Em formação

Por que a Tm é definida como a temperatura na qual 50% do dsDNA mudou para ssDNA?


Em biologia molecular, Tm é definida como a temperatura na qual 50% do dsDNA é convertido em sua forma de fita simples. Intuitivamente, pareceria que a temperatura de fusão deveria ter sido definida como a temperatura na qual a totalidade (100%) do dsDNA se converte em ssDNA. Qual é a base para usar essa proporção, ou seja, 50% na definição de Tm?


Se você pesquisar gráficos de temperatura de fusão de DNA, verá que eles têm uma forma sigmóide. É comum que esses tipos de gráficos sejam descritos pelo valor de 50%, por exemplo, o índice terapêutico e a dose letal de 50% de uma substância (LD50). Isso ocorre porque em temperaturas muito baixas e muito altas, todas as moléculas de DNA se tornam dsDNA ou ssDNA, respectivamente, de modo que a informação não é realmente útil. Você poderia talvez falar sobre a primeira temperatura na qual o DNA se torna 100% desnaturado, mas as curvas são altamente não lineares naquela região, então é difícil de quantificar. Os 50% são uma maneira fácil de comparar moléculas diferentes, uma vez que essa região é geralmente linear e fácil de comparar de uma forma significativa (basicamente todas as moléculas têm as mesmas extremidades da forma sigmóide, mas é a parte do meio que muda mais).


Antevisão da Solução

Este material pode consistir em explicações passo a passo sobre como resolver um problema ou exemplos de redação adequada, incluindo o uso de citações, referências, bibliografias e formatação. Este material é disponibilizado com o único propósito de estudar e aprender - o uso indevido é estritamente proibido.

1. Hipercromia é o fenômeno de aumento da absorbância de UV das moléculas de DNA quando elas são desnaturadas. As moléculas de DNA são duplamente helicoidais em sua forma nativa com ligações de hidrogênio entre bases de nitrogênio conectando duas fitas complementares. Quando as moléculas de DNA são aquecidas, as ligações de hidrogênio se rompem e a molécula torna-se de fita simples - desnaturada. Como as bases de nitrogênio absorvem a luz ultravioleta, sua absorção aumenta na desnaturação, pois são liberadas do lado interno da dupla hélice, onde sua interação com a luz é limitada. Na forma de fita simples, o entorno das bases é alterado, elas são liberadas e absorvem mais luz, resultando em maior absorção de UV. O termo hipercromia é composto pela palavra grega hyper que significa sobre e croma que significa cor. Nesse caso, as moléculas não são coloridas, mas absorvem luz (UV).
2. A inversão da base é o fenômeno no qual a base do nucleotídeo é girada para fora da dupla hélice do DNA. Isso ocorre quando uma determinada enzima tem que atuar em uma base específica, por exemplo, durante o reparo do DNA, quando extirpa a base errada e adiciona uma adequada. Quando a base precisa ser invertida, primeiro as ligações de hidrogênio e as interações de empilhamento precisam ser quebradas. Isso geralmente é feito também pela atividade enzimática.
3. Tm é a temperatura de fusão de uma molécula de DNA. A fusão é outro sinônimo de desnaturação de DNA ou separação de fitas de DNA. Isso ocorre em temperatura elevada. Dependendo da sequência, as moléculas de DNA ficam desnaturadas em temperaturas mais altas ou mais baixas. A temperatura de fusão é a medida da estabilidade da molécula de DNA e é definida como a temperatura na qual 50% das moléculas de DNA são desnaturadas. Sequências ricas em pares CG têm temperaturas de fusão mais altas do que sequências ricas em pares AT, pois os pares CG formam interações de empilhamento mais fortes que estabilizam a hélice.
A figura explica a temperatura de fusão. A absorção de UV é representada graficamente em relação à temperatura. A parte inferior da curva representa DNA de fita dupla (nativo) - dsDNA que se apresenta em temperaturas mais baixas e mostra menor absorção. Em temperaturas mais altas, ele assume a forma de fita simples - ssDNA que absorve a luz ultravioleta mais intensamente. Tm é o ponto onde 50% das moléculas são ss e 50% são ds - a absorbância está no meio.
4. A hibridização Northern Blot é uma técnica usada para detectar mRNA específico em uma amostra. É usado para estudar a expressão gênica. O método é baseado em sondas específicas que podem ser DNA, moléculas de RNA ou oligonucleotídeos de cerca de 25 nucleotídeos de comprimento que são complementares à sequência de mRNA alvo. , em geral, é a formação de pares complementares de fitas de ácido nucleico. Como a ligação complementar é altamente específica, ela é usada como uma ferramenta em biologia molecular para detectar a sequência alvo no RNA total ou no mRNA total de uma célula. As sondas são geralmente marcadas radioativamente ou ligadas a algumas moléculas quimioluminescentes para permitir a detecção de híbridos formados.

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Primers na replicação do DNA

É o papel que os primers de RNA desempenham na síntese de DNA que torna a biologia dos primers tão incrivelmente importante. In vivo, é a replicação do DNA ou síntese do gene, uma pedra angular da hereditariedade em que o material genético herdado das células-mãe é copiado para o crescimento, divisão e diferenciação celular.

A replicação do DNA começa em uma origem de replicação, que é identificada por proteínas chamadas iniciadores que se prendem e fazem pequenas aberturas na dupla hélice do DNA de fita dupla (dsDNA). Nessas quebras, as enzimas helicase quebram as ligações entre as fitas duplas, expondo o DNA de fita simples (ssDNA) em uma extremidade em forma de Y chamada de forquilha de replicação do DNA. A forquilha de replicação é onde a replicação do DNA realmente ocorrerá, fornecendo duas fitas do DNA pai agora expostas para atuar como o molde do DNA (fitas cinza abaixo). Em seguida, o RNA primase estabelece o primer de RNA em cada uma das fitas do modelo pai, fornecendo a extremidade 3 'para que uma nova fita polinucleotídica comece a se formar. A DNA polimerase se liga e a síntese é iniciada, com a formação de fitas filhas (fitas roxas). Neste diagrama, a fita filha superior é chamada de fita principal e é exposta na direção 5 linha (5 ') → 3' linha (3 ') da direita para a esquerda, permitindo que a síntese de DNA ocorra continuamente à medida que a hélice se desenrola.

Figura 1. O processo e os componentes da replicação do DNA

Em seguida, o RNA primase estabelece o primer de RNA em cada uma das fitas do modelo pai, fornecendo a extremidade 3 'para que uma nova fita polinucleotídica comece a se formar. A DNA polimerase se liga e a síntese é iniciada, com a formação de fitas filhas (fitas roxas). Neste diagrama, a fita filha superior é chamada de fita principal e é exposta na direção 5 linha (5 ') → 3' linha (3 ') da direita para a esquerda, permitindo que a síntese de DNA ocorra continuamente à medida que a hélice se desenrola.

A síntese da fita tardia da fita filha inferior ocorre na direção 5 '→ 3' da esquerda para a direita, onde a síntese de DNA deve recomeçar continuamente à medida que a hélice se desenrola. Isso cria muitos fragmentos curtos de produtos sintetizados, conhecidos como fragmentos de Okazaki que, em média,

150-200 nucleotídeos de comprimento. Cada fragmento de Okazaki contém uma articulação RNA-DNA como consequência do priming de RNA, uma descoberta que foi uma evidência importante para determinar o papel dos primers de RNA na replicação do DNA. Os fragmentos de Okazaki devem ser unidos pela enzima ligase, que catalisa a formação de ligações fosfodiéster covalentes entre duas fitas de DNA, ligando-as.

Primers para frente e para trás

Os primers se ligam apenas ao DNA de fita simples. Na replicação do DNA in vivo, isso é disponibilizado na bifurcação da replicação. In vitro, os cientistas podem criar ssDNA desnaturando o dsDNA com calor, quebrando efetivamente as ligações de hidrogênio que mantêm as duas fitas juntas. Isso cria duas fitas modelo lineares, onde a síntese de DNA pode ocorrer continuamente em ambas as fitas, geralmente chamadas de fita superior e inferior no lugar dos termos fitas principais e posteriores.

Figura 2. Os primers forward e reverse são fitas de DNA que se ligam a loci específicos no DNA de fita simples na forquilha de replicação. A extremidade 5 & # 8242 do primer se conecta à extremidade 3 & # 8242 da fita de DNA alvo.

Um par de primers deve ser usado, um para a parte superior e outro para a parte inferior. O par de iniciadores se liga em extremidades opostas da sequência sendo amplificada, com suas extremidades 3 'apontando uma para a outra. Os iniciadores de oligonucleotídeo sendo projetados não precisam realmente hibridizar completamente com a fita modelo, é essencial, no entanto, que a extremidade 3 'corresponda completamente ao DNA modelo para que o alongamento ocorra. O iniciador direto se liga à fita inferior que corre de 3 'a 5', e o iniciador reverso se liga à fita superior complementar de DNA que corre de 5 'a 3'. Após o alongamento, isso resulta em duas novas fitas de DNA de fita dupla: uma feita a partir do primer direto e a outra feita a partir do primer reverso.

Para que os primers se liguem à fita modelo, é importante que eles não sejam complementares entre si. Os primers complementares entre si podem resultar na criação de dímeros de primer, que são dois primers que se ligam um ao outro em vez da fita modelo. Dímeros de primer são discutidos em detalhes na seção sobre o que evitar ao projetar primers para PCR.


