Em formação

42.4B: Hipersensibilidades - Biologia


Hipersensibilidades são reações imunes mal adaptadas contra antígenos inofensivos (alergias) ou contra antígenos próprios (autoimunidade).

objetivos de aprendizado

  • Distinguir entre as perturbações do sistema imunológico causadas por alergias e autoimunidade

Pontos chave

  • Embora o sistema imunológico normalmente seja rigidamente controlado para desconsiderar antígenos "próprios" e inofensivos, uma condição conhecida como hipersensibilidade pode anular esse controle, causando doenças e lesões a um indivíduo.
  • As alergias ocorrem quando o sistema imunológico reconhece antígenos inofensivos, como pólen ou poeira; eles são caracterizados por olhos vermelhos e inchados, espirros e coceira, e também podem incluir sintomas mais graves, como choque anafilático.
  • A autoimunidade ocorre quando o sistema imunológico reconhece os "próprios" antígenos e começa a atacá-los; os anticorpos que se reconhecem são denominados autoanticorpos.

Termos chave

  • autoanticorpo: um anticorpo formado em resposta a um agente (autoantígeno) produzido pelo próprio organismo
  • histamina: uma amina que causa dilatação dos capilares, contração do músculo liso e estimulação da secreção de ácido gástrico; é liberado durante reações alérgicas

Hipersensibilidades

As respostas imunológicas desadaptativas a substâncias estranhas inofensivas ou antígenos próprios que ocorrem após a sensibilização do tecido são denominadas hipersensibilidades. Isso pode ser potencialmente muito perigoso para um indivíduo, pois a resposta imunológica pode ser muito poderosa; pode destruir o tecido do hospedeiro se não for controlado. Os tipos de hipersensibilidade incluem hipersensibilidade imediata, retardada e autoimune. Uma grande proporção da população é afetada por um ou mais tipos de hipersensibilidade.

Alergias

A reação imune que resulta de hipersensibilidades imediatas, na qual uma resposta imune mediada por anticorpos ocorre minutos após a exposição a um antígeno inofensivo, é chamada de alergia. Nos Estados Unidos, 20% da população apresenta sintomas de alergia ou asma, enquanto 55% apresentam teste positivo contra um ou mais alérgenos. Após a exposição inicial a um alérgeno potencial, um indivíduo alérgico sintetiza anticorpos da classe IgE; esta classe de anticorpos também medeia a resposta imune a vermes parasitas. O domínio constante das moléculas de IgE interage com os mastócitos embutidos nos tecidos conjuntivos. Esse processo prepara, ou sensibiliza, o tecido. Após a exposição subsequente ao mesmo alérgeno, as moléculas de IgE nos mastócitos ligam-se ao antígeno por meio de seus domínios variáveis, estimulando os mastócitos a liberar os aminoácidos modificados histamina e serotonina. Esses mediadores químicos então recrutam eosinófilos que medeiam as respostas alérgicas. Os efeitos de uma reação alérgica variam de sintomas leves, como espirros e coceira, olhos lacrimejantes, a reações mais graves ou mesmo fatais envolvendo vergões que coçam intensamente, conhecidos como urticária, contração das vias aéreas com dificuldade respiratória grave e queda da pressão arterial. Essa reação extrema é conhecida como choque anafilático. Se não for tratada com epinefrina para combater os efeitos da pressão arterial e da respiração, essa condição pode ser fatal.

A hipersensibilidade retardada é uma resposta imune mediada por células que leva aproximadamente um a dois dias após a exposição secundária para que uma reação máxima seja observada. Este tipo de hipersensibilidade envolve o TH1 resposta inflamatória mediada por citocinas. Pode se manifestar como lesões locais nos tecidos ou dermatite de contato (erupção cutânea ou irritação da pele). A hipersensibilidade retardada ocorre em alguns indivíduos em resposta ao contato com certos tipos de joias ou cosméticos. Também facilita a resposta imunológica à hera venenosa e é a razão pela qual o teste cutâneo para tuberculose resulta em uma pequena região de inflamação em indivíduos que foram previamente expostos a Mycobacterium tuberculosis. A cortisona é normalmente usada para tratar essas respostas, pois inibe a produção de citocinas.

Autoimunidade

Autoimunidade é um tipo de hipersensibilidade a antígenos próprios que afeta aproximadamente 5% da população. A maioria dos tipos de autoimunidade envolve a resposta imune humoral. Os anticorpos que marcam inadequadamente os componentes próprios como estranhos são denominados autoanticorpos. Em pacientes com doença autoimune miastenia gravis, os receptores das células musculares que induzem a contração em resposta à acetilcolina são direcionados por anticorpos. O resultado é fraqueza muscular que pode incluir dificuldade acentuada com funções motoras finas e / ou grossas. No lúpus eritematoso sistêmico, uma resposta difusa de autoanticorpos ao próprio DNA e proteínas do indivíduo resulta em várias doenças sistêmicas. O lúpus eritematoso sistêmico pode afetar o coração, articulações, pulmões, pele, rins, sistema nervoso central ou outros tecidos, causando danos aos tecidos por meio da ligação de anticorpos, recrutamento do complemento, lise e inflamação.

A autoimunidade pode se desenvolver com o tempo; suas causas podem estar enraizadas no mimetismo molecular. Anticorpos e TCRs podem se ligar a antígenos próprios que são estruturalmente semelhantes aos antígenos de patógenos, que os receptores imunológicos primeiro aumentaram. Por exemplo, infecção com Streptococcus pyogenes (bactéria que causa infecção na garganta) pode gerar anticorpos ou células T que reagem com o músculo cardíaco, que tem uma estrutura semelhante à superfície do S. pyogenes. Esses anticorpos podem danificar o músculo cardíaco com ataques auto-imunes, levando à febre reumática. O diabetes mellitus dependente de insulina (Tipo 1) surge de uma T inflamatória destrutivaH1 resposta contra células produtoras de insulina do pâncreas. Pacientes com essa autoimunidade devem receber insulina de outras fontes.


42.4B: Hipersensibilidades - Biologia

A imunodeficiência ocorre quando o sistema imunológico não consegue responder adequadamente às infecções.

Objetivos de aprendizado

Explique os problemas associados à imunodeficiência

Principais vantagens

Pontos chave

  • Se um patógeno pode proliferar até certos níveis, o sistema imunológico pode se tornar sobrecarregado. A imunodeficiência ocorre quando o sistema imunológico não consegue responder suficientemente a um patógeno.
  • A imunodeficiência pode ser causada por muitos fatores, incluindo certos patógenos, desnutrição, exposição a produtos químicos, exposição à radiação ou até mesmo estresse extremo.
  • O HIV é um vírus que causa imunodeficiência ao infectar células T auxiliares, fazendo com que as células T citotóxicas as destruam.

Termos chave

  • fagócito: uma célula do sistema imunológico, como um neutrófilo, macrófago ou célula dendrítica, que engolfa e destrói vírus, bactérias e resíduos
  • lise: a desintegração ou destruição de células
  • imunodeficiência: um esgotamento no sistema imunológico natural do corpo, ou em algum componente dele

Imunodeficiência

Falhas, insuficiências ou atrasos em qualquer nível da resposta imune podem permitir que patógenos ou células tumorais ganhem uma posição para se replicar ou proliferar a níveis altos o suficiente para que o sistema imunológico fique sobrecarregado, levando à imunodeficiência que pode ser adquirida ou herdada. A imunodeficiência pode ser adquirida como resultado da infecção por certos patógenos (como o HIV), exposição química (incluindo certos tratamentos médicos), desnutrição ou, possivelmente, por estresse extremo. Por exemplo, a exposição à radiação pode destruir populações de linfócitos, elevando a suscetibilidade do indivíduo a infecções e câncer. Dezenas de distúrbios genéticos resultam em imunodeficiências, incluindo Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), síndrome dos linfócitos nus e deficiências de MHC II. Raramente, podem ocorrer imunodeficiências primárias que estão presentes desde o nascimento. A neutropenia é uma forma na qual o sistema imunológico produz um número abaixo da média de neutrófilos, sendo os fagócitos mais abundantes do corpo. Como resultado, as infecções bacterianas podem passar sem restrições no sangue, causando complicações graves.

HIV / AIDS

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana / síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV / AIDS) é uma doença do sistema imunológico humano causada pela infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Durante a infecção inicial, uma pessoa pode apresentar um breve período de doença semelhante à influenza. Isso geralmente é seguido por um período prolongado sem sintomas. À medida que a doença progride, ela interfere cada vez mais no sistema imunológico. A pessoa tem uma alta probabilidade de se infectar, incluindo infecções oportunistas e tumores que geralmente não afetam pessoas com sistema imunológico ativo.

Imagem de HIV: micrografia eletrônica de varredura de brotamento de HIV-1 (em verde, cor adicionada) de linfócitos cultivados: Múltiplas saliências redondas na superfície celular representam locais de montagem e florescimento do HIV. Durante a infecção primária, o nível de HIV pode atingir vários milhões de partículas de vírus por mililitro de sangue.

Depois que o vírus entra no corpo, ocorre um período de rápida replicação viral, levando a uma abundância de vírus no sangue periférico. Durante a infecção primária, o nível de HIV pode atingir vários milhões de partículas de vírus por mililitro de sangue. Essa resposta é acompanhada por uma queda acentuada no número de células T CD4 + circulantes, células que são ou se tornarão células T auxiliares. A viremia aguda, ou disseminação do vírus, está quase invariavelmente associada à ativação das células T CD8 + (que matam as células infectadas pelo HIV) e, subsequentemente, à produção de anticorpos. Acredita-se que a resposta das células T CD8 + seja importante no controle dos níveis de vírus, que atingem o pico e depois diminuem, à medida que as contagens de células T CD4 + se recuperam.

Em última análise, o HIV causa AIDS ao esgotar as células T CD4 + (células T auxiliares). Isso enfraquece o sistema imunológico, permitindo infecções oportunistas. As células T são essenciais para a resposta imunológica sem elas, o corpo não pode lutar contra infecções ou matar células cancerosas. O mecanismo de depleção das células T CD4 + difere nas fases aguda e crônica. Durante a fase aguda, a lise celular induzida pelo HIV e a morte de células infectadas por células T citotóxicas são responsáveis ​​pela depleção de células T CD4 +, embora a apoptose (morte celular programada) também possa ser um fator. Durante a fase crônica, as consequências da ativação imunológica generalizada, juntamente com a perda gradual da capacidade do sistema imunológico de gerar novas células T, parecem ser responsáveis ​​pelo lento declínio no número de células T CD4 +.


Imunodeficiência

Falhas, insuficiências ou atrasos em qualquer nível da resposta imune podem permitir que patógenos ou células tumorais ganhem uma posição e se replicem ou proliferem em níveis altos o suficiente para que o sistema imunológico fique sobrecarregado. Imunodeficiência é a falha, insuficiência ou atraso na resposta do sistema imunológico, que pode ser adquirida ou herdada. A imunodeficiência pode ser adquirida como resultado da infecção por certos patógenos (como o HIV), exposição a produtos químicos (incluindo certos tratamentos médicos), desnutrição ou, possivelmente, por estresse extremo. Por exemplo, a exposição à radiação pode destruir populações de linfócitos e aumentar a suscetibilidade de um indivíduo a infecções e câncer. Dezenas de doenças genéticas resultam em imunodeficiências, incluindo Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), síndrome dos linfócitos nus e deficiências de MHC II. Raramente, podem ocorrer imunodeficiências primárias que estão presentes desde o nascimento. A neutropenia é uma forma na qual o sistema imunológico produz um número abaixo da média de neutrófilos, os fagócitos mais abundantes do corpo. Como resultado, as infecções bacterianas podem passar sem restrições no sangue, causando complicações graves.


Heterogeneidade celular durante a progressão do adenocarcinoma ductal do pâncreas de camundongo na resolução de uma única célula

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3 Departamento de Patologia Molecular Translacional, MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas, Houston, Texas, EUA.

