Em formação

Em que temperatura as células B de mamíferos devem ser armazenadas fora da incubadora?


Estou trabalhando com células B murinas. O protocolo geral é manter as células no gelo para evitar que morram, mas percebi que isso faz com que essas células se agregem e precipitem. Ouvi sugestões de que essas células deveriam ser mantidas apenas em temperatura ambiente. Como posso determinar em quais condições devo manter minhas células?

Eu estava tentando coletar células para prepará-las para estudos de ligação de células a anticorpos e, em seguida, avaliar as células em uma placa de filtro. Normalmente, você os mantém no gelo para interromper o estado metabólico, bem como para evitar a endocitose das moléculas ligadas. No entanto, essa mudança parece causar acomodação. Como você soluciona problemas de temperatura apropriada para processar células e quais são as justificativas científicas usuais para tomar tais decisões.


Para o assentamento, há pouco que você pode fazer, exceto agitação e usar um tubo mais alto e mais fino e um volume de suspensão maior.

Para a aglomeração, entretanto, se a análise permitir, a adição de soro a um [final] de 5% ajudará a desacelerar a aglomeração (em curto prazo). Você também pode filtrar os aglomerados iniciais empurrando as células por um filtro de malha de náilon (eles são feitos especialmente para fluxo - comumente usado com células fixas). Eu analisei células no gelo no escuro provavelmente até 6 horas após a colheita, com pouca mudança na viabilidade, no entanto, isso é obviamente uma prática ruim.


Transporte de células vivas - (14 / dez / 2006)

Hoje, recebi um frasco vivo de células de mamíferos de outro estado dos EUA. Imediatamente coloquei o frasco na incubadora. As células pareciam boas.

Minha pergunta é como as células vivas em cultura são transportadas de um local fora do estado?

Peguei-os por FEDEX regular durante a noite. Isso está correto? As células de mamíferos não devem ser mantidas em incubadora o tempo todo com dióxido de carbono? Eu acho que o envio foi pelo menos por 6 horas ou talvez mais & # 33 As células sobreviverão sem incubação por tanto tempo? Além disso, o frasco foi enchido com o meio até a borda.

210 ml em um T75. Eu removi o excesso de meio após

1 hora de incubação. Estou muito ansioso para ver como as células vão se sair amanhã. Mas estou apenas curioso, se alguém já teve experiência com envio / recebimento / transporte de células de mamíferos para outros estados. Todos nós sabemos como as células congeladas são transportadas - por gelo seco, certo? Que tal células vivas em frascos?
Obrigado.

Você verificou a temperatura do frasco de células vivas quando o recebeu?

Olá, não há problema em transportar células como esta. Eu rotineiramente envio células dessa forma - até mesmo para outros países.

O crescimento das células diminui e, enquanto o frasco estiver cheio, como você descreveu, o pH permanece estável e esse é o fator realmente importante.

Você não deve ter nenhum problema com eles.

Até eu recebi linhagens celulares em frascos T-25 cheios de meio até a borda. A cultura em crescimento é sempre transportada assim.

É mais barato transportar células vivas no frasco do que células congeladas com gelo seco.

Bem, a temperatura definitivamente não era 37 C. Mas talvez como a temperatura ambiente. A questão é: eu pensei que se deixarmos um frasco (por engano esquecendo) fora do capô por algumas horas, as células podem não sobreviver & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 & # 33 Então, talvez, Eu estou errado.

Olá, não há problema em transportar células como esta. Eu rotineiramente envio células dessa forma - até mesmo para outros países.

O crescimento das células fica mais lento e enquanto o frasco estiver cheio como você descreveu, o pH permanece estável e esse é o fator realmente importante.

Você não deve ter nenhum problema com eles.

Isso é algo novo para mim & # 33 e # 33 para outros países? Por quanto tempo as células podem sobreviver a um transporte como este?

Obrigado a todos pelas respostas.

Acho que até 3-4 dias não deve ser um problema.

Esqueça a compra de uma cultura viva em crescimento. SEMPRE SEMPRE SEMPRE compre ampolas / frascos CONGELADOS. São transportados em Cardice e estão sempre em melhores condições.

Recebi células vivas como essa enviadas para mim de fora do país via Fedex. A razão de termos feito isso dessa maneira foi que a Fedex pode tornar muito difícil para as pessoas enviarem gelo seco internacionalmente. Pelo que entendi é que as células podem sobreviver por cerca de uma semana assim. Eu sei que a remessa que recebi levou de 3 a 4 dias para chegar até mim. Eu segui o mesmo procedimento que você fez (1 hora de incubação seguida da remoção do excesso de mídia, deixando 5-10ml no frasco de 25cm2). O que me disseram foi que dentro de um dia as células poderiam ser colhidas. As células se saíram incrivelmente bem (eu tinha bem mais de 5x10 ^ 6 células quando fiz minha primeira contagem). Após o primeiro dia, cultivei as células como faria normalmente e elas têm estado saudáveis ​​e crescendo extremamente bem desde então.


Protocolo de técnicas de cultura de tecidos de células de mamíferos

O que se segue é uma orientação geral para a cultura de linhas celulares. Todas as culturas de células devem ser realizadas em cabine de segurança microbiológica usando técnica asséptica para garantir a esterilidade.

Conteúdo

1) Preparando um ambiente asséptico

Regulamentos do capô

Autoclavagem

  • (a) Pontas de pipeta (ou podem ser adquiridas pré-autoclavadas, sem DNAse / RNAse)
  • (b) Pipetas Pasteur de vidro de 9 "
  • (c) etanol 70% (certifique-se de pulverizar todas as áreas de superfície)

Todos os meios, suplementos e reagentes devem ser estéreis para prevenir o crescimento microbiano na cultura de células. Alguns reagentes e suplementos requerem esterilização por filtro, se não forem fornecidos estéreis.

Assista ao nosso protocolo de vídeo de técnica asséptica para obter diretrizes detalhadas sobre como evitar a contaminação.

2) Preparação do meio de crescimento celular

Antes de iniciar o trabalho, verifique as informações fornecidas com a linha celular para identificar que tipo de mídia, aditivos e recomendações devem ser usados.

A maioria das linhas celulares pode ser cultivada usando meio de cultura DMEM ou meio de cultura RPMI com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM e antibióticos podem ser adicionados se necessário (ver tabela abaixo).

Verifique quais meios de cultura e suplementos de cultura a linha celular que você está usando requer antes de iniciar as culturas. Os meios de cultura e suplementos devem ser estéreis. Compre reagentes estéreis quando possível, use apenas em condições assépticas em uma capela de cultura para garantir que eles permaneçam estéreis.

Exemplo geral usando mídia DMEM

meios de comunicaçãoMedir
DMEM - Retire 50 ml do frasco de 500 ml e adicione os outros constituintes. 450 ml
10% FBS50 ml
Glutamina 2 mM5 ml
100 U de penicilina / 0,1 mg / ml estreptomicina5 ml

3) Criação do ambiente de cultivo correto

A maioria das linhas de células crescerá em frascos de cultura sem a necessidade de matrizes especiais, etc. No entanto, algumas células, particularmente as células primárias, exigirão o crescimento em matrizes especiais, como o colágeno, para promover a fixação, diferenciação ou crescimento celular. Recomendamos revisar a literatura relevante para obter mais informações sobre as células que você está cultivando.

