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Qual DNA os espermatozoides conteriam de um escroto transplantado?


Tivemos uma discussão no intervalo para o café de hoje sobre o transplante de um escroto.

Vamos supor que seja possível.

Os espermatozoides produzidos conteriam o DNA do doador ou daquele que teve o escroto transplantado? Você pode explicar por quê?


10 fatos vitais sobre o escroto

O corpo humano é uma coisa incrível. Para cada um de nós, é o objeto mais íntimo que conhecemos. E, no entanto, a maioria de nós não sabe o suficiente sobre ele: seus recursos, funções, peculiaridades e mistérios. Nossa série The Body explora a anatomia humana, parte por parte. Pense nisso como uma mini enciclopédia digital com uma dose de uau.

O escroto pode parecer nada mais do que um pedaço de pele flácida, mas desempenha algumas funções muito importantes para a saúde humana e a reprodução. Os testículos, que produzem espermatozoides, estariam desprotegidos e sujeitos aos elementos sem o escroto - portanto, sem ele, nenhum de nós poderia existir. Para saber mais, Mental Floss conversou com Brian Levine, um endocrinologista reprodutivo e especialista em fertilidade do escritório de Nova York do Colorado Center for Reproductive Medicine.

1. O ESCROTO TEM, MAS UM PROPÓSITO HUMILDE.

"O escroto é um gênio", disse Levine ao Mental Floss. Embora isso possa ser um alongamento, ele diz que o principal objetivo do escroto "é manter os testículos fora do corpo", o que ajuda a mantê-los mais frios do que a temperatura corporal. Como os espermatozoides são muito sensíveis às flutuações de temperatura, isso ajuda a preservar sua saúde.

2. TESTÍCULOS QUENTES PODEM CAUSAR PROBLEMAS DE SAÚDE E FERTILIDADE.

"O aumento da temperatura corporal ou da temperatura em geral [como uma banheira de hidromassagem] leva a anormalidades cromossômicas. Ao manter a temperatura mais baixa, você protege o DNA que está sendo formado para unir os espermatozóides de erros inatos", explica Levine.

3. A TEMPERATURA REGULA A ALTURA DO TESTÍCULO.

À medida que o corpo fica mais frio, as fibras musculares aproximam o escroto do corpo para regulá-lo. Quando a pessoa está mais quente, ela fica pendurada mais abaixo do corpo. "A pessoa média tem um testículo acima do outro", diz Levine. A variação de tamanho e forma dos testículos não é por si só motivo de preocupação - a menos que você experimente uma mudança repentina.

4. ESPERMÃO MAIS REFRIGERADO TAMBÉM NADA MELHOR ...

Além disso, ao manter os testículos em uma temperatura mais baixa, metabolicamente, diz Levine, "você mantém os espermatozoides nadando mais devagar, então acaba preservando-os".

5. ... PELO QUE ALGUNS SUGERIRAM A EXPOSIÇÃO DO ESCROTO À CHAMA ABERTA OU A MERGULHO DE ÁGUA QUENTE.

Um estudo de 2013 [PDF] sobre métodos de controle de natalidade de uma cultura indígena no Zimbábue descreve como os homens foram instruídos a expor seus testículos a "calor acima da média do fogo" na crença de que isso enfraqueceria o esperma. Embora haja uma conexão entre a temperatura e a saúde do esperma, esta não é uma prática recomendada para controle de natalidade, pois é improvável que reduza com sucesso a contagem de esperma. Além disso, observa o estudo, "testículos com temperatura corporal muito alta estão associados a cânceres testiculares", embora outros argumentem que o júri ainda não decidiu sobre essa suposta conexão. De qualquer forma, você provavelmente deve manter seu escroto longe de chamas.

Na mesma linha, Marthe Voegeli, uma médica suíça e pioneira em fertilidade na década de 1950, elaborou um estudo no qual os homens se sentavam em um banho raso ou apenas testicular a 116 ° F por 45 minutos diários durante três semanas. Seu estudo afirmou que isso resultou em entre quatro e seis meses de infertilidade. A fertilidade voltou ao normal eventualmente, e os filhos nascidos desses homens eram saudáveis ​​e normais. Ela levou seu método para a Índia, para ajudar famílias que sofrem com a fome e a pobreza a evitar novas gravidezes. Embora ela afirmasse que seus métodos eram bem-sucedidos, a maioria dos médicos hoje não recomendaria isso como uma prática anticoncepcional confiável.

6. VOCÊ PODE OBTER MELANOMA DO ESCROTO.

Até o escroto é suscetível ao câncer, ressalta Levine. “Onde quer que haja pele, você pode pegar melanoma”, diz ele. Isso pode ser resultado de metástases de câncer que se espalham de alguma outra parte do corpo ou, se você for um banhista nu, esteja avisado: "Se você expô-lo ao sol, pode pegar melanoma."

7. A FALTA DE UM ESCROTO PODE SIGNIFICAR ISSO ...

Se você é homem, não é pré-púbere e não tem escroto, isso pode significar que tem testículos que não desceram, diz Levine, "o que pode levar à infertilidade". A maioria dos testículos desce eventualmente, mas às vezes eles podem ser ajudados por cirurgia.

8. ESTEJA CIENTE DESTAS CONDIÇÕES COMUNS DO ESCROTO.

Problemas comuns do escroto que podem requerer intervenção cirúrgica incluem varicoceles, que são essencialmente veias varicosas no escroto que podem causar infertilidade por acúmulo de sangue, o que pode afetar a contagem de esperma e a motilidade. As varicoceles também podem fazer com que os testículos não se desenvolvam normalmente ou encolham. Uma hidrocele, que os médicos chamam informalmente de "água no testículo", diz Levine, é simplesmente um cisto cheio de líquido que envolve o testículo e causa inchaço no escroto. Levine acrescenta que, uma vez que o escroto permite uma boa avaliação dos testículos, "se você sentir algum caroço, inchaço ou anormalidade, deve consultar um médico".