4 Departamento de Biologia Molecular e

5 Departamento de Patologia, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, EUA.

6 Departamento de Patologia, MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas, Houston, Texas, EUA.

7 Departamento de Farmacologia e

8 Divisão de Oncologia Cirúrgica, Departamento de Cirurgia, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, EUA.

Endereço para correspondência: Rolf A. Brekken, Hamon Center for Therapeutic Oncology, Research, University of Texas Southwestern Medical Center, 6000 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas 75390-8593, EUA. Telefone: 214.648.5151 Email: [email protected]

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O adenocarcinoma ductal pancreático (PCA) é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer, com opções terapêuticas limitadas disponíveis. Isso destaca a necessidade de uma melhor compreensão da biologia da progressão do PDA, um processo altamente complexo e dinâmico, com alterações nas células cancerosas e nas células do estroma. Uma caracterização abrangente da célula cancerosa PDA e da heterogeneidade das células do estroma durante a progressão da doença está faltando. Neste estudo, objetivamos traçar o perfil das populações de células e entender suas mudanças fenotípicas durante a progressão do PDA. Para esse fim, usamos a tecnologia de sequenciamento de RNA de célula única para perfilar agnosticamente a heterogeneidade celular durante os diferentes estágios da progressão de PDA em modelos de camundongos geneticamente modificados. Nossos dados indicam que uma transição epitelial-mesenquimal das células cancerosas acompanha a progressão do tumor, além de populações distintas de macrófagos com características inflamatórias crescentes. Também observamos a existência de 3 subtipos moleculares distintos de fibroblastos no pâncreas de camundongo normal, que em última análise deu origem a 2 populações distintas de fibroblastos em PDA avançado, apoiando relatórios recentes sobre heterogeneidade de fibroblastos intratumorais. Nossos dados também sugerem que as células cancerosas e fibroblastos podem ser regulados dinamicamente por mecanismos epigenéticos. Este estudo descreve sistematicamente o panorama da heterogeneidade celular durante a progressão da PCA e tem o potencial de atuar como recurso no desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra populações celulares específicas da doença.

O adenocarcinoma ductal pancreático (PCA) carrega a maior taxa de mortalidade de todas as principais doenças malignas nos países industrializados, com uma sobrevida em 5 anos de 8,5%. Os pacientes se deparam com opções de tratamento limitadas que atingem taxas de resposta duráveis ​​pobres, destacando a necessidade de uma melhor compreensão da biologia da doença de PCA (1). A progressão do PDA é um processo complexo e dinâmico que requer interação entre as células cancerosas e as células do estroma (2). É caracterizada pela formação de um microambiente único, consistindo em populações heterogêneas de células estromais que incluem fibroblastos, macrófagos, linfócitos e células endoteliais. Esses compartimentos estromais são essenciais para impulsionar a biologia do PDA (3).

As mudanças fenotípicas dinâmicas em diferentes populações de células durante a progressão de PDA não são totalmente compreendidas. O perfil de expressão gênica de tecidos em massa fornece uma imagem limitada da complexidade celular das populações de células heterogêneas em PDA. Em contraste, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq) tem o potencial de permitir o perfil de expressão gênica no nível da célula individual (4) e fornece uma ferramenta poderosa para entender a heterogeneidade celular do PDA. Nós aplicamos o scRNA-Seq para investigar as mudanças na expressão gênica de células cancerígenas e células do estroma durante a progressão de PDA em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Esta abordagem imparcial forneceu evidências de considerável heterogeneidade celular intratumoral, incluindo percepções moleculares em populações epiteliais e mesenquimais de células cancerosas e subtipos moleculares distintos de macrófagos e fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Esses dados fornecerão um recurso para estudos futuros visando caracterizar e direcionar ainda mais as populações de células específicas em PDA.

Heterogeneidade celular durante a progressão do PDA. Procuramos determinar a composição de células individuais durante a progressão de PDA GEMMs. Pâncreas de camundongo normal com 40 dias de idade Kras LSL − G12D / + Ink4a fl / fl Ptf1a Cre / + (KIC) (5) pâncreas de camundongo, denominado “precoce KIC”(Com a lesão inicial inicialmente confirmada por ultrassom Suplementar Figura 1 material suplementar disponível online com este artigo https://doi.org/10.1172/jci.insight.129212DS1) e 60 dias de idade KIC pâncreas, denominado “atrasado KIC”(Figura 1A) foram isolados de fresco e digeridos enzimaticamente, seguido pela geração de biblioteca de cDNA de célula única usando a plataforma 10 × Genomics (6). As bibliotecas foram subsequentemente sequenciadas a uma profundidade de mais de 10 5 leituras por célula. Realizamos filtragem rigorosa, normalização e agrupamento baseado em gráfico, que identificou populações de células distintas no pâncreas normal e em ambos os estágios de PDA.

Heterogeneidade celular durante a progressão do PDA. (UMA) Seções representativas de H & ampE do pâncreas normal, no início KIC lesão (que mostra neoplasia intraepitelial pancreática), e tardia KIC lesão (ampliação original, × 20). (B) gráfico de incorporação estocástica de vizinhança distribuída t (tSNE) do pâncreas normal exibindo 2354 células compreendendo 8 populações de células distintas (pâncreas agrupado de 2 camundongos). (C) trama tSNE do início KIC lesão exibindo 3524 células contendo 9 tipos de células com o surgimento da população de células cancerosas (lesões agrupadas de 2 camundongos). (D) trama tSNE do final KIC tumor mostrando células 804 e 7 populações distintas (tumores agrupados de 3 camundongos). Gráficos de violino empilhado de expressão de gene marcador representativo para cada uma das populações de células vistas no (E) pâncreas normal, (F) cedo KIC lesões, e (G) atrasado KIC lesão.

No pâncreas normal de camundongo, 2354 células foram sequenciadas e classificadas em tipos de células apropriados com base na expressão gênica de marcadores conhecidos: células acinares, ilhotas e células ductais (Figura 2 suplementar), macrófagos, células T e células B, bem como Foram observadas 3 populações distintas de fibroblastos (Figura 1, B e E). No início KIC lesão (3524 células sequenciadas), observou-se o surgimento de uma população ductal expandida (9,9% das células), expressando marcadores ductais conhecidos, como Krt18 e Sox9 (7), e exibindo alterações neoplásicas precoces (Figura 1, A, C e F e Figura Suplementar 3). A população de células acinares foi substancialmente reduzida, enquanto houve um aumento marcante no total de macrófagos e fibroblastos. Digno de nota, as mesmas 3 populações de fibroblastos vistas no pâncreas normal foram identificadas no início KIC lesão. Além disso, células endoteliais foram observadas nesta fase. Isso indica que a expansão de fibroblastos e macrófagos é um evento inicial durante o desenvolvimento de PDA. Em seguida caracterizamos o KIC pâncreas (804 células sequenciadas) e observou a ausência de células normais exócrinas (acinares) e endócrinas (ilhotas) (Figura 1, D e G). Em vez disso, 2 populações distintas de células cancerosas estavam presentes, sugerindo heterogeneidade fenotípica das células cancerígenas como um evento tardio no curso da doença. Observamos também a presença de apenas 2 populações distintas de fibroblastos, que apresentaram percentual semelhante em relação ao total de células. Visivelmente, os macrófagos se tornaram uma população de células predominante no final KIC tumor. Além disso, observamos linfócitos nesta fase. A heterogeneidade celular em células cancerosas e células estromais no início e no final KIC as lesões destacaram as mudanças celulares dinâmicas que ocorrem durante a progressão do PDA.

As células cancerosas enriquecidas com marcadores mesenquimais emergem em PDA avançado. Análise de expressão gênica de marcadores epiteliais (Cdh1, Epcam, Gjb1, e Cldn3) e marcadores mesenquimais (Cdh2, Cd44, Axl, Vim, e S100a4) revelou que o início KIC a população de células neoplásicas assumiu um perfil de expressão epitelial (Figura 2, A e C). Isso está em contraste com as populações de células tumorais no final KIC tumores, onde identificamos 2 populações de células cancerígenas distintas: 1 enriquecida por marcadores epiteliais e a outra população mais abundante enriquecida por marcadores mesenquimais (Figura 2, B e C). Esses dados de scRNA-Seq foram confirmados por custo de imuno-histoquímica da última KIC tumor, que mostrou células cancerosas Sox9 + Vim + invadindo o estroma, enquanto Sox9 + Vim - câncer apareceu em grupos de células mais ordenadas (Figura 4 suplementar). Estes dados suportam a noção de que a plasticidade epitelial das células tumorais pode contribuir para a heterogeneidade das células cancerosas durante a progressão de KIC tumores.

Análise de cedo e tarde KIC populações de células neoplásicas demonstram o surgimento da população de células cancerosas mesenquimais como um evento tardio. (UMA) parcelas tSNE do início KIC lesão demonstrou a expressão de marcadores epiteliais conhecidos na população de células neoplásicas iniciais (contorno preto). Os marcadores mesenquimais estavam ausentes nesta população. (B) gráficos tSNE demonstrando o surgimento de 2 populações de células cancerosas no final KIC tumor. Uma população de células cancerosas expressou os marcadores epiteliais (população menor delineada em preto) e uma segunda expressou os marcadores mesenquimais (população maior delineada em preto). (C) Gráficos de violino mostrando a alta expressão de marcadores epiteliais (Cdh1, Epcam, e Cldn3) no início da neoplasia KIC população de células e tarde KIC população de células cancerosas epiteliais, mas não na população mesenquimal. Marcadores mesenquimais (Cdh2, Vim, e S100a4) foram superexpressos na população de células cancerosas mesenquimais, mas não no início KIC neoplásico ou tardio KIC população de células cancerígenas epiteliais. (D) Mapa térmico de perfil de célula única de todos os primeiros e tardios KIC células neoplásicas exibindo genes expressos diferencialmente entre as 3 populações de células. Os nomes dos genes estão listados nas caixas na extrema direita do mapa de calor. Cada coluna representa uma célula individual e cada linha é o valor da expressão do gene para um único gene.

O agrupamento hierárquico dos principais genes significativos em cada uma das 3 populações putativas de células cancerígenas / neoplásicas (células neoplásicas iniciais no início KIC, populações de células cancerosas epiteliais e mesenquimais no final KIC) foi realizada (Figura 2D). Além disso, os agrupamentos de genes das populações de células cancerosas foram submetidos à análise da via e da Ontologia Genética (GO). Em primeiro lugar, comparamos as células neoplásicas dos primeiros KIC população com o total de células cancerosas da última KIC e descobri que os genes mais regulados no final KIC as células cancerosas foram associadas à função pancreática normal, como secreção, digestão e absorção pancreática e secreção de insulina (Figura Suplementar 5, A e B). Além disso, genes acinares pancreáticos normais, como Try4, Try5, Cela2a, Cela3b, Reg2, e Rnase1, foram expressos em níveis mais elevados no início da neoplasia KIC células (Figura 2D). Isso é sugestivo de metaplasia acinar-ductal (ADM) em andamento durante a progressão do tumor neste GEMM, que foi apoiado por análise histológica (Figura Suplementar 3). Em contraste, os genes mais regulados no final KIC células cancerosas foram associadas com ribossomo, glicólise / gliconeogênese e biossíntese de aminoácidos, o que é altamente sugestivo de aumento da tradução e células cancerosas metabolicamente ativas em KIC tumores. Curiosamente, as vias anteriormente relatadas como intimamente associadas ao estroma e à progressão do PCA também foram destacadas, como a interação ECM-receptor (8), TGF-β (9) e as vias de sinalização do hipopótamo (10). Em seguida, comparamos os primeiros neoplásicos KIC células com o tarde KIC população de células cancerígenas epiteliais para compreender os processos que promoveram a progressão de PDA no compartimento das células cancerígenas epiteliais. Curiosamente, funções celulares e vias de sinalização semelhantes foram identificadas comparando as 2 populações de células cancerígenas epiteliais (Figura Suplementar 5, C e D). Juntas, essas análises demonstram um estado ADM contínuo durante a progressão de KIC tumores.

As células cancerosas enriquecidas para marcadores mesenquimais existem em PDA GEMMs avançados com diferentes mutações de driver. Além de KRAS mutações, eventos de driver adicionais são necessários para a progressão do PDA (8), com TP53 e INK4A sendo o segundo e o terceiro genes mais comumente mutados no PDA humano, respectivamente. Como tal, procuramos compreender o efeito de diferentes mutações driver secundárias sobre os fenótipos e heterogeneidade das células cancerosas. Realizamos scRNA-Seq em outro PDA GEMM, Kras LSL-G12D / + Trp53 fl / fl Pdx1 Cre / + (KPfC) (Figura 3, A e B). Consistente com tarde KIC tumores, 2 populações de células cancerígenas distintas expressando Krt18 e Sox9 foram notados no final KPfC (60 dias de idade) tumores: 1 foi marcado por marcadores epiteliais, como Gjb1, Tjb1, Ocln, e Cldn3, enquanto o outro foi marcado por marcadores mesenquimais, como Vim, Cd44, Axl, S100a4, e Fbln2 (Figura 3C e Figura 6A suplementar). Populações de células cancerígenas epiteliais e mesenquimais em KPfC camundongos compartilhavam muitos genes em comum com as populações correspondentes em KIC no entanto, eles também expressaram assinaturas gênicas exclusivas (Figura 3D).