O seguinte é um exemplo para células endoteliais e epiteliais:

Para células humanas, cubra os frascos com 1% de gelatina. Alternativamente, para outros tipos de células, como BAEC, os frascos podem ser revestidos com fibronectina a 1%.

  1. Preparar 10mL de solução de revestimento composta por 1% de gelatina ou 1% de fibronectina diluindo com água destilada, seguida de filtração. Isso é eficiente para revestir cerca de 5 frascos.
  2. Pipete a solução de revestimento para o frasco. Balance para a frente e para trás para distribuir uniformemente o fundo do frasco. Deixe descansar em uma incubadora por 15-30 minutos.
  3. Aspire a solução de revestimento e lave com dH estéril2O antes de ver as células.

4) Verificando células

As células devem ser verificadas microscopicamente diariamente para monitorar a saúde, as taxas de crescimento e a confluência (% da área de superfície coberta com monocamada de células).

As células aderentes devem ser fixadas principalmente ao fundo do frasco, mostrar uma morfologia aderente (dependente da linha celular) e refratar a luz ao redor de sua membrana (consulte as imagens da planilha de dados da linha celular Abcam).

As células em suspensão devem apresentar uma morfologia circular e refratar a luz ao redor de sua membrana. Algumas células em suspensão podem se aglomerar (reagentes de dissociação, como Pluronic PF68, podem ser adicionados para promover a remoção do aglomerado).

A mídia que inclui o vermelho de fenol deve ser rosa / laranja (a cor da mídia pode mudar dependendo do CO2 ambiente). Para aplicação de imagem, mídia sem vermelho de fenol pode ser usada e evitará interferência na aquisição de imagem. Uma cor amarela pálida do meio indicaria uma acidez e diminuição do pH, que geralmente está associada a contaminação ou células prejudiciais à saúde.

  • Eles estão se destacando em grande número (linhas fixas) e / ou parecem enrugados e granulados / escuros na cor.
  • Eles estão em repouso (não parecem estar crescendo).

5) Subcultura

Também conhecido como divisão celular e passagem de células.

Rácios de divisão ou densidades de semeadura podem ser usados ​​para garantir que as células estejam prontas para um experimento em um determinado dia ou manter culturas de células para uso futuro ou como backup. As linhas de células em suspensão são semeadas com base no volume, portanto, as densidades de semeadura serão calculadas como células / mL, enquanto as linhas de células aderentes são semeadas com base na área de superfície do frasco, portanto, serão calculadas como células / cm 2. As linhas de células geralmente requerem densidades de semeadura específicas, portanto, sempre verifique as diretrizes para a linha de células em uso. As células de crescimento lento podem não crescer se uma alta proporção de divisão for usada. As células de crescimento rápido podem exigir uma alta proporção de divisão para garantir que não cresçam demais.

As linhas celulares aderentes podem ser divididas usando razões de divisão específicas da linha celular ou densidades de semeadura (células / cm 2):

  • A divisão 1: 2 deve ser 70-80% confluente e pronta para um experimento em 1 a 2 dias
  • A divisão 1: 5 deve ser 70-80% confluente e pronta para um experimento em 2 a 4 dias
  • A divisão 1:10 deve ser 70-80% confluente e pronta para subcultura ou plaqueamento em 4 a 6 dias.

As razões de divisão são baseadas na área de superfície do frasco, por exemplo:

Frasco de 1 x 25 cm 2 Divisão 1: 3 renderia frascos de 3 x 25 cm 2 ou 1 x 75 cm 2

As linhas de células em suspensão devem ser mantidas usando densidades de semeadura específicas da linha de células (células / mL):

  • 2e5 deve estar pronto para um experimento em 3-4 dias
  • 1e6 deve estar pronto para um experimento em 1-2 dias

Se as células forem deixadas sem supervisão por períodos mais longos (ou seja, fins de semana de feriados bancários), é recomendado usar uma densidade de semeadura / proporção de divisão mais baixa do que o normal.

​6) Protocolo de subcultura aderente (usando reagente de dissociação)

Quando as células estão aproximadamente 80% confluentes (80% da superfície do frasco é coberta por monocamada de células), as células ainda devem estar em sua fase logarítmica de crescimento e exigirão subcultura. Não é recomendado permitir que as células se tornem confluentes, pois isso pode afetar negativamente a expressão gênica e a viabilidade celular.

  1. Remova o meio de cultura de células e o reagente de dissociação da geladeira e coloque em uma incubadora a 37 o C e deixe aquecer a 37 o C.
    - Não deixe a mídia na incubadora por mais tempo do que o necessário, pois os componentes da mídia se degradarão com o tempo.
  2. Ligue e execute uma limpeza básica para seu armário de segurança biológica.
    - Pulverize todos os frascos de mídia, pipetas e tubos de centrífuga com etanol antes de colocá-los no gabinete de segurança biológica.
  3. Sob o gabinete de segurança biológica, remova o meio condicionado e lave suavemente a monocamada de células com DPBS à temperatura ambiente.
    - Adicione cuidadosamente DPBS ao lado do frasco para não desalojar à força as células aderentes.
  4. Remova o DPBS usando uma pipeta sorológica estéril e adicione o reagente de dissociação pré-aquecido (Tripsina-EDTA) ao frasco e coloque em uma incubadora por

7) Subcultura de linhas celulares frouxamente anexadas que requerem raspagem de células para subcultura

  1. Quando estiver pronto, despeje cuidadosamente a mídia do frasco das células necessárias para o recipiente de resíduos (contendo aproximadamente 100 ml de hipoclorito de sódio a 10%), tomando cuidado para não aumentar o risco de contaminação com qualquer gotejamento.
  2. Substitua imediatamente despejando cuidadosamente um volume igual de meio de cultura pré-aquecido no frasco.
  3. Usando o raspador de células, raspe suavemente as células do fundo do frasco para a mídia. Verifique se todas as células saíram inspecionando a base do frasco antes de prosseguir.
  4. Retire a quantidade necessária de suspensão de células para a proporção de divisão necessária usando uma pipeta sorológica.
    por exemplo. para divisão de 1: 2 de 100 ml, coloque 50 ml em um novo frasco
    1: 5 dividido a partir de 100 ml, coloque 20 ml em um novo frasco
    1:10 divisão de 100 ml, coloque 10 ml em um novo frasco
  5. Complete os novos frascos até o volume necessário (levando em consideração a proporção de divisão) com meios de cultura frescos pré-aquecidos
    por exemplo. em frasco de 25 cm 2 aproximadamente 5-10 ml
    Frasco de 75 cm 2 de aproximadamente 10-30 ml
    Frasco de 175 cm 2 de aproximadamente 40-150 ml

8) Subcultura de linhas celulares anexadas que requerem tripsina

Observação - nem todas as células exigirão tripsinização e, para algumas células, pode ser tóxico. Também pode induzir internalização temporária de algumas proteínas de membrana, o que deve ser levado em consideração ao planejar experimentos. Outros métodos, como a raspagem suave das células ou o uso de um detergente muito suave, podem ser usados ​​como um substituto nessas circunstâncias.