9. TÉCNICAS CIRÚRGICAS PARA O ESCROTO E TESTÍCULOS SÃO MUITO MUITOS.

Se você precisar de cirurgia para uma dessas condições, ou para uma vasectomia, Levine reafirma que as técnicas cirúrgicas modernas "geralmente poupam o escroto e requerem uma incisão mínima, quase invisível, no testículo". Weill Cornell Medical Center até mesmo aperfeiçoou o que eles chamam de vasectomia sem bisturi que usa uma pinça especializada em seu lugar.

10. POR QUE AS VARREDURAS DE CHAMINÉ FORAM PROPENSAS AO CÂNCER DE ESCROTA?

No final dos anos 1700 e início dos anos 1800, limpadores de chaminés - que muitas vezes eram meninos porque eram pequenos o suficiente para caber - desenvolveram câncer escrotal devido à coleta de creosoto entre as dobras cutâneas no escroto.

Sir Percival Pott, cirurgião inglês considerado o pai da ortopedia e o primeiro a fazer a ligação entre ocupações e certas doenças, também fez a ligação entre limpa-chaminés e câncer escrotal, escrevendo: "... há uma doença diferente peculiar a um determinado conjunto de pessoas, que, pelo menos que eu saiba, não foi notado publicamente, refiro-me ao câncer do limpador de chaminés. É uma doença que ataca pela primeira vez e aparece na parte inferior do escroto, onde produz uma lesão superficial , dolorido, irregular, feridas de aparência doentia, com bordas duras e ascendentes: o comércio chama isso de verruga de fuligem. " (Sabemos agora que um produto químico na fuligem causou danos genéticos ao cromossomo 17.)

Depois que essa conexão foi feita, os médicos recomendaram que os limpadores de chaminés mudassem suas roupas semanalmente e lavassem seus órgãos genitais diariamente.


A equipe da Johns Hopkins realiza o primeiro transplante de pênis e escroto

Uma equipe de onze cirurgiões sediados nos Estados Unidos é & ldquooptimistic & rdquo que o primeiro receptor de transplante de pênis e escroto total do mundo recuperará a função urinária e sexual.

O paciente anônimo é um veterano militar dos EUA que perdeu os órgãos genitais e as duas pernas depois de ser ferido por um dispositivo explosivo improvisado no Afeganistão. Os médicos esperavam que ele tivesse sensação peniana e função erétil em cerca de seis meses.

O procedimento, que ocorreu no Hospital Johns Hopkins em Baltimore no dia 26 de março, durou cerca de 14 horas. Durante esse tempo, nove cirurgiões plásticos e dois cirurgiões urológicos trabalharam para transferir um pênis, escroto e parte de uma parede abdominal de um doador falecido, conectando pele, nervos, vasos sanguíneos e uretra.

Os testículos do doador não foram transplantados, no entanto, devido a questões éticas, já que qualquer esperma criado após o procedimento ainda pode conter o DNA do doador.

O receptor também recebeu infusões de medula óssea do doador cerca de duas semanas após a cirurgia para ajudar seu corpo a aceitar o transplante. Como resultado, o paciente só precisará tomar uma dose diária da medicação de imunossupressão.

Embora os transplantes de pênis tenham sido realizados antes (primeiro na África do Sul em 2014, depois nos Estados Unidos em 2016 e novamente na África do Sul no ano passado), este foi o primeiro transplante a incluir o escroto e outros tecidos.

"Nosso transplante é diferente [dos anteriores] porque é um pedaço de tecido muito maior", disse o Dr. Richard Redett, cirurgião plástico e reconstrutor da Johns Hopkins e diretor clínico do programa de transplante geniturinário. cúpula, uma publicação da Johns Hopkins. & ldquoUm dispositivo explosivo improvisado geralmente atinge a região pélvica. Fomos capazes de projetar um transplante que incluiria todo o tecido para substituir todo o defeito. & Rdquo

A equipe da Johns Hopkins começou a se preparar para o transplante de pênis e escroto há cerca de cinco anos, praticando em cadáveres para entender melhor a complexa conexão de vasos sanguíneos e nervos. Também demorou algum tempo para encontrar um doador que correspondesse à idade do receptor, ao tom da pele e aos fatores imunológicos.

Outros pacientes estão sendo considerados para procedimentos futuros, mas não para fins de redesignação de gênero ainda.


Resultados

SSCT alogênico em Nanos2 Ratos Knockout.

Até o momento, a aplicação de SSCT em um contexto que será implantado em gado ou em espécies ameaçadas, isto é, entre machos imunologicamente incompatíveis onde o receptor é ablacionado da linha germinativa devido a uma deficiência genética e resulta na propagação do haplótipo do doador via reprodução natural não foi foi demonstrado. Para resolver isso, primeiro projetamos um esquema de prova de conceito com camundongos que envolve machos receptores tornados estéreis pela inativação do gene específico para células germinativas conservado evolutivamente. Nanos2 para SSCT alogênico com células de um doador masculino imunologicamente incompatível (Fig. 1UMA).

SSCT alogênico em Nanos2 camundongos receptores de nocaute. (UMA) Esquema da estratégia experimental. (B) Imagens representativas de testículos de camundongos adultos que possuem um ( +/− ) ou dois ( −/− ) Nanos2 alelos inativados pela edição do gene CRISPR-Cas9. (C) Comparação quantitativa dos pesos dos testículos entre adultos Nanos2 +/− e −/− camundongos. Os dados são média ± SEM para n = 3 machos diferentes e seis testículos de cada genótipo e * denota significativamente diferente em P & lt 0,05. (D) Imagens representativas de cortes transversais de testículos corados com hematoxilina e eosina de adultos Nanos2 +/− e −/− camundongos. (Barras de escala, 50 μm.) (E) Imagens representativas de testículos corados com X-Gal de um adulto Nanos2 −/− camundongo e um camundongo WT tratado com busulfan para esgotar a linha germinativa endógena. Um testículo do Nanos2 −/− camundongo e camundongo WT tratado com busulfan foram transplantados com SSCs de um alogênico Rosa26-LacZNanos2 +/+ camundongo doador e o outro testículo não foi transplantado. A coloração azul intensa nos testículos transplantados reflete o enxerto de SSC do doador e a rederivação da espermatogênese.