Comparação entre células cancerosas de KIC e KPfC tumores. (UMA) trama tSNE do final KPfC lesão exibindo 2893 células e 8 populações de células distintas (tumor analisado de 1 camundongo). (B) Gráficos de violino empilhado mostrando a expressão do gene marcador representativo para cada uma das populações de células vistas no final KPfC lesão. (C) Gráficos tSNE de gene único do KPfC tumor exibindo a presença de marcadores epiteliais (Ocln, Gjb1, e Tjp1) na população de células cancerosas epiteliais (população com contorno preto superior) e marcadores mesenquimais (Vim, Cd44, e Axl) na população de células cancerosas mesenquimais (população com contorno preto na parte inferior). (D) Mapa de calor de perfil de célula única comparando todas as células cancerosas no final KIC contra todas as células cancerosas no final KPfC. Cada coluna representa uma célula individual e cada linha é o valor da expressão do gene para um único gene.

Em seguida, comparamos as assinaturas gênicas totais das células cancerígenas entre os últimos KIC e tarde KPfC camundongos por métodos de análise de via KEGG e Biocarta, para identificar diferenças potenciais nas vias de sinalização de células cancerosas causadas pelas diferentes mutações condutoras secundárias. Como esperado, a via de sinalização de p53 foi regulada positivamente no KIC modelo em comparação com o KPfC modelo (Figura Suplementar 6B). As análises ultimamente KIC e tarde KPfC camundongos sugerem que a heterogeneidade das células cancerosas é um evento tumoral em estágio avançado que ocorre no contexto de múltiplas mutações condutoras secundárias. No entanto, sob o mesmo oncogênico Kras mutação, diferentes mutações de driver secundário podem potencialmente levar a diferentes vias de sinalização que impulsionam a progressão do PDA.

Heterogeneidade de macrófagos durante a progressão de PDA. Encontramos um aumento acentuado no tamanho da população de macrófagos conforme o PDA progrediu do pâncreas normal para o início KIC e eventualmente atrasado KIC tumores (Figura 1, B – D). Nós ainda caracterizamos o compartimento de macrófagos durante a progressão de PDA por subagrupamento de macrófagos no início e no final KIC lesões, que revelaram 3 grupos de macrófagos distintos transcricionalmente no início KIC e 2 atrasados KIC (Figura 4, A e C).

análise de scRNA-Seq de KIC a progressão do tumor revela múltiplas subpopulações de macrófagos. (UMA) gráfico tSNE de 3 subpopulações de macrófagos no início KIC lesão. (B) Mapa de calor representando os 30 principais genes significativamente superexpressos em cada um dos 3 primeiros KIC subpopulações de macrófagos. Os macrófagos do pâncreas normal são exibidos (grupo da extrema esquerda). Cada coluna representa uma célula individual e cada linha é o valor da expressão do gene para um único gene. (C) representação do gráfico tSNE de 2 subpopulações de macrófagos no final KIC. (D) Mapa de calor representando os 30 principais genes significativamente superexpressos em cada um dos 2 últimos KIC subpopulações de macrófagos. Cada coluna representa uma célula individual e cada linha é o valor da expressão do gene para um único gene.

População de macrófagos 1 no início KIC tumores foi caracterizado pela expressão de Fn1, Lyz1, Lyz2, Ear1, e Ear2 assim como Cd14 (Figura 4B). Além disso, esses macrófagos expressaram especificamente altos níveis dos ligantes do receptor de IL-1: Il1a, Il1b, e Il1rn. A análise de GO sugeriu que essa população de macrófagos estava envolvida na cura durante a inflamação, na regulação das hipersensibilidades dos tipos I e III e no processamento e apresentação do antígeno (Figura Suplementar 7A). Em contraste, observou-se que a população de macrófagos 2 expressa uma abundância de quimiocinas, incluindo Ccl2, Ccl4, Ccl7, Ccl8, e Ccl12, bem como muitos genes associados ao complemento (Figura 4B). Na verdade, a ativação de leucócitos, a ativação do complemento e os genes de resposta humoral foram as categorias GO mais significativamente enriquecidas nesta população de macrófagos (Figura Suplementar 7A). A terceira população de macrófagos expressa Ccl17 e Ccr7 e foi enriquecido em funções de biogênese, tradução e processamento de antígeno de pequenas unidades ribossômicas (Figura 4B e Figura Suplementar 7A). É importante ressaltar que os macrófagos no pâncreas de camundongo normal fracamente expressaram genes encontrados nas populações de macrófagos 2 e 3 desde o início KIC camundongos, sugerindo que os macrófagos normais do pâncreas podem ser macrófagos não comprometidos que residem no tecido do órgão normal que são induzidos a adotar um fenótipo distinto na iniciação do tumor.

O atrasado KIC tumor apresentava 2 subpopulações de macrófagos (Figura 4C). Genes altamente expressos da população de macrófagos 1, como S100a8 e Saa3, que foi demonstrado ser expresso em monócitos tratados com lipopolissacarídeo (11). Além disso, várias quimiocinas foram elevadas nesta população, como Ccl2, Ccl7, Ccl9, Ccl6, Cxcl3, e Pf4 (Figura 4D). A análise de GO revelou que essa população está provavelmente associada à ativação de Stat3, quimiotaxia de leucócitos e resposta a lipopolissacarídeo e estímulos inflamatórios (Figura 7B suplementar). Esses dados sugerem que a população de macrófagos 1 era de natureza inflamatória. População de macrófagos 2 ultimamente KIC os tumores eram ricos em moléculas de apresentação do antígeno MHC-II: Cd74, H2-Aa, H1-Ab1, H2-Dma, H2-Dmb1, H2-Dmb2, e H2-Eb1 (Figura 4D), e a análise de GO destacou a apresentação do antígeno e as vias de resposta imune adaptativa como sendo elevadas (Figura Suplementar 7B). Consistentemente, no final KPfC tumores, também observamos 2 populações distintas de macrófagos com características semelhantes (Figura 8 suplementar). Curiosamente, não observamos uma população de macrófagos em tumores tardios que se correlacionou com a população de macrófagos 1 dos tumores iniciais, sugerindo que esta população pode sofrer seleção negativa ou diferenciação em macrófagos inflamatórios ou ricos em MHC-II durante a progressão do tumor.

Também comparamos as características dos aglomerados totais de macrófagos entre o início e o final KIC tumores e observou uma assinatura inflamatória de macrófagos substancialmente aumentada conforme o tumor progrediu (Figura Suplementar 7, C e D). Uma grande variedade de genes inflamatórios aumentou, incluindo Il1a, Il1b, Il1r2, e Il6. A análise de GO desta lista de genes destacou as funções de quimiotaxia de leucócitos e resposta inflamatória como aumentadas em nível avançado KIC tumores. Esses dados sugerem que a progressão do PDA é caracterizada por um aumento nas características inflamatórias nos macrófagos.

Heterogeneidade de fibroblastos durante a progressão de PDA. No pâncreas normal e no início KIC lesão, identificamos 3 populações distintas de fibroblastos, enquanto no KIC apenas 2 populações de fibroblastos foram observadas (Figura 1, B – D). Para verificar a relação entre essas populações de fibroblastos e a dinâmica de suas mudanças fenotípicas durante a progressão de PDA, projetamos fibroblastos das 3 análises em um único gráfico tSNE e aplicamos um algoritmo de agrupamento baseado em gráfico (Figura 5A), que revelou 3 subtipos moleculares distintos de fibroblastos entre o pâncreas normal, no início KICe atrasado KIC. A sobreposição demonstra que o pâncreas normal e inicial KIC continha todos os 3 subtipos de fibroblasto, enquanto tardia KIC continha apenas 2, confirmando nossa análise inicial (Figura 1, B – D). Especificamente, esta análise demonstrou que a população de fibroblastos 1 (FB1) e a população de fibroblastos 3 (FB3) encontrados em normal e precoce KIC pâncreas estavam presentes no final KIC tumor, enquanto a população de fibroblastos 2 (FB2) estava ausente no KIC tardio.

A análise de fibroblastos durante a progressão de PDA revela vários subtipos moleculares. (UMA) Todos os fibroblastos do pâncreas normal e precoce e tardio KIC as lesões foram projetadas em um único gráfico tSNE com as populações FB1, FB2 e FB3 diferenciadas por rosa, laranja e marrom, respectivamente (canto superior esquerdo). Fibroblastos de pâncreas normais foram destacados em vermelho (canto superior direito), no início KIC fibroblastos em verde (canto inferior esquerdo) e tardio KIC fibroblastos em azul (canto inferior direito). Pâncreas normal e precoce KIC continha fibroblastos em todos os 3 grupos, enquanto o último KIC continha apenas FB1 e FB3. (B) Mapa de calor exibindo os principais genes significativos (corte: P & lt 10 –40) para cada uma das 3 populações de fibroblastos. São exibidas trinta células aleatórias de cada população de fibroblastos. Todos os 3 GEMMs de câncer tardio (tardio KIC, KPfC, e KPC) exibem apenas as populações FB1 e FB3. (C) Gráficos de violino demonstrando genes marcadores representativos para cada subtipo de fibroblasto: citocinas superexpressas de FB1 e Pdgfra. Marcadores mesoteliais superexpressos de FB3, marcadores de miofibroblastos, moléculas MHC-II e Cdh11.

No pâncreas normal, FB1, FB2 e FB3 representaram 35,4%, 56,9% e 7,7% do total de fibroblastos, respectivamente (Figura Suplementar 9). No início KIC, embora os fibroblastos totais tenham se expandido (Figura 1C), as razões de cada população de fibroblastos permaneceram semelhantes. Além disso, no final KIC tumor, FB1 e FB3 estavam presentes em proporções quase iguais de 46,5% e 53,5%, respectivamente (Figura 9 suplementar). Cada população de fibroblastos foi caracterizada por genes marcadores distintos. Por exemplo, FB1 expressado de forma marcante Cxcl14, Ptn, e vários genes que medeiam a sinalização do fator de crescimento semelhante à insulina, como Igf1, Igfbp7, e Igfbp4 (Figura 5B). FB2 expressado especificamente Nov, um membro da família CCN de proteínas matricelulares secretadas (12), bem como Pi16, que se mostrou expresso em populações de fibroblastos em vários tipos de tecido (13), além de Ly6a e Ly6c1. FB3 mostrou expressão distinta de marcadores mesoteliais, como Lrrn4, Gpm6a, Nkain4, Lgals7, e Msln (14), além de outros genes que já se mostraram expressos em fibroblastos, como Cav1, Cdh11, e Gas6 ( 15 – 17 ).

Também realizamos scRNA-Seq do Kras LSL-G12D / + Trp53 LSL-R172H / + Ptf1a Cre / + (KPC) modelo de camundongo (18), que também exibiu 2 subtipos de CAFs (Figura suplementar 10), assim como o KPfC GEMM (Figura 3A). O agrupamento hierárquico dos genes mais significativos para cada subtipo de fibroblasto mostrou a persistência de FB1 e FB3 durante a progressão de PDA (Figura 5B) e que eles existem em diferentes GEMMs de PDA em estágio avançado (KIC, KPC, e KPfC), sugerindo uma célula de origem consistente. Curiosamente, o mapa de calor de expressão gênica também indicou que a população FB2 começou a se mover em direção a um perfil de expressão semelhante ao FB1 no início KIC lesão, sugerindo que FB1 e FB2 podem convergir em uma única população de CAF com características predominantes de FB1 por doença invasiva tardia. De importância, Il6, Ccl2, Ccl7, Cxcl12, e Pdgfra foram expressos em FB1 e FB2 no pâncreas normal e precoce KIC lesão e mostrou maior expressão em FB1 recentemente KIC (Figura 5C). Em contraste, os marcadores de miofibroblastos Acta2 e Tagln foram expressos por uma porção de FB3. Esses dados suportam a presença dos subtipos de CAF previamente descritos, mutuamente exclusivos, inflamatórios (FB1) e miofibroblásticos (FB3) (19 - 21). Curiosamente, o FB3 também expressou vários genes associados ao MHC-II (Figura 5C). A análise de GO sugeriu que FB1 estava envolvido em uma resposta de fase aguda e resposta inflamatória, FB2 estava mais associado a funções fisiológicas de fibroblastos e FB3 tinha processamento e apresentação de antígenos através da via MHC-II e tinha funções de ativação de complemento (Figura Suplementar 11A). Além disso, analisamos genes que aumentaram em FB1 e FB3 durante a progressão de PDA e descobrimos que FB1 mostrou um aumento progressivo na expressão de genes associados à resposta inflamatória e quimiotaxia, enquanto os genes FB3 exibiram função aumentada na tradução durante a progressão da doença, possivelmente devido ao antígeno aprimorado -processamento atividade (Suplementar Figura 11, B e C). Esses dados sugerem que FB1 é uma população inflamatória e a característica inflamatória aumenta durante a progressão do PDA, enquanto FB3 consiste na população de miofibroblastos bem estudada e exibe um enriquecimento para genes MHC-II.