  1. Quando estiver pronto, despeje cuidadosamente a mídia do frasco das células necessárias para o recipiente de resíduos (contendo aproximadamente 100 ml de hipoclorito de sódio a 10%), tomando cuidado para não aumentar o risco de contaminação com qualquer gotejamento.
  2. Usando uma técnica asséptica, despeje / pipete PBS estéril suficiente no frasco para lavar as células e se livrar de qualquer FBS no meio de cultura residual. Incline o frasco suavemente algumas vezes para enxaguar as células e despeje / pipete com cuidado o PBS de volta para o recipiente de resíduos.

Isso pode ser repetido mais uma ou duas vezes, se necessário (algumas linhas de células levam muito tempo para tripsinizar e precisarão de mais lavagens para se livrar de qualquer FBS residual para ajudar a tripsinização)

9) Subcultura de linhas de células em suspensão

  1. Verifique as diretrizes para a linha de células quanto à proporção de divisão recomendada ou densidades de células de subcultura.
  2. Retire a quantidade necessária de suspensão de células do frasco usando uma pipeta e coloque em um novo frasco.
    Por exemplo, para divisão 1: 2 de 100 ml de suspensão de células, retire 50 ml
    Para divisão de 1: 5 de 100 ml de suspensão de células, retire 20 ml
  3. Adicione a quantidade necessária de meios de cultura de células pré-aquecidos em um frasco novo.
    por exemplo. Para divisão 1: 2 de 100 ml, adicione 50 ml de meio fresco a 50 ml de suspensão de células
    Para divisão de 1: 5 de 100 ml, adicione 80 ml de meio fresco a 20 ml de suspensão de células

10) Mudança de mídia

Se as células estiverem crescendo bem por alguns dias, mas ainda não estiverem confluentes, elas exigirão uma troca de mídia para reabastecer os nutrientes e manter o pH correto. As células produzem fatores de promoção de crescimento positivos que são secretados em seus meios de comunicação, portanto, pode ser benéfico realizar uma meia mudança de meio para reabastecer os nutrientes fornecidos pelos meios de comunicação e também manter esses fatores de crescimento positivos.

Para mudar o meio, aqueça o meio de cultura a 37 ° C em banho-maria ou incubadora por pelo menos 30 min. Aspire a mídia velha do frasco e substitua a mídia com o volume necessário de meio de cultura pré-aquecido fresco e retorne à incubadora.

11) Número da passagem

O número da passagem é o número de subculturas pelas quais as células passaram. O número da passagem deve ser registrado e não ficar muito alto. Isso evita o uso de células que sofrem derivação genética e outras variações.


A resposta ao choque térmico

A resposta ao choque térmico é uma resposta da célula ao calor intenso, incluindo a regulação positiva das proteínas de choque térmico.

Objetivos de aprendizado

Descreva como a resposta ao estresse bacteriano permite que as bactérias sobrevivam a condições adversas e flutuantes em seus arredores imediatos, como aumentos de temperatura

Principais vantagens

Pontos chave

  • A resposta ao estresse bacteriano permite que as bactérias sobrevivam a condições adversas e flutuantes em seu entorno imediato.
  • Uma célula bacteriana pode reagir simultaneamente a uma ampla variedade de estresses e os vários sistemas de resposta ao estresse interagem uns com os outros por meio de um complexo de redes regulatórias globais.
  • A regulação positiva de HSPs durante o choque térmico é geralmente controlada por um único fator de transcrição em eucariotos, esta regulação é realizada pelo fator de choque térmico (HSF), enquanto σ32 é o fator sigma de choque térmico em Escherichia coli.

Termos chave

A resposta ao estresse bacteriano permite que as bactérias sobrevivam a condições adversas e flutuantes em seu entorno imediato. Vários mecanismos bacterianos reconhecem diferentes mudanças ambientais e montam uma resposta apropriada. Uma célula bacteriana pode reagir simultaneamente a uma ampla variedade de estresses e os vários sistemas de resposta ao estresse interagem entre si por meio de um complexo de redes regulatórias globais.

Em bioquímica, o choque térmico é o efeito de submeter uma célula a uma temperatura mais alta do que a temperatura corporal ideal do organismo do qual a linha celular foi derivada. & # 8221

A resposta ao choque térmico é a resposta celular ao choque térmico que inclui a regulação positiva da transcrição de genes que codificam proteínas de choque térmico (HSPs) como parte do mecanismo de reparo interno da célula. As HSPs também são chamadas de & # 8216proteínas de estresse & # 8217 e respondem à privação de calor, frio e oxigênio ativando várias vias em cascata. HSPs também estão presentes nas células em condições perfeitamente normais. Algumas HSPs, chamadas de & # 8216chaperonas & # 8217, garantem que as proteínas da célula & # 8217s estejam na forma certa e no lugar certo na hora certa. Por exemplo, as HSPs ajudam proteínas novas ou mal dobradas a se dobrarem em suas conformações tridimensionais corretas, o que é essencial para sua função. Eles também transportam proteínas de um compartimento para outro dentro da célula e direcionam proteínas velhas ou mal dobradas terminalmente para proteases para degradação. Além disso, acredita-se que as proteínas de choque térmico desempenham um papel na apresentação de pedaços de proteínas (ou peptídeos) na superfície celular para ajudar o sistema imunológico a reconhecer as células doentes. A regulação positiva de HSPs durante o choque térmico é geralmente controlada por um único fator de transcrição em eucariotos, esta regulação é realizada pelo fator de choque térmico (HSF), enquanto σ32 é o fator sigma de choque térmico em Escherichia coli.

Proteínas de choque térmico: Proteína de choque térmico vem em vários tamanhos. Este é um exemplo de pequenas proteínas de choque térmico produzidas por variantes clonais de Pseudomonas aeruginosa isoladas de diversos nichos.


Temperatura, CO2 e pH em meio de cultura celular

A maioria, mas não todos, os meios de cultura de células contêm tampões à base de carbonato que funcionam com níveis elevados de dióxido de carbono gasoso na incubadora para estabilizar o pH da cultura de células (veja a figura). Tampões à base de carbonato estão presentes na Vivo e assim parece uma escolha óbvia para condições de incubação fisiologicamente relevantes. No entanto, os tampões à base de carbonato podem criar condições não ideais para culturas durante o manuseio da cultura de células fora da incubadora. Os parâmetros críticos da célula de temperatura e níveis de dióxido de carbono podem afetar a mídia de célula tamponada com carbonato. Continue lendo para aprender sobre a importância de ter um meio de crescimento de cultura de células durante a incubação.

O básico & # 8211 Isso é laranja vermelho o suficiente?

O pH adequado é fundamental para a função celular. Além dos transportadores de membrana acionados por prótons nas membranas celulares e organelas, as interações adequadas entre proteínas e lipídios dependem das cargas atômicas e moleculares disponíveis.

