nas características de uma espécie. Por longos períodos de tempo, a seleção natural age sobre essas variações para evoluir ou mudar as espécies.

A presença ou ausência de evidências de DNA na cena do crime pode significar a diferença entre um veredicto de culpado e uma absolvição. O DNA é tão importante que o governo dos Estados Unidos gastou enormes quantias de dinheiro para desvendar a sequência do DNA no genoma humano na esperança de compreender e encontrar curas para muitas doenças genéticas. Finalmente, a partir do DNA de uma célula, podemos clonar um animal, uma planta ou talvez até um ser humano.

Mas o que é DNA? Onde é encontrado? O que o torna tão especial? Como funciona? Neste artigo, examinaremos profundamente a estrutura do DNA e explicaremos como ele se forma e como determina todas as suas características. Primeiro, vamos ver como o DNA foi descoberto.

O DNA faz parte de uma classe de moléculas chamadas ácidos nucleicos. Os ácidos nucléicos foram originalmente descobertos em 1868 por Friedrich Meischer, um biólogo suíço, que isolou DNA de células de pus em bandagens. Embora Meischer suspeite que os ácidos nucléicos possam conter informações genéticas, ele não pode confirmar.

Em 1943, Oswald Avery e colegas da Universidade Rockefeller mostraram que o DNA retirado de uma bactéria, Pneumonia por estreptococo, pode fazer com que bactérias não infecciosas se tornem infecciosas. Esses resultados indicaram que o DNA era a molécula que contém a informação na célula. O papel da informação do DNA foi posteriormente apoiado em 1952, quando Alfred Hershey e Martha Chase demonstraram que, para criar novos vírus, um bacteriófago o vírus injetou DNA, não proteína, na célula hospedeira (consulte Como funcionam os vírus para obter mais informações).

Assim, os cientistas teorizaram sobre o papel informativo do DNA por muito tempo, mas ninguém sabia como essa informação era codificada e transmitida. Muitos cientistas adivinharam que a estrutura da molécula era importante para esse processo. Em 1953, James D. Watson e Francis Crick descobriram a estrutura do DNA na Universidade de Cambridge. A história foi descrita no livro de James Watson & quotThe Double Helix & quot e trazida para a tela no filme & quotThe Race for the Double Helix & quot. Basicamente, Watson e Crick usaram técnicas de modelagem molecular e dados de outros investigadores (incluindo Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Erwin Chargaff e Linus Pauling) para resolver a estrutura do DNA. Watson, Crick e Wilkins receberam o Prêmio Nobel de Medicina pela descoberta da estrutura do DNA (Franklin, que foi colaborador de Wilkins e forneceu uma peça-chave de dados que revelou a estrutura para Watson e Crick, morreu antes de o prêmio ser concedido).


Métodos

Preparação e armazenamento de reagentes e solventes

Os sucos gástricos foram presentes do Departamento de Gastroenterologia do Hospital Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Qingdao e do Hospital Municipal de Qingdao. Os sucos gástricos originais foram transferidos e armazenados a -20 ° C após deixarem o estômago.

A pepsina foi adquirida da Sigma-Aldrich (P6887) e foi dissolvida em água a uma concentração de 40 mg ml -1. Os tampões de digestão para pepsina foram preparados como soluções estoque de NaCl 800 mM e NaH 100 mM2PO4 em H2O e o pH foi ajustado aos valores requeridos pela adição de HCl 1 M ou NaOH 1 M.

DNA de esperma de salmão (& gt10 kb) foi adquirido na Sigma-Aldrich Co., Ltd (31149) e dissolvido em H2O a 300 μg ml −1. λ DNA (48,5 kb) foi adquirido da Thermo Fisher Scientific (Fermentas, SD0011) com 300 μg ml −1. O tampão de armazenamento para λ DNA fornecido juntamente com DNA foi Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) contendo EDTA 1 mM. O plasmídeo pET-28a (5,4 kb) foi adquirido da EMD Chemicals Inc. (Novagen, D00131614) com concentração de 500 μg ml −1 e foi diluído em 210 μg ml −1 antes do uso. O DNA M13mp18 (7,2 knt, ssDNA) foi adquirido na New England BioLabs (N4040S) com 250 μg ml −1. O tampão de estoque para o DNA de M13mpl8 fornecido junto com o DNA foi Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) contendo EDTA 1 mM e a concentração de estoque para o DNA de M13mpl8 foi de 90 μg ml-1. A escada de RNA (0,5–10 knt) com 500 μg ml −1 foi adquirida da TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. (D523A). Foi diluído em 42 μg ml −1 por H2O antes de usar. Suas sequências foram listadas na Fig. 3 e na Fig. 8b Suplementar. Eles foram diluídos em 42 μg ml −1 por H2O antes de usar. DNA de fita simples (ssDNA), como S82, S70, etc., foram fornecidos pela Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & amp Services. Eles foram dissolvidos em H2O a uma concentração de 10 μM e a concentração de reação final foi de 1 μM.