Instrumentos

Originalmente, a realização de PCR era trabalhosa porque era realizada movendo fisicamente os tubos de reação entre 3 banhos de água, cada um dos quais foi ajustado à temperatura necessária para desnaturação, anelamento e alongamento. O óleo foi adicionado ao topo da reação para evitar a evaporação e a análise era complicada de executar sem obter a interferência do óleo. Hoje, é comum usar um dos muitos instrumentos de ciclagem térmica especializados que estão disponíveis comercialmente. Os formatos de placa e bloco variam entre 48, 96 ou 384 poços e são compatíveis com pipetas multicanais. A maioria utiliza uma tampa aquecida que elimina a necessidade de cobertura de óleo. No entanto, existem instrumentos de alto rendimento baseados no princípio do banho-maria original 13.


BIT 410 Exam 1 Material

* o primer ideal tem uma sequência de alta complexidade (geralmente cerca de 20 bp) e é encontrado em exatamente UM local no modelo
- primers mais longos são mais complexos
- primers mais longos podem recozer-se a si próprios ou uns aos outros

Eles são idênticos à fita oposta

por exemplo. o primer reverso recoze-se com a fita de codificação (sentido) e combina com a fita anti-sentido

Não importa porque são complementares e codificam-se inatamente

A temperatura de recozimento é 4-6 graus C mais baixa do que o Tm

A temperatura de fusão pode ser estimada pela seguinte fórmula:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)

(esta é a orientação para o FORWARD PRIMER, pois parece ligado à fita anti-sentido)

para o primer reverso ligado à fita de sentido, será parecido com este:

3 '--- Especificação do gene. região homóloga --- modificador de RF --- sítio RE --- espaçador DNA

Útil na clonagem com apenas uma enzima ou na clonagem de extremidade BLUNT

* Trate apenas o vetor com fosfatase alcalina

Sequência encontrada em exatamente um local no modelo

20 nts de comprimento (intervalo de 18-30)

Tm = Faixa de 50-70 graus C (temperaturas mais altas fornecem produtos mais específicos)

Os primers F e R estão dentro de 5 graus C um do outro em Tm

2. AMP na Ligase liga-se ao fosfato 5 'na extremidade do DNA

3. O AMP facilita a formação da ligação fosfodiéster. Após a formação da ligação, o AMP é liberado

Tampão de ligase (ATP está neste)

Água (aumenta o volume final)

(inserir tamanho) / (tamanho do vetor) (inserir proporção / vetor) = (ng de inserção* / Vetor de 50 ng)

Vetor circular (sem inserção)

Múltiplas inserções ligadas entre si

Vários vetores ligados entre si

vetor contendo a inserção errada (como?)

Controle de competência: coloque o plasmídeo não digerido na presença de células competentes
-positivo para competência: muito crescimento no prato
-negativo para competência: nenhum crescimento no prato

Controle de ligase: plasmídeo digerido individualmente e ligase adicionado às células competentes
-positivo para a função da ligase: colônias na placa
-negativo para a função da ligase: nenhuma ou poucas colônias na placa (as bactérias não podem absorver DNA linearizado)

Essas extremidades são colocadas em uma mistura principal de Montagem Gibson com 3 enzimas:

1. A primeira enzima é uma exonuclase 5 'para 3' que mastiga as extremidades 5 'dos ​​fragmentos de DNA, deixando uma saliência 3'.
Essas saliências são complementares e podem ser recozidas para formar 1 peça de dsDNA (o resultado desejado)

2. A segunda enzima é a DNA polimerase. Esta enzima preenche as lacunas restantes onde a exonuclease mastigou de volta as extremidades 5 '

3. A terceira enzima é a DNA ligase, que sela os cortes remanescentes após a polimerase preencher a lacuna. Isso deixa o dsDNA do produto final


QPCR e RT-qPCR

PCR de ponto final quantitativo

PCR e RT-PCR são geralmente usados ​​em um formato qualitativo para avaliar amostras biológicas. No entanto, uma ampla variedade de aplicações, como determinação de carga viral, medição de respostas a agentes terapêuticos e caracterização de expressão gênica, seria melhorada pela determinação quantitativa da abundância alvo. Teoricamente, isso deveria ser fácil de conseguir, dada a natureza exponencial da PCR, pois existe uma relação linear entre o número de ciclos de amplificação e o logaritmo do número de moléculas. Na prática, entretanto, a eficiência da amplificação é diminuída por causa de contaminantes (inibidores), reações competitivas, exaustão do substrato, inativação da polimerase e reanimação do alvo. Conforme o número de ciclos aumenta, a eficiência da amplificação diminui, resultando eventualmente em um efeito de platô.

Normalmente, a PCR quantitativa requer que as medições sejam feitas antes da fase de platô, de modo que a relação entre o número de ciclos e as moléculas seja relativamente linear. Este ponto deve ser determinado empiricamente para diferentes reações devido aos inúmeros fatores que podem afetar a eficiência da amplificação. Como a medição é feita antes do platô da reação, a PCR quantitativa usa menos ciclos de amplificação do que a PCR básica. Isso pode causar problemas na detecção do produto final porque há menos produto para detectar.

Para monitorar a eficiência da amplificação, muitos aplicativos são projetados para incluir um padrão interno no PCR. Uma tal abordagem inclui um segundo par de iniciadores que é específico para um gene & ldquohousekeeping & rdquo (ou seja, um gene que tem níveis de expressão constantes entre as amostras comparadas) na reação (Gaudette e Crain, 1991 Murphy et al. 1990). A amplificação dos genes de manutenção verifica se o ácido nucleico alvo e os componentes da reação eram de qualidade aceitável, mas não leva em conta as diferenças nas eficiências de amplificação devido às diferenças no tamanho do produto ou na eficiência de recozimento do primer entre o padrão interno e o alvo a ser quantificado.

O conceito de PCR competitivo e variação de mdasha de PCR quantitativo e mdashis uma resposta a esta limitação. Na PCR competitiva, uma quantidade conhecida de um modelo de controle é adicionada à reação. Este modelo é amplificado usando o mesmo par de iniciadores que a molécula alvo experimental, mas produz um produto distinguível (por exemplo, tamanho diferente, padrão de digestão de restrição, etc.). As quantidades de controle e produto de teste são comparadas após a amplificação. Embora essas abordagens controlem a qualidade do ácido nucleico alvo, componentes do tampão e eficiências de recozimento do primer, elas têm suas próprias limitações (Siebert e Larrick, 1993 McCulloch et al. 1995), incluindo o fato de que muitos dependem da análise final por eletroforese.

Existem numerosos ensaios fluorescentes e de fase sólida para medir a quantidade de produto de amplificação gerado em cada reação, mas frequentemente falham em discriminar DNA amplificado de interesse de produtos de amplificação não específicos. Algumas dessas análises baseiam-se em técnicas de blotting, que introduzem outra variável devido às eficiências de transferência de ácido nucleico, enquanto outros ensaios foram desenvolvidos para eliminar a necessidade de eletroforese em gel e ainda fornecer a especificidade necessária. A PCR em tempo real, que fornece a capacidade de visualizar os resultados de cada ciclo de amplificação, é uma forma popular de superar a necessidade de análise por eletroforese.

PCR quantitativo em tempo real

O uso de sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência ou primers ou corantes fluorescentes de ligação a DNA para detectar e quantificar um produto de PCR permite que a PCR quantitativa seja realizada em tempo real. Instrumentos especialmente projetados executam ciclos térmicos para amplificar o alvo e detecção de fluorescência para monitorar o acúmulo de produto PCR. Os corantes de ligação ao DNA são fáceis de usar, mas não diferenciam entre produtos de PCR específicos e não específicos e não conduzem a reações multiplex. As sondas de ácido nucleico marcadas com fluorescência têm a vantagem de reagir apenas com produtos de PCR específicos, mas podem ser caras e difíceis de projetar. Algumas tecnologias qPCR empregam primers de PCR marcados com fluorescência em vez de sondas.

O uso de corantes fluorescentes de ligação ao DNA é uma das abordagens mais fáceis de qPCR. O corante é simplesmente adicionado à reação e a fluorescência é medida a cada ciclo de PCR. Como a fluorescência desses corantes aumenta dramaticamente na presença de DNA de fita dupla, a síntese de DNA pode ser monitorada como um aumento no sinal fluorescente. No entanto, muitas vezes é necessário realizar um trabalho preliminar para garantir que as condições de PCR produzam apenas um produto específico. Em reações subsequentes, a amplificação específica pode ser verificada por uma análise da curva de fusão. As curvas de fusão térmica são geradas permitindo que todo o produto forme DNA de fita dupla a uma temperatura mais baixa (aproximadamente 60 ° C) e aumentando lentamente a temperatura para níveis desnaturantes (aproximadamente 95 ° C). O comprimento do produto e a sequência afetam a temperatura de fusão (Tm), então a curva de fusão é usada para caracterizar a homogeneidade do amplicon. A amplificação não específica pode ser identificada por amplos picos na curva de fusão ou picos com valores Tm inesperados. Ao distinguir produtos de amplificação específicos e não específicos, a curva de fusão adiciona um aspecto de controle de qualidade durante o uso rotineiro. A geração de curvas de fusão não é possível com ensaios que dependem da atividade de exonuclease 5 & prime & rarr3 & prime da Taq DNA polimerase, como a tecnologia TaqMan & reg baseada em sonda.

Algumas estratégias de qPCR empregam sondas de ácido nucléico complementares para quantificar o DNA alvo. Essas sondas também podem ser usadas para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (Lee et al. Bernard de 1993 et al. 1998). Existem várias categorias gerais de sondas de PCR em tempo real, incluindo hidrólise, hairpin e sondas de hibridização simples. Essas sondas contêm uma sequência complementar que permite que a sonda se emparelhe com o produto de PCR acumulado, mas as sondas podem diferir no número e na localização dos repórteres fluorescentes.