Também descobrimos que alguns genes essencialmente exclusivos para FB3 no normal e no início KIC o pâncreas tornou-se expresso nas populações FB1 e FB3 no final KIC, marcando esses genes como potenciais marcadores globais de fibroblastos em PDA avançado. Um desses genes era Cdh11 (Figura 5C). Apoiamos esses dados por imunohistoquímica. Nós encontramos no final KIC e KPC tumores, a coloração do estroma para α-actina de músculo liso (α-SMA) e PDGFR-α foram quase mutuamente exclusivos, enquanto CDH11 mostrou coloração uniforme em todos os fibroblastos morfologicamente discerníveis (Figura Suplementar 11D). Tomados em conjunto, esses dados fornecem a primeira descrição in vivo de nosso conhecimento de todas as populações CAF durante a progressão de PDA.

Células cancerosas mesenquimais e CAFs mostram evidências de aumento da regulação epigenética e atividade transcricional em PDA avançado. Identificadores moleculares únicos (UMIs) servem para colocar um código de barras em cada molécula de mRNA de entrada durante a geração da biblioteca de cDNA, permitindo a determinação do número de transcrição inicial, mesmo após a amplificação da biblioteca de cDNA (22). Comparamos as contagens de UMI em todos os tipos de células entre o início e o final KIC lesões (Figura 6, A e B). Nas lesões iniciais, houve um aumento acentuado na UMI nas células das ilhotas beta (mediana: 2849, intervalo: 1322-12,857), o que pode indicar que o aumento da atividade transcricional é um meio pelo qual as necessidades endócrinas dessas células são atendidas. Nenhuma outra população de células no início KIC exibido este nível de IHMs. O neoplásico precoce KIC as células exibiram uma contagem UMI relativamente baixa (mediana: 1979, intervalo: 1163-7735). Em contraste, a população de células cancerosas mesenquimais no final KIC tumor exibiu um aumento acentuado na contagem total de UMI com uma contagem média de 18.334 e intervalo de 4433–50.061 (Figura 6C). As células cancerosas epiteliais no final KIC também exibiu um UMI aumentado, embora em um grau muito menor do que a população de células cancerosas mesenquimais (mediana: 10.368, intervalo: 4.940–30.440).

A análise da atividade transcricional em diferentes estágios de PDA revela atividade epigenética e transcricional diferencial em diferentes compartimentos de tecido. Gráfico tSNE do número de identificadores moleculares únicos (nUMIs) no (UMA) cedo e (B) atrasado KIC. (C) Parcelas de violino de genes reguladores epigenéticos nas populações de células epiteliais do pâncreas normal, precocemente KICe atrasado KIC. (D) Gráficos de violino de genes reguladores epigenéticos nas populações normais, de fibroblastos iniciais e de fibroblastos tardios, mostrando sua regulação positiva em CAFs. (E) Coloração imuno-histoquímica tripla sequencial no mesmo final KIC seção de tumor para células cancerosas (SOX9, mostrado em rosa), células mesenquimais (vimentina, mostrado em marrom) e atividade intensificadora aumentada (BRD4, mostrado em azul). Epitélio ductal bem diferenciado corado apenas para SOX9 (contorno verde). Células cancerosas mesenquimais (setas azuis) e CAFs (setas marrons). Ampliação original × 10. Ampliação de inserção × 30. (F) Análise imunohistoquímica de seções de tecido total de PDA humano usando o anticorpo H3K27ac. Estas figuras representativas de 2 PDAs humanos demonstram a coloração 3 + / 3 + nos fibroblastos do estroma (setas vermelhas) com coloração 1 + -2 + no epitélio do câncer (ampliação original, 20 ×).

Raciocinamos que o aumento da atividade transcricional pode ser, pelo menos em parte, regulado pelo aumento da atividade dos genes associados à epigenética, bem como pelo aumento da atividade do intensificador (23). BRD4 pertence à família do bromodomínio dos reguladores da transcrição e é um regulador chave da atividade do super intensificador (24). Além disso, estudos anteriores mostraram que a atividade de MYC é promovida pela atividade de super intensificador em PDA (25). Nós descobrimos isso no final KIC e KPfTumores C, Brd4 foi altamente expresso em células cancerígenas epiteliais e mesenquimais, enquanto Meu c foi expresso principalmente na população de células cancerosas mesenquimais (Figura 6C e Figura 12 suplementar). Além disso, vários genes que codificam proteínas do grupo A de alta mobilidade (Hmga1, Hmga1-rs, e Hmga2) foram marcadamente expressos no final KIC e KPfC células cancerosas mesenquimais. As proteínas HMGA são proteínas associadas à cromatina que regulam a atividade transcricional, incluindo a formação de realces (26). Por último, os componentes críticos do complexo SWI / SNF (Smarcb1, Arid1a, Arid2), que são essenciais na remodelação do nucleossomo e na regulação da transcrição (27), também foram altamente expressos em células cancerosas epiteliais e mesenquimais da última KIC mas não as células neoplásicas iniciais no início KIC lesão. Juntos, esses dados fornecem várias linhas de evidência para sugerir que a carga de transcrição de uma população de células cancerosas mesenquimais mais agressivas é aumentada em relação às células cancerosas em lesões iniciais ou células cancerosas epiteliais em PDA avançado. Também observamos que os fibroblastos no final KIC os tumores mostraram UMIs aumentados (mediana: 14.538, intervalo: 4461-37.497). Eles também exibiram uma expressão aumentada de genes reguladores da transcrição epigenética em contraste com fibroblastos de pâncreas de camundongo normal ou precoce KIC pâncreas (Figura 6D).

Apoiamos esses dados de expressão de scRNA usando análise imunohistoquímica de 3 cores KIC tumores: SOX9 foi usado como um marcador de células cancerígenas, vimentina como um marcador mesenquimal e BRD4 como um marcador substituto para o aumento da atividade do potenciador. Identificamos o costaining positivo para vimentina e BRD4 em CAFs, coloração tripla positiva (Vimentin + / SOX9 + / BRD4 +) em células cancerosas mesenquimais e coloração única de SOX9 em células cancerosas epiteliais que se localizaram em estruturas semelhantes a dutos mais diferenciadas no tumores avançados (Figura 6E). Em seguida, realizamos análise imuno-histoquímica em 16 seções de câncer pancreático humano de tumor inteiro usando um anticorpo contra H3K27ac, um marcador comumente aceito de aumento da atividade do elemento regulador do gene (23, 28). O epitélio maligno e os fibroblastos do estroma foram avaliados separadamente. Estas análises mostraram coloração 3 + / 3 + marcadamente positiva nos fibroblastos do estroma de todas as seções de tumor total (Figura 6F). Em 6 de 16 epitélios de câncer a pontuação foi 1+, e 10 de 16 pontuaram 2+, sem amostras mostrando uma pontuação epitelial de câncer de 3+. Esses dados justificam um estudo mais aprofundado dos mecanismos reguladores epigenéticos em fibroblastos, à medida que os fibroblastos normais do pâncreas progridem para CAFs em PDA.

Realizamos scRNA-Seq de diferentes estágios do KIC GEMM, além de atrasado KPfC e KPC tumores, para traçar o perfil agnóstico das mudanças fenotípicas do câncer e das células do estroma durante a progressão do PDA. Estabelecemos o surgimento de uma população de células cancerosas mesenquimais como um evento tumoral em estágio avançado e identificamos características potencialmente novas de diferentes populações de macrófagos e fibroblastos. Embora a heterogeneidade intertumoral possa existir entre camundongos com o mesmo genótipo GEMM (29, 30), análises recentes KIC e tarde KPfC revelou as mesmas 2 populações de células cancerosas (epiteliais e mesenquimais), macrófagos (inflamatórios e ricos em MHC-II) e fibroblastos (FB1 e FB3), ilustrando heterogeneidade celular intratumoral consistente entre PDA GEMMs com mutações condutoras secundárias distintas. Essas populações foram consistentes entre os agrupados (tarde KIC) e não em pool (atrasado KPfC) experimentos. No entanto, 3 animais foram testados para o KIC GEMM tardio e 1 para cada um dos últimos KPfC e KPC GEMMs, que podem ter causado a perda de variantes da população intertumoral. Estudos futuros devem ter como objetivo comparar vários camundongos do mesmo genótipo para refinar a definição de heterogeneidade intertumoral nesses GEMMs. As células endoteliais, em particular, justificam uma investigação mais aprofundada em PDA GEMMs. Descobrimos que o início KIC lesão apresentava uma população de células endoteliais expandida que se dissipou no final KIC lesão, limitando assim a utilidade do conjunto de dados atual sobre heterogeneidade endotelial em PDA. É provável que técnicas de enriquecimento celular pré-scRNA-Seq sejam necessárias para identificar uma assinatura endotelial em GEMMs de PDA em estágio avançado. Essas descobertas são um recurso importante e melhoram nossa compreensão da progressão do PDA, ao mesmo tempo que estabelecem as bases para estudos mecanísticos que visam dissecar a função de populações de células específicas na progressão do PDA.

A patogênese do PDA envolve metaplasia de células acinares normais em epitélio ductal, que por sua vez sofre transformação neoplásica em um KRAS- Maneira dirigida (31). O epitélio ductal maligno pode então assumir características mesenquimais mais agressivas à medida que a doença progride. Neste estudo, as populações de células cancerosas mesenquimais foram observadas em tumores em estágio avançado. Além disso, embora os dados de scRNA-Seq humanos sejam limitados em PDA, as análises de um tumor PDA humano previamente sequenciado (32) também sugerem a possibilidade de populações de células cancerosas semelhantes a epiteliais e mesenquimais (Figura Suplementar 13), embora para torná-las firmes conclusões requer uma coorte bastante expandida. Nossos dados apóiam um modelo no qual as características mesenquimais das células cancerosas são adquiridas posteriormente no processo da doença, embora outros tenham argumentado que este pode ser um dos primeiros eventos no PCA (33). Populações de células cancerosas mesenquimais foram estudadas extensivamente em modelos de camundongos com câncer pancreático e demonstraram ser críticas para a resistência quimioterápica, enquanto sua contribuição para a metástase tem sido mais controversa (34, 35).As células cancerosas mesenquimais demonstraram anteriormente um aumento do anabolismo protéico e ativação das vias de sobrevivência induzida pelo estresse do retículo endoplasmático em um PDA GEMM (36).

Na verdade, no final KIC modelo, as vias ribossomais foram as vias reguladas positivamente mais significativamente em células cancerosas (Figura Suplementar 5, A e C). É provável que a demanda por aumento da atividade ribossômica decorra da alta atividade transcricional governada por mecanismos epigenéticos nas células cancerosas mesenquimais, porque também vimos contagens de UMI marcadamente aumentadas nesta população (Figura 6B). A família de proteínas bromodomínio e extraterminal (BET), como BRD4, que é marcadamente regulada positivamente em células cancerosas e fibroblastos de PDA em estágio avançado (Figura 6, C e D), servem para recrutar complexos regulatórios para histonas acetiladas em locais estimuladores, resultando em aumento da transcrição (37). Anteriormente, uma abordagem de combinação usando um inibidor de proteína BET e um inibidor de histona desacetilase levou à regressão quase completa do tumor e melhorou a sobrevivência animal em um PDA GEMM (25). A ativação do super potenciador demonstrou recentemente ser fundamental na fisiopatologia de uma variedade de neoplasias (38) e está intimamente associada a Hmg2a no PDA porque a atenuação do super potenciador demonstrou regular negativamente Hmg2a expressão e o crescimento de células PDA em um modelo tridimensional in vitro (39). Foi demonstrado que a atividade do intensificador é crítica para a metástase de PDA (40) e pode até estar envolvida na troca de classe entre os subtipos moleculares clássicos e basais em amostras de PDA humanas (41). No entanto, esforços futuros para direcionar o aumento da atividade transcricional em PDA devem considerar os compartimentos de tecido distintos que regem a sensibilidade e resistência a novas terapêuticas.