Estômago fresco de suíno foi obtido de um frigorífico local e imediatamente resfriado em gelo. A mucosa do estômago foi removida e mantida a –80 ° C até o uso. O vetor de plasmídeo pPICZα A foi adquirido na Invitrogen (San Diego, CA). o Pichia Pastoris A cepa X-33 foi adquirida em CICC (China Center of Industrial Culture Collection, Pequim, China). E. coli TOP10, Trizol, TIANscript RT Kit e TIANpure Mini Plasmid Kit foram adquiridos de TIANGEN Biotech Co., Ltd (Pequim, China). A polimerase e as enzimas de restrição foram obtidas na New England Biolabs (EUA). Os primers foram sintetizados pela Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & amp Services. Suas sequências são fornecidas na Aba Complementar. 1. DEAE Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-200 HR foram adquiridos de GE Healthcare life sciences (EUA). O marcador de proteína foi adquirido na Solarbio (Pequim, China).

FastAP TM termossensível alcalina fosfatase (FastAP) foi adquirida da Fermentas (EF0651) e foi dissolvida em uma solução de HEPES-NaOH 20 mM (pH 7,4), MgCl 1 mM2, ZnCl 0,1 mM2 e 0,1% (v / v) Triton X-100. O tampão de reação FastAP continha Tris-HCl 100 mM (pH 8,0, 37 ° C), MgCl 50 mM2, 1 M KCl, 0,2% (v / v) Triton X-100 e 1 mg ml -1 BSA. T4 polinucleotídeo cinase (T4 PNK) foi adquirido da Fermentas (EK0037) e foi dissolvido em uma solução de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 2 mM DTT e 20% de glicerol a uma concentração de 10 U μl −1. O tampão de reação incluiu 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 ° C), 180 mM MgCl2, DTT 50 mM e espermidina 1 mM.

A ligase de DNA T4 foi adquirida de Fermentas (EL0014) e foi armazenada em tampão estoque composto de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), DTT 1 mM, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM e glicerol 50% (v / v). O tampão de reação estava incluindo Tris-HCl 400 mM (pH 7,5), MgCl 100 mM2, DTT 100 mM e ATP 5 mM (pH 7,8, 25 o C).

Todas as soluções estoque foram armazenadas a −20 ° C e todas as soluções estoque de ácidos nucléicos (NAs) foram armazenadas a −80 ° C antes do uso.

Expressão, purificação e ativação de pepsina recombinante (rP) e pepsina mutante (mP)

De acordo com a sequência do cDNA do pepsinogênio suíno (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), dois iniciadores (PF e PR, sequências detalhadas são fornecidas na Tabela Suplementar. 1) foram projetados para amplificar o ORF (Abrir Quadro de leitura) do cDNA da pepsina. O ORF foi amplificado por PCR e clonado no EcoRI e NãoI sites do vetor pPICZα A. Então, o vetor foi transformado em competente E. coli Células TOP10 e sequenciadas por BGI (Beijing Genomics Institute, China). O plasmídeo recombinante pPICZα A foi chamado pPPGA. pPPGA foi linearizado com PmeI e eletroporado em competente Pichia Pastoris Células X-33 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os transformantes foram testados em placas YPDS (Extrato de Levedura Peptona Dextrose com Sorbitol) com 100 μg ml −1 de Zeocina. As cepas de alta expressão foram rastreadas por gradiente de zeocina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). O DNA genômico de cepas recombinantes foi extraído e a presença do gene do pepsinogênio foi confirmada por PCR utilizando os primers universais 5 ′ AOX1 e 3 ′ AOX1.