As sondas de hidrólise são marcadas com um flúor na extremidade 5 ° e um supressor na extremidade 3 ° e, como os dois repórteres estão próximos, o sinal fluorescente é apagado. Durante a etapa de anelamento, a sonda hibridiza com o produto de PCR gerado em ciclos de amplificação anteriores.O híbrido sonda: alvo resultante é um substrato para a atividade de exonuclease 5 & prime & rarr3 & prime da DNA polimerase, que degrada a sonda recozida e libera o flúor (Holanda et al. 1991). O flúor é liberado dos efeitos do inibidor de absorção de energia, e o progresso da reação e o acúmulo do produto de PCR são monitorados pelo aumento resultante na fluorescência. Com esta abordagem, experimentos preliminares devem ser realizados antes dos experimentos de quantificação para mostrar que o sinal gerado é proporcional à quantidade do produto de PCR desejado e que a amplificação não específica não ocorre.

As sondas em gancho, também conhecidas como faróis moleculares, contêm repetições invertidas separadas por uma sequência complementar ao DNA alvo. As repetições se recozem para formar uma estrutura em grampo, onde o flúor na extremidade 5 ° e um supressor na extremidade 3 ° estão em estreita proximidade, resultando em pouco sinal fluorescente. A sonda em gancho é projetada de forma que a sonda se ligue preferencialmente ao DNA alvo em vez de reter a estrutura em gancho. À medida que a reação progride, quantidades crescentes da sonda recozem para o produto de PCR acumulado e, como resultado, o flúor e o inibidor tornam-se fisicamente separados. O flúor não é mais extinto e o nível de fluorescência aumenta. Uma vantagem desta técnica é que as sondas em gancho têm menos probabilidade de incompatibilidade do que as sondas de hidrólise (Tyagi et al. 1998). No entanto, experimentos preliminares devem ser realizados para mostrar que o sinal é específico para o produto de PCR desejado e que a amplificação não específica não ocorre.

A utilização de sondas de hibridação simples envolve duas sondas marcadas ou, alternativamente, uma sonda marcada e um iniciador de PCR marcado. Na primeira abordagem, a energia emitida pelo flúor em uma sonda é absorvida por um flúor na segunda sonda, que hibridiza nas proximidades. Na segunda abordagem, a energia emitida é absorvida por um segundo flúor que é incorporado ao produto de PCR como parte do primer. Ambas as abordagens resultam em fluorescência aumentada do aceitador de energia e fluorescência diminuída do doador de energia. O uso de sondas de hibridização pode ser simplificado ainda mais, de modo que apenas uma sonda marcada é necessária. Nesta abordagem, a extinção do flúor pela desoxiguanosina é usada para provocar uma mudança na fluorescência (Crockett e Wittwer, 2001 Kurata et al. 2001). A sonda marcada recoze-se de modo que o flúor esteja em estreita proximidade com os resíduos G dentro da sequência alvo e, à medida que o recozimento da sonda aumenta, a fluorescência diminui devido à extinção da desoxiguanosina. Com esta abordagem, a localização da sonda é limitada porque a sonda deve hibridizar para que o corante fluorescente esteja muito próximo de um resíduo G. A vantagem das sondas de hibridização simples é a capacidade de serem multiplexadas mais facilmente do que as sondas de hidrólise e em gancho, por meio do uso de flúores de cores diferentes e sondas com temperaturas de fusão diferentes (revisado em Wittwer et al. 2001).

Algumas estratégias de qPCR empregam sondas de ácido nucléico complementares para quantificar o DNA alvo. Essas sondas também podem ser usadas para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (Lee et al . Bernard de 1993 et al . 1998). Existem várias categorias gerais de sondas de PCR em tempo real, incluindo hidrólise, hairpin e sondas de hibridização simples. Essas sondas contêm uma sequência complementar que permite que a sonda se emparelhe com o produto de PCR acumulado, mas as sondas podem diferir no número e na localização dos repórteres fluorescentes.

Produtos e recursos qPCR

Os kits GoTaq & reg qPCR e RT-qPCR estão disponíveis para abordagens de PCR em tempo real baseadas em corante ou em sonda. Os sistemas GoTaq qPCR contêm BRYT Green Dye, que fornece máxima eficiência de amplificação e maior fluorescência do que SYBR Green.

Os sistemas de sonda GoTaq e reg são misturas master prontas para uso que simplificam a montagem da reação para detecção baseada em sonda de hidrólise.


Módulo 3 do BCHM 218.

DNA não codificador que pode ser transcrito em uma ampla variedade de tipos de RNA com funções regulatórias distintas da codificação de proteínas.

Quais são as duas classes principais de RNA e o que as diferencia (exemplos)?

RNA codificante e não codificante. A codificação é traduzida em proteína, enquanto o RNA não codificador não é. (mRNA é codificante, rRNA e tRNA não são codificantes)

Quais são as propriedades do mRNA

  • portadores transitórios de informação genética (cópia transcrita de um gene que codifica uma proteína específica)
  • carrega a informação codificada do núcleo para os ribossomos
  • a sequência de codificação do mRNA determina a sequência de aminoácidos da proteína
  • diferentes moléculas de mRNA adotam formas diferentes dependendo do que é mais energeticamente favorável.

quais são alguns tipos de RNA não codificador

  • RNA de transferência (tRNA): presente durante a tradução
  • RNA ribossomal (rRNA): presente durante a tradução
  • RNAs não codificantes longos (lncRNA): podem ser RNAs regulatórios importantes
  • RNAs nucleares pequenos (snRNAs): desempenham um papel na regulação do gene (splicing “snurps”)
  • microRNA (miRNAs): limita a tradução pela ligação à extremidade 3 'dos ​​mRNAs alvo
  • Pequenos RNAs interferentes (siRNAs): podem inibir a transcrição de certos genes e DNA viral
  • RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs): estão envolvidos no processamento de rRNAS
  • RNAs catalíticos: por exemplo, ribozimas.

Quais são algumas das diferenças entre DNA e RNA

O DNA ou RNA é mais sensível a condições alcalinas e por quê? Descreva este processo

O RNA é mais sensível a condições alcalinas, uma vez que bases como OH- podem interagir com o grupo 2'hidroxila no açúcar ribose do RNA causando a hidrólise da ligação fosfodiéster. Uma vez que o açúcar desoxirribose do DNA carece de um grupo 2'-hidroxila, não é tão facilmente hidrolisado, tornando a estrutura do DNA inerentemente mais estável do que o RNA.

  • Os monofosfatos cíclicos 2 ', 3' são os primeiros produtos da ação do álcali sobre o RNA
  • estes são rapidamente hidrolisados ​​para produzir uma mistura de nucleosídeo 2'- e 3'- monofosfatos

Qual é o papel da estabilidade variável do DNA e do RNA?

As moléculas de RNA podem ser sintetizadas e degradadas muitas vezes durante a vida de uma célula, enquanto o DNA correspondente é mantido durante a divisão celular e durante longos períodos em células não replicantes.

O que é estrutura secundária de RNA

a capacidade de dobrar sobre si mesma e formar par de bases intramoleculares

  • o arranjo espacial local de uma fita de RNA, incluindo uma descrição de qualquer par de bases intracadeia

Quais são algumas estruturas secundárias de RNA

descrever estruturas helicoidais

Quando a fita se dobra sobre si mesma, as "fitas emparelhadas" são antiparalelas umas às outras e formam uma hélice destra, dominada por interações de empilhamento de base

Ocorre quando o RNA de fita dupla (RNA de fita simples que se dobrou sobre si mesmo) se separa devido à falta de emparelhamento de bases Watson-Crick entre as duas fitas. Bulges são um tipo especial de loop interno onde apenas um fio contém uma base não emparelhada.

Loops em gancho ocorrem quando uma fita de RNA se dobra para trás sobre si mesma e há uma alça desemparelhada de bases no final de uma região do caule. Eles são o tipo mais comum de estrutura secundária de RNA. Os nucleotídeos dentro dos loops são organizados para maximizar a ligação de hidrogênio e o empilhamento de bases, aumentando a estabilidade termodinâmica.

Quais fatores afetam a estabilidade do RNA

Quais são alguns fatores que afetam a estabilidade do RNA

  • As interações fracas desempenham um papel importante na estabilidade das estruturas secundárias - o grupo 2'OH no açúcar ribose está frequentemente envolvido nas ligações de hidrogênio e nas interações de van der Waals que estabilizam essas estruturas.
  • Os íons metálicos também se ligam a locais específicos para ajudar a proteger a carga negativa do backbone, o que permite que o RNA se empacote firmemente.
  • O número de pares de bases GC versus AU (e GU)
  • O número de pares de bases em uma região de tronco
  • O número de pares de bases em loops em gancho, pois a formação de loops com mais de 10 ou menos de 5 bases requer mais energia
  • O número de bases desemparelhadas, pois as bases desemparelhadas diminuem a estabilidade da estrutura

Por que o RNA é mais adequado do que o DNA para formar estruturas 3D estáveis

devido aos grupos 2'-hidroxila em seu açúcar pentose. A presença desse açúcar torna o RNA vulnerável à hidrólise, tornando-o uma molécula mais transitória do que o DNA, mas também permite que ele se ligue por meio de hidrogênio.

qual é o objetivo para a quantificação de ácidos nucléicos e qual é o método mais preciso para fazer isso?

para determinar a concentração de RNA e DNA em uma amostra

o método mais preciso para quantificação de ácido nucleico é medir a quantidade de absorção de UV de uma amostra.

A quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à quantidade de proteína e / ou ácido nucléico presente na amostra - bases nitrogenadas absorvem luz UV

diferença entre purinas e pirimidinas

as purinas têm dois anéis, enquanto as pirimidinas têm um (absorvem luz ultravioleta em comprimentos de onda próximos a 260 nm)

O que é um espectrofotômetro e como funciona

usado para medir a quantidade de luz absorvida em uma amostra contendo ácidos nucléicos. expõe a amostra a um comprimento de onda de 260 nm (absorbância máxima de DNA e RNA). Um fotodetector mede a quantidade de luz que passou pela amostra e isso é representado em um espectro de absorção (entre 230 nm e 280 nm)

o que é um coeficiente de extinção molar

mede a quantidade de luz absorvida por solução 1M com um caminho de luz de 1 cm, e é uma propriedade que é específica da molécula que está sendo medida

o que influencia como as bases irão absorver a luz ultravioleta

se eles estão livres ou ligados ao ácido nucleico. A interação próxima de bases empilhadas quando ligadas a um ácido nucleico diminui a absorção de luz ultravioleta em relação à de uma solução com a mesma concentração de nucleotídeos livres.

A absorbância da luz em um determinado comprimento de onda é diretamente proporcional à concentração da solução. usado para calcular a absorção:

a quantidade de luz ultravioleta capaz de passar por uma solução a 260 nm é um somatório das propriedades ópticas das bases na molécula.

Como você pode diferenciar entre DNA e proteína

medindo sua absorvância, a DO do DNA é significativamente maior a 260 nm do que a DO da proteína, o que permite diferenciar entre DNA e proteínas.

como você pode diferenciar entre ssDNA e dsDNA

A ordem relativa de absorção de UV é a seguinte:

dsDNA & lt ssDNA & lt & lt nucleotídeos livres

a transição de dsDNA para ssDNA pode ser detectada monitorando a mudança na absorção de luz UV (efeito hipocrômico vs efeito hipercrômico)

Qual é o efeito hipocrômico

O efeito hipocrômico refere-se à grande diminuição na absorção de luz em 260 nm, ocorrendo como fitas simples de recozimento de DNA para formar o DNA de dupla hélice. As forças que estabilizam a dupla hélice do DNA, como ligações de hidrogênio e empilhamento de bases, limitam a quantidade de ressonância que pode ocorrer dentro dos anéis aromáticos das bases. Como resultado, há uma diminuição na quantidade de luz ultravioleta absorvida conforme o ssDNA recoze para formar dsDNA

qual é o efeito hipercrômico

O efeito hipercrômico refere-se ao grande aumento na absorção de luz em 260 nm que ocorre quando um DNA de dupla hélice se desenrola (ou derrete). Conforme o DNA é desnaturado, os pares de bases são rompidos e as duas fitas se separam - formando ssDNA. A ressonância dentro das bases em cada fita não é mais restrita e, como resultado, a absorção de luz ultravioleta do DNA de fita simples é maior do que a do DNA de fita dupla na mesma concentração.

O que é desnaturação e como é realizada

o desdobramento parcial ou completo da conformação nativa específica de uma cadeia polipeptídica, proteína ou ácido nucleico de modo que a função da molécula seja perdida quando sujeita a pH ou temperaturas extremas. Nesses casos, o dsDNA começa a desnaturar (ou derreter) e as duas fitas se separam. Separação de fios: ligações de hidrogênio e interações de empilhamento de bases são interrompidas, fazendo com que a dupla hélice se desenrole. O resultado são duas fitas simples de DNA.

Qual é a temperatura de derretimento

a temperatura na qual metade do DNA na amostra é desnaturado (ou seja, há 50% de dsDNA e 50% de ssDNA)

quais processos podem ser usados ​​para estimar a composição de base de uma sequência de DNA específica

O processo de desnaturação do DNA e a determinação da temperatura de fusão. Isso ocorre porque a ligação G /// C é mais forte e requer mais energia para ser quebrada do que a ligação A = T. Quanto maior o conteúdo de pares de bases G /// C no DNA, maior será o seu ponto de fusão.

Renaturação refere-se à reconstrução de um ácido nucleico (ou proteína) à sua forma original - particularmente após a desnaturação. (rápido e um passo). Pelo menos uma dúzia de resíduos deve permanecer intacta para unir os dois fios. Quando o pH / temperatura retorna aos seus valores normais, os segmentos separados da dupla hélice retrocedem espontaneamente para formar um duplex intacto. Este processo é chamado de reanimação

Quais são as duas etapas de renaturação?

1) Na primeira etapa, que é relativamente lenta, as sequências complementares nas duas fitas "se encontram" por colisão aleatória e formam um segmento curto de dupla hélice. Se as fitas complementares não se encontrarem adequadamente, pode resultar uma molécula dsDNA distorcida.

2) A segunda etapa é muito mais rápida, uma vez que as sequências complementares corretas se encontram: as bases desemparelhadas restantes entram sucessivamente no registro como pares de bases, e as duas fitas “fecham-se” juntas para formar a dupla hélice.

descreve experimentos de hibridização e qual é um exemplo de quando pode ser usado?

Em experimentos de hibridização, duas amostras de DNA ou RNA isolado são aquecidas para causar desnaturação e, em seguida, misturadas. A amostra é deixada para esfriar, permitindo que fitas complementares formem um duplex, seja um híbrido DNA-DNA, RNA-DNA ou RNA-RNA.

Ele pode ser usado para formar duplexes híbridos de diferentes animais.

(Os duplexes de RNA são mais estáveis ​​do que os duplexes de DNA. Os duplexes de RNA são mais estáveis ​​por causa do grupo 2'-OH dentro da estrutura do anel, que fornece um local extra para ligação de hidrogênio).

Quais são os três fatores que afetam a hibridização do DNA?

  • Concentração de DNA: uma amostra mais concentrada de DNA tem colisões intermoleculares mais frequentes e, portanto, uma taxa de hibridização mais rápida
  • pH: em uma faixa de pH de 5 a 9, há apenas um pequeno efeito na hibridização do DNA. Alternativamente, condições de pH mais extremas, sejam fortemente alcalinas ou ácidas, têm maior influência na eficiência de hibridização do DNA.
  • par de bases incompatíveis entre as duas fitas: nucleotídeos incompatíveis podem interromper o emparelhamento de bases, as interações de empilhamento e a estabilidade do DNA.

Estringência se refere à extensão em que a hibridização pode ocorrer entre duas fitas não complementares de ácidos nucleicos.

Alta estringência: a hibridização ocorre apenas quando as duas fitas são altamente compatíveis.

Baixo rigor: a hibridização ocorre mesmo na presença de algumas incompatibilidades de base

Quais são os fatores que afetam o rigor da hibridização de DNA

(mesmos fatores que alteraram a estabilidade do duplex dsDNA)

Como você pode aumentar o rigor?

  • altas temperaturas (próximo ao Tm do híbrido)
  • baixas concentrações de sal
  • presença de solventes orgânicos

Como você pode diminuir o rigor?

  • temperatura baixa - abaixo da Tm do duplex
  • alta concentração de sal
  • ausência de solventes orgânicos

o que uma mistura simples de PCR contém

quais são as cinco etapas do PCR?

1) desnaturação: a mistura de reação é brevemente aquecida, separando os fios. Isso permite que os componentes da reação interajam com o molde de DNA de fita simples

2) recozimento: a mistura é resfriada para que os primers sintéticos possam se recozer com o molde de DNA.

3) alongamento: a temperatura da mistura de reação é ligeiramente aumentada novamente para permitir a síntese de uma fita de DNA complementar. A DNA polimerase contida na mistura de reação reconhece as extremidades 3 'dos ​​primers hibridizados e realiza a síntese de DNA para estender essas fitas ao longo do segmento-alvo.

4) amplificação: este processo é então repetido uma segunda vez.

5) repetir: finalmente, o ciclo de aquecimento, resfriamento e extensão é repetido de 25 a 30 vezes

quais são os vários parâmetros para projetar um bom conjunto de primers de PCR?

  • 18-25 nucleotídeos de comprimento
  • 40-60% de conteúdo GC
  • Temperatura de recozimento (Ta) na faixa de 50-60 C
  • Um ou dois resíduos de GC na extremidade 3 'das fitas de DNA
  • Estrutura secundária mínima e repetição de base
  • Complementar à sequência escolhida para amplificação

Qual é a fórmula para calcular a temperatura de fusão para fragmentos de dsDNA?

para oligonucleotídeos mais curtos?

Como você determina o tamanho do seu produto após PCR e descreve esse processo?

usando eletroforese em gel, uma técnica para separar misturas de grandes moléculas carregadas, como proteínas ou ácidos nucléicos, fazendo com que se movam através de uma matriz de gel quando um campo elétrico é aplicado.

  • A amostra de interesse é adicionada a uma ranhura em uma das extremidades do gel. A matriz de gel é composta de agarose, um material derivado mantido que não interrompe o emparelhamento de bases de ácido nucleico.
  • Uma tensão é aplicada ao gel. Uma vez que a estrutura do núcleo é carregada negativamente, tanto o DNA quanto o RNA irão migrar em direção à extremidade positiva do gel no campo elétrico
  • Moléculas maiores tendem a se mover mais lentamente do que as menores, então as moléculas são separadas com base em seu tamanho - moléculas maiores são retidas mais perto do topo e moléculas menores migram para a parte inferior da célula.

como você visualiza o produto de PCR carregado em cada poço da GE?

o gel é corado com brometo de etídio, ele se insere entre as fitas de ácido nucléico de uma maneira não específica. Este composto fica fluorescente quando exposto à luz ultravioleta e, portanto, é usado para detectar ácidos nucléicos em um gel.

O que é transcriptase reversa?

é um processo usado para amplificar segmentos de RNA, como produtos de expressão gênica de mRNA. O RNA é convertido em cDNA que é amplificado por PCR. O RT-PCR pode ser usado para amplificar e sequenciar segmentos gênicos sem íntrons. O RT-PCR também pode ser usado para quantificar os níveis de mRNA como uma medida da expressão gênica usando um processo conhecido como PCR quantitativo (qPCR)

Qual é a falha no "PCR do ponto final" e como ela é resolvida?

não permite quantificar quantas cópias da sequência alvo original estavam presentes no início da reação.

na PCR quantitativa (qPCR), a quantidade de produto de DNA gerado pela reação é quantificada após cada ciclo de reação. Se mais cópias da sequência de DNA alvo estiverem presentes para começar, o produto de PCR será amplificado para um nível detectável em um ciclo anterior.

um corante marcador fluorescente adicionado à mistura de reação qPCR. É uma fluorescência substancialmente mais brilhante (

100x) quando está ligado ao dsDNA.