Em estudos anteriores, Nanos2 linhas nulas de camundongos foram criadas com origens genéticas exogênicas de CD1 (isto é, ICR) via inserção direcionada de LacZ ou edição CRISPR-Cas9 para interromper a sequência de codificação (16, 17). Estes CD1 Nanos2 −/− (knockout [KO]) machos eram estéreis na idade adulta com aparente ablação da linha germinativa, enquanto machos que eram heterozigotos para o Nanos2 mutações (ou seja, +/− genótipo) ou fêmeas KO eram de fertilidade normal. No entanto, se o soma testicular em Nanos2 Os machos KO têm funcionalidade normal para suportar a espermatogênese de células germinativas alogênicas de tipo selvagem (WT). Aqui, camundongos de um CRISPR-Cas9 Nanos2 A linha KO, produzida anteriormente (16), foi utilizada como recipiente para SSCT. Primeiro, confirmamos a esterilidade de Nanos2 KO machos por emparelhamento com fêmeas WT. Em um período de 2 meses, nenhum dos Nanos2 Machos KO (n = 3) prole reproduzida, mas fichas copulatórias eram evidentes em todas as fêmeas, confirmando que o acasalamento havia ocorrido. Em comparação, todos os homens Nanos2 +/− irmãos da mesma ninhada eram de fertilidade normal (Apêndice SI, Tabela S1). Além disso, todas as geradas por CRISPR-Cas9 Nanos2 Mulheres KO eram de fertilidade normal (Apêndice SI, Tabela S1). Em seguida, aos ∼2 meses de idade, um testículo foi removido de um grupo de Nanos2 Homens KO para fenotipagem e o testículo contralateral foi transplantado com SSCs isolados de testículos de imunologicamente incompatíveis Rosa26-LacZ (Fundo genético B6 129s com LacZ inserção no Rosa26 locus) machos doadores. Como esperado, o peso dos testículos não transplantados do CRISPR-Cas9 Nanos2 Homens KO foram encontrados para ser significativamente (P & lt 0,01) reduzido em & gt81% (média ± SEM e n = 3) em comparação com companheiros de ninhada heterozigotos da mesma idade (Fig. 1 B e C) Além disso, o exame de seções transversais testiculares revelou que a linha germinativa estava completamente ausente nos testículos do Nanos2 Machos KO (Fig. 1D e Apêndice SI, Fig. S1), confirmando nossos achados anteriores (16). Em seguida, em 2 meses após o transplante, o testículo transplantado contralateral foi coletado e corado com X-Gal para detectar colônias de espermatogênese derivada de doador. Observamos extensa colonização alogênica de doadores marcados com LacZ em todos os CD1 Nanos2 Testículos receptores KO sem sinais de rejeição imunológica, por exemplo, inflamação ou fibrose (Fig. 1E) Além disso, o grau de colonização foi maior em Nanos2 Testículos receptores KO comparados aos testículos de machos receptores B6129scv de tipo selvagem que foram submetidos à depleção da linha germinativa endógena por tratamento com busulfan e transplantados com a mesma população de células doadoras e concentração de células (Fig. 1E) Essas descobertas indicam que os testes de Nanos2 Os camundongos KO fornecem um ambiente aprimorado para o enxerto por SSCs de tipo selvagem transplantados.

Restauração da fertilidade natural após SSCT alogênico em Nanos2 Ratos Knockout.

Em estudos anteriores, SSCT singênico em pré-púbere (5 a 12 dias de idade), mas não adulto Wv / Wv machos receptores, resultou na obtenção eficiente de fertilidade natural (9, 10). Além disso, SSCT alogênico em adultos Wv / Wv os receptores foram capazes de produzir colônias duradouras de espermatogênese derivada do doador e a prole foi produzida por acasalamento natural, desde que o receptor fosse submetido à supressão imunológica (10). No entanto, a eficiência de obtenção da fertilidade foi bastante baixa (∼24% dos homens) e o número de células doadoras transplantadas por testículo provou ser um fator limitante (10). Aqui nós perguntamos se Nanos2 Receptores KO submetidos a SSCT alogênico sem imunossupressão poderiam atingir a fertilidade por acasalamento natural (Fig. 2UMA) Para padronizar a população de células doadoras, culturas primárias de espermatogônias indiferenciadas estabelecidas a partir de Rosa26-LacZ camundongos que são aloantígenos histoincompatíveis com camundongos receptores de CD1 foram usados. Nós transplantamos 3 a 8 × 10 4 células de doadores em um ou ambos os testículos de seis Nanos2 Homens receptores KO com idade de 21 a 43 dias no momento do transplante (Apêndice SI, Tabela S2). Aos 30 dias após o transplante, os receptores foram emparelhados com mulheres púberes CD1 para testar sua fertilidade. Tampões copulatórios foram observados para todos os receptores, confirmando que o acasalamento ocorreu, e três dos seis machos começaram a procriar entre 81 e 113 dias após o transplante, incluindo dois receptores nos quais apenas um testículo foi transplantado (Apêndice SI, Tabela S2). Ao longo de um período de 6 a 8 meses, os recipientes férteis produziram 33 litros e 111 descendentes no total (Apêndice SI, Tabela S2). Com base na cor da pelagem e na detecção do LacZ transgene, 100% da prole foram determinados como sendo de origem genética do doador (Fig. 2 B e C) Curiosamente, todos os receptores que atingiram a fertilidade foram transplantados com SSCs de doadores aos 21 a 28 dias de idade e receberam & lt1 × 10 5 células por testículo, nenhum dos receptores com mais de 28 dias de idade no transplante atingiu a fertilidade. Surpreendentemente, um dos recipientes férteis recebeu apenas 3 × 10 4 células em apenas um testículo (Apêndice SI, Tabela S2). Os receptores que não atingiram a fertilidade natural foram mortos entre 11 e 12 meses após o transplante, todos os testículos continham extensas colônias de espermatogênese derivada de doadores, mas o conteúdo de espermatozoides epididimários foi surpreendentemente baixo (Apêndice SI, Fig. S2). Com 1 ano de idade (∼11 meses após o transplante), matamos as receptoras férteis e, de forma semelhante às contrapartes inférteis, os testículos continham uma extensa espermatogênese derivada do doador (Fig. 2D) Em contraste com os receptores inférteis, o conteúdo de espermatozoides nos epidídimos de receptores férteis era abundante (Apêndice SI, Fig. S2). Além disso, o peso médio dos testículos para receptoras que atingiram a fertilidade natural foi significativamente maior (P & lt 0,05) em comparação com receptoras que não atingiram a fertilidade (Fig. 2E) Curiosamente, a obtenção de fertilidade natural foi significativamente associada a uma idade mais jovem no momento do transplante (Fig. 2F) Coletivamente, esses achados demonstram que enxerto alogênico de doador SSC e regeneração espermatogênica em testículos de pré-púbere Nanos2 Os ratos machos receptores KO são robustos o suficiente para produzir fertilidade natural persistente.