Para a expressão extracelular de pepsinogênio, um clone recombinante de Pichia Pastoris foi pré-cultivado em meio YPD e depois proliferado em meio de complexo de glicerol tamponado (BMGY) a 30 ° C em um agitador incubador a 220 r.p.m. Após 20 h, o meio foi substituído por BMMY (meio complexo de metanol tamponado) e incubado por mais 96 h. 0,5% de metanol foi adicionado a cada 24 h para manter as condições de indução. As culturas foram centrifugadas a 5.000 r.p.m durante 5 min a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido.

O pepsinogênio foi precipitado pela adição lenta de sulfato de amônio a 60% de saturação. Após a diálise contra 25 mM de tampão fosfato (tampão I de pH 7,0) durante a noite a 4 ° C, a proteína foi aplicada a uma coluna DEAE Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences, 5 × 10 cm, taxa de fluxo 5 ml min -1). A coluna foi eluída em gradiente com tampão I contendo 0 a 0,5 M de NaCl. A fração ativa em 0,5 M de NaCl foi dialisada contra 25 mM de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 0,15 M NaCl (tampão II), então foi aplicada a Sephacryl S-200 HR (1,6 x 60 cm) e eluída por tampão II em uma taxa de fluxo de 0,5 ml min -1. A fração ativa foi coletada, dessalinizada e liofilizada como pepsinogênio recombinante purificado (rPG). As coletas de frações durante a cromatografia em coluna foram monitoradas por um ensaio de atividade de pepsina 12. Todos os procedimentos foram realizados em baixas temperaturas (0–4 ° C).

Para ativar o rPG, o rPG foi diluído em 0,01 M de HCl (o pH era de aproximadamente 2,0) e incubado a 25 ° C durante 0,5 h. A mistura foi neutralizada pela adição de acetato de sódio 1 M (pH 5,3). O prosegmento e o sal foram removidos por ultrafiltração com membrana YM-10 (Millipore, EUA).

O pepsinogênio mutante abrigou duas alterações de aminoácidos nos locais 32 e 215 da pepsina e foi produzido por mutagênese dirigida ao local 11,24. O Asp no local 32 foi alterado para Ala usando os iniciadores 32F1, 32R1, 32F2 e 32R2 (ver detalhes da sequência na Tab. Suplementar. 1), enquanto Asp no local 215 foi alterado para Ala usando os iniciadores 215F1, 215R1, 215F2 e 215R2 (ver detalhes na guia suplementar. 1). Os procedimentos subsequentes de clonagem, purificação e ativação foram os mesmos que para o rPG nativo.

A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (1976) 25 usando albumina de soro bovino como padrão. Durante a purificação da enzima, os picos de eluição foram medidos pela absorvância a 280 nm.

O peso molecular das pepsinas recombinantes e mutantes foi analisado conforme descrito por Laemmli (1970) 26 usando um gel de empilhamento a 5% (p / v) e um gel de separação a 12% (p / v). As massas moleculares das proteínas foram estimadas por calibração dos géis com um marcador de proteína.

As purezas da pepsina recombinante e mutante foram analisadas por HPLC. As condições de HPLC foram descritas como segue: TSK gel G2000SWxl UV 280 nm taxa de fluxo, 0,5 ml min -1 fase móvel, 25 mM Na2HPO4-NaH2PO4 tampão (pH 6,0, contendo NaCl 25 mM).

Digestão de ácidos nucléicos pelo suco gástrico

Sucos gástricos de diferentes pHs foram ajustados pela adição de NaH 25 mM2PO4 solução tampão (pH 8,0) a 3,8. Em seguida, sucos gástricos originais ou com pH ajustado foram adicionados às soluções de NA na proporção de 3: 1 (v / v). A digestão dos ANs pelo suco gástrico foi realizada a 37 ° C por 3 h. Após a digestão, o pH foi ajustado para 7,0–8,0 em preparação para a eletroforese.

Digestão de ácidos nucléicos pela pepsina

Soluções de estoque de pepsina, NA, tampão de digestão e H2O foram misturados em uma proporção de 2: 3: 5: 10 (v / v / v / v). A mistura reagiu a 37 ° C por 0–24 h. Diferentes concentrações de pepsina foram diluídas em solução estoque de pepsina por H2O antes da reação. Diferentes concentrações de NaCl em soluções tampão foram preparadas em tampão de armazenamento com uma quantidade apropriada de NaCl. Após a reação, os NAs foram imediatamente extraídos usando o método fenol-clorofórmio 27. A fração superior da solução contendo NAs foi mantida para eletroforese. O ssDNA de 1 μM, como as sequências S82, S70 e 59 nt de comprimento, também foram digeridas como acima.