Os meios são freqüentemente formulados com vermelho de fenol como um indicador de pH de fácil visualização. Estas soluções têm uma cor amarela com pH igual ou inferior a 6,8. A cor fica mais vermelha, então mais rosa conforme o pH aumenta e um fúcsia brilhante acima de pH 8,2. Geralmente, uma cor laranja-avermelhada indica condições de pH saudáveis ​​para o crescimento celular de mamíferos, pH 7,0 - 7,7. É rapidamente óbvio para o cultivador de células que algo está errado com a cultura se a cor for amarelo brilhante (muito ácido) ou fúcsia (muito alcalino).

O pH da cultura de células pode sair dos intervalos ideais em culturas estáticas na incubadora por vários motivos. Um dos motivos é o acúmulo de metabólitos metabólicos ácidos por culturas que se tornaram muito densas ou por muito tempo nesse meio. A cultura em baixos níveis de oxigênio também pode favorecer a produção de ácido lático pelas células, o que reduzirá o pH da cultura. A contaminação por bactérias ou fungos de crescimento rápido pode rapidamente tornar a mídia amarela.

No outro extremo da faixa, os meios de cultura que foram armazenados na geladeira por um mês ou mais podem aumentar o pH o suficiente para virar fúcsia. Se o tanque de CO2 que alimenta a incubadora acabar, o meio da célula também ficará fúcsia.

O pH pode mudar durante o manuseio da célula de ar da sala devido ao CO2 e mudanças de temperatura

Tampões à base de carbonato na mídia são formulados para um CO específico2 nível de gás na incubadora. Os usuários devem consultar o fabricante do meio para obter informações e certificar-se de que as configurações da incubadora e do meio correspondem.

O pH da incubação é controlado pelo alto CO2 níveis na incubadora (5% ou mais), mas o ar ambiente é muito mais baixo em CO2 (Menos de 1%). Isso deixa as células cultivadas em meio tamponado à base de carbono expostas às mudanças de pH durante o manuseio das células no BSC de ar ambiente.

A água tem uma constante de dissociação que diminui com a diminuição da temperatura, ao contrário dos buffers à base de carbonato. As mudanças de temperatura durante o manuseio da célula no ar ambiente mais frio significam um componente adicional para as oscilações de pH.

Manter células e mídia em incubação CO2 e CO fisiológico constante2 e temperaturas tanto quanto possível para melhor controle de pH.

Capacidade tampão adicional para manipulação de células no ar ambiente

A adição de tampões auxiliares, como o ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfônico (HEPES), é uma abordagem comum para tentar adicionar mais capacidade tampão para o manuseio de células no ar ambiente. HEPES tem uma constante de dissociação que cai com a queda da temperatura, semelhante à água. Isso o torna mais compatível com um ambiente mais frio fora da incubadora e mais capaz de manter a função da proteína em um meio aquoso do que os tampões à base de carbonato [1]. No entanto, o tampão HEPES pode gerar espécies reativas tóxicas de oxigênio em combinação com triptofano e outros componentes do meio se o meio não estiver protegido da luz [2]. Se você usar tampão HEPES, mantenha os frascos médios armazenados cobertos com papel alumínio para protegê-los da luz. Se possível, evite o uso de HEPES completamente.

Um BSC padrão em temperatura ambiente é um ambiente hostil para culturas de células. Minimizar o tempo que as culturas de células passam fora das condições ideais é essencial. Prepare todos os materiais e equipamentos necessários antes de retirar as culturas de células. Aqueça apenas os meios de comunicação necessários à temperatura de incubação. Devolva o restante ao armazenamento refrigerado.

Use um espaço de manipulação de células com controle de temperatura e gás

O uso de um espaço de trabalho de cultura de células com temperatura controlada e gás, como uma câmara de hipóxia ou um isolador de barreira, é de longe a melhor maneira de manter as culturas de células em seu ambiente ideal durante as manipulações. Com a otimização em tempo integral das condições, as culturas de células não são expostas às oscilações de pH das culturas durante o manuseio de células no ar ambiente.

Se você tiver alguma dúvida ou feedback sobre os meios de cultura de células, entre em contato conosco aqui no Cytocentric Blog.

1. Baicu SC, Taylor MJ. Tampão ácido-base em soluções de preservação de órgãos em função da temperatura: novos parâmetros para comparar a capacidade e eficiência do tampão. Criobiologia. 200245 (1): 33-48.

2. Zigler JS, Jr., Lepe-Zuniga JL, Vistica B, Gery I. Análise dos efeitos citotóxicos do meio de cultura contendo HEPES exposto à luz. In Vitro Cell Dev Biol. 198521 (5): 282-7.


Resultados

Taxas de aquecimento medidas

As taxas medidas de aquecimento alcançadas em frascos pelos diferentes protocolos experimentais são mostradas na Fig. & # X000a0 2. As taxas de aquecimento medidas entre & # x0221280 & # x02009 & # x000b0C e 0 & # x02009 & # x000b0C variam de uma média de 113 & # x02009 & # x000b1 & # x0200937 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 & # x022121 & # x02009b & # x02009b & # x02009b & # x02009b & # x002009 min & # x022121 nos banhos-maria 95 & # x02009 & # x000b0C e 37 & # x02009 & # x000b0C, respectivamente, para 6,2 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.5 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 para amostras no ar e # 1,6 & # 1.6 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 em amostras descongeladas em poliestireno. Em todos os casos, as taxas de aquecimento são observadas como não lineares com o tempo. Amostras descongeladas no banho de água 95 & # x02009 & # x000b0C aquecidas a uma taxa média de 293 & # x02009 & # x000b1 & # x0200929 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 entre & # x0221280 & # x0200912 & # x200940 & # x200940 & # x000b0C, e somente 39 & # x02009 & # x000b1 & # x0200923 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 entre & # x0221210 & # x02009 & # x000b0C e & # x022121 & # x02009 & # x000b0C. Isso se compara a uma taxa média de 6,4 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.4 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 entre & # x0221280 & # x02009 & # x000b0C e & # x0221240 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 entre & # x0221280 & # x02009 & # x000b0C e & # x0221240 & # x02009 & # x000b0C # x000 x020090.03 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 entre & # x0221210 & # x02009 & # x000b0C e & # x022121 & # x02009 & # x000b0C quando a inserção de poliestireno foi usada.

Temperaturas medidas em criotubos (preenchimento de 1 e # x02009mL) durante vários protocolos de aquecimento (linha sólida cinza). As taxas de aquecimento entre & # x0221280 & # x02009 & # x000b0C e 0 & # x02009 & # x000b0C foram 113 & # x02009 & # x000b1 & # x0200937 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 e 45 & # x02009 & # x000b22 & # x02009 & # x000b2 & # x000b221 x0200937 & # x0200937 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 & # x00022 & # x000b22 & # x000b221 os banhos de água 95 & # x02009 & # x000b0C e 37 & # x02009 & # x000b0C, respectivamente, 6,2 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.5 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 para amostras descongeladas ao ar e # x0200901 & 1.6 & # x02009 & # x020090.5 & # x02009 & # x000b0C. 1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 em amostras descongeladas em poliestireno. Esses perfis foram emulados usando o criomicroscópio (linha tracejada preta) para visualizar quaisquer alterações na estrutura do gelo durante o aquecimento em frascos. O gráfico de inserção mostra a massa total de um sistema DMSO a 10% no estado líquido a qualquer temperatura dada, derivado de 43.