Nanos2 camundongos receptores knockout atingem fertilidade natural após SSCT alogênico. (UMA) Esquema da estratégia experimental. (B) Imagem de um CD1 Nanos2 receptor nocaute do SSCT e par reprodutor fêmea CD1 de tipo selvagem com ninhada da prole possuindo o haplótipo do doador SSCT. (C) Imagem de biópsias da cauda coradas com X-Gal de pais CD1 (Nanos2 nocaute SSCT receptor macho e fêmea selvagem) e descendência gerada por acasalamento natural para LacZ atividade do transgene que seria herdada do doador de SSCT. (D) Imagem de um testículo corado com X-Gal de um CD1 Nanos2 nocaute 11 meses após SSCT alogênico com células-tronco de um LacZ macho doador transgênico. o Nanos2 o receptor do nocaute atingiu a fertilidade por meio do acasalamento natural. (E) Comparação quantitativa dos pesos dos testículos para Nanos2 receptoras nocaute que obtiveram (+) ou não (-) fertilidade por meio de acasalamento natural após SSCT alogênico. Os dados são média ± SEM para n = 3 a 9 homens diferentes de cada resultado receptor. (F) Comparação da idade no momento do SSCT alogênico para Nanos2 recipientes knockout que obtiveram (+) ou não (-) fertilidade natural. Os dados são média ± SEM para n = 3 machos diferentes de cada resultado receptor. Para E e F, * denota uma diferença significativa em P & lt 0,05.

Espermatogênese derivada de doador após SSCT alogênico em NANOS2 Javalis Knockout.

A tradução do conceito de SSCT de camundongos para gado tem sido elogiada por quase duas décadas como uma ferramenta de criação de última geração para expandir a disponibilidade de espermatozoides de touros geneticamente desejáveis ​​(8). No entanto, o avanço do conceito à realidade tem sido limitado, em parte devido à falta de abordagens eficazes para preparar machos receptores de transplante. Para que o transplante de SSC seja implementado na produção de gado, os machos receptores devem carecer completamente da linha germinativa endógena para otimizar o enxerto de SSC e garantir que toda a produção de espermatozoides seja de origem de um doador. Além disso, a função das células somáticas de suporte deve ser mantida nos testículos receptores para fornecer um ambiente que promova a regeneração da espermatogênese normal. Como uma primeira etapa no desenvolvimento de receptores de gado potencialmente ideais, utilizamos anteriormente a edição de genes baseada em CRISPR-Cas9 para criar porcos (raça Duroc) com mutações inativadoras na NANOS2 gene e descobriram que homens homozigotos KO possuem testículos com túbulos seminíferos intactos e produção normal de hormônio, mas ablação completa da linha germinativa, refletindo assim o fenótipo de Nanos2 Camundongos KO (18). Para explorar se um NANOS2 O porco macho KO poderia servir como substituto para a regeneração da espermatogênese do doador após o SSCT, clonamos um macho fundador que possuía 150-bp e 4-bp Δ NANOS2 alelos (javali # 146) usando transferência nuclear de células somáticas. No total, seis clones foram gerados (machos # 132, 133, 134, 135, 136 e 137) e todos foram verificados como nocautes para NANOS2 por genotipagem (Apêndice SI, Fig. S3). Além disso, após a morte do javali # 146, examinamos & gt500 seções transversais do parênquima testicular retiradas de regiões ao longo do testículo e não observamos quaisquer túbulos seminíferos com espermatogênese (Apêndice SI, Fig. S3), confirmando assim o fenótipo da ablação da linha germinativa endógena.

Aos ∼4 meses de idade, um ou ambos os testículos de quatro varrascos (# 132, 134, 135 e 137) foram injetados com uma suspensão de célula única não fracionada de tecido testicular total de um javali alogênico doador do tipo selvagem de raça mista. Um dos machos (# 133) desenvolveu degeneração osteopática e foi morto e outro varrasco (# 136) foi deixado como controle não transplantado. As células do doador foram transferidas para o NANOS2 testes de receptor nocaute usando uma variação da metodologia descrita anteriormente para injeção guiada por ultrassom na rete testis (12) (Fig. 3UMA e Apêndice SI, Tabela S3) no entanto, a infusão bem-sucedida nos túbulos seminíferos não foi observada por imagem de ultrassom. Independentemente disso, na puberdade (∼6 meses de idade), todos NANOS2 Os varrascos KO começaram a coleta de sêmen regularmente para avaliar a presença de células na ejaculação. Semelhante ao fundador e como esperado devido a não observar a infusão da suspensão de células do doador nos túbulos seminíferos, os espermatozoides nunca foram observados nos ejaculados de qualquer NANOS2 Clone KO ao longo de um período de ∼6 meses de coleta, confirmando assim o fenótipo azoospérmico devido à ablação da linha germinativa e transplante de células do doador malsucedido. Então, aos 14 a 15 meses de idade, quatro dos NANOS2 Os varrascos KO (# 132, 134, 135 e 137) foram novamente transplantados com células de doadores de tipo selvagem alogênico (Apêndice SI, Tabela S3). Para o segundo transplante, a suspensão de células testiculares do doador foi enriquecida para espermatogônias indiferenciadas usando uma abordagem multiparâmetros que, com base na imunomarcação para o marcador ZBTB16, consistia em ∼70% de espermatogônias (Apêndice SI, Fig. S4).