Digestão de ácidos nucleicos por pepsina recombinante (rP) e pepsina mutante (mP)

rP e mP foram dissolvidos em H2O na concentração de 0,25 mg ml −1. As soluções de armazenamento de rP NA e tampão de digestão foram misturadas na proporção de 12: 3: 5 (v / v / v). A mistura reagiu a 37 ° C durante 12 h. mP reagiu com NAs da mesma maneira que rP. Após a reação, os NAs foram extraídos e submetidos à eletroforese conforme descrito acima.

Inibição de pepsina por uma solução alcalina

Quatro microlitros de solução de armazenamento de pepsina (40 mg ml −1) foram ajustados para pH 8,0 usando NaOH 5 mM e mantidos em temperatura ambiente por 0,5 h para inativar a pepsina. Em seguida, 10 μl de tampão de armazenamento (pH 2,0), 6 μl de λ DNA e 20 μl de H2O foram adicionados. O pH final da mistura foi de 3,8, medido por um medidor de pH S20K (Mettler-Toledo, Shanghai, China). Para o grupo de controle, H2O foi adicionado em vez de NaOH. A mistura foi então feita reagir a 37 ° C durante 2 h e analisada por eletroforese como descrito acima.

Para inibir a pepsina, 30 μl de suco gástrico foram adicionados à solução de pepsina e o pH foi ajustado para 8,0 pela adição de NaOH 5 mM. Após 0,5 h, o suco gástrico inativado foi reajustado para pH 3,8 com tampão armazenado (pH 2,0), então 30 μl do suco gástrico (pH 3,8) foram misturados com 10 μl de solução de armazenamento de NA e reagiram a 37 ° C por 3 h. A extração e análise de NAs foi realizada conforme descrito acima.

Fosforilação e desfosforilação

S59CGTT (3 ′ FITC) foi digerido por 8 mg ml -1 pepsina em pH 3,8 NaH2PO4 tampão (25 mM NaH2PO4 e NaCl 200 mM) durante 12 h, em seguida extraída usando o método de fenol-clorofórmio. Cinco microlitros de produtos S59CGTT (3 ′ FITC) (2 μM), 1 μl de tampão 10 × T4 PNK, 1,25 μl de ATP (10 mM) e 0,75 μl de 10 U μl −1 T4 polinucleotídeo quinase (T4 PNK, Fermentas) foram misturados. Finalmente, 2 μl de H2O foi adicionado. As reações foram realizadas a 37 ° C durante 0,5 h, depois foram aquecidas a 75 ° C para inativar a enzima.

A reação de desfosforilação foi semelhante à reação de fosforilação, exceto S59CGTT (sem FITC marcado 3′end) como substrato. O T4 PNK foi substituído por FastAP (FastAP TM Thermosensitive Alkaline Phosphatase, Fermentas).

Ligadura

Após a fosforilação, 2 μl de fragmento Sp20 (10 μM), 2 μl de Syn-31 ssDNA (10 μM), 1 μl de tampão T4 DNA ligase e 2,5 μl de H2O foram adicionados a 10 μl de solução fosforilada. A mistura foi mantida a 90 ° C durante 5 min, depois arrefecida à temperatura ambiente. Em seguida, 2 μl de PEG 4000 e 0,5 μl de T4 DNA ligase foram adicionados a um volume final de 20 μl. A razão molar de Syn-31: Sp20: S59CGTT (3 ′ FITC) foi de 2: 2: 1. A ligação foi mantida à temperatura ambiente por 1 h, em seguida, aquecida a 65 ° C por 15 min para inativar a enzima T4 DNA ligase. Um gel de acrilamida desnaturante 20% foi usado para eletroforese.

For the dephosphorylated products, Sp20 and Syn-31 were replaced by Sp14 and Syn-16 and other ligation conditions were the same as for phosphorylation.