Estrutura e quantidade do gelo

Um criomicroscópio foi empregado para examinar a estrutura do gelo e as mudanças na estrutura do gelo seguindo diferentes combinações de taxas de resfriamento e aquecimento. As taxas de aquecimento usadas nos estudos de criomicroscopia são os perfis não lineares medidos em criotubos (Fig. & # X000a0 2). Como pode ser visto na Fig. & # X000a0 3, para o protocolo de criopreservação padrão de resfriamento em 1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 e descongelamento em um banho de água a 37 & # x02009 & # x000b0C, mudanças na estrutura do gelo ocorrem durante o ciclo de resfriamento , mas há pouca mudança aparente no aquecimento, até que ocorra o descongelamento completo da amostra. Isso também é verdadeiro para amostras resfriadas a 10 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 e aquecidas em banho-maria. Amostras resfriadas a 10 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121, mas aquecidas muito lentamente em poliestireno, exibem mudança substancial na estrutura do gelo durante o aquecimento. As amostras resfriadas a 0,1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 têm uma estrutura de cristal de gelo muito maior após o resfriamento, mas a estrutura de gelo não foi modificada durante o aquecimento em qualquer condição de aquecimento. Vídeos de criomicroscopia estão incluídos nas Informações Suplementares.

Estrutura do gelo e mudanças observadas durante o ciclo de aquecimento. Cada um dos três conjuntos mostra taxas de resfriamento diferentes (10 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121, 1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 e 0,1 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 de cima para baixo, respectivamente). As três imagens superiores em cada conjunto mostram a estrutura de gelo ao atingir & # x02212100 & # x02009 & # x000b0C, e as três imagens inferiores mostram a estrutura de gelo pouco antes do derretimento (em aproximadamente & # x022125 & # x02009 & # x000b0C). Em cada conjunto foram realizados três perfis de aquecimento diferentes. Da esquerda para a direita muito lento (em poliestireno), padrão (em banho-maria a 37 & # x02009 & # x000b0C) e degelo rápido (em banho-maria a 95 & # x02009 & # x000b0C). As mudanças na estrutura do gelo são mostradas pela seta vermelha. A barra de escala indica aproximadamente 100 & # x003bcm, com cada imagem mostrada na mesma escala.

Calorimetria de varredura diferencial (DSC)

Durante o resfriamento, a cristalização de gelo do CryoStor10 foi visualizada por DSC como um evento exotérmico liberando calor, resultando, portanto, em um fluxo de calor medido por DSC (& # x00394Hc na Tabela & # x000a0 1), enquanto o derretimento do gelo ocorrendo durante o aquecimento apareceu como esperado como um evento endotérmico (& # x00394Hm na Tabela & # x000a0 1). A diferença entre os fluxos de calor associados a ambos os eventos (& # x00394Hm & # x02009 & # x02212 & # x02009 & # x00394Hc) informa sobre um desvio potencial do comportamento de congelamento de equilíbrio da amostra. Os valores positivos indicam uma maior quantidade de derretimento de gelo do que cristalizou durante o resfriamento, sugerindo recristalização durante o aquecimento. Aqui, as taxas de resfriamento de 10 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 ou abaixo, seguidas por 10 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 descongelamento resultou em & # x00394Hm & # x02009 & # x02212 & # x02009 & # x00394Hc e valores próximos de zero ) Ao aumentar a taxa de resfriamento para 100 e 150 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121, foi observado um aumento gradual de & # x00394Hm & # x02009 & # x02212 & # x02009 & # x00394Hc. A diferença de fluxo de calor atingiu cerca de 10 & # x02009J & # x02009g & # x022121 para taxas de resfriamento de 150 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 e taxas de descongelamento entre 10 e 2 & # x02009 & # x000b0C min & # x022121 (sem diferenças significativas entre cotações, p-valor & # x02009 = & # x020090.98), Este resultado indica um desvio significativo do comportamento de congelamento de equilíbrio e sugere que alguma água que não cristalizou durante o resfriamento rápido pode recristalizar durante o descongelamento.

Tabela 1

Resumo dos eventos térmicos observados por DSC de amostras CryoStor10 após congelamento e descongelamento em diferentes taxas de resfriamento e aquecimento: temperaturas de transição vítrea (Tg1) e temperatura de amolecimento (Tg2), calor de cristalização (& # x00394Hc), calor de fusão (& # x00394Hm). Letras sobrescritas indicam contrastes estatísticos entre as médias para as diferentes taxas de resfriamento e aquecimento aplicadas a um nível de confiança de 95%.

Taxa de resfriamento (& # x000b0C min & # x022121)Taxa de aquecimento (& # x000b0C min & # x022121)Tg1 (& # x000b0C)Tg2 (& # x000b0C)& # x00394Hc (J g & # x022121)& # x00394Hm (J g & # x022121)& # x00394Hm & # x02009 & # x02212 & # x02009 & # x00394Hc (J g & # x022121)
2, 510& # x02212121.0 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.6 a & # x0221272.9 & # x02009 & # x000b1 & # x020093.4 a 155,4 & # x02009 & # x000b1 & # x020093.6 ab 157,4 & # x02009 & # x000b1 & # x020094.2 a 2.1 & # x02009 & # x000b1 & # x020094.1 ab
1010& # x02212121.3 & # x02009 & # x000b1 & # x020092.1 a & # x0221270.6 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.8 ab 156,9 & # x02009 & # x000b1 & # x020094.3 a 157,4 & # x02009 & # x000b1 & # x020093.6 a 0,5 & # x02009 & # x000b1 & # x020094.0 a
10010& # x02212122.4 & # x02009 & # x000b1 & # x020092.4 a & # x0221268.1 & # x02009 & # x000b1 & # x020092.1 b 153.1 e # x02009 & # x000b1 & # x020093.2 ab 157,4 & # x02009 & # x000b1 & # x020093.2 a 4,4 e # x02009 e # x000b1 e # x020092,6 ac
15010& # x02212122.6 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.2 a & # x0221268.1 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.9 b 149,9 e # x02009 e # x000b1 e # x020092,8 ab 159,6 & # x02009 & # x000b1 & # x020093.6 a 9,7 e # x02009 e # x000b1 e # x020095.1 bc
1502, 5& # x02212122.7 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.7 a & # x0221269.3 & # x02009 & # x000b1 & # x020091.8 ab 148,8 & # x02009 & # x000b1 & # x020096.3 b 160,0 & # x02009 & # x000b1 & # x020094.0 a 11.1 e # x02009 & # x000b1 & # x020096.7 c

Após o aquecimento, dois eventos endotérmicos fracos (explicados pela composição complexa e baixas concentrações) foram identificados a partir da primeira derivada do fluxo de calor em cerca de & # x02212120 & # x02009 & # x000b0C (Tg1) e & # x0221270 & # x02009 & # x000b0C (Tg2) (Tabela & # x000a0 1 e picos na Fig. & # X000a0 4). Eles correspondem à temperatura de transição vítrea da fase de congelamento concentrado e à temperatura de amolecimento, respectivamente 32. No entanto, nenhum pico exotérmico correspondente ao evento de recristalização do gelo foi identificado durante o descongelamento (Fig. & # X000a0 4). Nenhuma influência significativa das taxas de resfriamento ou aquecimento pode ser observada na Tg1 (p-value & # x02009 & # x0003e & # x020090.5, Table & # x000a0 1 e Fig. & # x000a0 4). Slight shifts of Tg2 values were observed when the cooling rate was increased or the thawing rate was decreased. However, the low Tg2 signals observed at low thawing rates limit any further interpretation (Fig.  4 ).