Nossos dados revelaram 2 subtipos moleculares de macrófagos em PDA avançado (Figura 4). Um expressava vários genes associados a quimiocinas e inflamação, enquanto o outro era rico em genes associados ao MHC-II. Em um estudo anterior, macrófagos MHC-II + foram isolados de tumores de mama ortotópicos e CCL altamente expresso17, consistente com nossos dados (42). Em paralelo com nosso estudo, macrófagos MHC-II lo foram encontrados para ser altamente enriquecido para numerosas quimiocinas. Além disso, em um modelo de camundongo com hepatoma ortotópico, uma população de macrófagos MHC-II + precoce pareceu suprimir o crescimento do tumor, mas uma população de macrófagos MHC-II lo tornou-se a população de macrófagos predominante conforme o tumor progredia, resultando em um fenótipo de protumor (43). No entanto, para confirmar sua significância fisiopatológica, estudos funcionais são necessários nos quais a ablação seletiva induzível (44) é realizada em 2 subpopulações de macrófagos PDA em estágio avançado usando marcadores específicos que identificamos neste estudo. Zhu e colegas (45) demonstraram que os monócitos derivados da medula óssea constituem aproximadamente 80% dos macrófagos MHC-II + em um PDA GEMM, enquanto os macrófagos MHC-II - no pâncreas normal e PDA foram mantidos independentemente das contribuições dos monócitos. Macrófagos residentes em tecido MHC-II independente de monócitos expandiram durante a progressão do tumor e contribuíram para o crescimento e sobrevivência de PDA. Por outro lado, Sanford e colegas (46) mostraram que os monócitos podem dar origem a uma população de macrófagos pró-inflamatórios em um modelo de camundongo PDA, que, quando antagonizado com anticorpos neutralizantes contra CCR2, resultou na diminuição do crescimento do tumor e redução das metástases in vivo (46). Esses dados destacam a necessidade de um estudo de scRNA-Seq em populações de macrófagos em PDA GEMMs com substituição de medula óssea marcada para reconciliar essas discrepâncias.

Mais importante ainda, nos estudos de macrófagos associados a tumores, as quimiocinas inflamatórias são comumente usadas para indicar um tipo M1 de macrófago, que normalmente está associado a funções imunoestimulatórias. No entanto, nosso estudo indica que um fenótipo de macrófago M1 / ​​M2 distinto não é prontamente discernível no nível de uma única célula. Em vez disso, conforme o PDA progride, uma característica inflamatória é substancialmente aumentada, e isso acompanha um aumento de um importante marcador de macrófago M2, ARG1 (Figura Suplementar 7, A – D). Isso levanta questões sobre o sistema de classificação M1 / ​​M2, pois a característica inflamatória está associada à progressão do PCA. Estudos futuros devem enfocar a função desses macrófagos inflamatórios no PCA, além de validar marcadores para classificação de macrófagos.

Embora numerosos estudos tenham geralmente mostrado que os CAFs são promotores de tumor na biologia do PDA e outros carcinomas (47, 48), estudos recentes descobriram que as funções dos CAFs na biologia do PDA são mais variadas. Özdemir e colegas (44) demonstraram que a depleção de células α-SMA + do microambiente em um PDA GEMM resultou em sobrevida encurtada e tumores pouco diferenciados (44), e baixo conteúdo de tumor de miofibroblastos mostrou estar associado a pior sobrevida em humanos Seções de PDA. Esses dados levaram a uma mudança de paradigma por meio da qual certos CAFs podem funcionar para restringir, ao invés de promover, PDA. Além disso, até recentemente, a heterogeneidade molecular de CAFs em PDA não foi bem avaliada. A tentativa primária de caracterizar a heterogeneidade de fibroblastos em PDA demonstrou que as células estreladas pancreáticas de camundongo (PSCs) poderiam ser induzidas a expressar α-SMA in vitro quando co-cultivadas diretamente com células PDA primárias de camundongo em um sistema de cocultura organoide (19). Esses CAFs miofibroblásticos foram designados como "myCAFs". Isso era diferente dos fibroblastos IL-6 + que foram produzidos in vitro quando os PSCs foram indiretamente co-cultivados com organóides de PDA de camundongo através de uma membrana semipermeável. Os fibroblastos IL-6 + também foram positivos para PDGFR-α e várias outras citocinas e, portanto, denominados CAFs inflamatórios ou “iCAFs”. A imunohistoquímica de tecido PDA humano e de camundongo mostrou estroma IL-6 + distal como uma população distinta do estroma α-SMA + peritumoral (32). Estudos subsequentes em PDA GEMMs demonstraram que a população iCAF pode mediar propriedades protumorigênicas e é um potencial alvo terapêutico para sensibilizar PDA para estratégias imunoterapêuticas (20, 21).

Nosso estudo é o primeiro que temos conhecimento a demonstrar a existência de 3 subtipos moleculares distintos de fibroblastos no pâncreas de camundongo normal, que por sua vez deu origem a 2 subtipos distintos de CAFs que foram amplamente conservados em 3 GEMMs de PDA. Notamos que FB1 expressa genes de sinalização de fator de crescimento semelhante à insulina (Igfbp7, Igfbp4, e Igf1) além de Pdgfra, Cxcl12, Il6, e várias outras citocinas (Ccl11, Ccl7, Ccl2, e Csf1) Propomos que nossa população FB1 seja a população iCAF descrita anteriormente e, portanto, provavelmente protumorigênica. Por outro lado, a população FB3 foi positiva para os marcadores de miofibroblastos Acta2 e Tagln e, portanto, representa mais de perto a população myCAF descrita anteriormente. É importante ressaltar que nossa abordagem agnóstica não identificou nenhuma outra população CAF putativa e, portanto, apoiamos o modelo 2-CAF proposto por Öhlund e colegas (19).

Em resumo, este relatório descreve sistematicamente a paisagem celular durante a progressão do PDA e destaca a heterogeneidade celular na patogênese do PDA. Como tal, futuras estratégias terapêuticas direcionadas devem ser desenvolvidas tendo em mente a subpopulação-alvo pretendida.

Estudos em animais. KIC (Kras LSL − G12D / + Ink4a fl / fl Ptf1a Cre / + ), KPC (Kras LSL-G12D / + Trp53 LSL-R172H / + Ptf1a Cre / + ), e KPfC (Kras LSL-G12D / + Trp53 fl / fl Pdx1 Cre / + ) os camundongos foram gerados conforme descrito anteriormente (18, 49, 50). Os camundongos foram sacrificados quando estavam moribundos: 60 dias de idade para o KIC (n = 3, KIC atrasado) e KPfC (n = 1) ou 6 meses de idade para o KPC (n = 1). Cedo KIC camundongos foram sacrificados com 40 dias de idade (n = 2), e camundongos de pâncreas normais (n = 2) foram sacrificados com 60 dias de idade. O pâncreas normal foi obtido a partir de ninhadas Cre-negativas da KIC camundongos. Em experimentos com mais de 1 camundongo, os tecidos foram agrupados antes da digestão enzimática. o KPfC camundongo tinha um fundo genético C57BL / 6 puro, e todos os outros tinham um fundo misto (C57BL / 6 com FVB). A ultrassonografia foi realizada sob anestesia geral com isoflurano. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia. Os tecidos foram fixados em formalina a 10% para imuno-histoquímica ou digeridos enzimaticamente para análise de uma única célula.

Digestão de tecidos. Um tampão de digestão 10 × foi preparado em PBS: colagenase tipo I (450 unidades / mL, Worthington Biochemical), colagenase tipo II (150 unidades / mL, Worthington Biochemical), colagenase tipo III (450 unidades / mL, Worthington Biochemical), colagenase tipo IV (450 unidades / mL, Gibco, Thermo Fisher Scientific), elastase (0,8 unidades / mL, Worthington Biochemical), hialuronidase (300 unidades / mL, MilliporeSigma) e DNAse tipo I (250 unidades / mL, MilliporeSigma). Os tumores e o pâncreas foram digeridos enzimaticamente em uma suspensão de uma única célula. Resumidamente, o tecido recentemente dissecado foi colocado em um prato de cultura de tecidos de 10 cm, e uma lâmina de barbear estéril foi usada para cortar o tecido em pedaços finos. As amostras foram ressuspensas em PBS e lavadas duas vezes por centrifugação a 480 g por 3 minutos e adicionado a um tubo de 50 mL contendo tampão de digestão 1 × (Worthington Biochemical) contendo 1% de FBS. O tubo foi incubado num agitador a 37 ° C durante 60 minutos. Em seguida, 35 mL de PBS foram adicionados e as células foram lavadas 3 vezes antes de filtrar os resíduos usando um filtro de malha de 70 μm (MilliporeSigma). As células únicas foram ressuspensas em 100 μL de PBS em preparação para a criação da biblioteca de uma única célula. A viabilidade celular foi medida pelo azul de tripano. A viabilidade era de 80% para o pâncreas normal e tardio KIC amostras, 75% para o início KIC e KPfC, e 90% para o KPC.

Preparação e sequenciação de biblioteca de cDNA de célula única. A geração da biblioteca foi realizada usando o 10 × Chromium System (10 × Genomics Inc.). As suspensões de células únicas foram lavadas em 1 × PBS (livre de cálcio e magnésio) contendo 0,04% w / v albumina sérica bovina (400 μg / mL) e levada a uma concentração de 200–700 células / μL. O volume apropriado de células foi carregado com esferas de gel Single Cell 3 'em um Chip Single Cell A e executado no Chromium Controller (10x Genomics, Inc.). Pérola de gel em emulsão (GEM) foi incubada e então quebrada. Contas magnéticas Dynabeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific) foram usadas para limpar a mistura de reação GEM. Ler 1 sequência de primer (10X Genomics 'Chromium Single Cell 3ʹ Reagent Kits Guia do usuário https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep) foi adicionado durante a incubação, e cDNA de comprimento total com código de barras foi amplificado por PCR após a limpeza. O tamanho da amostra foi verificado em um Agilent Tapestation 4200 usando fita DNA HS 5000 e a concentração determinada por um fluorômetro Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific) usando o ensaio DNA HS. As amostras foram fragmentadas enzimaticamente e submetidas à seleção de tamanho antes de prosseguir para a construção da biblioteca. Durante a preparação da biblioteca, a sequência do primer Read 2, o índice da amostra e ambas as sequências do adaptador Illumina foram adicionadas. As amostras foram limpas usando esferas AMPure XP (Beckman Coulter) e, após a preparação da biblioteca, o controle de qualidade foi realizado usando fita DNA 1000 no Agilent Tapestation 4200. A concentração final foi determinada usando o ensaio Qubit 4 Fluorometer DNA HS. As amostras foram carregadas a 1,5 pM e executadas no Illumina NextSeq500 High Output Flowcell usando química V2.5. A configuração de execução foi de 26 pares de bases (bp) × 98 bp × 8.

Análises de bioinformática. Usamos o Cell Ranger versão 1.3.1 (10x Genomics) para processar dados de sequenciamento brutos. Resumidamente, os arquivos de chamada de base bruta (BCL) foram convertidos em arquivos FASTQ e alinhados ao transcriptoma de referência mm10 / GRCm38 do mouse. As contagens de transcrição em cada célula foram quantificadas usando UMIs com código de barras e sequências de código de barras de 10 × células. As matrizes de expressão gene por célula foram carregadas no pacote R Seurat versão 2.3.1 para análises posteriores (51). As células de baixa qualidade foram filtradas posteriormente com base no número de genes detectados, nUMIs e conteúdo do gene mitocondrial. Os dados foram escalonados pela regressão dos nUMIs e porcentagem do conteúdo do gene mitocondrial e foram submetidos à redução dimensional por análise de componente principal e visualização usando tSNE. Os clusters de células foram identificados por meio da função FindClusters usando uma resolução de 0,6 para todas as amostras, com base em um algoritmo de agrupamento baseado em gráfico implementado em Seurat. Um teste baseado na razão de verossimilhança ou um algoritmo de pontuação baseado em AUC (implementado em Seurat) foi usado para calcular genes marcadores para cada cluster, e os níveis de expressão de vários genes marcadores conhecidos foram examinados. Grupos diferentes que expressam genes marcadores conhecidos para um determinado tipo de célula foram selecionados e combinados como 1 para cada tipo de célula. As análises de GO e de via foram realizadas usando o banco de dados para o pacote de bioinformática de anotação, visualização e descoberta integrada, versão 6.8 (52).

Os dados de scRNA-Seq humano foram obtidos de um relatório publicado anteriormente (32). UMAPs foram gerados seguindo as práticas recomendadas de Seurat conforme descrito anteriormente (51). A análise e os gráficos foram feitos através do Seurat 3.0.