Espermatogênese derivada de doador após SSCT alogênico em NANOS2 javalis nocaute. (UMA) Esquema da estratégia experimental. (B) Imagens representativas que retratam a regeneração espermatogênica derivada de doador em um NANOS2 Javali receptor KO (# 135) após SSCT alogênico. (Barras de escala, 10 μm.) (C) Imagem representativa de genotipagem baseada em PCR para NANOS2 alelos com amostras de DNA isoladas de tecido testicular de um tipo selvagem (NANOS2 + / +) varrasco, bem como folículos pilosos, ejaculação total e esperma coletado de um NANOS2 Destinatário KO submetido a SSCT alogênico com células-tronco de um tipo selvagem (NANOS2 + / +) varrasco doador. O peso molecular (MW) é uma escada de DNA de 100 pb. (D) Saídas da análise de sequenciamento de DNA de produtos de genotipagem baseados em PCR mostrando detecção de 4-bp e 150-bp NANOS2 deleção (Δ) alelos de amostras de folículos capilares e intactos NANOS2 alelo de amostras de espermatozóides de um NANOS2 Javali receptor KO submetido a SSCT alogênico com células-tronco de doadores de tipo selvagem. (E) Imagens representativas de cortes transversais corados com hematoxilina e amp eosina de parênquima testicular de NANOS2 Varrascos KO transplantados com SSCs de doadores ou não transplantados. (Barras de escala, 50 μm.) (F) Imagens representativas de cortes transversais corados com hematoxilina e amp eosina de túbulos epididimários de NANOS2 Varrascos KO transplantados com SSCs ou não transplantados. (Barras de escala, 50 μm.)

A partir de 50 dias após o segundo procedimento de transplante, os machos receptores foram novamente submetidos à coleta de sêmen. Semelhante às coleções pré-transplante, nenhuma célula foi observada nos ejaculados (Fig. 3B) No entanto, aos 90 dias pós-transplante, começamos a observar células redondas com uma morfologia nuclear semelhante em aparência aos espermatócitos e espermátides redondas em divisão, conforme descrito no manual da Organização Mundial de Saúde para avaliação de sêmen humano, em dois dos animais transplantados, varrascos # 134 e 135 (Fig. 3B) Então, começando em ~ 100 d pós-transplante, o esperma apareceu na ejaculação do javali transplantado # 135 (Fig. 3B) Além disso, os espermatozoides eram de morfologia normal, móveis (Filme S1) e persistiam na ejaculação por & gt200 d pós-transplante (Fig. 3B) Infelizmente, a saúde do javali # 134 se deteriorou logo após observar células redondas na ejaculação devido à degeneração osteopática que exigiu sua morte. É importante ressaltar que nem células redondas nem espermatozoides foram jamais observados (período de avaliação & gt400-d) na ejaculação do javali não transplantado # 136. Para confirmar que os espermatozoides produzidos nos testículos do macho receptor # 135 eram derivados de SSCs de doadores transplantados, nós os isolamos do ejaculado e realizamos a genotipagem de PCR para o NANOS2 gene. Como esperado, dois produtos de tamanhos diferentes foram gerados por PCR com DNA isolado de folículos capilares do receptor, ambos de tamanho menor em comparação com um amplicon gerado a partir de DNA de um javali tipo selvagem (Fig. 3C), e estes foram confirmados por análise de sequenciamento como sendo mutações Δ de 4-bp e 150-bp (Fig. 3D) É importante ressaltar que a PCR de DNA genômico do espermatozóide isolado gerou um amplicon de tamanho idêntico ao do tipo selvagem (Fig. 3C), que foi confirmado por sequenciamento como intacto NANOS2 alelo (Fig. 3D) Em ∼2 anos após o transplante, o javali # 135 foi morto devido à idade avançada e os espermatozoides foram detectáveis ​​no fluxo epididimal (Fig. 3B) Além disso, a avaliação histológica das secções transversais do testículo revelou que a espermatogênese estava ocorrendo em -15% dos túbulos seminíferos (Fig. 3E), e os espermatozoides foram observados em cortes transversais dos túbulos epididimários (Fig. 3F) Como esperado pela falta de espermatozoides na ejaculação, a espermatogênese não foi detectada em nenhum túbulo seminífero ou secção transversal do epidídimo examinado (n = 400 a 500) para o javali não transplantado # 136 (Apêndice SI, Fig. S5). Coletivamente, esses resultados demonstram que semelhante ao enxerto de SSC de doador alogênico de camundongos e espermatogênese pode ocorrer em testículos de NANOS2 Varrascos receptores KO que são ablacionados da linha germinativa endógena.

Geração de NANOS2 Knockout Bucks e espermatogênese derivada de doador após SSCT alogênico.