First derivatives of heat flow traces of CryoStor10 obtained by DSC following cooling at 150 ଌ min 𢄡 and thawing at different rates from 2 to 10 ଌ min 𢄡 . Both endothermic events at approximately � ଌ and � ଌ represent the glass transition temperature (Tg1) and the softening temperature (Tg2), respectively.

Viability tests

Trypan blue viability assays shown in Supplementary Materials Fig.  S2A show that samples cooled at 0.1 ଌ min 𢄡 or 10 ଌ min 𢄡 had significantly (p-values <𠂐.05 and π.01, respectively) lower viability compared with 1 ଌ min 𢄡 cooling when thawed in polystyrene. In addition, samples cooled at 0.1 ଌ min 𢄡 had a significantly higher viability compared with 1 ଌ min 𢄡 cooling when thawed in a 95 ଌ water bath (p-value <𠂐.05). No significant differences were seen with any other warming profile compared to the 1 ଌ min 𢄡 cooling condition. Very poor (㱀%) viability was seen in samples which were plunged into LN2 directly (159 ଌ min 𢄡 ) therefore the data is not shown.

Using live/dead aqua staining for phenotype analysis Supplementary Fig.  S2B shows samples cooled at 10 ଌ min 𢄡 had significantly worse outcome when thawed in air (p-value <𠂐.01) and polystyrene (p-value <𠂐.05) compared with samples cooled at 1 ଌ min 𢄡 , and no significant difference was seen in any other data sets when comparing to the 1 ଌ min 𢄡 cooling condition. Very poor (ς%) viability was seen in samples which were rapidly frozen (cooled at 159 ଌ min 𢄡 ) therefore the data is not shown here.

Viable cell number

Figure  5 shows the viable cell number immediately post thaw of samples cooled and thawed at different rates, the data is normalised against a standard cryopreservation protocol run on eight different days (Supplementary Materials Fig.  S1 ). For samples thawed in a 37 ଌ water bath there is no significant difference between the data sets at each of the cooling rates tested. The most noteworthy result was from samples cooled at 10 ଌ min 𢄡 which resulted in significantly worse outcome when thawed in air (p-value <𠂐.05) or polystyrene (p-value <𠂐.01) compared with those cooled at 1 ଌ min 𢄡 . Samples thawed in a 95 ଌ water bath had significantly (p-value <𠂐.01) better post thaw viable cell numbers when cooled at 0.1 ଌ min 𢄡 compared with cooling at 1 ଌ min 𢄡 .

Normalised viable cell numbers achieved at each cool/thaw condition tested. Normalised viable cell number =𠂚verage (viable cell number/average run control viable cell number). Error bars represent the standard deviation of five replica thaws for the majority of the data shown. Error bars represent the standard deviation of ten replica thaws when cooling at 0.1 ଌ min 𢄡 and thawing in polystyrene and in a 95 ଌ water bath. Error bars represent the standard deviation of seven replica thaws when cooling at 1 ଌ min 𢄡 and thawing in a 95 ଌ water bath. The 95 ଌ water bath data has a dashed line to represent that an inverse trend was observed compared to all other trend lines.

Average and normalized proliferation

Figure  6 shows that proliferation four days after thaw was not affected by either cooling rates or warming rates – no significant differences were seen. However, more intra-experimental variation was seen in proliferation studies as highlighted in Fig.  S1 .

Normalised proliferation results achieved at each freeze/thaw condition tested. Normalised proliferation =𠂚verage (percentage proliferation/average run control percentage proliferation). Error bars represent the standard deviation of five replica thaws for the majority of the data shown. Error bars represent the standard deviation of ten replica thaws when freezing at 0.1 ଌ min 𢄡 and thawing in a 95 ଌ water bath. Error bars represent the standard deviation of seven replica thaws when freezing at 1 ଌ min 𢄡 and thawing in a 95 ଌ water bath.

Phenotype assessment

For all conditions tested in this study (except for those which were plunged into LN2 at 159 ଌ min 𢄡 , resulting in too few live cells to be successfully processed), it was found that the phenotype of the cells before cryopreservation and after warming matched with 㺕% CD3 positive cells. Therefore, the detrimental impact on viable cell number observed at particular conditions in this study had no impact on the cell phenotype profile.

Comparison against literature

In Fig.  7 we replot literature values of the effect of warming rate on the viability of somatic mammalian cells following either slow or rapid cooling. At slow rates of cooling (Fig.  7A ) there was very little effect of warming rate on survival for T cells redrawn from Fig.  6 and CHO cells, with L cells viability was reduced by 36% when the warming rate was reduced from 200 ଌ min 𢄡 to 1 ଌ min 𢄡 , at a slower rate (0.3 ଌ min 𢄡 ) there was a further 20% reduction in viability. With lymphocytes cooled at an intermediate rate of cooling (2.7 ଌ min 𢄡 ) viability was reduced by 17% when the warming rate was reduced from 100 ଌ min 𢄡 to 2 ଌ min 𢄡 at slower rates (1 ଌ min 𢄡 ), there was significant reduction in viability and at a rate of 0.5 ଌ min 𢄡 no viable cells were recovered.

Literature values showing the effect of different rates of warming following either (uma) Slow cooling L cells following cooling at 1 ଌ min 𢄡 (♦) 25 , CHO cells following cooling at 1.7 ଌ min 𢄡 (▪) 24 , lymphocytes following cooling at 2.7 ଌ min 𢄡 (▲) 12 and T cells following cooling at 1 ଌ min 𢄡 (●) (this paper) or (b) Rapid cooling L cells following cooling at 10 ଌ min 𢄡 (♦) 25 , CHO cells following cooling at 100 ଌ min 𢄡 (▪) 24 and T cells following cooling at 10 ଌ min 𢄡 (●) (this paper).

Following rapid cooling rates (Fig.  7B ) the viability of T cells and CHO cells was significantly reduced at slow rates of warming. With L cells the influence of warming rate following fast cooling was very similar to that observed following slow cooling.

Scale-Up

Conventional cryovials used in the study are manufactured from polypropylene, whilst new vials and bags are manufactured from Cyclic Olefin Copolymer (COC) and Ethylene vinyl acetate (EVA), respectively. Values of typical wall thickness and heat conductivity are shown in Table  2 . Bags are expected to thaw faster than cryovials as they have a larger surface area to volume ratio and thinner walls aiding thermal conductivity.

Mesa 2

Some physical properties of the wall materials of conventional cryovials (polypropylene), Aseptic Technologies cryovials (COC), CellSeal vials (COC) West Pharma (COC), cryobags (EVA) and aluminium cassettes.