Ele permite a quantificação do produto dsDNA na reação após o estágio de extensão de cada ciclo de PCR. um termociclador especial registra a emissão fluorescente da mistura de reação após cada ciclo, quantificando efetivamente a quantidade de dsDNA presente.

quais são alguns problemas potenciais com qPCR?

O SYBR green liga o dsDNA indiscriminadamente, então como você pode ter certeza de que o sinal fluorescente está vindo exclusivamente do produto de amplificação desejado?

qual é a fase exponencial em qPCR

o processo pelo qual mais produtos de fita dupla estão sendo produzidos exponencialmente e sua fluorescência está sendo detectada

qual é a fase de platô em qPCR?

quando um ou mais componentes da reação são exauridos, liberando um sinal conhecido como 'fase de platô'

Qual é o limite de ciclo (Ct) em qPCR

O limite do ciclo (Ct) é o número do ciclo no qual o limite é ultrapassado pela primeira vez

o que é um controle sem modelo (NTC)?

um controle sem modelo (NTC) é frequentemente adicionado como uma reação separada no experimento. Na ausência de DNA ou cDNA alvo, esta amostra não deve atingir o limite em nenhum ciclo

adicionado em uma mistura de reação separada no experimento, a fim de

E se mais do segmento de cDNA alvo estivesse presente na mistura de reação original?

o valor Ct seria menor do que o original (21), pois haverá mais transcrições iniciais presentes para serem amplificadas, e a curva atingirá o limite mais rapidamente

como você pode evitar produtos não específicos em PCR?

Produtos não específicos, incluindo dímeros de primer e produtos de emparelhamento e amplificação não específicos, podem diminuir a eficiência e a fidelidade de uma reação de PCR. Você pode evitar produtos não específicos aumentando o rigor da reação

O que é Sequenciamento Sanger

Um método de sequenciamento de DNA. Este método utiliza o mecanismo de síntese de DNA pela DNA polimerase. Requer a síntese enzimática de uma fita de DNA complementar à fita em análise, usando um iniciador marcado e didesoxinucleotídeos.

o que diferencia os nucleotídeos dos trifosfatos didesoxincleosídeos (ddNTPs) no sequenciamento de Sanger?

Os trifosfatos de didesoxincleosídeo (ddNTPs) têm H nas posições 2 'e 3', o que interrompe a síntese de DNA porque lhes falta o grupo 3'-hidroxila necessário para a próxima etapa.

Resumidamente, quais são as etapas do sequenciamento de Sanger?

  1. Desnaturação de DNA
  2. DNA Primer
  3. Nucleotídeos livres (dNTPs)
  4. nucleotídeos modificados (ddNTPs)
  5. Terminação de corrente
  6. Eletroforese em gel

que tipo de nucleotídeo é adicionado em uma concentração mais baixa durante o sequenciamento Sanger e por quê?

os nucleotídeos modificados (ddNTPs) são adicionados em uma concentração muito menor do que os nucleotídeos livres (dNTPs), uma vez que permite a extensão da fita sintetizada com dNTPs não modificados antes que um ddNTP seja adicionado para encerrar a extensão.

Como o sequenciamento Sanger terminado em corante é diferente do sequenciamento Sanger?

Ambos os métodos diferem de duas maneiras principais:

  • No sequenciamento Sanger do terminador de corante, todos os ddNTPs são adicionados à mesma mistura de reação - ddCTP (azul), ddATP (verde), ddGTP (amarelo) e ddTTP (vermelho).
  • No sequenciamento Sanger do terminador de corante, produtos de tamanhos diferentes são separados por tamanho usando eletroforese capilar. Os segmentos marcados com fluorescência são excitados por um laser e o comprimento de onda da emissão fluorescente (vermelho, verde, amarelo ou azul) é detectado, um nucleotídeo por vez.

Como funciona a eletroforese capilar?

Cada ddNTP adicionado à mistura de reação é marcado com fluorescência (cores diferentes). Esses segmentos marcados são excitados por um laser e o comprimento de onda da emissão fluorescente (vermelho, verde, amarelo ou azul) é detectado, um nucleotídeo por vez.

Como você obtém cópias suficientes de um segmento de DNA purificado para realizar o sequenciamento? (in vitro e in vivo)

Os primers de PCR podem ser projetados para amplificar as regiões de interesse (quando a sequência ou a sequência circundante é conhecida). Se a sequência for completamente desconhecida, adaptadores sintéticos com sequências conhecidas podem ser ligados às extremidades para servir como regiões de ligação do iniciador, permitindo a amplificação por PCR. (em vitro)

O segmento pode ser incorporado em um vetor por um processo conhecido como clonagem molecular. Uma vez inserido na bactéria, o vetor pode ser replicado conforme as bactérias proliferam, permitindo a amplificação do segmento de DNA de interesse.

O que é clonagem molecular?

Outro método que pode fornecer grandes quantidades de DNA purificado para sequenciamento. É útil por ser capaz de expressar uma proteína de interesse em células para poder estudar sua função. Também pode ser usado para fazer formas mutantes de uma proteína ou versões marcadas para visualização.

um investigador pode adaptar o exercício de clonagem a um objetivo específico: sequenciamento de DNA, expressão gênica para purificação de proteínas, estudo dos efeitos de mutações ou criação de muitos tipos de alterações gênicas.

Qual é o processo de clonagem molecular?

É o isolamento e geração de moléculas de DNA recombinante que são colocadas em organismos para replicação e estudo. O processo de clonagem de DNA envolve a separação de um gene específico ou segmento de DNA de um cromossomo maior e sua incorporação em uma pequena molécula de DNA transportador. Este DNA modificado é então introduzido em uma célula hospedeira e replicado, aumentando o número de células e o número de cópias do DNA clonado em cada célula.

Quais são as cinco etapas da clonagem molecular?

  1. obtenção do segmento de DNA a ser clonado
  2. selecionar uma molécula transportadora adequada de DNA capaz de auto-replicação
  3. juntando dois fragmentos de DNA covalentemente
  4. mover DNA recombinante do tubo de ensaio para o organismo hospedeiro
  5. selecionar ou identificar células hospedeiras que contêm DNA recombinante

Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA conhecida por se replicar autonomamente em um hospedeiro

Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular encontrada em bactérias que se replica separadamente do cromossomo bacteriano. Eles são úteis para clonar fragmentos que são menores que

15.000 bp de comprimento. Para sobreviver na célula hospedeira, os plasmídeos contêm, ou incorporam, várias sequências especializadas que os permitem usar os recursos da célula para sua própria replicação e expressão gênica.

componentes do DNA de plasmídeo

Ori, sequências de restrição, número de pares de bases, resistência a antibióticos.

o que é o experimento de clonagem molecular?

as etapas deste experimento são discutidas em duas fases, 1) geração de plasmídeo e 2) transformação e eleição de antibiótico

O que são cromossomos artificiais bacterianos (BACs)?

um tipo de vetor que suporta fragmentos de fonte de DNA maiores. eles são semelhantes aos plasmídeos no sentido de que são vetores circulares com uma origem de replicação, resistência a antibióticos, sítios de restrição e frequentemente contêm um gene repórter.

Para acomodar segmentos muito longos de DNA clonado, os vetores BAC têm origens de replicação estáveis ​​que mantêm o plasmídeo em uma ou duas cópias por célula. O baixo número de cópias é útil na clonagem de grandes segmentos de DNA porque limita as oportunidades de reações de recombinação indesejadas que podem alterar de forma imprevisível grandes DNAs clonados ao longo do tempo.

quais são as limitações do sequenciamento Sanger e como ele é resolvido?

  • O sequenciamento de Sanger tende a ser lento e caro
  • Os comprimentos de leitura para este método são normalmente de até 1.000 a 1.500 bases.
  • Sequências para um grande segmento de DNA (ou seja, um cromossomo eucariótico de

isso é resolvido usando sequenciamento de última geração (NGS)

O que é sequenciamento de próxima geração (NGS)?

O Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), também conhecido como técnicas de “sequenciamento de alto rendimento”, permite o sequenciamento rápido de grandes segmentos de DNA. Esses grandes segmentos de DNA (que podem compreender um genoma humano inteiro) são fragmentados em segmentos menores (

300-400 bp) e são sequenciados simultaneamente. As sequências de fragmentos sobrepostos são então alinhadas para gerar uma sequência de consenso para todo o segmento de DNA.

Quais são as etapas do sequenciamento de terminador reversível (RTS)

O que diferencia o sequenciamento Sanger do RTS

O RTS depende de nucleotídeos modificados com um terminador reversível (RT). Como no sequenciamento Sanger, os nucleotídeos RT são marcados com marcadores fluorescentes. No entanto, os marcadores fluorescentes usados ​​em RTS são ligados aos nucleotídeos modificados usando uma região de ligação clivável.

O genoma é definido como o conjunto completo de material genético codificado em uma célula ou vírus. O genoma inclui um conjunto de autossomos e dois conjuntos de cromossomos. Os genomas contêm informações codificantes e não codificantes.

O genoma contém componentes “funcionais” e “não funcionais” de DNA.

Como é feito o genoma de um vírus?

o genoma é composto da cópia completa do ácido nucléico necessária para especificar o vírus.

em que consiste o genoma humano?