Em seguida, pretendemos estender o conceito de SSCT com NANOS2 KO substitutos machos para espécies de ruminantes relevantes para a agricultura. Devido à facilidade de manuseio e ao intervalo de geração relativamente curto em comparação com ruminantes maiores, como o gado, começamos com cabras como modelo. Para gerar NANOS2 Machos KO para fenotipagem e SSCT, transferência nuclear de células somáticas (SCNT) foi usada (19) com o doador de DNA nuclear derivado de fibroblastos fetais XY de cabras machos cruzadas Nubian × Boer que foram modificadas por edição CRISPR-Cas9 para possuir 16 bp e 23-bp NANOS2 Δ alelos (Apêndice SI, Fig. S6). No total, 125 embriões clonados em estágio de uma célula foram gerados e transferidos cirurgicamente para sete receptoras sincronizadas com o estro. Aos 40 a 45 dias de gestação, cinco receptoras foram confirmadas grávidas por ultrassonografia que resultou em cinco NANOS2 bucks mutantes nascendo vivos (buck ID # 901, 902, 904, 905 e 906) e todos desenvolvidos normalmente desde o nascimento até a idade adulta (Fig. 4 UMA e B e Apêndice SI, Tabela S4). Na idade puberal de 4 meses, uma suspensão de uma única célula enriquecida para espermatogônias indiferenciadas (-60% com base na imunocoloração para o marcador ZBTB16, Apêndice SI, Fig. S4) que foi isolado de testículos de um macho doador da raça Lamancha de mesma idade foi transplantado para um ou ambos os testículos de todos NANOS2 KO bucks usando um procedimento de injeção de testículo guiada por ultrassom semelhante ao usado para varrascos (Fig. 4C e Apêndice SI, Tabela S5). No momento do transplante, também foram obtidas biópsias testiculares para avaliação histológica. Idêntico ao fenótipo de NANOS2 Camundongos KO e porcos, os bucks KO continham túbulos seminíferos intactos, mas a linha germinativa não era evidente nas seções transversais testiculares (Fig. 4D), que foi confirmada por imunocoloração indetectável para o marcador espermatogonial ZBTB16 (Fig. 4E) Para avaliar se a espermatogênese derivada de doador estava ocorrendo no NANOS2 KO destinatários após o SSCT, começamos a coletar ejaculados do bucks em ∼80 d após o SSCT. Em ∼85 d após o transplante, as células redondas estavam presentes nos ejaculados de três receptores (buck ID # 901, 902 e 906) e os espermatozoides tornaram-se evidentes a partir de 136 d após o transplante em um buck (buck ID # 902), que nós confirmado foi derivado de SSCs de doadores transplantados por genotipagem para um intacto NANOS2 alelo que estava presente em células derivadas de machos doadores Lamancha (Fig. 4 F e G) Além disso, os espermatozoides eram de morfologia e mobilidade normais (Fig. 4F e Filme S2). Esses achados demonstram inequivocamente que a ablação germinativa NANOS2 Os dólares KO podem servir como recipientes para SSCT alogênico.

Espermatogênese derivada de doador após SSCT alogênico em linha germinativa ablacionada NANOS2 dinheiro nocaute. (UMA) Imagem de cinco NANOS2 Bucks KO gerados por transferência nuclear de células somáticas de fibroblastos fetais de cabra editados pelo gene CRISPR-Cas9. (B) Saídas da análise de sequenciamento de DNA de produtos de genotipagem baseados em PCR mostrando 16-bp e 23-bp NANOS2 alelos de deleção (Δ). (C) Esquema para SSCT em NANOS2 KO bucks. Machos da raça Lamancha pré-púbere (orelha de anão) foram usados ​​como fonte de SSCs doadores. (D) Imagens representativas de cortes transversais corados com hematoxilina e amp eosina de parênquima testicular de WT e NANOS2 KO bucks aos 4 meses de idade. (Barras de escala, 100 μm.) (E) Imagens representativas de coloração imunofluorescente para o marcador espermatogonial ZBTB16 em seções transversais de testículos de tipo selvagem de 4 meses de idade e NANOS2 KO bucks. (Barras de escala, 100 μm.) (F) Imagens representativas de espermátides e espermatozoides nos ejaculados de NANOS2 KO bucks que surgiram 85 a 136 d após o doador SSCT. (Barra de escala, 10 μm.) (G) Imagem representativa de um gel de agarose para visualizar a genotipagem baseada em RFLP para NANOS2 alelos com DNA genômico isolado de espermatozoides em NANOS2 KO buck ejacula e folículos pilosos do tipo selvagem ou NANOS2 KO bucks. A mutação gerada pela edição CRISPR-Cas9 do caprino NANOS2 sequência de DNA genômico removido um BmrI sítio de enzima de restrição presente no DNA de tipo selvagem, tornando assim a sequência resistente à clivagem.

Geração de NANOS2 Gado Knockout.

Por fim, dado o sucesso com as cabras, pretendíamos gerar NANOS2 KO bovinos para determinar se o fenótipo da ablação da linha germinativa masculina específica é conservado em um ruminante maior. Para conseguir isso, a edição CRISPR-Cas9 baseada em eletroporação de embriões produzidos in vitro foi realizada usando metodologia que descrevemos recentemente (16). No total, 32 embriões em estágio de blastocisto foram transferidos para 16 vacas receptoras multíparas sincronizadas com estro, resultando em oito gestações, uma das quais terminou em natimorto prematuro de um bezerro com 8 meses de gestação e duas das quais evoluíram a termo resultando em vida nascimento de um bezerro e um bezerro (Fig. 5UMA e Apêndice SI, Fig. S7 e Tabela S6). Ambos os bezerros nascidos vivos tinham peso normal ao nascer e se desenvolveram de maneira consistente com a fisiologia normal (Apêndice SI, Tabela S7) da mesma forma, o bezerro natimorto tinha peso e tamanho normais para um feto bovino de 8 meses de idade. A análise de genotipagem revelou que o bezerro natimorto prematuro e o bezerro vivo foram NANOS2 KO com ambos possuindo edição bialélica de mutações 11- ou & gt300-bp Δ inativadas, respectivamente (Apêndice SI, Fig. S7). Em corroboração da análise de genotipagem, exame de cortes transversais do parênquima testicular do natimorto NANOS2 O bezerro KO revelou cordões seminíferos intactos e a presença de soma, mas ausência de células germinativas (Fig. 5B), que foi confirmada pela falta de imunocoloração para o marcador de células germinativas conservado DDX4, mas imunocoloração detectável para o marcador de células somáticas de Sertoli SOX9 (Fig. 5C) Curiosamente, a genotipagem de DNA isolado de diferentes linhagens celulares revelou que o bezerro touro nascido vivo foi um mosaico para edição NANOS2 alleles note that mosaicism is a common occurrence in model organisms such as mice and pigs when CRISPR-Cas9 reagents are delivered to zygotes (18, 20). For the blood cell lineage which derives from embryonic mesoderm, genomic DNA sequencing analysis of cloned PCR amplicons (n = 14) detected intact NANOS2 alleles at a frequency of 20% and INDEL mutated alleles detected at a frequency of 80% (Apêndice SI, Fig. S7). In contrast, analysis of genomic DNA from hair follicle cells, which derives form embryonic ectoderm, revealed that 100% of NANOS2 amplicons (n = 16) contained INDEL mutations (Apêndice SI, Fig. S7). To assess the extent of NANOS2 editing in primordial germ cells (PGCs) from which the spermatogenic lineage derives, biopsies of testicular tissue were collected from the mosaic bull calf at 4 months of age. Similar to the stillborn fetal calf, germ cells were undetectable in cross-sections of parenchyma but seminiferous tubules were intact with apparent somatic cells and these observations were confirmed by lacking immunostaining for DDX4 but detectable staining for SOX9 (Fig. 5C) Collectively, these findings solidify that NANOS2 is evolutionarily conserved as a specific regulator of male germline establishment and indicate that CRISPR-Cas9-based inactivation can produce surrogate sires for many, if not all, mammalian species.