Wall materialThermal conductivity, (approx.)Wall ThicknessRelative conductivity (1)
Polypropylene0.15 W m 𢄡 K 𢄡 1.0 mm1
Cyclic olefin copolymer (COC)0.13 W m 𢄡 K 𢄡 1.0 mm0.9
Ethylene-vinyl acetate (EVA)0.25 W m 𢄡 K 𢄡 0.3 mm (without overwrap)5.6
Ethylene-vinyl acetate (EVA)0.25 W m 𢄡 K 𢄡 0.6 mm (with overwrap)2.8
Aluminium200 W m 𢄡 K 𢄡 variávelTypically 𾄀

The relative conduction rates relative to a polypropylene cryovial have been calculated during thawing, i.e. a value of 2 indicates that heat will conduct twice as fast through the wall, and 0.5 half as fast.


Células primárias vs. linhas celulares

Linhas de células contínuas adquiriram a capacidade de proliferar indefinidamente (imortalizadas) por meio de mutação aleatória como em linhas de células de câncer transformadas, ou por modificação deliberada, como expressão artificial de genes de câncer. As linhas de células contínuas são geralmente mais robustas e fáceis de trabalhar do que as células primárias. Eles têm potencial de crescimento ilimitado e são uma maneira rápida e fácil de obter informações básicas. Algumas desvantagens de trabalhar com linhas de células contínuas é que elas são geneticamente modificadas / transformadas, o que pode alterar as propriedades fisiológicas e não representar o na Vivo estado, e isso pode mudar ainda mais com o tempo com passagens extensas.


Thawing Cells

Introdução

The 293FT Cell Line is supplied in a vial containing 1 x 10 7 cells in 1 ml of Freezing Medium. Store frozen 293FT cells in liquid nitrogen until ready to use.

Handle as potentially biohazardous material under at least Biosafety Level 2 containment. This product contains Dimethyl Sulfoxide (DMSO), a hazardous material. Review the Material Safety Data Sheet before handling.

Thawing Cells

Use the following procedure to thaw 293FT cells to initiate cell culture. Thaw cells in prewarmed, complete medium without Geneticin.

  1. Remove the vial of frozen cells from liquid nitrogen and thaw quickly in a 37°C water bath.
  2. Just before the cells are completely thawed, decontaminate the outside of the vial with 70% ethanol, and transfer the cells to a sterile 15 ml tube containing PBS. Briefly centrifuge the cells at 150-200 x g and resuspend the cells in 2 ml complete medium without Geneticin.
  3. Transfer the cells to T-75 cm2 flask containing 10 ml of complete medium without Geneticin.
  4. Incubate the flask overnight at 37°C for allowing the cells to attach to the bottom of the flask.
  5. The next day, aspirate off the medium and replace with fresh, complete medium containing 500 μg/ml Geneticin.
  6. Incubate the cells and check them daily until the cells are 80-90% confluent.
  7. Proceed to Subculturing Cells

We recommend subculturing cells for a minimum of 3 passages after thawing before use in other applications.


Resultados

The Dynabeads Untouched Human T Cells Kit was used to prepare isolated T cells that were 95% viable as determined by the Countess II FL Automated Cell Counter (Figure 2).

These isolated T cells were then activated and expanded with Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28. This process could be easily monitored by viewing the flask of T cells and beads on the EVOS XL Core Imaging System without disturbing the cells or the activation process (Figures 3 and 4).

Figure 2. Viability and concentration of isolated T cells determined using the Countess II FL Automated Cell Counter. T cells isolated with the Dynabeads Untouched Human T Cells Kit were 95% viable.

Viability and concentration of the activated T cells were measured on the Countess II FL Automated Cell Counter. Beads were excluded from the cell count by increasing the size threshold using the gating feature of the instrument software. Viability of the activated T cells could be determined even in the presence of beads (Figure 5).


Conteúdo

Spermatogenesis produces mature male gametes, commonly called esperma but more specifically known as espermatozóide, which are able to fertilize the counterpart female gamete, the oocyte, during conception to produce a single-celled individual known as a zygote. This is the cornerstone of sexual reproduction and involves the two gametes both contributing half the normal set of chromosomes (haploid) to result in a chromosomally normal (diploid) zygote.

To preserve the number of chromosomes in the offspring – which differs between species – one of each gamete must have half the usual number of chromosomes present in other body cells. Otherwise, the offspring will have twice the normal number of chromosomes, and serious abnormalities may result. In humans, chromosomal abnormalities arising from incorrect spermatogenesis results in congenital defects and abnormal birth defects (Down syndrome, Klinefelter syndrome) and in most cases, spontaneous abortion of the developing foetus.

Spermatogenesis takes place within several structures of the male reproductive system. The initial stages occur within the testes and progress to the epididymis where the developing gametes mature and are stored until ejaculation. The seminiferous tubules of the testes are the starting point for the process, where spermatogonial stem cells adjacent to the inner tubule wall divide in a centripetal direction—beginning at the walls and proceeding into the innermost part, or lumen—to produce immature sperm. [2] Maturation occurs in the epididymis. The location [Testes/Scrotum] is specifically important as the process of spermatogenesis requires a lower temperature to produce viable sperm, specifically 1°-8 °C lower than normal body temperature of 37 °C (98.6 °F). [6] Clinically, small fluctuations in temperature such as from an athletic support strap, causes no impairment in sperm viability or count. [7]

For humans, the entire process of spermatogenesis is variously estimated as taking 74 days [8] [9] (according to tritium-labelled biopsies) and approximately 120 days [10] (according to DNA clock measurements). Including the transport on ductal system, it takes 3 months. Testes produce 200 to 300 million spermatozoa daily. [11] However, only about half or 100 million of these become viable sperm. [12]

The entire process of spermatogenesis can be broken up into several distinct stages, each corresponding to a particular type of cell in humans. In the following table, ploidy, copy number and chromosome/chromatid counts are for one cell, generally prior to DNA synthesis and division (in G1 if applicable). The primary spermatocyte is arrested after DNA synthesis and prior to division.

Tipo de célula ploidy/chromosomes in human DNA copy number/chromatids in human Process entered by cell
spermatogonium (types Ad, Ap and B) diploid (2N) / 46 2C / 46 spermatocytogenesis (mitosis)
espermatócito primário diploid (2N) / 46 4C / 2x46 spermatidogenesis (meiosis I)
two secondary spermatocytes haploid (N) / 23 2C / 2x23 spermatidogenesis (meiosis II)
four spermatids haploid (N) / 23 C / 23 espermiogênese
four functional spermatozoids haploid (N) / 23 C / 23 spermiation

Spermatocytogenesis Edit

Spermatocytogenesis is the male form of gametocytogenesis and results in the formation of spermatocytes possessing half the normal complement of genetic material. In spermatocytogenesis, a diploid spermatogonium, which resides in the basal compartment of the seminiferous tubules, divides mitotically, producing two diploid intermediate cells called primary spermatocytes. Each primary spermatocyte then moves into the adluminal compartment of the seminiferous tubules and duplicates its DNA and subsequently undergoes meiose I to produce two haploid secondary spermatocytes, which will later divide once more into haploid spermatids. This division implicates sources of genetic variation, such as random inclusion of either parental chromosomes, and chromosomal crossover that increases the genetic variability of the gamete. The DNA damage response (DDR) machinery plays an important role in spermatogenesis. The protein FMRP binds to meiotic chromosomes and regulates the dynamics of the DDR machinery during spermatogenesis. [13] FMRP appears to be necessary for the repair of DNA damage.