Inhibition of pepsin by pepstatin A

To inhibit pepsin, 1 μl of pepstatin A (10 mg ml −1 ) was added to 10 μl of pepsin (0.4 mg ml −1 ) and incubated at 37 °C for 0.5 h. Pepsin, pepstatin A, NAs, digestion buffer and H2O were mixed together at a ratio of 10:1:6:10:13 (v/v/v/v/v), then reacted at 37 °C for 5 h. After digestion, NAs were extracted and analysed as described above. The pepsin-negative group contained DMSO instead of pepstatin A solution. To inhibit pepsin in gastric juice, original gastric juice was diluted 1,000 times by 100 mM NaH2PO4 (pH 3.0, containing 800 mM NaCl), then 10 μl of pepstatin A (10 mg ml −1 ) was added to 10 μl of gastric juice and incubated at 37 °C for 0.5 h. Diluted gastric juice, pepstatin A, NAs and H2O (1:1:1:1, v/v/v/v) were mixed and reacted for 1 h. Electrophoresis conditions were the same as for active pepsin.

Hydrolysis of nucleic acids by Cathepsin D or trypsin

Digestion of λ DNA by Cathepsin D or trypsin was similar to the protocol used for pepsin. λ DNA at a concentration of 45 μg ml −1 was treated by 9 mg ml −1 Cathepsin D in a 25 mM NaH2PO4 buffer solution (pH 3.5) at 37 °C for 24 h.

For trypsin, 45 μg ml −1 of λ DNA was treated by 1 mg ml −1 of trypsin in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.5) or 25 mM NaH2PO4 buffer solution (pH 3.5) at 37 °C for 5 h.

Kinetic measurements

Medir Km e kgato values, a synthetic substrate of 82 nt labelled by FITC at its 5′ end was employed. Final concentration of S82 was 1 μM. Pepsin in concentration range of 2.85 μM–115 μM were incubated at 37 °C (pH 3.0) for various times to determine the initial rates. After degradation, samples were extracted by phenol and chloroform as described above and 10 μl supernatant was electrophoresed on a 20% denaturing polyacrylamide gel. The images were captured by Image Lab 3.0 and a relative amount of DNA in different bands was analyzed using software of Molecular imager Gel Doc XR+ imaging system. Then, we used Lineweaver-Burk to calculate the Km and derived the kgato valor. The results are reported as the mean of three independent experiments for each concentration of S82.

Agarose gel electrophoresis

Extracted NAs were electrophoresed as described previously 28 . Concentrations of NAs were measured by NanoDrop ND 2000 (Thermo Fisher Scientific). NA solution (8.0 μl) was electrophoresed on a 0.8% agarose gel by DYCP-31DN (Liuyi, Beijing, China) under 100 v using DYY-6C (Liuyi, Beijing, China) as power supply. Gel was stained by 0.005‰ EB (Ethidium bromide) for 20 min and then imaged by GEL DOC XR + (Bio-Rad, CA, US). Data were analyzed by Image Lab Software Version3.0 (Bio-Rad, CA, US).

Polyacrylamide gel electrophoresis

Extracted NAs were electrophoresed on native or denaturing polyacrylamide gel as described previously 29 . NA was performed on a 20% polyacrylamide gel by DYCZ-24F (Liuyi, Beijing, China) under 350 v. Other conditions were the same as agarose gel electrophoresis as described above.


Protein and Nucleic Acid Relationship

As molecules, proteins and nucleic acids are not similar in structure. They look nothing alike, either as large molecules or in terms of their building blocks. While they're both made up of mostly carbon, hydrogen, nitrogen, and oxygen, the elements are assembled in vastly different ways. The major relationship between the two has to do with protein production -- DNA contains the information that a cell uses, with the help of RNA, to make protein.


Ascorbic Acid

Ascorbic acid, more commonly known as vitamin C, is well-known for fighting off colds by keeping your immune system strong, but the vitamin and antioxidant does much more than that. It also helps form proteins that your body uses to make blood vessels, tendons, ligaments and skin. In addition to that, ascorbic acid plays a major role in wound healing and scar tissue formation and helps keep your cartilage, bones and teeth healthy. Your body also needs ascorbic acid to properly absorb iron.

Since your body can’t make ascorbic acid on its own, you need to get it through your diet. The richest sources of vitamin C are citrus fruits (oranges, lemons and grapefruit), kiwi fruit, mango, cantaloupe, pineapple, strawberries, raspberries, blueberries, broccoli, Brussels sprouts, cauliflower, bell peppers, spinach, cabbage, potatoes (both white and sweet), tomatoes and winter squash. You can also meet your needs through supplementation, but whole, fresh foods are always best.