  • Aproximadamente 3 bilhões de pares de bases de nucleotídeos
  • 23 pares de cromossomos (22 autossomos e 2 cromossomos sexuais)
  • Cerca de 20.000 a 25.000 genes

quais são os três domínios principais da vida?

  • bactérias: Pequenos microrganismos procarióticos. Eles têm uma membrana plasmática, mas não têm organelas ou núcleos internos. As bactérias têm um genoma que consiste em uma única molécula de DNA circular com vários milhões de pares de bases.
  • archaea: Archaea são organismos unicelulares sem organelas ou núcleos internos. Embora tenham uma aparência semelhante à das bactérias, as arqueas são, na verdade, mais relacionadas aos eucariotos no que diz respeito a alguns genes e vias metabólicas.
  • eucariotos: eucariotos são organismos unicelulares ou multicelulares com células que possuem um núcleo delimitado por membrana, vários cromossomos e organelas internas.

quantos cromossomos os humanos têm?

46 cromossomos, 22 pares homólogos de autossomos e 2 cromossomos sexuais. (F tem 2 X homens tem 1Y e 1X)

heterocromatina vs eucromatina

padrão quando manchado com um corante chamado Giemsa

  • As bandas escuras são heterocromatina, áreas que ficam fortemente manchadas. A heterocromatina é a porção condensada dos cromossomos que não são transcricionalmente ativos. heterocromatina é a forma condensada, onde os genes não estão sendo transcritos
  • As bandas mais claras na figura são a eucromatina, que cora mal ou não cora, essas regiões representam áreas do cromossomo nas quais os genes estão sendo ativamente expressos. Eucromatina é a forma levemente empacotada de cromatina, onde os genes são acessíveis e ativamente submetidos à transcrição

o que são polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) representam uma mudança de par de bases genômicas que ajuda a distinguir uma espécie de outra, ou um subconjunto de indivíduos em uma população. SNPs são o tipo mais comum de variação genética entre diferentes pessoas.

grandes rearranjos genômicos

Refere-se a alterações maiores na sequência de DNA dos cromossomos. Estes podem ser divididos em inversões e fusões.


Por que a Tm é definida como a temperatura na qual 50% do dsDNA mudou para ssDNA? - Biologia

3 de setembro A dupla hélice do DNA

Ao longo deste curso, iremos discutir as propriedades do DNA: como ele é replicado, reparado, recombinado, transcrito, empacotado em cromatina, reconhecido por enzimas específicas de sequência e não específicas de sequência. Assim, entendemos melhor a (s) estrutura (s) dessa molécula - pois o DNA pode existir em várias conformações diferentes, cada uma das quais pode ser importante em algum contexto biológico.

Conheça suas bases! Você é responsável por conhecer as estruturas das 5 bases comumente encontradas na natureza (A, G, C, T e U).

As bases do DNA são às vezes modificadas, por metilação. As bases metiladas provam ser úteis e irritantes (levando a mutações). Estaremos especialmente interessados ​​em 6-Me Adenina e 5-Me Citosina, bem como no análogo de T, BrdU.

Limitaremos nossa atenção principalmente aos chamados pares de bases Watson-Crick, mas pares de bases alternativos são possíveis e algumas estruturas incomuns de DNA (e estruturas de RNA) também são estabilizadas por pares de bases incomuns, como G = T.

Formas helicoidais alternativas

A forma mais comumente discutida de DNA é uma forma helicoidal destra conhecida como B DNA, com 3,4 por par de bases e 10 pares de bases por volta da hélice. A molécula possui sulcos principais e secundários distintos.

O DNA da forma A, com 11 bp por volta, provavelmente só é visto em laboratório, com baixo teor de sal e baixa hidratação, mas o Z-DNA é provavelmente uma forma alternativa biologicamente significativa.

O Z-DNA é canhoto, com cerca de 12 pares de bases por turno. O eixo da hélice não é "através dos pares de bases" como é para o DNA B, mas ao longo do sulco menor. Z-DNA requer que as bases purinas estejam no syn , ao invés do anti , Formato. Esta forma é grandemente estabilizada por 5-Me C. Vários experimentos sugerem que Z-DNA pode ser biologicamente importante na regulação do gene ou na recombinação, mas nenhum experimento definitivo foi feito.

Estabilização da estrutura por emparelhamento de base e por empilhamento de interações entre as bases. Inercalação de corantes, como brometo de etídio ou iodeto de propídio, na hélice.

O DNA também pode ser esticado em outras formas mais extensas. Isso requer muita energia, fornecida por proteínas. O caso mais bem estudado é a extensão da hélice em 50% dentro do filamento da proteína recA, onde ocorre a troca de fitas entre o DNA de fita simples e dupla.

Estruturas alternativas

Os pares de bases são pares de bases, entre duas fitas de DNA ou dentro de uma fita. Os pares de bases alternativos também são possíveis.

Palíndromos & quotUm homem, um plano, um canal - Panamá & quot

A natureza antiparalela das fitas de DNA nos dá sequências de DNA que são lidas da mesma forma para a frente (5 'para 3' na fita superior) e para trás (5 'para 3' na fita inferior). Muitos sites de reconhecimento de endonuclease de restrição: GGATCC ou GAATTC. Quando essas sequências são mais longas, elas podem formar estruturas cruciformes.

Estruturas semelhantes também podem ser formadas entre duas moléculas de DNA de fita dupla, na forma de Junções Holliday.

Grampo estruturas também podem surgir. O caso mais comumente imaginado (porque ninguém ainda fez um experimento para provar sua existência - embora a evidência de apoio seja muito convincente) surge durante a replicação do DNA, onde o DNA de fita simples que ainda não foi replciado na fita retardada, pode facilmente ser imaginado para formar tal estrutura. Imagina-se que tais grampos de cabelo sejam responsáveis ​​por deleções espontâneas de DNA entre duas sequências curtas e repetidas.

Repetições de trigêmeos. Muita atenção foi dada recentemente à instabilidade de repetições de trigêmeos, mais notavelmente CGG, que ocorre em uma série de doenças neurológicas humanas, incluindo Fragile-X e CAG, encontradas na doença de Huntington e outras. Experimentos in vitro demonstraram que as repetições do CTG de fita simples (e em menor extensão, as repetições CAG complementares) podem formar estruturas em grampo, apesar do pareamento incorreto de cada terceiro par de bases. T-T bp estabiliza a estrutura CTG. Nem todos os trigêmeos são encontrados na natureza (GAC, por exemplo).

Execuções de 5-6 pares de base AT consecutivos causam uma curvatura distinta no DNA por causa das interações de empilhamento dos pares de base.

Wu, H.M. e D.M. Crothers (1984) The locus of sequ-dirigido e proteína-induzida DNA bending Nature 308 509-513. Não vamos ler este artigo, mas é útil saber.

O DNA "Bent" provará ser importante em como o DNA pode envolver proteínas (por exemplo, histonas, proteínas ativadoras, como CAP, etc.)

Os procedimentos normais de isolamento de DNA fraturam o DNA em fragmentos de 30 kb ou menos. Uma agitação ou sonicação mais vigorosa cortará o DNA em fragmentos muito menores de 500 bp.

É possível isolar DNA muito mais longo incorporando células em agarose e perfundindo todas as enzimas necessárias (proteases, lipases, RNases) para digerir células e deixar essencialmente apenas o DNA - intocado por mãos humanas. Tal DNA é útil para o "cariótipo molecular" de cromossomos de levedura, por exemplo, onde a eletroforese em gel de campo de pulso pode separar cromossomos que variam em tamanho de alguns 100 kb a vários Mbp.

Desnaturação e hipocromicidade

O empilhamento de pares de bases extingue a absorção de UV. Portanto, quando o DNA se desnatura, as fitas simples de DNA absorvem têm um coeficiente de extinção mais alto.

Detectando DNA de fita simples

o DNA de fita simples tem muitas propriedades que o distinguem do DNA de fita dupla, incluindo:

uma afinidade fraca para hidroxiapatita (uma matriz de fosfato de cálcio). Uma vez que pode separar ssDNA de dsDNA por este método

digestão por nucleases de fita simples, como S1

Operacionalmente, a temperatura na qual metade do DNA é desnaturado. A desnaturação é complexa devido às diferenças inerentes aos pares de bases GC e AT.

Uma fórmula útil: Tm = 69,3 + 0,41 (% GC)

A Tm pode ser reduzida aumentando a intensidade iônica do meio com agentes como sal ou formamida.

Uma vez que o DNA é desnaturado, pode-se perguntar com que rapidez ele reanimara. Reannealing é, em grande parte, um processo bimolecular, dependente da concentração inicial (Co) de sequências complementares. A taxa de reanimação é então dada por dC / dt = -kC 2, C / Co = 1 / (1 + k Co t)

reassociação de fração = log (Co) t

Berço1/2 = 50% de renaturação

Sequências simples (por exemplo, poli (dA) e poli (dT)) reanimam mais rapidamente do que sequências complexas.

No entanto, algumas sequências complexas reanimam-se muito rapidamente. Sequências repetidas invertidas podem formar grampos de cabelo em um independente da concentração moda.

A curva & quotCot & quot para DNA genômico é complexa.

Alguns DNA reanneal muito rapidamente, outras sequências reanneal moderadamente, enquanto alguns reanneal lentamente, dependendo da complexidade da sequência e do número de cópias dessa sequência no genoma. A cinética de reassociação é feita em DNA cortado de cerca de 500 bp de tamanho.