Análise histológica. Tecidos fixados em formalina foram incluídos em parafina e cortados em seções de 5 μm. As seções foram avaliadas por H & ampE e análise imunohistoquímica usando anticorpos contra vimentina (catálogo 5741, Cell Signaling Technology), BRD4 (catálogo AB128874, clone EPR5150, Abcam ref. 2), SOX9 (catálogo AB5535, MilliporeSigma), CDH11 (catálogo NBP2-15661, Novus Biologicals) e H3K27ac (catálogo AB4729, Abcam). Após uma recuperação inicial do antígeno com tampão Tris-EDTA-glicerol (10%) (Thermo Fisher Scientific) e inibição da atividade da peroxidase endógena, as lâminas foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram incubadas com peroxidase de rábano ou anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (ImmPRESS-AP anti-coelho IgG fosfatase alcalina [catálogo MP-5401] e ImmPRESS HRP anti-coelho IgG peroxidase [catálogo MP-7451] Vector Laboratories) por 1 hora a 25 ° C. Isso foi seguido pelo desenvolvimento usando o substrato cromogênico apropriado: DAB, Warp Red ou Ferangi Blue (Biocare Medical). No caso da imunohistoquímica multicanal, as lâminas foram posteriormente removidas com tampão de citrato de sódio e fervido a 110 ° C por 3 minutos. O procedimento foi então repetido como acima usando um cromógeno de cor diferente para o desenvolvimento. Todas as amostras humanas de PDA foram fornecidas pelo Southwestern Tissue Management Shared Resource da Universidade do Texas (UT) e seu uso foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da UT Southwestern para pesquisa. Todas as amostras de pacientes foram desidentificadas e interpretadas por um patologista credenciado.

Declaração de compartilhamento de dados. Não há dados adicionais não publicados deste estudo.

Disponibilidade de dados. Todos os dados de scRNA-Seq brutos e processados ​​descritos neste manuscrito foram enviados para o repositório de banco de dados Gene Expression Omnibus do National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) sob o número de acesso GSE125588.

Estatisticas. Para a análise da via KEGG, uma análise de variância foi realizada em diferentes vias e P & lt 0,05 foi considerado significativo. Na análise de dados de scRNA-Seq de PDA humanos publicados anteriormente (32), um Z O ponto de corte de 1 foi usado para denotar células nas quais o gene de interesse foi superexpresso.

Aprovação do estudo. Os camundongos foram usados ​​neste estudo de acordo com as diretrizes institucionais da UT Southwestern, e os protocolos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da UT Southwestern Medical Center. As diretrizes da American Veterinary Medical Association para a eutanásia de animais foram estritamente seguidas. Todas as amostras humanas foram adquiridas por meio do recurso compartilhado de gerenciamento de tecidos da UT Southwestern e aprovadas pelo conselho de revisão institucional da UT Southwestern.

ANH e HH foram responsáveis ​​pela concepção e delineamento do estudo, aquisição dos dados, análise e interpretação dos dados e redação do manuscrito. ZW realizou análises de bioinformática e interpretou dados. KP realizou interpretação patológica e pontuação de amostras de tecido humano. Dados adquiridos WD. JH realizou análises de bioinformática e revisão crítica do manuscrito. AM e EO realizaram análises de bioinformática, interpretação dos dados e revisão crítica do manuscrito. UV foi responsável pela concepção e desenho do estudo e revisão crítica do manuscrito. RAB foi responsável pela concepção e delineamento do estudo, interpretação dos dados e redação do manuscrito.

Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede R01 CA192381 e U54 CA210181 Projeto 2 para RAB a Effie Marie Cain Fellowship para RAB o H. Ray e Paula Calvert Pancreatic Cancer Research Fund para UV NIH concede U01 CA200468, U01 CA196403, R01 CA218004, R01 CA204969, e P01 CA117696 para AM e doações do NIH e Welch Foundation para EO. ZW foi apoiado por uma bolsa pré-doutorado da American Heart Association e do Harry S. Moss Heart Trust (19PRE34380436).

Agradecemos ao McDermott Center Next-Generation Sequencing Core da UT Southwestern por preparar e sequenciar as bibliotecas scRNA-Seq. Agradecemos a Jeon Lee, do UT Southwestern Bioinformatics Core, pela assistência no pré-processamento dos dados scRNA-Seq. O núcleo UT Southwestern Bioinformatics é financiado pelo Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (RP150596). Agradecemos também a Dave Primm do Departamento de Cirurgia da UT Southwestern pela ajuda na edição deste artigo.

Conflito de interesses: AM recebeu royalties da Cosmos Wisdom Biotechnology por um ensaio de biomarcador relacionado à detecção precoce de câncer de pâncreas.


DISCUSSÃO

Nenhum defeito bioquímico foi identificado até agora em cdc1 mutantes do ciclo de divisão celular e, portanto, era difícil distinguir causa e consequência entre as numerosas anormalidades biológicas celulares que surgem após um aumento de temperatura em cdc1 ts mutantes. O possível defeito bioquímico foi identificado pelo estudo inovador do grupo Taroh Kinoshita em PGAP5 (Fujita et al., 2009). Nossos dados indicam que é provável que o Cdc1 homólogo tenha uma função semelhante à de PGAP5 e remova EtN-P de Man1 da âncora GPI, enquanto a literatura sugere que Ted1 pode remover EtN-P de Man2, assim como PGAP5. Os ensaios bioquímicos diretos são necessários para testar essa hipótese.

Três explicações principais para o forte fenótipo da parede celular de cdc1 pode ser considerada. Qualquer cdc1 as células não transferem GPI-CWPs para os glucanos da parede celular, porque a persistência de EtN-P em Man1 torna a interação dessas proteínas com as enzimas que operam essa transferência menos eficiente. Na verdade, EtN-P está ligado ao átomo C2 de Man1 (Homans et al., 1988) na vizinhança do C1 envolvido na ligação glicosídica que tem que ser clivada a fim de transferir Man1 para β1,6-glucanos (Kollar et al., 1997 Fujii et al., 1999). Em segundo lugar, as duas presumíveis transferases Dfg5 e Dcw1, bem como Gas1, todas sendo proteínas GPI, não podem alcançar a superfície da célula por causa do bloqueio de secreção que afeta o transporte de superfície das proteínas GPI em cdc1 (Figura 7A). A partir dos estudos de marcação metabólica com [32 S] metionina, no entanto, sabemos que este bloqueio de secreção é apenas parcial e que a maior quantidade de proteína entra na parede celular de cdc1 mantida a 37 ° C como em WT (Figura S7). Além disso, as células foram cultivadas durante a noite a 24 ° C antes de serem marcadas a 37 ° C, e alguns Dcw1 e Dfg5 feitos a 24 ° C devem ainda estar presentes na membrana plasmática durante a marcação. Portanto, esta segunda hipótese parece menos provável. Terceiro, a persistência de EtN-P em Man1 leva ao direcionamento incorreto de GPI-CWPs para locais inadequados da parede celular ou membrana plasmática e, portanto, causa letalidade. Também neste cenário, a localização incorreta de GPI-CWPs em cdc1 e a superprodução subsequente de quitina e β-glucanos pode prender / imobilizar Dfg5p, Dcw1 e seus substratos, ou seja, os futuros GPI-CWPs, de forma que eles não possam interagir. No entanto, o aprisionamento muito severo de proteínas GPI visto no perfeitamente viável gas1∆ mutante argumentaria que pelo menos alguns tipos de armadilhas não são letais. Obviamente, é possível que o [3 H] inositol associado à parede celular seja elevado por diferentes razões em diferentes mutantes, por exemplo, para a hipótese 1 em cdc1 e para a hipótese 3 em gas1∆.

A discriminação entre as hipóteses 1 e 3 exigirá um ensaio bioquímico in vitro das atividades Dcw1 e Dfg5, para as quais os ensaios preliminares até agora não mostraram resultados positivos (Hiroshi Kitagaki, comunicação pessoal). Seja qual for a razão exata para o fenótipo da parede celular de cdc1, atualmente não está claro se a falha em remover EtN-P de Man1 diz respeito a todas as proteínas GPI, ou apenas GPI-CWPs, ou apenas um subgrupo delas. O maior aumento nas âncoras de GPI extraíveis por SDS com a porção lipídica pG1 (Figura 5D) pode ser uma indicação de que Cdc1 atua principalmente em âncoras de GPI do tipo pG1. Também pode ser considerado que Cdc1 prepara certas proteínas GPI para transferência para a parede celular, removendo o EtN-P de Man1. No entanto, Cdc1 provavelmente atua em mais de uma proteína GPI, porque nenhuma das 64 proteínas GPI previstas de Saccharomyces cerevisiae é essencial, mas não podemos excluir um efeito dominante através do qual uma única proteína GPI não processada e mal localizada pode matar cdc1 células.

Embora Cdc1 possa atuar em apenas uma fração de proteínas GPI, é claro que todas as âncoras GPI de células WT contêm inicialmente um EtN-P em Man1, porque a manosiltransferase 3 Gpi10 requer este elemento, como mencionado anteriormente, e a única maneira de produzir As âncoras GPI sem EtN-P em Man1 são por meio de Cdc1.

Curiosamente, o falta de EtN-P em Man2 foi invocado como uma causa potencial para o direcionamento incorreto de Egt2, uma presumida glucanase específica da célula filha que é uniformemente distribuída sobre a superfície do botão em gpi7∆ células e digere sua parede celular, ao passo que é direcionado para o septo primário nas células WT (Fujita et al., 2004). Assim, algumas proteínas GPI, como Egt2, podem não ser influenciadas por Ted1, mas o efeito inibitório do gpi7∆ exclusão na remodelação de GPI mediada por Cwh43 também pode ser responsável por este defeito de classificação específico (Benachour et al., 1999).

Nossa proposta que cdc1 as células param de crescer a 37 ° C por causa de um defeito grave da parede celular não exclui a possibilidade de que a interrupção do crescimento de cdc1 a 33 ° C é devido a outras razões, por exemplo, o influxo de Ca 2+, perda de filamentos de actina, polarização de actina, herança de Golgi (Losev et al., 2008), e / ou defeito de secreção parcial (Figuras 7, A e B e S3). No entanto, em meios contendo sorbitol, os defeitos de polarização e secreção da actina desaparecem, enquanto o crescimento não é retomado. Tão severo CDC1 a deficiência leva a um defeito de crescimento que não pode ser atribuído à despolarização da actina e aos fenótipos subsequentes e pode ser devido ao defeito da parede celular.

Dcw1dfg5∆ mutantes duplos resgatados por um alelo sensível à temperatura de qualquer um dos genes interrompidos após o aumento da temperatura, tendo pequenos botões, DNA duplicado, corpos polares de fuso não separados e citoesqueleto de actina despolarizado (Kitagaki et al., 2004), um fenótipo intimamente relacionado com cdc1 mutantes (Byers e Goetsch, 1974 Paidhungat e Garrett, 1998b Losev et al., 2008). Além disso, dfg5Δ /dcw1-3ts e dcw1Δ /dfg5-29ts as células podem crescer a 37 ° C em sorbitol 1 M, e a coloração CFW indicou deposição atípica de quitina nas pontas de pequenos botões (Kitagaki et al., 2004). Essa semelhança argumenta que cdc1 mutantes podem ser deficientes no mesmo processo que ocorre em dfg5/dcw1 mutantes, ou um que esteja intimamente relacionado.

Somente dfg5∆, não dcw1∆, mostra uma interação genética negativa com cdc1, e as quantidades de proteínas GPI marcadas com [3H] inositol em frações da parede celular fenocópias das interações genéticas (Figura 8B). Uma possível razão é que apenas DFG5 é induzido sob estresse da parede celular (Yoshimoto et al., 2002 Hagen et al., 2004), enquanto uma indução semelhante de DCW1 não foi relatado. Alternativamente, pode ser que as proteínas GPI possuindo um EtN-P em Man1 sejam processadas apenas por Dfg5, não Dcw1. Além disso, a transcrição máxima de DFG5 ocorre em G1, enquanto a transcrição máxima de DCW1 ocorre na fase S (Kitagaki et al., 2004), e a localização celular precisa de ambos é atualmente desconhecida. Deve-se notar que alguns CWPs também tendem a ser transcritos em diferentes momentos do ciclo celular e a se localizar em diferentes partes da parede celular (Klis et al., 2006).

Os dados na Figura 8 nos levaram a propor o modelo de captura um tanto herético, que pode ser especialmente aplicável a mutantes com uma resposta de parede celular montada, em que a captura de GPI-CWPs contendo inositol é abolida quando as células recebem suporte osmótico. Uma análise de espectrometria de massa de CWPs de levedura liberados por base suave ou ácido fluorídrico (para clivar a ligação fosfodiéster de GPI-CWPs ligados a β1.6-glucano) identificou 19 CWPs, três dos quais não tinham um sinal de fixação de GPI nem uma repetição de consenso PIR (Q [IV] XDGQ [IVP] Q Yin et al., 2005). Isso apóia a ideia de que, mesmo em células WT, alguns CWPs podem simplesmente estar presos ou ancorados de outra maneira ainda desconhecida.