Each cell division from a spermatogonium to a spermatid is incomplete the cells remain connected to one another by bridges of cytoplasm to allow synchronous development. Not all spermatogonia divide to produce spermatocytes otherwise, the supply of spermatogonia would run out. Instead, spermatogonial stem cells divide mitotically to produce copies of themselves, ensuring a constant supply of spermatogonia to fuel spermatogenesis. [14]

Spermatidogenesis Edit

Spermatidogenesis is the creation of spermatids from secondary spermatocytes. Secondary spermatocytes produced earlier rapidly enter meiosis II and divide to produce haploid spermatids. The brevity of this stage means that secondary spermatocytes are rarely seen in histological studies.

Spermiogenesis Edit

During spermiogenesis, the spermatids begin to form a tail by growing microtubules on one of the centrioles, which turns into basal body. These microtubules form an axoneme. Later the centriole is modified in the process of centrosome reduction. [15] The anterior part of the tail (called midpiece) thickens because mitochondria are arranged around the axoneme to ensure energy supply. Spermatid DNA also undergoes packaging, becoming highly condensed. The DNA is packaged firstly with specific nuclear basic proteins, which are subsequently replaced with protamines during spermatid elongation. The resultant tightly packed chromatin is transcriptionally inactive. The Golgi apparatus surrounds the now condensed nucleus, becoming the acrosome.

Maturation then takes place under the influence of testosterone, which removes the remaining unnecessary cytoplasm and organelles. The excess cytoplasm, known as residual bodies, is phagocytosed by surrounding Sertoli cells in the testes. The resulting spermatozoa are now mature but lack motility. The mature spermatozoa are released from the protective Sertoli cells into the lumen of the seminiferous tubule in a process called spermiation.

The non-motile spermatozoa are transported to the epididymis in testicular fluid secreted by the Sertoli cells with the aid of peristaltic contraction. While in the epididymis the spermatozoa gain motility and become capable of fertilization. However, transport of the mature spermatozoa through the remainder of the male reproductive system is achieved via muscle contraction rather than the spermatozoon's recently acquired motility.

At all stages of differentiation, the spermatogenic cells are in close contact with Sertoli cells which are thought to provide structural and metabolic support to the developing sperm cells. A single Sertoli cell extends from the basement membrane to the lumen of the seminiferous tubule, although the cytoplasmic processes are difficult to distinguish at the light microscopic level.

Sertoli cells serve a number of functions during spermatogenesis, they support the developing gametes in the following ways:

  • Maintain the environment necessary for development and maturation, via the blood-testis barrier
  • Secrete substances initiating meiosis
  • Secrete supporting testicular fluid
  • Secrete androgen-binding protein (ABP), which concentrates testosterone in close proximity to the developing gametes
    • Testosterone is needed in very high quantities for maintenance of the reproductive tract, and ABP allows a much higher level of fertility

    The intercellular adhesion molecules ICAM-1 and soluble ICAM-1 have antagonistic effects on the tight junctions forming the blood-testis barrier. [17] ICAM-2 molecules regulate spermatid adhesion on the apical side of the barrier (towards the lumen). [17]

    The process of spermatogenesis is highly sensitive to fluctuations in the environment, particularly hormones and temperature. Testosterone is required in large local concentrations to maintain the process, which is achieved via the binding of testosterone by androgen binding protein present in the seminiferous tubules. Testosterone is produced by interstitial cells, also known as Leydig cells, which reside adjacent to the seminiferous tubules.

    Seminiferous epithelium is sensitive to elevated temperature in humans and some other species, and will be adversely affected by temperatures as high as normal body temperature. Consequently, the testes are located outside the body in a sack of skin called the scrotum. The optimal temperature is maintained at 2 °C (man) (8 °C mouse) below body temperature. This is achieved by regulation of blood flow [18] and positioning towards and away from the heat of the body by the cremasteric muscle and the dartos smooth muscle in the scrotum.

    One important mechanism is a thermal exchange between testicular arterial and venous blood streams. Specialized anatomic arrangements consist of two zones of coiling along the internal spermatic artery. This anatomic arrangement prolongs the time of contact and the thermal exchange between the testicular arterial and venous blood streams and may, in part, explain the temperature gradient between aortic and testicular arterial blood reported in dogs and rams. Moreover, reduction in pulse pressure, occurring in the proximal one third of the coiled length of the internal spermatic artery. [ esclarecimento necessário ] [19] [20] Moreover, the activity of spermatogenic recombinase decreases, and this is supposed to be an important factor of testicles degeneration. [ esclarecimento necessário ] [21]

    Dietary deficiencies (such as vitamins B, E and A), anabolic steroids, metals (cadmium and lead), x-ray exposure, dioxin, alcohol, and infectious diseases will also adversely affect the rate of spermatogenesis. [ citação necessária ] In addition, the male germ line is susceptible to DNA damage caused by oxidative stress, and this damage likely has a significant impact on fertilization and pregnancy. [22] Exposure to pesticides also affects spermatogenesis. [23]

    Hormonal control of spermatogenesis varies among species. In humans the mechanism is not completely understood however it is known that initiation of spermatogenesis occurs at puberty due to the interaction of the hypothalamus, pituitary gland and Leydig cells. If the pituitary gland is removed, spermatogenesis can still be initiated by follicle stimulating hormone (FSH) and testosterone. [24] In contrast to FSH, luteinizing hormone (LH) appears to have little role in spermatogenesis outside of inducing gonadal testosterone production. [24] [25]

    FSH stimulates both the production of androgen binding protein (ABP) by Sertoli cells, and the formation of the blood-testis barrier. ABP is essential to concentrating testosterone in levels high enough to initiate and maintain spermatogenesis. Intratesticular testosterone levels are 20–100 or 50–200 times higher than the concentration found in blood, although there is variation over a 5- to 10-fold range amongst healthy men. [26] [27] FSH may initiate the sequestering of testosterone in the testes, but once developed only testosterone is required to maintain spermatogenesis. [24] However, increasing the levels of FSH will increase the production of spermatozoa by preventing the apoptosis of type A spermatogonia. The hormone inhibin acts to decrease the levels of FSH. Studies from rodent models suggest that gonadotropins (both LH and FSH) support the process of spermatogenesis by suppressing the proapoptotic signals and therefore promote spermatogenic cell survival. [28]

    The Sertoli cells themselves mediate parts of spermatogenesis through hormone production. They are capable of producing the hormones estradiol and inhibin. The Leydig cells are also capable of producing estradiol in addition to their main product testosterone. Estrogen has been found to be essential for spermatogenesis in animals. [29] [30] However, a man with estrogen insensitivity syndrome (a defective ERα) was found produce sperm with a normal sperm count, albeit abnormally low sperm viability whether he was sterile or not is unclear. [31] Levels of estrogen that are too high can be detrimental to spermatogenesis due to suppression of gonadotropin secretion and by extension intratesticular testosterone production. [32] Prolactin also appears to be important for spermatogenesis. [25]


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