Germline ablation in NANOS2 knockout male cattle. (UMA) Pictures of a NANOS2 mosaic bull calf at 2 days, 1 month, and 4 months of age that was generated by CRISPR-Cas9 editing of a bovine zygote and embryo transfer. (B) Representative images of hematoxylin & eosin-stained cross-sections of testicular parenchyma from a WT bull calf at 4 months of age, NANOS2 KO fetal bull calf at 253 d of gestation, and NANOS2 mosaic bull calf at 4 months of age. (Scale bars, 50 μm.) Arrows indicate examples of germ cells in wild-type testes. (C) Representative images of immunohistochemical staining for germ cells (DDX4 + ) or Sertoli cells (SOX9 + ) in cross-sections of testicular parenchyma from a WT bull calf at 4 months of age, NANOS2 KO fetal bull calf at 253 d of gestation, and NANOS2 mosaic bull calf at 4 months of age. (Scale bars, 50 μm.) Arrows indicate examples of DDX4-stained germ cells and SOX9-stained Sertoli cells.


Structure of Formed Sperm

Sperm are smaller than most cells in the body in fact, the volume of a sperm cell is 85,000 times less than that of the female gamete. Approximately 100 to 300 million sperm are produced each day, whereas women typically ovulate only one oocyte per month as is true for most cells in the body, the structure of sperm cells speaks to their function. Sperm have a distinctive head, mid-piece, and tail region. The head of the sperm contains the extremely compact haploid nucleus with very little cytoplasm. These qualities contribute to the overall small size of the sperm (the head is only 5 µm long). A structure called the acrosome covers most of the head of the sperm cell as a “cap” that is filled with lysosomal enzymes important for preparing sperm to participate in fertilization. Tightly packed mitochondria fill the mid-piece of the sperm. ATP produced by these mitochondria will power the flagellum, which extends from the neck and the mid-piece through the tail of the sperm, enabling it to move the entire sperm cell. The central strand of the flagellum, the axial filament, is formed from one centriole inside the maturing sperm cell during the final stages of spermatogenesis.

Figure 5. Sperm cells are divided into a head, containing DNA a mid-piece, containing mitochondria and a tail, providing motility. The acrosome is oval and somewhat flattened.


The Process of Spermatogenesis Explained

The process of spermatogenesis, i.e., the formation of sperms, is an essential part of reproduction in humans and all kinds of animals. In this article, we will learn about where and when spermatogenesis occurs, and what are the stages that the cells need to go through to complete the process.

The process of spermatogenesis, i.e., the formation of sperms, is an essential part of reproduction in humans and all kinds of animals. In this article, we will learn about where and when spermatogenesis occurs, and what are the stages that the cells need to go through to complete the process.

Did You Know?

In humans, spermatogenic cells need to be maintained at around 2°C below the body temperature to function. This is done by the regulation of blood flow and the positioning of the muscles, which keeps the scrotum away from the heat of the body.

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Spermatogenesis can be defined as ‘the process occurring in the male gonad of sexually reproducing organisms, wherein the undifferentiated male germ cells develop into spermatocytes, which then transform into spermatozoa’. Spermatozoa are mature male gametes that are present in organisms which are sexually reproductive, and it is similar to oogenesis in females. Spermatogenesis usually occurs in the seminiferous tubules of the testes in a series of stages, followed by maturation in the epididymis, where they become ready to be passed out as semen along with other glandular secretions. This process begins at puberty due to the actions of the hypothalamus, pituitary gland, and Leydig cells, and the process only ends at death. However, the quantity of sperms reduces gradually with age, eventually leading to infertility.

Purpose of Spermatogenesis

The purpose of spermatogenesis is to create mature male gametes, which can effectively fertilize female gametes in order to form a single-celled organism called a zygote, which eventually leads to cell division and multiplication to form a fetus. Also, to have a healthy offspring, the number of chromosomes must be maintained at a fixed number across the body, for which, failure can lead to abnormalities such as Klinefelter’s syndrome, Down’s syndrome, or abortion of the fetus. Spermatogenesis works to avoid this.

Process of Spermatogenesis

The process of spermatogenesis is very similar in animals and humans. Let us look at each stage of the spermatogenesis process in some detail.