Perturbações no sistema imunológico

Um sistema imunológico funcional é essencial para a sobrevivência, mas mesmo as sofisticadas defesas celulares e moleculares da resposta imunológica dos mamíferos podem ser derrotadas por patógenos em praticamente todas as etapas. Na competição entre a proteção imunológica e a evasão de patógenos, os patógenos têm a vantagem de uma evolução mais rápida por causa de seu tempo de geração mais curto, grandes tamanhos populacionais e, frequentemente, taxas de mutação mais altas. Assim, os patógenos desenvolveram uma ampla gama de mecanismos de escape imunológico. Por exemplo, Streptococcus pneumoniae (a bactéria que causa pneumonia e meningite) envolve-se com uma cápsula que inibe os fagócitos de engolfá-la e exibir antígenos ao sistema imunológico adaptativo. Staphylococcus aureus (a bactéria que pode causar infecções cutâneas, abcessos e meningite) sintetiza uma toxina chamada leucocidina, que mata os fagócitos depois de engolir a bactéria. Outros patógenos também podem prejudicar o sistema imunológico adaptativo. HIV infecta TH células usando suas moléculas de superfície CD4, gradualmente esgotando o número de TH células no corpo ([link]) isso inibe a capacidade do sistema imune adaptativo de gerar respostas suficientes a infecções ou tumores. Como resultado, os indivíduos infectados pelo HIV freqüentemente sofrem de infecções que não causariam doenças em pessoas com sistema imunológico saudável, mas que podem causar doenças devastadoras em indivíduos imunologicamente comprometidos.

As respostas inadequadas das próprias células e moléculas imunológicas também podem perturbar o funcionamento adequado de todo o sistema, levando a danos nas células hospedeiras que podem se tornar fatais.

Imunodeficiência

Imunodeficiência é uma falha, insuficiência ou atraso na resposta do sistema imunológico, que pode ser adquirida ou herdada. A imunodeficiência pode permitir que os patógenos ou células tumorais ganhem uma posição e se replicem ou proliferem em níveis altos o suficiente para que o sistema imunológico fique sobrecarregado. A imunodeficiência pode ser adquirida como resultado da infecção por certos patógenos que atacam as células do próprio sistema imunológico (como o HIV), exposição química (incluindo certos tratamentos médicos, como quimioterapia), desnutrição ou estresse extremo. Por exemplo, a exposição à radiação pode destruir populações de linfócitos e aumentar a suscetibilidade de um indivíduo a infecções e câncer. Raramente, imunodeficiências primárias que estão presentes desde o nascimento também podem ocorrer. Por exemplo, a doença de imunodeficiência combinada grave (SCID) é uma condição na qual as crianças nascem sem células B ou T funcionais.

Hipersensibilidades

Uma resposta imune mal-adaptativa a substâncias estranhas inofensivas ou auto-antígenos que ocorrem após a sensibilização do tecido é chamada de hipersensibilidade. Os tipos de hipersensibilidade incluem imediata, retardada e autoimune. Uma grande proporção da população humana é afetada por um ou mais tipos de hipersensibilidade.

Alergias

A reação imune que resulta de hipersensibilidades imediatas em que uma resposta imune mediada por anticorpos ocorre dentro de minutos de exposição a um antígeno geralmente inofensivo é chamada de alergia. Nos Estados Unidos, 20% da população apresenta sintomas de alergia ou asma, enquanto 55% apresentam teste positivo contra um ou mais alérgenos. Na exposição inicial a um alérgeno potencial, um indivíduo alérgico sintetiza anticorpos por meio do processo típico de APCs apresentando antígeno processado para TH células que estimulam as células B a produzirem os anticorpos. As moléculas de anticorpo interagem com os mastócitos embutidos nos tecidos conjuntivos. Esse processo prepara, ou sensibiliza, o tecido. Na exposição subsequente ao mesmo alérgeno, as moléculas de anticorpo nos mastócitos ligam-se ao antígeno e estimulam os mastócitos a liberar histamina e outros produtos químicos inflamatórios, esses mediadores químicos então recrutam eosinófilos (um tipo de glóbulo branco), que também parecem estar adaptados a respondendo a vermes parasitas ([link]). Os eosinófilos liberam fatores que aumentam a resposta inflamatória e as secreções dos mastócitos. Os efeitos de uma reação alérgica variam de sintomas leves, como espirros e coceira, olhos lacrimejantes, até reações mais graves ou mesmo fatais envolvendo vergões ou urticária com coceira intensa, constrição das vias aéreas com dificuldade respiratória grave e queda da pressão sanguínea causada pela dilatação dos vasos sanguíneos e perda de fluido do sistema circulatório. Essa reação extrema, geralmente em resposta a um alérgeno introduzido no sistema circulatório, é conhecida como choque anafilático. Os anti-histamínicos são insuficientes para combater o choque anafilático e, se não forem tratados com epinefrina para combater a pressão arterial e os efeitos respiratórios, essa condição pode ser fatal.

A hipersensibilidade tardia é uma resposta imune mediada por células que leva aproximadamente um a dois dias após a exposição secundária para uma reação máxima. Este tipo de hipersensibilidade envolve o TH1 resposta inflamatória mediada por citocinas e pode causar lesões locais nos tecidos ou dermatite de contato (erupção cutânea ou irritação da pele). A hipersensibilidade retardada ocorre em alguns indivíduos em resposta ao contato com certos tipos de joias ou cosméticos. A hipersensibilidade retardada facilita a resposta imunológica à hera venenosa e também é a razão pela qual o teste cutâneo para tuberculose resulta em uma pequena região de inflamação em indivíduos que foram previamente expostos a Mycobacterium tuberculosis, o organismo que causa a tuberculose.

Experimente diagnosticar uma reação alérgica selecionando um dos estudos de caso interativos no site da Organização Mundial de Alergia.

Autoimunidade

Autoimunidade é um tipo de hipersensibilidade a antígenos próprios que afeta aproximadamente cinco por cento da população. A maioria dos tipos de autoimunidade envolve a resposta imune humoral. Um anticorpo que marca inadequadamente os componentes próprios como estranhos é denominado um autoanticorpo. Em pacientes com miastenia gravis, uma doença autoimune, os receptores de células musculares que induzem a contração em resposta à acetilcolina são direcionados por anticorpos. O resultado é fraqueza muscular que pode incluir dificuldade acentuada com funções motoras finas ou grossas. No lúpus eritematoso sistêmico, uma resposta difusa de autoanticorpos ao próprio DNA e proteínas do indivíduo resulta em várias doenças sistêmicas ([link]). O lúpus eritematoso sistêmico pode afetar o coração, as articulações, os pulmões, a pele, os rins, o sistema nervoso central ou outros tecidos, causando danos aos tecidos por meio da ligação de anticorpos, recrutamento do complemento, lise e inflamação.

A autoimunidade pode se desenvolver com o tempo e suas causas podem estar enraizadas no mimetismo molecular, uma situação em que uma molécula é semelhante em formato a outra molécula a ponto de se ligar aos mesmos receptores imunológicos. Anticorpos e receptores de células T podem se ligar a autoantígenos que são estruturalmente semelhantes aos antígenos de patógenos. Por exemplo, infecção com Streptococcus pyogenes (a bactéria que causa infecções na garganta) pode gerar anticorpos ou células T que reagem com o músculo cardíaco, que tem uma estrutura semelhante à superfície do S. pyogenes. Esses anticorpos podem danificar o músculo cardíaco com ataques auto-imunes, levando à febre reumática. O diabetes mellitus insulino-dependente (Tipo 1) surge de uma T inflamatória destrutivaH1 resposta contra células produtoras de insulina do pâncreas. Os pacientes com esta autoimunidade devem ser tratados com injeções regulares de insulina.

Resumo da Seção

As interrupções imunológicas podem envolver respostas imunológicas insuficientes ou respostas imunológicas inadequadas. A imunodeficiência aumenta a suscetibilidade de um indivíduo a infecções e cânceres. As hipersensibilidades são respostas mal direcionadas a partículas estranhas inofensivas, como no caso das alergias, ou aos próprios tecidos do indivíduo, como no caso da autoimunidade. As reações aos componentes próprios podem ser o resultado de mimetismo molecular.


Conteúdo

A imunologia clássica está ligada aos campos da epidemiologia e da medicina. Ele estuda a relação entre os sistemas do corpo, patógenos e imunidade. A menção escrita mais antiga de imunidade remonta à praga de Atenas em 430 AEC. Tucídides observou que as pessoas que se recuperaram de um surto anterior da doença podiam cuidar dos enfermos sem contrair a doença uma segunda vez. [14] Muitas outras sociedades antigas têm referências a este fenômeno, mas não foi até os séculos 19 e 20 que o conceito se desenvolveu em teoria científica.

O estudo dos componentes moleculares e celulares que compõem o sistema imunológico, incluindo sua função e interação, é a ciência central da imunologia. O sistema imunológico foi dividido em um sistema imunológico inato mais primitivo e, nos vertebrados, um sistema imunológico adquirido ou adaptativo. Este último é ainda dividido em componentes humorais (ou anticorpos) e mediados por células.

O sistema imunológico tem a capacidade de auto-reconhecimento e não-reconhecimento. [15] Um antígeno é uma substância que ativa a resposta imune. As células envolvidas no reconhecimento do antígeno são linfócitos. Uma vez que eles reconhecem, eles secretam anticorpos. Os anticorpos são proteínas que neutralizam os microrganismos causadores de doenças. Os anticorpos não matam diretamente os patógenos, mas, em vez disso, identificam os antígenos como alvos de destruição por outras células do sistema imunológico, como fagócitos ou células NK.

A resposta humoral (anticorpo) é definida como a interação entre anticorpos e antígenos. [16] Os anticorpos são proteínas específicas liberadas de uma determinada classe de células do sistema imunológico conhecidas como linfócitos B, enquanto os antígenos são definidos como qualquer coisa que estimule a geração de anticorpos (anticorpo generadores). A imunologia se baseia na compreensão das propriedades dessas duas entidades biológicas e na resposta celular a ambas.

Agora está ficando claro que as respostas imunológicas contribuem para o desenvolvimento de muitos distúrbios comuns não tradicionalmente vistos como imunológicos, [17] incluindo condições metabólicas, cardiovasculares, câncer e neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, há implicações diretas do sistema imunológico nas doenças infecciosas (tuberculose, malária, hepatite, pneumonia, disenteria e infestações por helmintos). Portanto, a pesquisa no campo da imunologia é de primordial importância para os avanços nos campos da medicina moderna, pesquisa biomédica e biotecnologia.

A pesquisa imunológica continua a se tornar mais especializada, buscando modelos não clássicos de imunidade e funções de células, órgãos e sistemas não previamente associados ao sistema imunológico (Yemeserach 2010).

A imunologia clínica é o estudo de doenças causadas por distúrbios do sistema imunológico (falha, ação aberrante e crescimento maligno dos elementos celulares do sistema). Também envolve doenças de outros sistemas, em que as reações imunológicas desempenham um papel na patologia e nas características clínicas.

As doenças causadas por distúrbios do sistema imunológico se enquadram em duas grandes categorias:

    , em que partes do sistema imunológico falham em fornecer uma resposta adequada (exemplos incluem doença granulomatosa crônica e doenças imunológicas primárias), em que o sistema imunológico ataca o próprio corpo do hospedeiro (exemplos incluem lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, doença de Hashimoto e miastenia gravis).

Outros distúrbios do sistema imunológico incluem várias hipersensibilidades (como na asma e outras alergias) que respondem inadequadamente a compostos inofensivos.