O DNA reanimado rapidamente é composto de até um milhão de repetições de uma sequência simples, como AAGAA. Essas sequências são frequentemente chamadas de sequências de DNA de satélite, por causa de seu comportamento na centrifugação de gradiente de densidade de CsCl, onde pedaços de DNA fragmentados se sedimentam até seu ponto de densidade bouyant. O DNA rico em GC tem uma densidade de boyant maior do que o DNA rico em AT. Sequências de DNA repetidas simples foram inicialmente identificadas como bandas de "quotsattelite" de densidade mais alta ou mais baixa do que o pico principal de DNA.

densidade bouyant = 1,66 + 0,098 (% GC)

Existem outras sequências mais complexas, como SINES (elementos curtos intercalados), que são encontradas em 100.000 - 500.000 cópias no genoma. Uma dessas sequências em humanos é denominada Alu, porque muitas cópias têm um local de restrição AluI em seu ca. Sequência de 300 bp. As sequências Alu estão dispersas em muitos locais ao redor do genoma humano.

Existem elementos menos repetitivos chamados LINES (longas intercaladas), bem como sequências retrovirais e pseudogenes.

Finalmente, existe o DNA de "sequência única" - DNA para o qual há apenas uma cópia em todo o genoma. É claro que é aqui que está a maioria dos genes.

Nota: as curvas de cotovelo não chegam a 100% de reanexação. POR QUE NÃO?

Mais da metade do genoma humano é composto por sequências repetitivas não codificantes


Taxonomia bacteriana: significado, importância e níveis

A ciência da classificação de bactérias é chamada de taxonomia bacteriana. A taxonomia bacteriana (G: táxis = arranjo ou ordem, nomos = lei ou nemein = distribuir ou governar), em um sentido mais amplo, consiste em três disciplinas separadas, mas inter-relacionadas: classificação, nomenclatura e identificação.

A classificação se refere aos arranjos de bactérias em grupos ou táxons (sing, táxon) com base em sua semelhança mútua ou parentesco evolutivo.

Nomenclatura é a disciplina relacionada à atribuição de nomes a grupos taxonômicos de acordo com as regras publicadas. A identificação representa o lado prático da taxonomia, que é o processo de determinar se um determinado isolado pertence a um táxon reconhecido. É para mencionar aqui que o termo Sistemática bacteriana é freqüentemente usado para taxonomia bacteriana.

Mas a sistemática tem um sentido mais amplo do que a taxonomia e é definida por muitos como o estudo científico dos organismos com o objetivo final de caracterizá-los e organizá-los de maneira ordenada. A sistemática, portanto, abrange disciplinas como morfologia, ecologia, epidemiologia, bioquímica, biologia molecular e fisiologia das bactérias.

Importância da Taxonomia Bacteriana:

A taxonomia bacteriana, no entanto, é importante devido às seguintes razões:

1. A taxonomia bacteriana parece ser um catálogo de biblioteca que ajuda a acessar facilmente um grande número de livros. A taxonomia, portanto, ajuda a classificar e organizar a diversidade desconcertante de bactérias em grupos ou taxa com base em sua semelhança mútua ou parentesco evolutivo.

2. A ciência da bacteriologia não é possível sem a taxonomia porque esta coloca as bactérias em grupos significativos e úteis com nomes precisos para que os bacteriologistas possam trabalhar com elas e se comunicar com eficiência.

3. A taxonomia bacteriana ajuda os bacteriologistas a fazer previsões e hipóteses de enquadramento para pesquisas futuras com base no conhecimento de bactérias idênticas. Por conveniência, o bacteriologista pode prever que uma bactéria em questão possuiria características semelhantes à sua bactéria relativa, cujas características já são conhecidas.

4. A contribuição da taxonomia bacteriana na identificação precisa de bactérias é de importância prática. Por conveniência, a taxonomia bacteriana contribui particularmente na área da microbiologia clínica. O tratamento de doenças bacterianas costuma se tornar excepcionalmente difícil se o patógeno não for identificado de maneira adequada.

Classificações ou níveis de taxonomia bacteriana:

Na taxonomia bacteriana, uma bactéria é colocada dentro de um grupo pequeno, mas homogêneo, em uma classificação ou nível. Os grupos desta classificação ou nível se unem criando um grupo de classificação ou nível mais alto. Na taxonomia bacteriana, as classificações ou níveis mais comumente usados ​​em sua ordem ascendente são: espécies, gêneros, famílias, ordens, classes, filos e domínio (Tabela 3.1).

Espécie é o grupo taxonômico básico na taxonomia bacteriana. Grupos de espécies são então coletados em gêneros (sing, gênero). Os grupos de gêneros são agrupados em famílias (sing, family), famílias em ordens, ordens em classes, classes em filos (sing, phylum) e filos em domínio (a classificação ou nível mais alto). Grupos de bactérias em cada classificação ou nível têm nomes com terminações ou sufixos característicos dessa classificação ou nível.

Características usadas na taxonomia bacteriana:

1. Características Clássicas (Taxonomia Clássica):

Várias características fenotípicas (por exemplo, morfológicas, fisiológicas e metabólicas, ecológicas) e análises genéticas têm sido usadas na taxonomia bacteriana (microbiana) por muitos anos.

Essas características são avaliadas e os dados são usados ​​para agrupar bactérias até a escada taxonômica de espécie para domínio. As características clássicas são bastante úteis na identificação de rotina de bactérias e também fornecem pistas para relações filogênicas entre elas, bem como com outros organismos.

Características Morfológicas:

Várias características morfológicas, por exemplo, forma celular, tamanho da célula, morfologia colonial, arranjo de flagelos, mecanismo de motilidade celular, características ultraestruturais, comportamento de coloração, formação de endosporos, morfologia e localização de esporos e cor são normalmente usados ​​para classificar e identificar microorganismos.

As características morfológicas desempenham um papel importante na classificação e identificação microbiana devido às seguintes razões:

(i) Eles são facilmente estudados e analisados, especialmente em microrganismos eucarióticos e procariotos comparativamente complexos.

(ii) Eles normalmente não variam muito com as mudanças ambientais, pois são resultantes da expressão de muitos genes e, portanto, são geralmente geneticamente estáveis.

(iii) A similaridade morfológica entre os microrganismos freqüentemente é uma boa indicação de parentesco filogenético.

Algumas características morfológicas taxonomicamente úteis e suas variações são mostradas na Tabela 3.2.

Características Fisiológicas e Metabólicas:

Algumas características fisiológicas e metabólicas são muito úteis na classificação e identificação de microrganismos, pois estão diretamente relacionadas à natureza e à atividade de enzimas microbianas e proteínas de transporte.

Algumas características fisiológicas e metabólicas mais importantes usadas na taxonomia microbiana são tipos nutricionais, componentes da parede celular, fontes de carbono e nitrogênio, metabolismo de energia, tolerância osmótica, relações de oxigênio, relações de temperatura, requisitos de sal e tolerância, metabólitos secundários, inclusões de armazenamento, etc.

Algumas características fisiológicas e metabólicas taxonomicamente úteis e suas variações são apresentadas na Tabela 3.3.

Características Ecológicas:

As características ecológicas, ou seja, as características de relacionamento dos microrganismos com seu ambiente contribuem significativamente na taxonomia microbiana. É porque mesmo microrganismos intimamente relacionados podem variar consideravelmente no que diz respeito às suas características ecológicas.

Por conveniência, os microrganismos que habitam os ambientes de água doce, marinhos, terrestres e do corpo humano diferem uns dos outros e daqueles que vivem em ambientes diferentes.

No entanto, algumas das características ecológicas mais importantes usadas na taxonomia microbiana são padrões de ciclo de vida & # 8211, a natureza da relação simbiótica, natureza patogênica e variações nos requisitos de temperatura, pH, oxigênio e concentrações osmóticas.

Análise genética:

A análise genética é usada principalmente na classificação de microrganismos eucarióticos porque a espécie é definida nesses organismos em termos de reprodução sexuada que ocorre neles. Esta análise às vezes é empregada na classificação de microrganismos procarióticos, particularmente aqueles que usam os processos de conjugação e transformação para troca de genes.

Por exemplo, membros do gênero Escherichia podem se conjugar com os membros dos gêneros Shigella e Salmonella, mas não com aqueles dos gêneros Enterobacter e Proteus. Isso mostra que os membros dos três primeiros gêneros estão mais intimamente relacionados entre si do que com Enterobacter e Proteus.

Estudos de transformação com gêneros como Bacillus, Haemophilus Micrococcus, Rhizobium, etc. revelam que a transformação ocorre entre diferentes espécies de bactérias, mas apenas raramente entre gêneros.

Isso fornece evidências de uma relação próxima entre as espécies, uma vez que a transformação ocorre, a menos que os genomas sejam muito semelhantes. Plasmídeos bacterianos que carregam genes que codificam para características fenotípicas, sem dúvida, contribuem na taxonomia microbiana, pois ocorrem na maioria dos gêneros.

2. Características moleculares:

Algumas abordagens moleculares recentes, como proporções de GC de DNA genômico, hibridização de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, ribotipagem e comparação de proteínas, tornaram-se cada vez mais importantes e são usadas rotineiramente para determinar as características de microrganismos a serem usados ​​na taxonomia microbiana.

Razões de DNA genômico GC (conteúdo G + C):

A proporção de DNA genômico GC (G + C) é a primeira, e possivelmente a mais simples, abordagem molecular a ser usada na taxonomia microbiana. A proporção de GC é definida como a porcentagem de guanina mais citosina no DNA de um organismo & # 8217s.

A proporção de GC varia com a sequência de base e muda de acordo com a sequência:

A proporção GC de DNA de animais e plantas superiores é em média em torno de 40% e varia entre 30 e 50%. Ao contrário disso, a proporção de GC de microrganismos eucarióticos e procarióticos varia muito. A proporção de GC é a mais variável, variando de cerca de 20% a quase 80%. Apesar de uma ampla gama de variação, a proporção de cepas de GC dentro de uma determinada espécie é constante.

As razões do DNA genômico GC de uma ampla variedade de microrganismos foram determinadas, e o conhecimento dessa razão pode ser útil na taxonomia microbiana, dependendo da situação. Por conveniência, dois microrganismos podem possuir proporções de GC idênticas e, no entanto, não estarem relacionados tanto taxonomicamente quanto filogeneticamente porque uma variedade de sequências de bases é possível com DNA de uma única composição de base.

Neste caso, as proporções de GC idênticas são inúteis do ponto de vista da taxonomia microbiana. Em contraste, se a proporção de dois microrganismos & # 8217 GC diferir em mais de cerca de 10%, eles compartilharão poucas sequências de DNA em comum e, portanto, provavelmente não estarão intimamente relacionados.

Os dados de proporção de GC são valiosos na taxonomia microbiana de pelo menos duas maneiras a seguir:

(i) Eles podem confirmar um esquema de classificação de microrganismos desenvolvido com base em outros dados. Se os microrganismos no mesmo táxon variam muito em suas proporções de GC, o táxon merece ser dividido.

(ii) A proporção de GC parece ser útil na caracterização de gêneros bacterianos, uma vez que a variação dentro de um gênero é geralmente inferior a 10%, embora o conteúdo possa variar muito entre os gêneros.

Por conveniência, Staphylococcus e Micrococcus são os gêneros de cocos gram-positivos com muitas características em comum, mas diferindo em sua proporção de GC em mais de 10%. O primeiro tem uma proporção de GC de 30-38%, enquanto o último de 64-75%.

Hibridização de ácido nucléico (hibridização genômica):

A hibridização de ácido nucléico ou hibridização genômica mede o grau de similaridade entre dois genomas (ácidos nucléicos) e é útil para diferenciar duas bactérias (microrganismos). A hibridização DNA-DNA é útil para estudar apenas bactérias intimamente relacionadas, enquanto a hibridização DNA-RNA ajuda a comparar bactérias distantemente relacionadas.

1. Hibridização DNA-DNA:

O DNA de fita dupla isolado de uma bactéria é dissociado em fitas simples em temperatura apropriada que são tornadas radioativas com 32 P, 3 H ou 14 C.

Da mesma forma, o DNA de fita dupla isolado de outra bactéria é dissociado em fitas simples que não são tornadas radioativas. As moléculas de DNA de fita simples não radioativas são primeiro permitidas a se ligar a um filtro de nitrocelulose e as fitas não ligadas são removidas por lavagem.

Agora, o filtro com as fitas de DNA ligadas é incubado com o DNA de fita simples radioativo em condições ideais de emparelhamento. O recozimento é uma característica interessante do DNA de fita simples em que as fitas, ao resfriar, tendem a se reassociar para formar uma estrutura de dupla hélice automaticamente.

O recozimento ocorre de maneira ideal quando a temperatura é levada a cerca de 25 ° C abaixo da temperatura de fusão (Tm) em uma solução de alta concentração iônica.

No entanto, durante a incubação, as fitas simples radioativas de DNA hibridizam com fitas simples não radioativas de DNA, dependendo de sua homologia na sequência de base. Em seguida, o enchimento é lavado para remover moléculas de DNA radioativo não ligadas e a radioatividade das moléculas de DNA radioativo hibridizado é medida.

Em seguida, a quantidade de radioatividade nas moléculas de DNA radioativo hibridizado é comparada com o controle que é tomado como 100%, e esta comparação dá uma medida quantitativa do grau de complementaridade das duas espécies de DNA, ou seja, homologia entre os dois DNAs. O procedimento é esquematicamente mostrado na Fig. 3.1.

Embora não haja uma convenção fixa quanto à quantidade de hibridização entre dois DNAs é necessária para atribuir duas bactérias à mesma classificação taxonômica, 70% ou maior grau de complementaridade dos dois DNAs é recomendado para considerar as duas bactérias pertencentes à mesma espécie.

Em contraste, um grau de pelo menos 25% é necessário para argumentar que as duas bactérias devem residir no mesmo gênero. O grau de complementaridade na faixa de 10% ou menos denota que as duas bactérias estão mais distantemente relacionadas taxonomicamente.

A hibridização DNA-DNA é um método sensível para revelar diferenças sutis nos genes de duas bactérias (outros micróbios também) e, portanto, é útil para diferenciar bactérias intimamente relacionadas.

Estudos de homologia de DNA foram conduzidos em mais de 10.000 bactérias pertencentes a cerca de 2.000 espécies e várias centenas de gêneros. Provou ser uma ferramenta poderosa na resolução de muitos problemas de taxonomia bacteriana, particularmente a nível de espécie.

2. Hibridização DNA-RNA:

A hibridização DNA-RNA ajuda a comparar, ao contrário da hibridização DNA-DNA, bactérias distantemente relacionadas (microorganismos) usando RNA ribossômico radioativo (rRNA) ou RNA de transferência (tRNA).

Torna-se possível porque os segmentos de DNA (genes) que transcrevem rRNA e tRNA representam apenas uma pequena porção do genoma do DNA total e não evoluíram tão rapidamente quanto a maioria dos outros genes que codificam proteínas (ou seja, eles são mais conservados em comparação com genes que codificam proteínas) .

Entre os diferentes rRNAs, o 16S rRNA de procariotos e o análogo 18S rRNA de organismos eucarióticos foram considerados os mais adequados para comparação de suas sequências em estudos taxonômicos. Um dos principais impactos dos estudos de rRNA na taxonomia, por conveniência, é o reconhecimento de três domínios principais - a Archaea, a Bactéria e a Eukarya por Woese e Colegas em 1990.

A técnica de hibridização DNA-RNA é semelhante à empregada para a hibridização DNA-DNA. O ssDNA não radioativo ligado ao filtro é incubado com rRNA radioativo, lavado e contado.

Uma medição ainda mais precisa da complementaridade é obtida encontrando a temperatura necessária para dissociar e remover metade do rRNA radioativo do filtro quanto mais alta esta temperatura, mais forte o complexo DNA-rRNA e mais semelhantes as sequências de base.

No entanto, a hibridização DNA-RNA foi feita com milhares de bactérias para a relevância de suas relações taxonômicas. Tais estudos foram feitos com culturas puras de bactérias até 1997-98, mas desde então, técnicas foram desenvolvidas para recuperar genes de rRNA diretamente de habitats naturais. Isso passou a ser chamado de análise de comunidade de rRNA da comunidade bacteriana natural.

Sequenciamento de ácido nucléico:

O sequenciamento de ácido nucléico (DNA e RNA) é outra característica molecular que ajuda a comparar diretamente as estruturas genômicas. Muita atenção tem sido dada ao sequenciamento de rRNAs 5S e 16S isolados das subunidades 50S e 30S do ribossomo procariótico 70S, respectivamente.

Conforme mencionado na hibridização DNA-RNA, os rRNAs são quase ideais para os estudos de evolução bacteriana (microbiana) e parentesco porque:

(i) Eles são essenciais para os ribossomos encontrados em todas as bactérias,

(ii) Suas funções são as mesmas em todos os ribossomos, e

(iii) Sua estrutura muda muito lentamente com o tempo, ou seja, eles são mais conservados.

O procedimento de sequenciamento de rRNA envolve as seguintes etapas:

(i) o rRNA é isolado do ribossomo e purificado,

(ii) A enzima transcriptase reversa é usada para fazer DNA complementar (cDNA) usando iniciadores que são complementares a sequências de rRNA conservadas,

(iii) O cDNA é amplificado usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e, finalmente,

(iv) O cDNA é sequenciado e a sequência de rRNA deduzida dos resultados.

O sequenciamento Shotgun e outras técnicas de sequenciamento do genoma levaram à caracterização de muitos genomas procarióticos (aproximadamente 100) em um tempo muito curto e muitos outros estão em processo de sequenciamento. A comparação direta de sequências completas do genoma, sem dúvida, se tornará uma ferramenta importante na determinação das categorias classificatórias de procariotos.

A ribotipagem é uma técnica que mede o padrão único gerado quando o DNA de uma bactéria (todos os outros organismos também) é digerido por uma enzima de restrição e os fragmentos são separados e sondados com uma sonda de rRNA.

A técnica não envolve sequenciamento de ácido nucleico. A ribotipagem tem se mostrado útil para a identificação bacteriana e encontrou muitas aplicações em diagnósticos clínicos e para análises microbianas de alimentos, água e bebidas.

A ribotipagem é um método rápido e específico para a identificação bacteriana, é tão específico que recebeu o apelido de & # 8216molecular fingerprinting & # 8217 porque uma série única de bandas aparece para virtualmente qualquer bactéria (qualquer organismo).

Na ribotipagem, primeiro o DNA é isolado de uma colônia ou cultura líquida da bactéria a ser identificada. Usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), genes de DNA para rRNA (preferencialmente 16S rRNA) e moléculas relacionadas são amplificados, tratados com uma ou mais enzimas de restrição, separados por eletroforese e, em seguida, sondados com genes de rRNA.

O padrão gerado a partir dos fragmentos de DNA no gel é então digitalizado e um computador usado para fazer a comparação desse padrão com padrões de outras bactérias disponíveis em um banco de dados.

Comparação de proteínas:

As sequências de aminoácidos das proteínas são reflexos diretos de sequências de mRNA e, portanto, intimamente relacionadas às estruturas dos genes que codificam para sua síntese. À luz disso, as comparações de proteínas de diferentes bactérias mostram-se muito úteis taxonomicamente.

Embora existam muitos métodos para comparar proteínas, a abordagem mais direta é determinar as sequências de aminoácidos de proteínas com a mesma função.

Quando as sequências de proteínas com as mesmas funções em duas bactérias são semelhantes, as bactérias que as possuem são consideradas intimamente relacionadas. No entanto, as sequências de citocromos e outras proteínas de transporte de elétrons, histonas, proteínas de meia de calor e uma variedade de enzimas têm sido usadas em estudos taxonômicos.


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