  • Stage 1: The original diploid spermatogonium located in the seminiferous tubules has twice the number of chromosomes, which replicate mitotically in interphase before meiosis 1 to form 46 pairs of sister chromatids.
  • Stage 2: The chromatids exchange genetic information by the process of synapsis, before dividing through meiosis into haploid spermatocytes.
  • Etapa 3: In the second meiosis division, the two new daughter cells further divide themselves into four spermatids, which have unique chromosomes that are half in number to the original spermatogonium.
  • Stage 4: These cells now move through the lumen of the testes to the epididymis, where they mature into four sperm cells by growing microtubules on the centrioles, forming an axoneme, i.e., a basal body, and some of the centrioles elongate to form the tail of the sperm, facilitated by testosterone.

It is important to note that each division in the process is incomplete, and that the cells are always attached to each other by cytoplasm to allow them to mature at the same time. Also, some spermatogonia replicate themselves, rather than change into spermatids, which ensures that the supply of sperms does not run out. Throughout the entire process, spermatogenic cells interact with sertoli cells, which provide nutrition and structural support to them.

Factors Affecting Spermatogenesis

  • The process of spermatogenesis is very sensitive, and can be affected by the slightest change in the levels of hormones such as testosterone produced by the hypothalamus, pituitary gland, and Leydig cells.
  • The process is also very sensitive to changes in temperature.
  • Deficiencies in diet, exposure to strong drugs, alcoholism, and presence of diseases can adversely affect the rate of sperm formation.
  • Stress of oxidation can cause DNA damage to the sperms, leading to problems in fertilization and pregnancy.

The process of spermatogenesis in humans transpire over a time period that is more than two months long. During this time, over 300 million spermatozoa are produced on a daily basis. However, by the end of the process, only around 100 million become mature sperms. It can take another month to transport the new sperms on the ductal system.

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As men age, their sperm may become a little sluggish and their DNA a bit more fragmented. But the factory never closes.


Optimal Environment for Sperm Maturation

Fine-crafted machines need precise environments to ensure proper function. Sperm are incredibly sensitive to alterations in temperature. For proper development, they require an average temperature of approximately 93.5 degrees Fahrenheit. The scrotum is cleverly engineered for temperature control. The outermost layer is thin, stretchy skin specially designed to allow for movement and air cooling. The next layer in is a thin muscular sac called the cremaster muscle that contains and supports the testicle like a hammock. As it relaxes allowing the testicle to hang lower, the cremaster thins out allowing air to cool things off. If the scrotum gets too cold or when the testicle is threatened, the cremaster contracts drawing the delicate organ in towards the body and forms a thicker, more protective layer around it.

Decontamination Systems

As motile cells, sperm generate a significant amount of metabolic bi-product known as reactive oxygen species (ROS). Similar to exhaust that comes out of a car, ROS is the bi-product from the sperm’s engine burning sugars and nutrients to generate energy. Small amounts of ROS help sperm in the process of fertilization, but large amounts of ROS can injure and even kill sperm cells. The body’s natural defense against reactive oxygen species is the release of antioxidants. Antioxidants, such as vitamin C and vitamin E, are typically molecules that contain double-bonded carbon that enables them to easily bond to and neutralize reactive oxygen species.


Espermatogênese

Spermatogenesis occurs in the testes. It takes about two months to produce spermatozoa from a germ cell and consists of three phases:

  • Spermacytogensis: a spermatogonium or unipotent germline stem cell (GSC) is an undifferentiated cell that can only differentiate into one other cell type. This cell remains silent (G0 of the cell cycle) until puberty, although spermatogenesis begins shortly after birth with the production of spermatogonia. Either a GSC produces more of its own type to ensure continued production of spermatozoa, or it divides to produce two primary spermatocytes. Both the original stem cell and its partially differentiated spermatocyte daughter cells are diploid cells – they contain twenty-three chromosome pairs in their nuclei (forty-six chromosomes, as with any somatic cell). The next round of cell division divides the primary spermatocytes into secondary ones, and shares the chromosomes rather than replicating them. Each secondary spermatocyte is haploid and contains twenty-three chromosomes, not twenty-three chromosome pairs.
  • Spermatidogenesis: when the two secondary spermatocytes divide they produce four haploid spermatids.
  • Spermiogenesis: under the influence of the hormone testosterone, the spermatids grow tails (originating from the centrioles). Their inactive DNA (that does not produce proteins) is condensed into chromatin. The Golgi apparatus changes its form and becomes the acrosome the cytoplasm shrinks. Less essential organelles disintegrate and may be the source of nuclear vacuoles. Once spermiogenesis has taken place, spermatids are called spermatozoa. These are mature cells capable of fertilizing a female egg.


Scrotum

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Scrotum, in the male reproductive system, a thin external sac of skin that is divided into two compartments each compartment contains one of the two testes, the glands that produce sperm, and one of the epididymides, where the sperm is stored. The scrotum is a unique anatomical feature of humans and certain other species of land-dwelling mammals. It is continuous with the skin of the lower abdomen and is located directly behind the penis and in front of the anus. The scrotal wall is a thin layer of skin lined with smooth muscle tissue (dartos fascia). The skin contains more pigment than that of surrounding areas and has many sebaceous (oil-producing) glands and sweat glands, as well as some hair. The two compartments of the scrotum are distinguished externally by a middle ridge called the raphe. Internally, the raphe connects to a muscular partition, the septum, which serves to divide the scrotum into its two areas.

The function of the scrotum is to protect the testes and to keep them at a temperature several degrees below the normal body temperature. The scrotum thus protrudes from the body wall: moreover, it contracts from cold, exercise, or sexual stimulation and expands and relaxes when warm. When contracted, it conserves heat while relaxed it is smooth and elongated, permitting the circulation of air that effects cooling. The relatively cool temperature of the scrotum is thought to be important for the production of viable sperm.

The muscle tone of the scrotum becomes weakened and relaxed in older men. In animals whose scrotum is always tight against the body, as in rats, boars, and stallions, the testes are cooled by the intricate blood system that surrounds them. Failure of the scrotum to cool the testes, which occurs during high fevers or, in some animals, during the hot summer months, causes temporary sterility.

Este artigo foi revisado e atualizado mais recentemente por Kara Rogers, Editora Sênior.


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