A doença mais conhecida que afeta o próprio sistema imunológico é a AIDS, uma imunodeficiência caracterizada pela supressão das células T CD4 + ("auxiliares"), células dendríticas e macrófagos pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

Imunologistas clínicos também estudam maneiras de prevenir as tentativas do sistema imunológico de destruir aloenxertos (rejeição de transplante). [18]

A capacidade do corpo de reagir aos antígenos depende da idade da pessoa, do tipo de antígeno, de fatores maternos e da área onde o antígeno é apresentado. [19] Os neonatos estão em um estado de imunodeficiência fisiológica, porque suas respostas imunológicas inatas e adaptativas são bastante suprimidas. Uma vez nascido, o sistema imunológico da criança responde favoravelmente aos antígenos proteicos, embora não tão bem às glicoproteínas e polissacarídeos.Na verdade, muitas das infecções adquiridas por neonatos são causadas por organismos de baixa virulência como Estafilococo e Pseudomonas. Em neonatos, a atividade opsônica e a capacidade de ativar a cascata do complemento são muito limitadas. Por exemplo, o nível médio de C3 em um recém-nascido é aproximadamente 65% daquele encontrado no adulto. A atividade fagocítica também é bastante prejudicada em recém-nascidos. Isso se deve à menor atividade opsônica, bem como à diminuição da regulação positiva dos receptores de integrina e selectina, que limitam a capacidade dos neutrófilos de interagir com as moléculas de adesão no endotélio. Seus monócitos são lentos e apresentam produção reduzida de ATP, o que também limita a atividade fagocítica do recém-nascido. Embora o número de linfócitos totais seja significativamente maior do que em adultos, a imunidade celular e humoral também está prejudicada. As células apresentadoras de antígenos em recém-nascidos têm uma capacidade reduzida de ativar células T. Além disso, as células T de um recém-nascido proliferam mal e produzem quantidades muito pequenas de citocinas como IL-2, IL-4, IL-5, IL-12 e IFN-g, o que limita sua capacidade de ativar a resposta humoral, bem como a atividade fagocítica do macrófago. As células B se desenvolvem no início da gestação, mas não estão totalmente ativas. [20]

Fatores maternos também desempenham um papel na resposta imunológica do corpo. Ao nascimento, a maior parte da imunoglobulina presente é IgG materna. Esses anticorpos são transferidos da placenta para o feto usando o FcRn (receptor Fc neonatal). [21] Como IgM, IgD, IgE e IgA não atravessam a placenta, são quase indetectáveis ​​ao nascimento. Alguma IgA é fornecida pelo leite materno. Esses anticorpos adquiridos passivamente podem proteger o recém-nascido por até 18 meses, mas sua resposta é geralmente de curta duração e de baixa afinidade. [20] Esses anticorpos também podem produzir uma resposta negativa. Se uma criança for exposta ao anticorpo para um antígeno específico antes de ser exposta ao próprio antígeno, a criança produzirá uma resposta atenuada. Os anticorpos maternos adquiridos passivamente podem suprimir a resposta do anticorpo à imunização ativa. Da mesma forma, a resposta das células T à vacinação difere em crianças em comparação com adultos, e as vacinas que induzem respostas Th1 em adultos não provocam prontamente essas mesmas respostas em neonatos. [20] Entre seis e nove meses após o nascimento, o sistema imunológico de uma criança começa a responder mais fortemente às glicoproteínas, mas geralmente não há melhora acentuada em sua resposta aos polissacarídeos até que tenham pelo menos um ano de idade. Esse pode ser o motivo dos distintos intervalos de tempo encontrados nos esquemas de vacinação. [22] [23]

Durante a adolescência, o corpo humano passa por várias alterações físicas, fisiológicas e imunológicas desencadeadas e mediadas por hormônios, sendo a mais significativa no sexo feminino o 17-β-estradiol (um estrogênio) e, no masculino, a testosterona. O estradiol geralmente começa a agir por volta dos 10 anos de idade e a testosterona alguns meses depois. [24] Há evidências de que esses esteróides não apenas agem diretamente nas características sexuais primárias e secundárias, mas também têm um efeito no desenvolvimento e na regulação do sistema imunológico, [25] incluindo um risco aumentado no desenvolvimento de autoimunidade na puberdade e pós-puberdade . [26] Também há evidências de que os receptores da superfície celular nas células B e macrófagos podem detectar hormônios sexuais no sistema. [27]

Foi demonstrado que o hormônio sexual feminino 17-β-estradiol regula o nível de resposta imunológica, [28] enquanto alguns andrógenos masculinos, como a testosterona, parecem suprimir a resposta ao estresse à infecção. Outros andrógenos, entretanto, como DHEA, aumentam a resposta imunológica. [29] Como nas mulheres, os hormônios sexuais masculinos parecem ter mais controle do sistema imunológico durante a puberdade e pós-puberdade do que durante o resto da vida adulta de um homem.

Mudanças físicas durante a puberdade, como a involução do timo, também afetam a resposta imunológica. [30]

Ecoimunologia, ou imunologia ecológica, explora a relação entre o sistema imunológico de um organismo e seu ambiente social, biótico e abiótico.

Pesquisas ecoimunológicas mais recentes se concentraram nas defesas de patógenos do hospedeiro tradicionalmente consideradas "não imunológicas", como prevenção de patógenos, automedicação, defesas mediadas por simbiontes e trocas de fecundidade. [31] A imunidade comportamental, uma frase cunhada por Mark Schaller, refere-se especificamente aos impulsionadores de evitação de patógenos psicológicos, como nojo despertado por estímulos encontrados em torno de indivíduos infectados por patógenos, como o cheiro de vômito. [32] Mais amplamente, a imunidade ecológica "comportamental" foi demonstrada em várias espécies. Por exemplo, a borboleta monarca freqüentemente põe seus ovos em certas espécies de erva-leiteira tóxica quando infectada com parasitas. Essas toxinas reduzem o crescimento do parasita na prole do Monarca infectado. No entanto, quando as borboletas monarca não infectadas são forçadas a se alimentar apenas dessas plantas tóxicas, elas sofrem um custo de adequação, pois a vida útil é reduzida em relação a outras borboletas monarca não infectadas. [33] Isso indica que botar ovos em plantas tóxicas é um comportamento caro em Monarcas, que provavelmente evoluiu para reduzir a gravidade da infecção do parasita. [31]

As defesas mediadas por simbiontes também são hereditárias através das gerações de hospedeiros, apesar de uma base direta não genética para a transmissão. Pulgões, por exemplo, dependem de vários simbiontes diferentes para se defenderem de parasitas importantes e podem transmitir verticalmente seus simbiontes de pais para filhos. [34] Portanto, um simbionte que confere com sucesso a proteção de um parasita é mais provável de ser passado para a prole do hospedeiro, permitindo a coevolução com parasitas que atacam o hospedeiro de uma forma semelhante à imunidade tradicional.

O uso de componentes do sistema imunológico ou antígenos para tratar uma doença ou distúrbio é conhecido como imunoterapia. A imunoterapia é mais comumente usada para tratar alergias, distúrbios autoimunes, como doença de Crohn e artrite reumatóide, e certos tipos de câncer. A imunoterapia também é freqüentemente usada em pessoas imunossuprimidas (como pacientes com HIV) e pessoas que sofrem de outras deficiências imunológicas. Isso inclui fatores reguladores, como IL-2, IL-10, GM-CSF B, IFN-α.

A especificidade da ligação entre o anticorpo e o antígeno tornou o anticorpo uma excelente ferramenta para a detecção de substâncias por uma variedade de técnicas diagnósticas. Os anticorpos específicos para um antígeno desejado podem ser conjugados com um marcador isotópico (rádio) ou fluorescente ou com uma enzima formadora de cor para detectá-lo. No entanto, a semelhança entre alguns antígenos pode levar a falsos positivos e outros erros em tais testes por anticorpos que reagem de forma cruzada com antígenos que não são correspondências exatas. [35]

O estudo da interação do sistema imunológico com as células cancerosas pode levar a testes diagnósticos e terapias para encontrar e combater o câncer. A imunologia se preocupa com a reação fisiológica característica do estado imunológico.

Esta área da imunologia é dedicada ao estudo dos aspectos imunológicos do processo reprodutivo, incluindo a aceitação do feto. O termo também tem sido usado por clínicas de fertilidade para tratar de problemas de fertilidade, abortos recorrentes, partos prematuros e complicações perigosas como a pré-eclâmpsia.

A imunologia é fortemente experimental na prática cotidiana, mas também é caracterizada por uma atitude teórica contínua. Muitas teorias foram sugeridas em imunologia desde o final do século XIX até os dias atuais. O final do século 19 e o início do século 20 assistiram a uma batalha entre as teorias "celular" e "humoral" da imunidade. Segundo a teoria da imunidade celular, representada em particular por Elie Metchnikoff, eram as células - mais precisamente, os fagócitos - os responsáveis ​​pelas respostas imunitárias. Em contraste, a teoria humoral da imunidade, sustentada por Robert Koch [36] e Emil von Behring, [37] entre outros, afirmava que os agentes imunológicos ativos eram componentes solúveis (moléculas) encontrados nos "humores" do organismo e não em suas células. . [38] [39] [40]

Em meados da década de 1950, Macfarlane Burnet, inspirado por uma sugestão de Niels Jerne, [41] formulou a teoria da seleção clonal (CST) da imunidade. [42] Com base no CST, Burnet desenvolveu uma teoria de como uma resposta imune é desencadeada de acordo com a distinção self / não self: "self" constituintes (constituintes do corpo) não desencadeiam respostas imunológicas destrutivas, enquanto entidades "não-self" (por exemplo, patógenos, um aloenxerto) desencadeiam uma resposta imunológica destrutiva. [43] A teoria foi posteriormente modificada para refletir novas descobertas sobre histocompatibilidade ou a complexa ativação de "dois sinais" das células T. [44] A teoria da imunidade self / não self e o vocabulário self / não self foram criticados, [40] [45] [46] mas permanecem muito influentes. [47] [48]

Mais recentemente, várias estruturas teóricas foram sugeridas em imunologia, incluindo visões "autopoiéticas", [49] visões "imunológicas cognitivas", [50] o "modelo de perigo" (ou "teoria do perigo"), [45] e a "descontinuidade "teoria. [51] [52] O modelo de perigo, sugerido por Polly Matzinger e colegas, tem sido muito influente, gerando muitos comentários e discussões. [53] [54] [55] [56]


Teste mecânico

Limiares de retirada da pata (PWTs) em resposta a estímulos mecânicos (filamentos de von Frey calibrados) foram medidos com o paradigma de teste up-down descrito anteriormente [16,17]. Cada rato foi colocado em uma câmara de Plexiglas em uma tela de malha elevada. Após aclimatação no ambiente, os filamentos de von Frey calibrados em incrementos logarítmicos de força (0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51, 15,14 e 26,00 g) foram aplicados na superfície plantar das patas traseiras dos ratos. O filamento de von Frey de 2,04 g foi o primeiro a ser aplicado. Se uma resposta positiva ocorresse, o próximo filamento de von Frey de força inferior era usado se uma resposta negativa fosse observada, o próximo filamento de força mais alta era usado. O teste foi encerrado quando uma das seguintes condições ocorreu: (i) Uma resposta negativa foi obtida com o cabelo de 26,00 g ou (ii) Três estímulos foram aplicados após a primeira resposta positiva. O PWT foi calculado convertendo o padrão de respostas positivas e negativas à estimulação do filamento de von Frey em um valor limite de 50% com uma fórmula fornecida por Dixon e Chaplan [19,20].


Reconhecimentos

Todos os experimentos radioativos foram realizados no laboratório de isótopos radioativos com a orientação de HJ Zhang no manuseio de materiais radioativos (IBP, CAS). Também agradecemos aos colegas cujos trabalhos não puderam ser citados devido à limitação de espaço.

Financiamento

Este trabalho foi apoiado por doações ao GL da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630041, 31525013 e 31521002), do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2017YFA0504200, 2015CB856200) e da Academia Chinesa de Ciências (CAS) Pesquisa de Prioridade Estratégica Programa (XDB19040202) para PC da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31471218) e da Associação de Promoção de Inovação Juvenil CAS (2015071) e para XX do Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201406007). O trabalho também foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Principal CAS em Ciência de Fronteira (QYZDY-SSW-SMC020) e bolsa de bolsa de pesquisa internacional HHMI (55008737) para GL. O trabalho no RM Lab é apoiado por uma concessão ERC-StG (REPODDID).

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados gerados e analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis no banco de dados SRA ou GEO (números de acesso: SRP154023 GSE117035).


Afiliações

Departamento de Bioquímica, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Thi Thuy Trang Nguyen, Jacqueline Kia Kee Chua, Kwi Shan Seah, Kim Kiat Lim, Shermaine Yu Wen Pang e Ee Sin Chen

National University Health System (NUHS), Singapura

Thi Thuy Trang Nguyen, Kwi Shan Seah, Jie Yin Yee, Kim Kiat Lim, Edmund Jon Deoon Lee e Ee Sin Chen

NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore

Escola de Pós-Graduação NUS para Ciências Integrativas e Engenharia, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Departamento de Farmacologia, Escola de Medicina Yong Loo Lin, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Seok Hwee Koo, Jie Yin Yee e Edmund Jon Deoon Lee

Departamento de Farmácia, Faculdade de Ciências, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Eugene Guorong Yang e Brian Dymock

Departamento de Matemática, Faculdade de Ciências, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Departamento de Química, Faculdade de Ciências, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura